JP2011169878A - 核酸検出用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記式(1)等で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む核酸検出用キットである。
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
【選択図】なし
Description
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、A1およびA2のうち少なくとも1つは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(5)中、XおよびYは、それぞれ独立して、エテニレン基、−(C2H4O)n−または−(C3H6O)n−(ここで、n=2,4,8,12,24)基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキレン基または炭素数2〜48のアルケニレン基であり、Zは、ジニトロフェニル基またはL−3,4−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキル基、炭素数1〜48のアルコキシ基、炭素数6〜48のアリール基、炭素数6〜48のアリールオキシ基、炭素数7〜48のアリールアルキル基または炭素数7〜48のアリールアルキルオキシ基であり、Bは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Y,Zは独立してLys以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。)
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、A1およびA2のうち少なくとも1つは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、TGaseが認識可能なグルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する上記式(1),(2),(3)または(4)で示されるヌクレオシド三リン酸である。上記式(1),(2),(3)または(4)で示されるヌクレオシド三リン酸は、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、ウリジン三リン酸(uridine triphosphate:UTP)誘導体、アデノシン三リン酸(adenosine triphosphate:ATP)誘導体、グアノシン三リン酸(guanosine triphosphate:GTP)誘導体、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate:CTP)誘導体、デオキシウリジン三リン酸(deoxyuridine triphosphate:dUTP)誘導体、デオキシアデノシン三リン酸(deoxyadenosine triphosphate:dATP)誘導体、デオキシグアノシン三リン酸(deoxyguanosine triphosphate:dGTP)誘導体、デオキシシチジン三リン酸(deoxycytidine triphosphate:dCTP)誘導体である。本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンは、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
本実施形態に係る核酸検出キットを用いて調製することができるTGase基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、上記式(1)〜(5)で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されているTGase基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位である酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸のグルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合して構成することができる。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、MTGなどのTGaseを用いて、MTG認識GlnなどのTGase認識Glnが複数箇所に導入された核酸プローブZ−QG RNAに、TGase認識Lysを導入した標識酵素などを結合させることによって、RNAと標識酵素などの標識部分が1:nであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる(図2)。
(1)TGaseの由来を変える。
(2)TGaseの基質特異性を変える。
NK14−PfuAPとは、MKHKGGGSGGGSGSの配列を有するアミノ酸14残基からなる付加配列を遺伝子工学的にPfuAPのN末端に、精製用タグをC末端に導入したものである。PfuAPの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。PCRによりPfuAPをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターpET22に組換え、大腸菌BL21株を形質転換した。アンピシリンを含むLB培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、25mM TBSで2回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のPfuAPは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を80℃で30分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、His−tagカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、PD−10カラムを用いて溶媒を10mM Tris−HCl(pH8.0)へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
・対象となる標識酵素は、TGaseが認識可能なリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を有する酵素、TGaseが認識可能なリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、C末端に限定されない。TGase活性なLys残基またはGln残基が存在するか、そのようなLys残基またはGln残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・C末端、N末端に加え、loop領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式(1)〜(5)で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを調製し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
(a)基材表面に固定化された核酸、
(b)固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列(固定化核酸相補的配列)、および標的核酸に特異的に結合可能な配列(標的核酸特異的配列)を有するアプタマ核酸、
(c)構成単位として上記式(1)〜(5)で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び/又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を調製し、
(A)固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
(B)固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
(C)固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
(1)dATPと溶媒とを含むdATP含有溶液、dCTPと溶媒とを含むdCTP含有溶液、dGTPと溶媒とを含むdGTP含有溶液、dTTPと溶媒とを含むdTTP含有溶液、Z−QG−dUTPと溶媒とを含むZ−QG−dUTP含有溶液のZ−QG DNAラベリングセット(Z−QG デオキシリボヌクレオチドセット)。各溶液の濃度は、例えば、1mM〜100mMである。dTTPとZ−QG−dUTPとは適切な比率(例えば、モル比で6:4)で混合されていてもよい。
(2)ATPと溶媒とを含むATP含有溶液、CTPと溶媒とを含むCTP含有溶液、GTPと溶媒とを含むGTP含有溶液、UTPと溶媒とを含むUTP含有溶液、Z−QG−UTPと溶媒とを含むZ−QG−UTP含有溶液のZ−QG RNAラベリングセット(Z−QG リボヌクレオチドセット)。各溶液の濃度は、例えば、1mM〜100mMである。UTPとZ−QG−UTPとは適切な比率(例えば、モル比で6:4)で混合されていてもよい。
(3)標識部分としてNK14−PfuAP等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物と溶媒とを含む標識化合物含有溶液、MTGと溶媒とを含むMTG含有溶液、反応バッファ、コントロール用DNA(Z−QG標識済DNA)、コントロール用RNA(Z−QG標識済RNA)の標識セット。
(1)dATPとdCTPとdGTPとdTTPとZ−QG−dUTPと溶媒とを含むZ−QG−dUTP含有溶液のZ−QG DNAラベリング混合物セット(Z−QG デオキシリボヌクレオチドミックス)。各成分の濃度は、例えば、1mM〜100mMであり、PCRに用いやすい2mMまたは汎用性が高い100mMである。
(2)ATPとCTPとGTPとUTPとZ−QG−UTPと溶媒とを含むZ−QG−UTP含有溶液のZ−QG RNAラベリング混合物セット(Z−QG リボヌクレオチドミックス)。各溶液の濃度は、例えば、1mM〜100mMであり、RNA合成に用いやすい20mMである。
(3)標識部分としてNK14−PfuAP等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物とMTGと反応バッファと溶媒とを含む標識化合物/MTG含有溶液、コントロール用DNA(Z−QG標識済DNA)、コントロール用RNA(Z−QG標識済RNA)の標識セット。NK14−PfuAPおよびMTGは、反応に適した終濃度の例えば2倍の濃度とし、Z−QG核酸と例えばモル比で1:1で混合することにより反応させる。
<Z−QG−UTPの合成・精製>
Z−QG−UTPの合成スキームは、図4に示す通りである。まず100mM N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、100mM N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、50mM Z−QGを、室温(調製した日は27.0℃)でN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)4mL中で20時間反応させることにより、NHS化Z−QG(50mM)を調製した(この段階で500μLずつに分注し、−80℃で保存)。その後、25mMのNHS化Z−QGと5mMの5−(3−aminoallyl)−UTP(以下、aminoallyl−UTPと略記、SIGMA社製)とを、100mM ホウ酸緩衝液(pH8.8)とDMFの混合溶媒(v/v=1/1)0.32mL中において25℃で12時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水(Milli−Q)で10倍希釈し、HPLC(日本分光製)(高速液体クロマトグラフ・ポンプ:TRI ROTAR−V型、バリアブル・ループ・インジェクタ:VL−613型、紫外可視分光検出器:UVIDEC−100−IV型)によって精製を行った。HPLCの測定条件は表1の通りとした。生成物の同定は、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置であるMALDI TOF−MS(島津製作所製 AXIMA(登録商標)−CFR Plus)によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料1μLをMALDI用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液;2,5−ジヒドロキ安息香酸(DHB)の10mg/ml溶液(超純水)を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをMALDI TOF−MS装置のイオン源内に導入して計測した。
まず、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)4mL中にて、100mM N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、100mM N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、50mM Z−QGを、室温(調製した日は18〜22℃程度)で20時間反応させることによって、NHS化Z−QG(50mM)を調製した。一方、50mM 5−(3−aminoallyl)−dUTP(以下、aminoallyl−dUTPと略記、SIGMA社製)を含む10mM Tris−HCl(pH7.5)溶液(Ambion製)16μLと200mM ホウ酸緩衝液(pH8.8)40μL、滅菌水16μLとを混合し、10mM aminoallyl−dUTP溶液を80μL調製した。この溶液に対して、上記で調製したNHS化Z−QG溶液を80μL添加し、25℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で10倍希釈し、HPLC(日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ:TRI ROTAR−V型、バリアブル・ループ・インジェクタ:VL−613型、紫外可視分光検出器:UVIDEC−100−IV型)によって、表2に示す条件で精製を行った。生成物の同定はMALDI TOF−MS(BRUKER DALTONICS製、autoflex III)によって行った。結果を図7に示す。この際、3−ヒドロキシピコリン酸(3−HPA)をマトリックスとして使用した。
遺伝子工学的手法により、N末端にMTGが認識するKを含んだペプチドタグ(MKHK(GGGS)2GS)を導入したNK14−PfuAPを調製した。
表3(下記(1)),表4(下記(2)),表5(下記(3))に示す組成で、以下の溶液を調製した。
(1)dATPと溶媒とを含むdATP含有溶液
dCTPと溶媒とを含むdCTP含有溶液
dGTPと溶媒とを含むdGTP含有溶液
dTTPと溶媒とを含むdTTP含有溶液
Z−QG−dUTPと溶媒とを含むZ−QG−dUTP含有溶液
(2)ATPと溶媒とを含むATP含有溶液
CTPと溶媒とを含むCTP含有溶液
GTPと溶媒とを含むGTP含有溶液
UTPと溶媒とを含むUTP含有溶液
Z−QG−UTPと溶媒とを含むZ−QG−UTP含有溶液
(3)NK14−PfuAPと溶媒とを含むNK14−PfuAP含有溶液
MTGと溶媒とを含むMTG含有溶液
反応バッファ
まず、マウス由来のSonic hedgehog(Shh)をコードする遺伝子中の約300bpをPCR増幅するプライマを設計した。次に、PCR反応液の全dTTPのうちの40%をZ−QG−dUTPに置き換えて反応液を調製してPCRを行うことによって、Z−QG 40%DNAを得た。Z−QG 40%DNAに95℃、5分間の熱変性を施し、Z−QG 40%DNA 25ng/μL、NK14−PfuAP 0.2mg/mL、MTG 5.0Unit/mLの条件で、37℃で3時間反応を行い、Z−QG 40%マルチラベル化核酸プローブを調製した。
Nybond N+(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のプロトコールに準じてメンブランを作製した。アプライ前にDNAを95℃、5分で熱変性した。メンブランを80℃で2時間ベーキングした。
AlkPhos Direct(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、プレハイブリダイゼーション(55℃、1時間)を行った。
AlkPhos Direct(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、ハイブリダイゼーション(55℃、O/N、プローブ濃度10ng/mL)を行った。Wash BufferIでメンブランを洗浄(55℃、10分間×2回)した。Wash BufferIIでメンブランを洗浄(室温、5分間×2回)した。
発光基質をメンブラン上に1mL滴下し、ハイブリバックにくるんでインキュベート(室温、5分間)した。化学発光装置(化学発光装置(BIO RAD社製、ChemiDoc XRS+))にセットし、1時間露光した。発光基質として、Immun−Star(商標) Chemiluminescent Protein Detection Kit(BIO RAD社製)添付の発光基質を用いた。結果を図10(a)に示す。
AlkPhos Direct(商標、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のキットに付随する試薬にて調製したプローブを用いた以外は、実施例1と同様にして評価した。結果を図10(b)に示す。
NK14−PfuAPの濃度を変え、検出を行った。結果を図11に示す。
実施例1と同様にしてZ−QG 40%マルチラベル化核酸プローブを調製し、反応液を以下の手順で精製し、未精製のもの、1回精製したものについて、実施例1と同様にしてハイブリダイゼーション、検出を行った。結果を図12に示す。
MicroSpin S−400 HR Columns(GEヘルスケアバイオサイエンス社製、27−5140−01)の下を折り、フタを開けて、カラムに添付されている2mLチューブにセットして735×gで1分間遠心処理した。カラムを新しい1.5mLチューブにセットし、MTG反応液100μLをゲル上部に置いて735×gで4分間遠心処理した。溶出したマルチラベル化核酸プローブ溶液を4℃で保存した。核酸の溶出量はおよそ50%、未反応のタンパク質の溶出量はおよそ10%未満であった。
1×TEバッファ(pH8.0)にて、SYBR Green II(タカラバイオ社製、F0523)を10,000倍に希釈した。PCRまたはRun−off転写反応により得られた核酸を精製し、0,1,3,10ng/μLの水溶液を10μLずつ調製した。この核酸を熱変性後、SYBR Green II溶液990μLに添加して蛍光強度を測定し(励起波長/蛍光波長:480nm/520nm)、検量線を作成した。SYBR Green II溶液990μLにプローブ精製溶液を10μL添加し、蛍光を測定して検量線から濃度を算出した。タンパク質濃度はBCA法により定量した。
<Ac−PLQMR−dUTPの合成>
まず、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)150μL中にて、50mM N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、50mM N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、25mM Ac−PLQMRを、4℃で16時間反応させることによって、NHS化PLQMR(25mM)を調製した。一方、20mM 5−(3−aminoallyl)−dUTP(aminoallyl−dUTP、SIGMA社製)を含む100mM ホウ酸緩衝液(pH8.8)の溶液100μLに対して、上記で調製したNHS化PLQMR溶液を100μL添加し、25℃で12時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で10倍希釈し、HPLC(日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ:TRI ROTAR−V型、バリアブル・ループ・インジェクタ:VL−613型、紫外可視分光検出器:UVIDEC−100−IV型)によって、表6に示す条件で精製を行った。生成物の同定はMALDI TOF−MS(BRUKER DALTONICS製、autoflex III)によって行った。この際、3−ヒドロキシピコリン酸(3−HPA)をマトリックスとして使用した。
表7に示す組成で、以下の溶液を調製した。
dATPと溶媒とを含むdATP含有溶液
dCTPと溶媒とを含むdCTP含有溶液
dGTPと溶媒とを含むdGTP含有溶液
dTTPと溶媒とを含むdTTP含有溶液
Ac−PLQMR−dUTPと溶媒とを含むAc−PLQMR−dUTP含有溶液
まず、マウス由来のSonic hedgehog(Shh)をコードする遺伝子中の約300bpをPCR増幅するプライマを設計した。次に、PCR反応液の全dTTPのうちの80%をAc−PLQMR−dUTPに置き換えて反応液を調製してPCR(表8参照、94℃×2min+(94℃×20sec,54℃×20sec,72℃×30sec)×40サイクル)を行うことによって、Ac−PLQMR 80%DNAを得た。結果を図16に示す。
Claims (10)
- 下記式(1),(2),(3)または(4)で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、A1およびA2のうち少なくとも1つは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Aは、グルタミン(Gln)残基またはリシン(Lys)残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも1つを含む置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。) - 請求項1に記載の核酸検出用キットであって、
前記式(1)で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が、下記式(5)で示される化合物であることを特徴とする核酸検出用キット。
(式(5)中、XおよびYは、それぞれ独立して、エテニレン基、−(C2H4O)n−または−(C3H6O)n−(ここで、n=2,4,8,12,24)基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキレン基または炭素数2〜48のアルケニレン基であり、Zは、ジニトロフェニル基またはL−3,4−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキル基、炭素数1〜48のアルコキシ基、炭素数6〜48のアリール基、炭素数6〜48のアリールオキシ基、炭素数7〜48のアリールアルキル基または炭素数7〜48のアリールアルキルオキシ基であり、Bは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Y,Zは独立してLys以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。) - 請求項2に記載の核酸検出用キットであって、
前記Xはエテニレン基、Yはメチレン基であり、Zはベンジルオキシ基であることを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項1に記載の核酸検出用キットであって、
前記グルタミン(Gln)残基は、FYPLQMR、YPLQMR、PLQMR、FYPLQMG、YPLQMG、YPLQM、PLQMG、FYPLQG、YPLQGまたはPLQGのアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸検出用キットであって、
トランスグルタミナーゼ(TGase)を含むことを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項1〜5いずれか1項に記載の核酸検出用キットであって、
リシン(Lys)残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン(Gln)残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも1つである標識部分を含む標識化合物を含むことを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項6に記載の核酸検出用キットであって、
前記リシン(Lys)残基が、MTGに認識されるアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項6または7に記載の核酸検出用キットであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも1つであることを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項6〜8のいずれか1項に記載の核酸検出用キットであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする核酸検出用キット。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸検出用キットであって、
前記Bが水素原子の場合には、dATP、dCTP、dGTP、dTTPのうち少なくとも1つ、前記Bがヒドロキシル基の場合には、ATP、CTP、GTP、UTPのうち少なくとも1つを含むことを特徴とする核酸検出用キット。
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