JP2002507203A

JP2002507203A - ヌクレオシドおよびヌクレオチド標識のための非スルホン化シアニン色素

Info

Publication number: JP2002507203A
Application number: JP50473699A
Authority: JP
Inventors: ブラッシュ，チャールズ・ケイ; ライマー，ネッド・ディ
Original assignee: アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 2002-03-05
Also published as: EP0989990B1; WO1998058942A1; EP0989990A1; US5986086A; DE69815342T2; ATE242260T1; DE69815342D1; CA2294979A1

Abstract

(57)【要約】式：〔式中、Ｒ¹はアルキル、アラルキルおよび置換アルキルからなる群から選択される；Ｒ³はＨ、ＰＯ₃ ^-2；Ｐ₂Ｏ₆ ^-3；Ｐ₃Ｏ₉ ^-4、およびα−チオホスフェート(ＰＯ₂ ^-2、Ｐ₂Ｏ₅ ^-3およびＰ₃Ｏ₈ ^-4)；およびαＢＨ₃ ^-ホスフェート(Ｐ(ＢＨ₃)Ｏ₂ ^-2、Ｐ₂(ＢＨ₃)Ｏ₅ ^-3およびＰ₃(ＢＨ₃)Ｏ₈ ^-4)からなる群から選択される：Ｒ⁴はＨ、低級アルキル、アシル、(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)および５,６；６,７；または７,８−ブタジエニルからなる群から選択される；Ｒ⁵はＨ、低級アルキル、アシル、(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)および５,６；６,７；または７,８−ブタジエニルからなる群から選択される；ｒは１、２または３；ＸおよびＹはＯ、Ｓ、Ｃ(Ｒ⁶)₂、Ｎ(Ｒ⁶)(式中、Ｒ⁵は好ましくはＣＨ₃または低級アルキル)である；およびＲ³−Ｏ−Sugar−Baseはヌクレオチドまたはヌクレオシドである。〕の化学化合物が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオシドおよびヌクレオチド標識のための非スルホン化シアニン色素発明の背景シアニン色素は、主に写真の目的で、長年文献に記載されている^1,2。近年、研究者は生物分子を標識するためのカルボシアニンの優れた蛍光特性を利用している。最初の試みは、色素をタンパク質と結合させたときに観察される高いバックグラウンドおよび／または蛍光の消失により妨害された。色素の疎水性性質が、それらを水性媒体中で、またはタンパク質の疎水性ドメイン上で凝集させた。従って、以前の文献に記載されたように色素は標識には適していなかった。 Waggoner，et al.^3.4は、生物分子の標識のためのカルボシアニンのスルホン化誘導体の使用を記載した。スルホネート基は、分子間の陰性電荷の反発のために、凝集の防止に有効であることが発見された。引用されたWaggoner文献のいくつかで、核酸に包含される、新規で有効な色素誘導体のためのスルホネート基の重要性が強調された。 US5,556,959は、合成オリゴヌクレオチドの標識へのカルボシアニンアミド亜リン酸の使用を記載する。DNA合成で使用される自動化システムの制約のため、アミデート(amidites)は非プロトン性有機溶媒に可溶性でなければならない。スルホン化カルボシアニンは、オリゴヌクレオチド合成に最も適した溶媒に不溶性である。従って、US5,556,959に記載の色素アミデートは、スルホネート基を欠いた。実験は、アミデートがアセトニトリルおよびジクロロメタンのような適当な溶媒に可溶性であり、高収率でオリゴヌクレオチドを標識することを示した。色素アミデートおよび中間体は合成および精製が容易であり、効率的である。レポーター基で標識されたヌクレオシド三リン酸(NTP)が、長年使用されている^5,6。スルホン化カルボシアニンで標識されたNTPは、科学文献に報告され^7a、商品として入手可能である^7b。しかし、スルホン化シアニンの合成は困難な方法であり、標識に使用する色素中間体の純度は変わりやすい。推奨される貯蔵寿命は短い。標識のための試薬は従って、それ由来の標識NTPもそうであるように、高価である。分子生物学の分野での必要性は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合する非スルホン化シアニン色素である。発明の要約本発明は、以下の式：〔式中、Ｒ¹はアルキル、アラルキルおよび置換アルキルからなる群から選択される。好ましいＲ¹置換基は、ＯＲ²、ＣＯＯＲ²、ＮＲ²Ｒ²、ＳＲ²、最も好ましくは、Ｒ²はＨ、除去可能な保護基、または低級アルキル基であるが、これらに限定されない。Ｒ³はＨ、ＰＯ₃ ^-2；Ｐ₂Ｏ₆ ^-3；Ｐ₃Ｏ₉ ^-4、ＰＳＯ₂ ^-2；Ｐ₂ＳＯ₅ ^- ³ ；Ｐ₃ＳＯ₆ ^-4のようなα−チオホスフェート、およびＰ(ＢＨ₃)Ｏ₂ ^-2、Ｐ₂(ＢＨ₃)Ｏ₅ ^-3、Ｐ₃(ＢＨ₃)Ｏ₈ ^-4のようなαＢＨ₃ ^-ホスフェート。Ｒ⁴はＨ、低級アルキル、アシルおよび(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)からなる群から選択される。Ｒ⁵はＨ、低級アルキル、アシルおよび(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)からなる群から選択される。Ｒ⁴またはＲ⁵はまた５,６；６ ,７；または７,８−ブタジエニルでもあり得る(従って、第２の融合芳香族環を形成する)。ｒは１、２または３ならびにＸおよびＹはＯ、Ｓ、Ｃ(Ｒ⁶)₂、Ｎ(Ｒ⁶ )(式中、Ｒ⁶は好ましくはＣＨ₃または低級アルキル)である。Ｒ³−Ｏ−Sugar− Baseはヌクレオチドまたはヌクレオシドである。〕の化学化合物である。非スルホン化シアニン色素に結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの提供が本発明の目的である。蛍光標識に結合したヌクレオシドまたはヌクレオチドの提供が本発明の更なる目的である。本発明の他の目的、利点および性質は、本発明の明細書、請求の範囲および図面の吟味の後に明らかになるであろう。図面の幾つかの観点の簡単な記載図１は、アミデート合成中間体から出発するシアニン色素−結合ヌクレオシドの合成の模式図である。図２は、シアニン色素−結合ヌクレオチドの合成の模式図である。図３はインドジカルボシアニン(IDC)−dCTPの図である。図４は別のリンカーの図である。図５は本発明の一般式の図である。発明の詳細な説明本発明は、一般式の化学化合物である。Ｒ¹はアルキル、アラルキルおよび置換アルキル鎖からなる群から選択される。好ましくは、本置換基は、ＯＲ²、ＣＯＯＲ²、ＮＲ²Ｒ²、ＳＲ²、ここで、Ｒ² は好ましくは、Ｈ、トリチルまたはアセチルのような除去可能な保護基、または低級アルキル基(ｎ＝１−４)である。以下の実施例で、我々は、Ｒが(ＣＨ₂)₃ＯＨである化合物を記載する。他の好ましいＲ基は、(ＣＨ₂)₅ＣＯＯＨ、(ＣＨ₂)₃ ＮＨ₂およびＣ₂Ｈ₅である。Ｒ³はＨ、ＰＯ₃ ^-2、Ｐ₂Ｏ₆ ^-3、Ｐ₃Ｏ₉ ^-4、ＰＳＯ₂ ^-2、Ｐ₂ＳＯ₅ ^-3、Ｐ₃ＳＯ₈ ^- ⁴ のようなα−チオホスフェート、およびＰ(ＢＨ₃)Ｏ₂ ^-2、Ｐ₂(ＢＨ₃)Ｏ₅ ^-3またはＰ₃(ＢＨ₃)Ｏ₈ ^-4のようなαＢＨ₃ ^-ホスフェートのいずれかである。Ｒ⁴はＨ、低級アルキル、アシルおよび(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)からなる群から選択される。Ｒ⁵ はＨ、低級アルキル、アシルおよび(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)からなる群から選択される。Ｒ⁴またはＲ⁵はまた５,６；６,７；または７,８−ブタジエニルでもあり得る(従って、第２の融合芳香族環を形成する)。ｒは１、２または３ならびにＸおよびＹはＯ、Ｓ、Ｃ(Ｒ⁶)₂、ＮＲ⁶(式中、Ｒ⁶は好ましくはＣＨ₃またはＣＨ₂ＣＨ₃のような低級アルキル(ｎ＝１−４))である。ブタジエニル化合物は、BrushおよびAndersonにより１９９７年２月１０日に出願された08/799,593に記載され、これは引用して本明細書に包含させる。 “リンカー”は、Ｎ１を経由して塩基上の位置に色素を結合させる鎖の炭素、酸素、窒素および／または硫黄原子の組合わせである。リンカーは、アミド、エステル、ウレア、チオウレア、アミン、エーテル、スルフィドまたはジスルフィド結合を含み得る。塩基上の位置は、ウラシルのＣ⁵またはＣ⁶、チミンのＣ⁶、シトシンのＮ⁴、Ｃ⁵、またはＣ⁶、グアニンのＮ²、Ｎ⁷またはＣ⁸、７−デアザグアニンのＮ²、Ｃ⁷またはＣ⁸、ヒポキサンチンのＣ⁸、７−デアザヒポキサンチンのＣ⁷またはＣ⁸、アデニンのＮ⁶またはＣ⁸、もしくは７−デアザアデニンのＮ⁶ 、Ｃ⁷またはＣ⁸である。好ましいリンカーは、下記実施例(例えば、プロピル− Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−ヘキシル、プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯ、プロピル−Ｏ₂Ｃ −エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシルおよびプロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−プロピニル)および図４に記載する。好ましいリンカーは、３から２５原子の長さである。塩基、糖およびＲ³は合わさって、当業者に既知のヌクレオチドおよびヌクレオシドを形成する。 “塩基”は、ウラシル、チミン、シトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、または７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンまたは引用文献８およびその中の引用文献に記載のものような他の窒素−ヘテロ環式塩基であり得る。 “糖”は、リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシルまたは２',３'−ジデオキシリボシルまたは２'−オキサブチルであり得、糖は好ましくはピリミジンにＮ１で、プリンおよびデアザプリンにＮ９で結合している。 “Ｒ³−Ｏ−Sugar−Base”は、Ｒ³基が好ましくは糖の５'酸素に結合していることを示す。２−オキサブチル“糖”の場合、５'酸素はなく、Ｒ³基は４'酸素に結合する。下記の実施例は本発明の化合物の好ましい合成法を記載する。一般に、本化合物の合成は下記の通りである：芳香族４級アンモニウム塩を、２−メチルインドレニン、ベンズオキサゾールまたはベンゾチアゾールもしくは関連ベンゾ誘導体のアルキル化により合成する。アルキル化剤は、更に誘導体化し得る(保護)官能基を含む。得られる４級塩の二つの分子を、保護不飽和ジアルデヒドの一つの分子と縮合し、対称シアニンを製造する。あるいは、一つの分子を、不飽和ジアルデヒドのジアニルと縮合する。生産物を、次いで、異なる芳香族４級アンモニウム塩と縮合し、非対称シアニンを得る。アルキル化剤の官能基を、次いで(必要であれば)脱保護し、誘導体化して、ヌクレオシド三リン酸の基と反応できる活性基を製造する。これを達成するために適合できる多くの方法が当分野で既知である。本発明はまた核酸の標識法でもある。好ましくは、上記の化合物を他のヌクレオチドに挿入させるのと同じ方法で、核酸鎖に挿入する。本発明の最も好ましい形において、次いで、標識核酸分子の核酸配列を決定できる。実施例一般下記の反応スキームは、一般に、本方法により製造される数個の化合物に関する。“NTP”は、リンカーおよび色素にアミノ基を介して結合したヌクレオシド、またはヌクレオシド一、二または三リン酸を意味する。全ての合成例は、製造するのがもっとも困難であるが、最も有用でもある化合物のため、三リン酸である。以下の略語を使用する：図２に記載する方法で製造する化合物は： IDC-rCTP IDC-dCTP IDC-ddCTP ITC-ddCTP ITC-ddATP IDC-dATP IMC-c7-ddGTP OMC-ddCTP IMC-ddCTP を含む。可視スペクトルを使用した研究は、疎水性色素が水性溶液中で凝集するかを測定するために行った。大きいほど波長ショルダーが短く、より凝集が起こっている。最も疎水性の色素−ヌクレオシド接合体の一つであるインドトリカルボシアニン−ddATPの濃度は、０.６から８０μMの範囲で変化させた。７４４nm：６８２nmの比を観察した(ITCスペクトルのショルダーで、最大波長から短い波長)。変化は、全範囲で±５％であり、Ａ₇₄₄＝０.５７８：Ａ₆₈₂＝０.２０２の平均吸収の比と同程度であり、凝集があったとしても非常に小さいことを示す。実験法実施例１ (図５、ｒ＝２、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−ヘキシル)−塩基；糖＝デオキシリボシル；塩基＝アデニン−Ｎ⁶) １−３"−(Ｎ⁶−ヘキシルデオキシアデノシン,５'−Ｏ−トリホスフェート)−プロピル)ホスフェート)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'− テトラメチル−インドジカルボシアニン (β−シアノエチル) (１−(３'"−(１'"−プロピル))−１'−(３"−(１"−(ｐ−メトキシトリチル)オキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニン)(６ −Ｎ−トリフルオロアセチルアミノヘキシル)ホスフェート対応するアミデート(１.１３ｇ、０.００１４５mol)の製造のために、モノMMT r中間体を６−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノヘキシル−β−シアノエチル− Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスホロアミデート(１.４ｇ、０.００６５mol) および０.４g(０.００５６mol)のテトラゾール(２mLの乾燥アセトニトリル中)の７mLの乾燥ジクロロメタン溶液で処理した。反応物を一晩撹拌し、次いで、ピリジン、水およびコリジン混合物中の１０mLの０.３５Ｍヨウ素で処理した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水性炭酸水素塩および食塩水で抽出した。溶液を乾燥させ、蒸発させて完全に保護されたホスホトリエステルとした。 (１−(３'"−(１'"−プロピル)−１'−(３"−オキシプロピル))−３,３,３',３' −テトラメチル−インドジカルボシアニン)(６−アミノヘキシル)ホスフェートトリエステルを５０mLのエタノールに溶解し、それに１５０mLの３：１濃アンモニア／エタノールを添加した。２時間、６０℃の後、TFAおよびシアノエチル保護基を除去した。溶媒を蒸発させ、残渣を５０mLの７％トリクロロ酢酸に１時間溶解させた。反応混合物を水性炭酸水素塩で抽出することにより中和し、乾燥させ、蒸発させた。残渣をC-18 NovaPakカラムクロマトグラフィーで、酢酸トリエチルアンモニウム中の４０−１００％アセトニトリルの１５分にわたる勾配で精製した、０.１Ｍ、pH７.０、Ｒ_f＝７.８分。この単離物質は、予期されたUV／可視スペクトル、λ＝６４８nmを有した。 (１−(３'"−(１'"−プロピル)−１'−(３"−オキシプロピル))−３,３,３',３' −テトラメチル−インドジカルボシアニン)(６−アミノヘキシルＮ⁶−デオキシアデノシン、５'−Ｏ−トリホスフェート)ホスフェート上記のアミノヘキシル−誘導体化色素を５００μLの０.１Ｍホウ酸ナトリウム、pH９.２に溶解した。これに、６−クロロプリン−９−(１'−β−デオキシリボシド−５'−Ｏ−トリホスフェート)を添加した。反応物を一晩６０℃で撹拌し、その後、HPLC(C-18、０−７０％アセトニトリル／TEAA)分析が、本生産物の高い割合を示した。主ピークをprep C-18 HPLC、１０−５０％アセトニトリル／０ .０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２の４０分にわたる勾配で単離した。これを２回、prep C-18 HPLC、１５−４０％アセトニトリル／０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２の４０分にわたる勾配で、＞９９％の純度まで再精製した。生産物をC-18カートリッジで脱塩し、水性溶液中に貯蔵した。UV／可視スペクトルは、色素に関して６４８nmのおよびＮ⁶−誘導体化アデニンに関して２６８nmの予期されたピークを示した。本物質は、商品として得たCy5-29^TM−Osu(NHSエステル)とＮ⁶−アミノヘキシル−dATPの反応により製造したCy5-29^TM-dATPと同等であった。UV／可視スペクトルは同一であり、ALFexpress(Pharmacia Biotech)で得た自動配列決定結果は同一であった。配列決定結果は、本明細書に記載の非スルホン化物質と二つのスルホネート基を担持するCy5-29^TM-標識物質の反応に差がないことを証明した。実施例２ (図５、ｒ＝２、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯ −)−塩基；糖＝デオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−(Ｎ⁴−６−アミドヘキシルデオキシシチジン−５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３ ,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニン(図３参照) (１−３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３"−(１"−(ｐ−メトキシトリチル)オキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニン) アミデート(１ｇ、０.００１２８mol)製造のためのモノMMTr中間体を１０mLのピリジンに溶解し、０.３８４ｇ(０.００４mol)のコハク酸無水物および０.１１ｇの４−ジメチルアミノピリジン(０.００５８mol)で処理した。反応物を４時間環境温度で撹拌した。進行を、３μmカラムのC-18 HPLCで、８０％アセトニトリル／TEAA、アイソクラチック、６４８nmで検出で追跡した。１mLの水の添加後、反応物を蒸発乾燥させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、水性炭酸水素塩および食塩水で抽出した。乾燥後、有機層を蒸発乾燥させた。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニン) 先の反応からの物質を３０mLの８０％酢酸水溶液に溶解した。５時間、環境温度の後、脱トリチル化が完了し、コハク酸エステルの加水分解はなかった。進行を、３μmカラムのC-18 HPLCで、５０％アセトニトリル／TEAA、アイソクラチックで１分、次いで、１００％アセトニトリルで１０分追跡し、６４８nmで検出した。溶液を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、水性炭酸水素塩で３回および食塩水で抽出した。溶液を乾燥させ、蒸発させて青色粉末とした。 (１−(３'"−プロピルオキシコハク酸,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル) )−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル− インドジカルボシアニン) 乾燥固体を１０mLの乾燥ジクロロメタン、続いて０.５mLのピリジンおよび０. ８１ｇ(−３等量)のＯ−トリフルオロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに溶解した。３μmカラムのC-18 HPLCで、５０％アセトニトリル／TEAA、アイソクラチックで１分、次いで、１００％アセトニトリルで１０分追跡し、６４８nm で検出した反応は、５分で完了した。ジクロロメタンを３０mLまで添加し、溶液を水で３回抽出し、乾燥させ、蒸発させた。１−３"−(Ｎ⁴−６−アミドヘキシルデオキシシチジン−５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３ ,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニンＮ⁴−(６−アミノヘキシル)-dCTPを０.３mLの０.１Ｍ炭酸ナトリウム、pH９. ４に溶解した。これに、２００μＬのDMF、続いて１０mgのアミノリンカー色素を含む１００μＬのDMFを添加した。pHを９.４に再調節した。反応物を１.５時間、環境温度で撹拌し、その時にアニオン交換HPLC(３０分にわたり、Ａ中５− ５０％Ｂ；Ａ＝０.００５Ｍリン酸ナトリウム、pH７.５と２０％アセトニトリル；Ｂ＝Ａ＋１Ｍ NaCl)分析は、〜６分で生産物の高い割合を示した。主ピークをC-18 HPLC、２分５％、次いで５−６０％アセトニトリル／０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２の４０分にわたる勾配で再精製した。これを２回、prep C- 18HPLCで、１５−４０％アセトニトリル／０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７. ２の４０分にわたる勾配で＞９９％の純度まで再精製した。生産物をC-18カートリッジで脱塩し、水性溶液中で貯蔵した。UV／可視スペクトルは、色素に関して６４８nmのおよびＮ⁴−誘導体化シトシンに関して２７６nmの予期されたピークを示した。本物質は、商品として得たCy5-29^TM−OSu(NHSエステル)とＮ⁴−アミノヘキシル−dCTPの反応により製造したCy5-29^TM-dCTPと同等であった。UV／可視スペクトルは同一であり、ALFexpress(Pharmacia Biotech)で得た自動配列決定結果は同一であった。配列決定結果は、本明細書に記載の非スルホン化物質と二つのスルホネート基を担持するCy5-29^TM-標識物質の反応に差がないことを証明した。実施例３ (図５、ｒ＝２、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂）₃ＯＨ、Ｒ³＝５'−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝リボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシルシチジン,５'−Ｏ−トリホスフェート)− スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３' ,３'−テトラメチル−インドジカルボシアニンジアミノヘキサンとCTPの亜硫酸水素塩触媒で製造したＮ⁴−(６−アミノヘキシル)−CTP(10mg)を２００μL炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５に溶解した。１０ mgのインドジカルボシアニン−NHSエステル(図２参照、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、ｒ＝２ )を５０μLのDMPに添加した。pHを９.５に調節し、反応を２時間進行させた。生産物をNovaPak C18 HPLC(Ａ＝０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.５、Ｂ＝アセトニトリル：５％Ｂ、２分、５−６０％Ｂ、３０分)で単離した。適当なピークをプールし、C-18カートリッジで脱塩した。UV／可視スペクトルは、色素に関して６４６nmのおよびＮ⁴−誘導体化シトシンに関して２７６nmの予期されたピークを示した。実施例４ (図５、ｒ＝２、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシシチジン，５'−Ｏ −トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニンジアミノヘキサンと２',３'−ジデオキシ−CTPの亜硫酸水素塩触媒で製造したＮ⁴−(６−アミノヘキシル)−CTP(１４μmol)を１０００μLの０.０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５に溶解した。これに、８mgのインドジカルボシアニン −NHSエステル(図２参照、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、ｒ＝２)の１５０μLのDMPの溶液および１５０μLの水を添加した。pHを９.３に調節し、反応を１時間進行させた。生産物をNovaPak C18 HPLC(Ａ＝０.００５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２、Ｂ＝アセトニトリル：０％Ｂから７０％Ｂ、４０分)で単離した。適当なピークをプールし、C-18カートリッジで脱塩した。UV／可視スペクトルは、色素に関して６４６nmのおよびＮ⁴−誘導体化シトシンに関して２７６nmの予期されたピークを示した。収率：HPLC分析で、５９％の物質が６４６nmで吸収された。物質は、標準配列決定アッセイでDNAポリメラーゼにより包含され、鎖伸張を停止させた。実施例５ (図５、ｒ＝３、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシシチジン,５'−Ｏ −トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドジカルボシアニン１,１"−ビス−(３"−(１−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドトリカルボシアニン) １−((３'−(１'−アセトキシプロピル))−２,３,３−トリメチル−(３Ｈ)− インドリニウムヨージド(２ｇ)および０.７１ｇのグルタコンジアルデヒドジアニルを４０mLの酢酸無水物、１０mL酢酸および１ｇの酢酸カリウムの混合物に溶解した。溶液を２０分還流し、その時、Ａ₇₄₀対Ａ₂₈₀の比は反応が完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、３回水性炭酸水素塩でおよび１回食塩水で抽出し、蒸発させた。残渣を１００mLのメタノールに溶解し、１００mLの４Ｍ HClを添加した。反応物を環境温度で一晩撹拌し、酢酸エステルの加水分解を完了させた。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、３回水性炭酸水素塩および１回食塩水で抽出し、蒸発させた。HPLCは、ジアセチルと比べて、標題化合物への変換を確認した。UV／可視：λ_max＝７４４n m最大。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチルインドトリカルボシアニン) １,１"−ビス−(３"−(１−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドトリカルボシアニン)(０.５ｇ)を２回乾燥ピリジンと共蒸発させ、１０mLのピリジンに溶解し、６５ｍｇ(１等量)のコハク酸無水物および０.０５５ｇの４−ジメチルアミノピリジンで処理した。反応物を４時間、環境温度で撹拌させた。進行を、４μmカラムのC-18 HPLCで、６０％アセトニトリル/TEAA、アイソクラチックで追跡した。１mLの水の添加後、反応物を蒸発乾燥させた。残渣を１０mLジクロロメタンに溶解し、水で抽出し、乾燥させた。乾燥後、有機層を蒸発乾燥させた。残渣を１Ｍ TEAA、pH７中の１０％アセトニトリルに溶解し、 NovaPak C18カートリッジのprep HPLCで、０−７０％アセトニトリル／０.１Ｍ TEAA、pH７の勾配で精製した。収量：３０mg。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル))−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル)−３,３,３',３'−テトラメチルインドトリカルボシアニン) (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドトリカルボシアニン)を、２回ジクロロメタンとの共蒸発により乾燥させ、次いで、１mLの乾燥ジクロロメタンおよび０.０５mLのピリジンに溶解させた。Ｏ−トリフルオロアセチル−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド(０.０２５ｇ)を添加し、次いで、反応物を撹拌した。４μmカラムのC-18 HPCLで、０−７５％アセトニトリル／TEAA、pH７で追跡して、６４８nmで検出して、反応は５分で完了した。ジクロロメタンを３０mLまで添加し、溶液を３回水で抽出し、乾燥させ、蒸発させた。 UV／可視：λ_max＝７４４nm；収量：８０％純度で３４mg。１−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシシチジン,５'−Ｏ −トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドトリカルボシアニンジアミノヘキサンと２',３'−ジデオキシ−CTPの亜硫酸水素塩触媒で製造したＮ⁴−(６−アミノヘキシル)−ddCTP(６mg、１０μmol)を７００μLの０.０７Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５に溶解した。これに、５mgのインドトリカルボシアニン−NHSエステル(図２参照、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、ｒ＝３)の１００μLのDMF の溶液および１００μLの水を添加した。pHを９.３に調節し、反応を４５分進行させた。生産物をNovaPak C18 HPLC(Ａ＝０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７. ２、Ｂ＝アセトニトリル：０％Ｂから７０％Ｂ、４０分)で単離した。適当なピークをプールし、C-18カートリッジで脱塩した。UV／可視スペクトルは、色素に関して７４４nmのおよびＮ⁴−誘導体化シトシンに関して２７４nmの予期されたピークを示した。収量：１.５μmol。物質は、標準配列決定アッセイでDNAポリメラーゼにより包含され、鎖伸張を停止させた。実施例６ (図５、ｒ＝３、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝デオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシル−２'−デオキシシチジン,５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチルインドトリカルボシアニンジアミノヘキサンと２'−デオキシ−CTPの亜硫酸水素塩触媒で製造したＮ⁴−( ６−アミノヘキシル)−dCTP(１mg)を１０００μLの０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５に溶解した。これに、１mgのインドトリカルボシアニン−NHSエステル(図２参照、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、ｒ＝３)の５０μLのDMPの溶液および５０μLの水を添加した。pHを９.３に調節し、反応を４５分進行させた。生産物をNovaPak C18 HPLC(Ａ＝０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２、Ｂ＝アセトニトリル：０％Ｂから７０％Ｂ、４０分)で単離した。適当なピークをプールし、C-18カートリッジで脱塩した。UV／可視スペクトルは、色素に関して７４４nmのおよびＮ⁴ −誘導体化シトシンに関して２７４nmの予期されたピークを示した。収率：HPL C分析で、５０％の物質が７４４nmで吸収された。実施例７ (図５、ｒ＝３、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝アデニン−Ｎ⁶) １−３"−((Ｎ⁶−６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシアデノシン,５'− Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドトリカルボシアニンジアミノヘキサンと６−クロロプリン−２',３'−ジデオキシリボシド−５'− Ｏ−トリホスフェートの反応で製造したＮ⁶−(６−アミノヘキシル)−ddATP(１０μmol)を５００μLの０.０８Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５に溶解した。これに、３mgのインドトリカルボシアニン−NHSエステル(図２参照、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、ｒ＝３)の７５μLのDMPの溶液および７５μLの水を添加した。pHを９.３に調節し、反応を２時間進行させた。生産物をNovaPak C18 HPLC(Ａ＝０.０５Ｍリン酸アンモニウム、pH７.２、Ｂ＝アセトニトリル：０％Ｂから７０％Ｂ、４０分)で単離した。適当なピークをプールし、アセトニトリルを蒸発させ、生産物をリン酸アンモニウム溶液に貯蔵した。UV／可視スペクトルは、色素に関して７４６nmのおよびＮ⁶−置換アデニンに関して２７１nmの予期されたピークを示した。収量：４８nmol。実施例８ (図５、ｒ＝１、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−プロピニル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝７−デアザグアニン−Ｃ⁷) １−３"−((７−(３−アミドプロピニル−２',３'−ジデオキシ−７−デアザグアノシン,５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−( ３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドモノカルボシアニン１−３'"−((１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３"−(１"−(ｐ−メトキシトリチル)オキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドモノカルボシアニン) IMCアミデート(０.２ｇ)の製造由来のモノMMTr中間体を乾燥ピリジンと二回共蒸発させ、２mLのピリジンに溶解し、０.０７７ｇのコハク酸無水物および０.０２２ｇの４−ジメチルアミノピリジンで処理した。反応物を２時間環境温度で撹拌した。進行を３μmカラムのC-18 HPLCで、６０％アセトニトリル／TEAA、アイソクラチックで追跡した。０.２mLの水の添加後、反応物を蒸発乾燥させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、水性炭酸水素塩および食塩水で抽出した。乾燥後、有機層を蒸発乾燥させた。UV／可視：λ_max＝５５０ｎｍ。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸)−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドモノカルボシアニン) 先の反応からの物質を１０mLの８０％酢酸水溶液に溶解した。３時間、環境温度の後、脱トリチル化が完了し、コハク酸エステルの加水分解はなかった。進行をC-18 HPLCで追跡した。溶液を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、水性炭酸水素塩で３回および食塩水で抽出した。溶液を乾燥させ、蒸発させた。収量：１３０mg。UV／可視：λ_max＝５５０nm。 (１−(３'"−プロピルオキシコハク酸,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル) )−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル− インドモノカルボシアニン) 乾燥固体を乾燥ピリジンと２回共蒸発させ、２mLのジクロロメタン、続いて０ .２ｇ(−３等量)のＯ−トリフルオロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに溶解した。C-18 HPLCで追跡して、反応は５分で完了した。ジクロロメタンを添加し、溶液を水で３回抽出し、乾燥させ、蒸発させた。HPLC分析(０.１Ｍ TE AA中１０−９０％アセトニトリル、ｐＨ７)は、物質が約８５％純粋であることを示した。収量：１８０mg。UV／可視：λ_max＝５５０nm。１−３"−((７−(３−アミドプロピニル−２',３'−ジデオキシ−７−デアザグアノシン,５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−( ３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドモノカルボシアニン NEN/DuPontから得た７−(３−アミノプロピニル)-７−デアザ−２',３'−ddGT P(０.２５μmol)を０.１Ｍ水性炭酸緩衝液、pH９.５に溶解した。(１−３'"−( １'"−プロピルオキシコハク酸,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル))−１' −(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチルインドモノカルボシアニン)(１mg)を、各々５０μｌのDMFおよび水に添加した。pHを９. ２に調節した。１時間後、ＮａＨ₂ＰＯ₄のpH６.７までの添加により反応を停止させた。生産物を、C-18 HPLCでアセトニトリルおよびリン酸アンモニウム、pH ６で精製した。適当なピークをプールし、アセトニトリルを蒸発させ、生産物をリン酸アンモニウム溶液に貯蔵した。収量：２９nmol。UV／可視：λ_max＝５５０nm。実施例９ (図５、ｒ＝１、Ｘ＝Ｃ(ＣＨ₃)₂、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５ '−Ｏ−トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−(６−アミドヘキシル−２'−デオキシシチジン,５'−Ｏ−トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチル−インドモノカルボシアニンジアミノヘキサンと２'−デオキシ−CTPの亜硫酸水素塩触媒で製造したＮ⁴−( ６−アミノヘキシル)−dCTP(１mg)を０.１Ｍ水性炭酸緩衝液、pH９.５に溶解した。(１−(３−(１'"−プロピルオキシコハク酸,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル))−１'−(３"−(１"−ヒドロキシプロピル))−３,３,３',３'−テトラメチルインドモノカルボシアニン)(１mg)を、各々５０μｌのDMFおよび水に添加した。pHを９.２に調節した。１時間後、生産物の存在を、同様の化合物との比較によりHPLCで確認した。UV／可視：λ_max＝５５０nm。実施例１０ (図５、ｒ＝１、Ｘ＝Ｏ、Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ、Ｒ＝(ＣＨ₂)₃ＯＨ、Ｒ³＝５'−Ｏ− トリホスフェート、リンカー＝色素−(プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシル)−塩基；糖＝ジデオキシリボシル；塩基＝シトシン−Ｎ⁴) １−３"−((Ｎ⁴−(６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシシチジン,５'−Ｏ −トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニン１−((３'−(１'−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾリウムヨージド２−メチルベンズオキサゾール(７.０ｇ、０.０５３mol)および１３.２ｇ(０. ０３mol)の酢酸３−ヨードプロピルを共に１００−１１０℃に１６時間加温した。混合物を酢酸エチル中での粉砕により顆粒状粉末に結晶化させた。それを濾過し、エーテルで洗浄することにより乾燥させた。収量：１５.１g。１,１"−ビス−(３"−(１−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニン１−((３'−(１'−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾリウムヨージド(５ｇ、０.０１４mol)および４.５ｇのトリエチルオルトホルメートを１００mLの乾燥ピリジンに溶解した。溶液を３時間還流した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルから結晶化させた。収量：４.９ｇ。UV／可視：λ_max＝４８４nm。 (１−(３"−(１"−アセトキシプロピル)−１"−(３'"−(１'"−ヒドロキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニン１−((３'−(１'−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾリウムヨージド(１ｇ)を、２０mLの４Ｎ HClと２０mLのメタノールの混合物中、１時間撹拌し、次いで回転蒸発(rotovaped)し、乾燥させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水を３回ジクロロメタンで逆抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ、蒸発させた。物質を、１０−６５％アセトニトリル／TEAA勾配を使用して、２５×２００mm NovapakカートリッジでC18 prep HPLCで精製した。モノ−アセチル誘導体に富むフラクションをプールし、蒸発乾燥させた。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸))−１'−(３'"−(１'"−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニンモノ−アセチル誘導体(１７５mg)を、３回乾燥アセトニトリルとの共蒸発により乾燥させ、１mLの乾燥ピリジンに溶解した。コハク酸無水物およびDMAPを添加し、反応を２時間進行させた。反応を１mLの水で停止させ、生産物を、０−８０％アセトニトリル／TEAA勾配を使用して、２５×１００mm NovapakカートリッジでC18 prep HPLCで精製した。収量：２２mg。 (１−(３'"−(１'"−プロピルオキシコハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル))−１'−(３'"−(１'"−アセトキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニンスクシネート誘導体(２２mg)を、２回乾燥ピリジンとの共蒸発により乾燥させ、５０μLの乾燥ピリジンを含む1mLのジクロロメタンに溶解した。Ｏ−トリフルオロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(１００mg)を添加した。５分後、反応を５mLのジクロロメタンで希釈し、２回水で抽出した。ジクロロメタンを乾燥および蒸発させ、２０mgの活性化エステルを得た。１−３"−((Ｎ⁴−６−アミドヘキシル−２',３'−ジデオキシシチジン，５'−Ｏ −トリホスフェート)−スクシノイルオキシプロピル)−１'−(３'"−ヒドロキシプロピル))−ベンズオキサゾールモノカルボシアニン活性化エステル(２mg)を２００μLの５０％DMF／水に溶解し、４μmolの６− アミノヘキシル−ddCTPの５００μL ０.１Ｍ炭酸緩衝液、pH９の溶液を添加した。４５分後、反応を終了させた。生産物をC18 HPLC(３.９×１５０mm Novapak 、０−７５％アセトニトリル／リン酸アンモニウム、ｐＨ６)で精製した。収率：５８４nmol。UV／可視４８４、２７２nm。本物質は、標準配列決定アッセイでDNAポリメラーゼにより包含され、鎖伸張を停止させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ライマー，ネッド・ディアメリカ合衆国53219ウィスコンシン州ウエスト・アリス、サウス・セブンティフィフス・ストリート2685番

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の式の化学化合物：〔式中、Ｒ¹はアルキル、アラルキルおよび置換アルキルからなる群から選択される；Ｒ³はＨ、ＰＯ₃ ^-2；Ｐ₂Ｏ₆ ^-3；Ｐ₃Ｏ₉ ^-4、α−チオホスフェート；およびαＢＨ₃ ^-ホスフェートからなる群から選択される：Ｒ⁴はＨ、低級アルキル、アシル、(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)および５,６；６,７；または７,８− ブタジエニルからなる群から選択される；Ｒ⁵はＨ、低級アルキル、アシル、(ＣＨ₂)_pＣＯＯ(ＣＨ₂)_qＣＨ₃(式中、ｐは０から４の整数およびｑは０から４の整数)および５,６；６,７；または７,８− ブタジエニルからなる群から選択される；ｒは１、２または３；ＸおよびＹはＯ、Ｓ、Ｃ(Ｒ⁶)₂、Ｎ(Ｒ⁶)(式中、Ｒ⁶はＣＨ₃または低級アルキル)である；およびＲ³−Ｏ−Sugar−Baseはヌクレオチドまたはヌクレオシドである。〕２．Ｒが置換基がＯＲ²、ＣＯＯＲ²、ＮＲ²Ｒ²またはＳＲ²(式中、Ｒ²はＨ、除去可能な保護基、または低級アルキル基である)、置換アルキル鎖からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。３．Ｒ²がＨ、除去可能な保護基、または低級アルキル基からなる群から選択される、請求項２記載の化合物。４．Ｒが(ＣＨ₂)₃ＯＨである、請求項１記載の化合物。５．Ｒが(ＣＨ₂)₅ＣＯＯＨ、(ＣＨ₂)₃ＮＨ₂およびＣ₂Ｈ₅からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。６．Ｒ³がＰＯ₃ ^-2、Ｐ₂Ｏ₆ ^-3およびＰ₃Ｏ₉ ^-4からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。７．リンカーがプロピル−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−ヘキシル、プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯ、プロピル−Ｏ₂Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−ヘキシルおよびプロピル−Ｏ₂ Ｃ−エチル−ＣＯＮＨ−プロピニルからなる群から選択される、請求項１記載の化合物。８．リンカーが３から２５原子の長さである、請求項１記載の化合物。９．ＸおよびＹがＣ(ＣＨ₃)₂である、請求項１記載の化合物。１０．Ｒ³−Ｏ−Sugar−Baseにより形成されるヌクレオチドまたはヌクレオシドがIDC-rCTP、IDC-dCTP、IDC-ddCTP、ITC-ddCTP、ITC-ddATP、IDC-dATP、IMC-c 7-ddGTPおよびOMC-ddCTPからなる群から選択される、請求項１記載の化合物。１１．Ｒ³がＰＯ₂ ^-2、Ｐ₂Ｏ₅ ^-3およびＰ₃Ｏ₈ ^-4からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。１２．Ｒ³がＰ(ＢＨ₃)Ｏ₂ ^-2、Ｐ₂(ＢＨ₃)Ｏ₅ ^-3およびＰ₃(ＢＨ₃)Ｏ₈ ^-4からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。１３．ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した非スルホン化カルボシアニン色素。１４．色素がインドカルボシアニン色素である、請求項１３記載の色素。１５．請求項１記載の化合物を核酸鎖に挿入させる段階を含む、核酸分子の標識法。１６．更に分子の核酸配列の決定の段階を含む、請求項１５記載の方法。１７．請求項１３記載の化合物を核酸鎖に挿入させる段階を含む、核酸分子の標識法。１８．更に分子の核酸配列の決定の段階を含む、請求項１７記載の方法。