CN115181049B - 一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂 - Google Patents

一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有机化合物试剂技术领域，具体涉及一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂。本发明荧光化合物作为创新的Cy3结构，通过‑COR6‑作为连接基附接至核苷酸形成修饰核苷酸，采用含有醚键的杂烷基结构‑(CH2)n‑O‑(CH2)m‑作为连接结构将连接基‑COR6‑连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为修饰分子形成的修饰核苷酸作为DNA测序试剂的稳定性和荧光强度，作为胸腺嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸的标记分子，与现有的绿色罗丹明标记的腺嘌呤核苷酸、Cy5标记的胞嘧啶核苷酸混合制成DNA测序试剂，应用于DNA测序，提高其测序质量。

Description

一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂
技术领域
本发明涉及有机化合物试剂技术领域，具体涉及一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂。
背景技术
荧光染料是有机染料，其吸收紫外辐射或可见光，并在几纳米发光的形式再次发射所述紫外辐射或可见光，在辐射结束后迅速终止的发光形式。荧光染料用于许多技术领域，例如在照明装置中或在染料激光器中或在荧光显微镜中用作光学增强剂，在生物化学和医学中的许多分析和诊断方法也很常见使用荧光染料作为标记分子，比如DNA测序技术中。
DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam 和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的基本原理是边合成边测序，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
限制荧光染料在DNA测序技术中应用的因素有很多，包括光稳定性、与其他聚合酶等试剂的相容性、荧光强度、反应和储存稳定性等。碳菁染料已经被广泛应用于DNA测序。然而许多碳菁染料具有某些缺点，例如碳菁染料的荧光严重猝灭，花菁染料还具有很强的自缔合趋势，会显著降低荧光量子产率。因此存在大量研究针对花菁染料的结构进行优化改进，这些改进基本都是针对花菁染料吲哚环结构的可取取代结构上进行优化，采用不同的取代结构获得符合相应应用场景的花菁染料，然而对于DNA测序技术适用的花菁染料还需要进一步的优化改进，以提高测序质量。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种荧光化合物，能够作为核酸测序的修饰核苷酸的荧光修饰结构，修饰的核苷酸作为测序试剂能够提高测序质量。
本发明的目的之二是提供一种荧光化合物的制备方法。
本发明的目的之三是提供连接本发明荧光化合物进行修饰的荧光修饰核苷酸，应用于边合成边测序系统，提高测序质量。
同时，本发明还在于提供一种测序试剂，包含本发明提供的荧光修饰核苷酸，提高测序质量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种荧光化合物，由式(Ⅰ)所示的化学结构通式的化合物形成：
其中m、n为1～3的整数；
R1、R2、R3各自独立地为烷基或取代的烷基；R7为H、SO3 -、芳基或取代的芳基；
X为O或-CH2-；
R4、R5各自独立地为H、卤素、SO3 -、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；
R1、R2、R3、R4、R5至少有一个具有磺酸基团；
R6为OR8或NR8R9，其中R8和R9独立地为H、烷基、杂烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。
需要解释的是，由式(Ⅰ)所示的化学结构通式的化合物形成是指荧光化合物的结构可以是式(Ⅰ)所示的化学结构，也可以是式(Ⅰ)所示的化学结构的内消旋体，也可以是式(Ⅰ)所示化学结构的其他共振结构。
本发明荧光化合物作为荧光标记分子，通常通过共价连接、表面缀合或其他形式附接至检测反应试剂中，比如蛋白试剂、化学试剂等；本发明荧光化合物的一个具体应用场景是作为标记分子对核苷酸分子进行标记，形成带有荧光标记分子的修饰核苷酸，使修饰核苷酸具有独特的荧光性能，通过检测荧光信号判断修饰核苷酸的存在，甚至判断修饰核苷酸的碱基种类，比如作为DNA测序试剂的核苷酸原料。
在双色、四色等基因测序系统中，花菁类染料Cy3通常作为绿色荧光标签对核苷酸进行标记作为测序反应的核苷酸原料，本发明荧光化合物作为创新的Cy3结构，通过-COR6-作为连接基附接至核苷酸形成修饰核苷酸，本发明创造性的改进-COR6-与荧光化合物核心结构之间的连接结构，采用含有醚键的杂烷基结构-(CH2)n-O-(CH2)m-作为连接结构将连接基-COR6-连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为标记分子形成的修饰核苷酸作为DNA测序试剂的稳定性，具体的作为胸腺嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸的标记分子，与现有的绿色罗丹明标记的腺嘌呤核苷酸、Cy5标记的胞嘧啶核苷酸混合制成DNA测序试剂，应用于DNA测序，提高其测序质量。
本发明的一个最优选实施例中，上述荧光化合物结构中n为3，m为1；R5为SO3 -， R4为H或SO3H；R1为甲基，R2为甲基或-(CH2)4SO3H，进一步优选的R2为甲基；-R3-X-R7为-(CH2)4SO3H或-(CH2CH2O)4-CH3或进一步优选的-R3-X-R7为/>
应当可以理解的是，在不影响本发明声称的荧光化合物的荧光性能和作为修饰分子形成修饰核苷酸的其他性能的前提下，本发明荧光化合物核心结构不同位置的取代基也可以为其他结构取代基，m、n为1～3的整数。
上述荧光化合物的制备方法，以包括式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)所示化合物为原料制备而成：
其中m、n为1～3的整数；
R1、R2、R3各自独立地为烷基或取代的烷基；R7为H、SO3 -、芳基或取代的芳基；
X为O或-CH2-；
R4、R5各自独立地为H、卤素、SO3 -、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；
R1、R2、R3、R4、R5至少有一个具有磺酸基团；
R6为OR8或NR8R9，其中R8和R9独立地为H、烷基、杂烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。
上述荧光化合物通过连接基R6附接至核苷酸形成荧光修饰核苷酸，通常附接位置为核苷酸嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位，作为优选的荧光化合物与核苷酸碱基之间的连接结构中包括化学可切割结构，进一步的包括聚乙二醇结构。并且为了配合边合成边测序的核酸测序过程，荧光修饰核苷酸的的核糖或脱氧核糖的3’OH位置共价附接阻断基团，本发明一个实施例优选的，可切割结构为叠氮基团；阻断基团为甲基叠氮。
本发明还提供一种测序试剂，包括用于边合成边测序的合成过程中的延伸试剂，其中延伸试剂中包括四种修饰核苷酸原料，其中一种修饰核苷酸原料为上述荧光分子修饰的核苷酸原料，其他三种核苷酸原料采用不同的荧光化合物进行标记修饰，每种荧光化合物具有不同的最大吸收度且每种荧光化合物之间是可区分的，优选的，鸟嘌呤核苷酸不修饰荧光分子，其他三种核苷酸修饰不同的荧光化合物，其中一种核苷酸修饰上述荧光分子；更进一步优选的，第一种核苷酸采用上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第二种核苷酸采用与第一核苷酸结构不同的上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第三种核苷酸采用第一种核苷酸荧光修饰基团和第二种核苷酸荧光修饰基团的混合物作为荧光修饰基团，第四种核苷酸不带有荧光修饰基团；测序仪器可以包含在不同的波长下操作的两种激光，实现对四种修饰核苷酸的识别。
在本发明的一些实施例中，上述测序试剂包括上述荧光分子修饰的胸腺嘧啶核苷酸、绿色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光的胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸；
优选的，绿色荧光为罗丹明和/或Cy3；红色荧光为Cy5；其中Cy5可以采用现有已知的Cy5，可选的，也可以采用本发明上述提供的Cy3分子结构。
上述荧光化合物、修饰核苷酸以及测序试剂能够用于核苷酸测序之外，还可以用于表达分析、杂交分析、细胞测定或蛋白质测定等。上述荧光化合物可以结合具体的应用场景附接至底物部分，底物部分可以是需要荧光标记修饰的任何分子或物质，例如核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机或无机聚合物、染色体、细胞核、活细胞以及其组合或集合物；荧光化合物可以结合实际应用场景通过疏水吸引力、离子吸引力和共价附接等多种方式附接至相应的底物部分，优选的，通过-COR6转变为酰胺或酯结构通过连接基共价附接至底物部分。
具体实施方式
定义：
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所述技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。
术语“烷基”指的是C1-C20烃并且可以包括C3-C10非芳族的碳环，烷基可以包含一个或更多个不饱和的基团，比如烯基和炔基。
术语“卤素”指的是氟、氯、溴、或碘，通常涉及核心结构中H原子的取代。
术语“被取代的烷基”指的是上述烷基、烯基或炔基，任选地被卤素、氰基、SO3 -、SRa、ORa、NRbRc、氧代、CONRbRc、COOH和COORb进一步取代。Ra、Rb和Rc可以各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基和被取代的芳基。其中被取代的烷基、被取代的烯基和被取代的炔基可以任选地通过选自O、NRb、S、S-O以及类似物至少一个杂原子或基团被中断。被取代的烷基还包括另外的芳基或被取代的芳基部分。
本发明技术方案的详细描述：
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明提供一种荧光化合物，其具有式(Ⅰ)所示的化学结构通式，或式(Ⅰ)所示的化学结构通式的内消旋体或共振结构：
其中m、n为1～3的整数；
R1、R2、R3各自独立地为烷基或取代的烷基；R7为H、SO3 -、芳基或取代的芳基；
X为O或-CH2-；
R4、R5各自独立地为H、卤素、SO3 -、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；
R1、R2、R3、R4、R5至少有一个具有磺酸基团；
R6为OR8或NR8R9，其中R8和R9独立地为H、烷基、杂烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。
上述荧光化合物通过连接基R6附接至核苷酸形成荧光修饰核苷酸，通常附接位置为核苷酸嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位，为了配合边合成边测序的核酸测序过程，荧光化合物与核苷酸碱基之间的连接结构中包括化学可切割结构，核糖或脱氧核糖的3’OH 位置共价附接可逆阻断基团。花菁类染料Cy3通常作为绿色荧光标记对核苷酸进行标记作为测序反应的核苷酸原料，本发明荧光化合物作为创新的Cy3结构，创造性的改进-COR6- 与荧光化合物核心结构之间的连接结构，采用含有醚键的杂烷基结构-(CH2)n-O-(CH2)m-作为连接结构将连接基-COR6-连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为修饰分子形成的修饰核苷酸作为DNA测序试剂的稳定性和荧光强度，作为胸腺嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸的标记分子，与现有的绿色罗丹明标记的腺嘌呤核苷酸、Cy5标记的胞嘧啶核苷酸混合制成DNA测序试剂，应用于DNA测序，提高其测序质量。
下面将结合具体结构的荧光化合物以及形成的修饰核苷酸分析作为举例说明，对上述有益效果进行表征和验证：
实施例1
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅱ)所示：
实施例2
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅲ)所示：
实施例3
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅳ)所示：
实施例4
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅴ)所示：
实施例5
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅵ)所示：
实施例6
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅶ)所示：
实施例7
本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式(Ⅷ)所示：
上述实施例1～7荧光化合物作为修饰分子对核苷酸进行荧光修饰时，通常需要中间连接基结构将荧光化合物附接至核苷酸的相应位置，通常需要首先将实施例1～7荧光化合物的COOH结构与形成连接基结构的化合物反应形成-COOR8或NR8R9结构，通过R8或R8R9结构将荧光化合物附接至核苷酸形成荧光修饰核苷酸，OR8、NR8R9结构相当于荧光修饰核苷酸化合物结构中的Linker结构，本领域技术人员公知的Linker结构均可适用于本申请，例如R8和R9可以选自烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基，并且通常Linker结构中包括化学可裂解或者物理/生物可切割结构，例如叠氮结构、二硫键结构等，作为举例说明，例如可以采用专利CN106604926A中公开的linker结构等。
本发明下述实施例选择一种具体的Linker结构对本发明的荧光修饰核苷酸进行举例说明。
实施例8
本实施例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如式(Ⅸ)所示：
实施例9
本实施例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式(Ⅸ-1)所示：
上述实施例中将式(Ⅸ)和(Ⅸ-1)荧光化合物通过具体的Linker结构附接至胸腺嘧啶核苷酸的C5位形成的荧光修饰核苷酸，其仍然能够响应酶促发生的沃森-克里克碱基配对反应。应当可以理解的是，本发明其他实施例提供的其他荧光化合物同样可以通过Linker 结构附接至胸腺嘧啶核苷酸形成新的荧光修饰核苷酸，同样应当可以理解的是，本发明实施例提供的荧光化合物也可以通过linker结构附接至其他类型的核苷酸形成荧光修饰的核苷酸，形成的荧光修饰核苷酸同样能够响应酶促发生的沃森-克里克碱基配对反应。
另外，目前常用的边合成边测序的高通量测序方法，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、C和G)分别用独特且相互可区分的荧光分子修饰核苷酸，在测序反应中，加入修饰的核苷酸试剂，通过检测并入测序模板多核苷酸链上的独特荧光分子的信号判断并入的核苷酸的种类，进而实现对多核苷酸链的测序；通常需要修饰的核苷酸具有3’-OH阻断基团，阻断基团包括可裂解或切割去除结构，控制聚合延伸反应的继续进行，在完成一次荧光信号检测后，将并入的修饰的核苷酸的3’-阻断基团和荧光分子通过相同的或者不同的化学或酶促或者物理方法移除，暴露可延伸的新生链用于下一步的修饰核苷酸的并入，实现核苷酸链的持续测序。因此，本发明实施例提供的荧光修饰核苷酸能够作为边合成边测序的试剂盒中的核苷酸试剂，并且当本发明荧光修饰核苷酸作为核苷酸试剂进行核苷酸测序反应时，荧光修饰核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’OH位置共价附接阻断基团，该阻断基团通常是化学可裂解或物理/生物可切割的，比如甲基叠氮。同时，上述用于核苷酸测序的试剂盒还包括除本发明实施例提供的荧光修饰核苷酸之外的其他三种核苷酸试剂，其他三种核苷酸试剂可以是具有荧光标记的或不具有荧光标记的；
作为优选的，本发明测序试剂盒中包括边合成边测序的延伸试剂，其中延伸试剂中包括核苷酸原料，其组成包括上述荧光分子修饰的胸腺嘧啶核苷酸、绿色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸；
需要解释说明的是，绿色荧光为罗丹明和/或Cy3；红色荧光为Cy5；其中Cy5可以采用现有已知的Cy5，例如专利CN106459001A记载的结构；Cy3可以采用现有已知的Cy3，例如专利CN105164106A记载的结构；也可以采用本发明上述实施例提供的Cy3分子结构。
实施例10
本实施例提供一种实施例8所示荧光修饰核苷酸的制备方法，以式(ⅰ-1)、式(ⅱ-1)、式(ⅲ-1)所示化合物为原料制备而成：
具体操作步骤如下：
1)合成实施例1提供的式(Ⅱ)荧光化合物：
①取溴丙醇加入有机溶剂中，加入溴乙酸乙酯，低温环境下，缓慢加入NaH，低温反应一定时间后，升温至室温继续搅拌反应，TLC(PE/EA体系)检测反应完全后，调节反应体系的pH，萃取有机相，干燥浓缩，柱分离制得中间产物1；反应方程式如下式(1)所示：
②取4-肼基苯磺酸盐酸盐加入到有机溶剂中，加入3-甲基-2-丁酮，升温继续反应，TLC 检测反应完全，降温至室温，加入萃取剂过滤，抽干得中间产物2；反应方程式如式(2) 所示：
③取中间产物2加入到单口瓶中，加入有机溶剂、中间产物1，加热反应，TLC检测反应完全，降温至室温，加入萃取剂过滤得中间产物3；反应方程式如式(3)所示：
④取中间产物3溶于有机溶剂中，加入氢氧化钠，加热反应，TLC检测反应完全，浓缩除去有机溶剂，得式(ⅰ-1)所示原料；反应方程式如式(4)所示：
⑤于三口瓶内加入苯酚，丙酮溶解，加入1,3-二溴丙烷，碳酸钾，开启搅拌，升温至回流反应，TLC检测反应完全，降温至室温，过滤，浓缩拌样柱层析得中间产物4；反应方程是如式(5)所示：
⑥取中间产物4加入到单口瓶内，加入2,3,3-三甲基吲哚、环丁砜，升温反应，TLC检测反应完全，降温至室温，加入硅胶，拌样柱层析得产物，作为式(ⅱ-1)所示原料；整个反应方程式如下式(6)所示：
⑦取式(ⅱ-1)所示原料，溶于醋酸中，加入醋酸酐、二苯甲脒，加热反应，TLC检测反应完全后，浓缩除去有机溶剂，将残渣用乙酸重新溶解后，加入吡啶、式(ⅰ-1)所示原料，加热反应，TLC检测反应完全后，浓缩除去溶剂，拌样柱分离得式(Ⅱ)所示化合物；整个反应方程式如式(7)所示：
2)荧光化合物连接Linker结构：将步骤1)制备的式(Ⅱ)所示荧光化合物溶于DMF中，加入DIEA，体系在氩气保护下，加入TSTU室温搅拌反应，加入式(ⅳ)所示化合物的有机溶液，室温搅拌，TLC检测，反应完全，浓缩除去溶剂，拌样柱分离得中间产物 5；反应方程式如式(8)所示：
3)制备荧光修饰核苷酸：取中间产物5溶于DMF中，加入DIEA，体系在氩气保护下冷却至0℃，加入TSTU继续搅拌5min，加入式(ⅴ)所示化合物的有机溶液，继续搅拌反应，TLC检测反应完全，减压浓缩除去溶剂，分离纯化，得式(Ⅷ)所示荧光修饰核苷酸，反应方程式如式(9)所示：
需要说明的是按照实施例8同样的方法原理能够合成以实施例1～6所示荧光化合物作为修饰分子的荧光修饰核苷酸，只需要依据终产物的化合物结构替换相应的原料即可。
对比例1
本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式(Ⅸ-2)所示：
对比例2
本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式(Ⅸ-3)所示：
对比例3
本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式(Ⅸ-4)所示：
试验例1
1、荧光性能检测试验：
试验方法：准确称取待分析样品，采用10mmol Tris缓冲液配置成相同浓度的样品溶液备用，设置高效液相荧光检测器参数，入射光520nm，检测光信号550nm，检测待分析样品的相对荧光强度。
试验结果如下表1所示：
表1
2、不同的荧光修饰核苷酸的掺入效率评价试验：
试验方法：
配制反应体系，成分包括TherminatorIII酶(NEB,M0333)0.01mg/mL；特定序列的退火发卡引物2uM；待测的荧光修饰的待测核苷T；将反应体系置于恒温恒匀器中，设置参数在60℃，1000rpm条件下反应10min，反应结束后加入75uL 25mM EDTA混匀终止反应；取出样品，点样1uL，采用Agilent DNA 1000试剂盒，在生物分析仪上进行检测，根据产物峰与底物峰的积分面积计算即可得出掺入效率值；
试验结果如下表2所示：
表2
3、不同测序试剂的测序应用效果评价试验：
试验方法：
其中配置的延伸试剂1，其中荧光修饰核苷酸原料包括实施例8提供的核苷酸T，以式(Ⅸ)和式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸A、以式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸C、不连接荧光分子的核苷酸G；
其中配置的延伸试剂1，其中荧光修饰核苷酸原料包括实施例9提供的核苷酸T，以式(Ⅸ)和式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸A、以式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸C、不连接荧光分子的核苷酸G；
配置的延伸试剂3，其中荧光修饰核苷酸原料包括对比例1提供的核苷酸T，以式(Ⅸ) 和式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸A、以式(Ⅺ)所示荧光分子标记的核苷酸C、不连接荧光分子的核苷酸G；
采用延伸试剂1和延伸试剂2分别替换市售试剂盒中的延伸试剂，在illumina的Nextseq550测序仪上对人模板进行测序，测序验证结果如下表3所示：
表3
结论：
由上述表3所示的数据可知，本发明提供的荧光化合物作为标记分子形成的修饰核苷酸应用于测序试剂能够进一步提高测序质量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (11)

1.一种荧光化合物，其特征在于，由式(Ⅰ)所示的化学结构通式的化合物形成：
其中m、n为1～3的整数；
R5为SO3 -；R4为H或SO3H；R1为甲基或-(CH2)3SO3H；R2为甲基；
-R3-X-R7为-(CH2)4SO3H或-(CH2CH2O)4-CH3或
R6为OH。
2.如权利要求1所述的荧光化合物，其特征在于，n＝3，m＝1。
3.如权利要求2所述的荧光化合物，其特征在于，R1为甲基。
4.如权利要求1所述的荧光化合物，其特征在于，-R3-X-R7为
5.一种如权利要求1～4任一项所述的荧光化合物的制备方法，其特征在于以包括式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)所示化合物为原料制备而成：
其中m、n如权利要求1～4所述；
R5、R4、R1、R2、R3-X-R7、R6如权利要求1～4所述。
6.一种荧光修饰核苷酸，其特征在于，由如权利要求1～4任一项所述的荧光化合物通过连接基R6附接至核苷酸嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位制备而成。
7.如权利要求6所述的荧光修饰核苷酸，其特征在于，所述荧光修饰核苷酸为荧光修饰的胸腺嘧啶核苷酸或荧光修饰的腺嘌呤核苷酸。
8.如权利要求7所述的荧光修饰核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的碱基与荧光化合物之间的连接结构中包括可切割结构；3’OH位置设置有可逆阻断结构。
9.如权利要求8所述的荧光修饰核苷酸，其特征在于，所述可切割结构为叠氮基团；可逆阻断基团为甲基叠氮。
10.一种测序试剂，包括用于边合成边测序的合成过程中的延伸试剂，其特征在于，所述延伸试剂包括如权利要求8所述的荧光修饰的胸腺嘧啶核苷酸、绿色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光修饰的腺嘌呤核苷酸、红色荧光的胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸；
11.如权利要求10所述的测序试剂，其特征在于，所述绿色荧光为罗丹明和/或Cy3；红色荧光为Cy5。
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