CN105164106A - 多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途 - Google Patents

多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途 Download PDF

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
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    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
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Abstract

本公开内容涉及新的多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途。化合物可以在核酸测序应用中被用作用于核苷酸的荧光标记物。

Description

多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途
本公开内容涉及新的多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途。特别地，化合物可以在核酸测序应用中被用作用于核苷酸的荧光标记物。
背景
在本申请中引用若干出版物和专利文献，以便更充分地描述本公开内容所属的领域的状态。这些出版物和文献中的每个的公开内容通过引用并入本文。
利用荧光标记物的核酸的非放射性检测在分子生物学中是重要的技术。在重组DNA技术中采用的许多程序之前主要依赖于用例如32P放射性地标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允许灵敏检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的限制，诸如其费用、有限的储存期以及更重要地安全考虑。排除对放射性标记物的需求提高安全性，同时减少与例如试剂处置相关的环境影响和成本。通过非限制性实例的方式，适合于非放射性荧光检测的方法包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。
对于许多应用，期望采用多重光谱可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在这类多重方法中，反应容器的数目可以减少，从而简化实验方案并且有利于产生应用特定的试剂盒。例如，在多色自动DNA测序中，多重荧光检测允许在单个电泳泳道中分析多个核苷酸碱基，从而使总处理能力(throughput)增加超过单色方法并且降低与泳道之间的电泳迁移率变化相关的不确定性。
然而，多重荧光检测可以是有问题的并且有限制荧光标记物的选择的许多重要因素。首先，可能难以发现发射光谱在给定的应用中被适当地光谱地分辨的染料化合物。此外，当若干荧光染料被一起使用时，通过同时激发在可区别的光谱区中产生荧光信号可能是困难的，因为对此可以是可用的染料的吸收带通常被宽泛地分开，所以难以实现几乎相等的荧光激发效率(甚至对于两种染料)。许多激发方法使用高功率光源，如激光并且因此染料必须具有足够的光稳定性以经受这种激发。分子生物学方法中特别重要的最终考虑是荧光染料必须与使用的试剂化学成分诸如例如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶相容的程度。
随着测序技术提高，需要开发另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物以及满足以上限制中的全部并且特别适合于高总处理能力的分子方法诸如固相测序以及类似方法的染料组。
具有改进的荧光性质诸如荧光带的荧光强度、形状和最大波长的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和精确度。当在基于水的生物缓冲液中并且在较高温度下进行测量时，强荧光信号是特别重要的，因为大部分染料的荧光强度在这类条件下是显著较低的。此外，染料被附接到其的碱基的性质也影响最大荧光、荧光强度和其他光谱染料性质。核碱基(mucleobase)和荧光染料之间的序列特定的相互作用可以通过荧光染料的特定设计来调整。荧光染料的结构的优化可以改进核苷酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。
本文描述改进的多次甲基构建体和其作为生物分子标记物、特别地作为用于在核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。可以看到在使用新的荧光构建体可获得的标记的核苷酸并入的效率和测序读数的长度上的具体改进。
概述
根据第一方面，本公开内容提供式(I)的多次甲基染料化合物或其内消旋形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机的带正电荷/带负电荷的反离子，并且
m是整数0-3；
Ra1和Ra2中的每个独立地是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环；
Rb是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；
Rc1和Rc2中的每个独立地是烷基或被取代的烷基；并且
Rb、或Rc1或Rc2中的一个包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接至另外的分子。
在另一个实施方案中，本公开内容的化合物可以与多种底物部分诸如例如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配体、颗粒、细胞、半固体表面(例如凝胶)和固体表面缀合。
因此，根据本公开内容的另外的方面，提供了包含连接基的染料化合物，该连接基使得能够实现例如共价附接至这类底物部分。
根据另外的方面，本公开内容提供通过式：N-L-染料定义的核苷或核苷酸化合物，其中N是核苷酸，L是任选的连接基部分并且染料是根据本公开内容的荧光化合物。
在另外的方面中，本公开内容提供使用本公开内容的染料化合物测序的方法。
根据另外的方面，本公开内容还提供包含染料化合物(游离的或呈缀合物的形式)的试剂盒，该试剂盒可以用于各种免疫测定、寡核苷酸与核酸标记以及用于通过合成的DNA测序。在又另一方面中，本公开内容提供包含染料‘组’的试剂盒，该试剂盒特别适合于在自动仪器平台上进行通过合成的测序循环。
本公开内容的另外的方面是本公开内容的化合物的化学制备。
详细描述
本公开内容提供新颖的多次甲基染料化合物，其特别适合于荧光检测和通过合成测序的方法。
根据第一方面，本公开内容提供式(I)的多次甲基染料化合物或其内消旋形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机的带正电荷/带负电荷的反离子，并且
m是整数0-3；
Ra1和Ra2中的每个独立地是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环；
Rb是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；
Rc1和Rc2中的每个独立地是烷基或被取代的烷基；并且
Rb、或Rc1或Rc2中的一个包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接至另外的分子。
每个Ra1或Ra2可以独立地是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环；Ra1或Ra2可以是H。Ra1或Ra2可以是SO3 -。Ra1可以与Ra2不同，例如，结构在Ra1处可以具有单个磺酸基，并且H作为Ra2。Ra1或Ra2可以是磺酰胺。磺酰胺可以是SO2NH2或SO2NHR，其中R是烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。
Ra1或Ra2可以是稠合至吲哚环的相邻碳的另外的脂肪族环、芳香族环或杂环。例如，在这类情况下，当芳香族环被稠合时，染料端基可以代表以下类型的结构。
因此，本公开内容的染料可以通过式(1A)、(IB)或(IC)来描述：
在式(IA)、(IB)或(IC)中，稠合至吲哚环的相邻碳原子的一个或两个另外的环可以任选地例如被磺酸或磺酰胺取代。
化合物可以是，其中Ra基团中的一个是形成式(II)的结构的另外的稠合的环：
其中Ra3是H、SO3 -、磺酰胺或卤素；并且
Rc1是烷基或被取代的烷基。
Rb可以是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基。Rb可以是烷基。Rb可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。烷基链可以例如用羧基或磺酸基进一步取代。Rb可以用于进一步缀合。例如，如果Rb包含COOH部分，其可以与另外的分子缀合以便附接标记物。在生物分子、蛋白质、DNA标记以及诸如此类的情况下，缀合可以经由Rb来实施。在缀合已经发生之后，Rb可以形成酰胺或酯衍生物。化合物可以经由Rb附接至核苷酸或寡核苷酸。
Rb可以是芳基或被取代的芳基。Rb可以是苯基。
每个Rc1和Rc2可以独立地是烷基或被取代的烷基。Rc1和Rc2可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或(CH2)qSO3H，其中q是1-6。q可以是1-3。Rc1和Rc2可以是被取代的烷基。Rc1和Rc2可以包含COOH或-SO3H部分或其酯或酰胺衍生物。
Rb或Rc1或Rc2包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接至另外的分子。Rb或Rc1或Rc2可以包含羧基或羧酸根(COOH或COO-)部分。在缀合已经发生之后，Rb或Rc1或Rc2可以包含酰胺或酯。
化合物的实例包括：
或其盐。
特别有用的化合物是如本文描述的用染料标记的核苷酸或寡核苷酸。标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有经由被取代的烷基Rb或Rc1或Rc2附接的标记物。标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过连接基部分附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位的标记物。
标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价地附接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的阻断基团。阻断基团可以在核糖或脱氧核糖的任何位置处被附接。在特定的实施方案中，阻断基团在核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’OH位。
本文提供了包含两种或更多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是用本公开内容的化合物标记的核苷酸。试剂盒可以包含两种或更多种标记的核苷酸。核苷酸可以用两种或更多种荧光标记物来标记。标记物中的两种或更多种可以使用单个激发源来激发，所述单个激发源可以是激光。例如，两种或更多种标记物的激发带可以是至少部分重叠的，使得在光谱的重叠区中的激发引起两种标记物均发射荧光。在特定的实施方案中，来自两种或更多种标记物的发射将在光谱的不同区域中发生，使得标记物中的至少一种的存在可以通过光学地区别该发射而确定。
试剂盒可以包含四种标记的核苷酸，其中四种核苷酸中的第一核苷酸用如本文公开的化合物标记。在这种试剂盒中，第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸可以各自用任选地不同于第一核苷酸上的标记物且任选地不同于彼此的标记物的化合物标记。因此，化合物中的一种或更多种可以具有不同的最大吸收度和/或最大发射，使得该化合物与其他化合物是可区别的。例如，每种化合物可以具有不同的最大吸收度和/或最大发射，使得化合物中的每种与其他三种化合物是可区别的。将理解的是，除了最大值之外的吸收光谱和/或发射光谱的部分可以不同，并且这些差异可以被利用以区别化合物。试剂盒可以使得化合物中的两种或更多种具有在600nm以上的不同的最大吸收度。
本文陈述的化合物、核苷酸或试剂盒可以被用于检测、测量或识别生物系统(包括，例如其过程或其组分)。可以采用化合物、核苷酸或试剂盒的示例性技术包括测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析、细胞测定(例如，细胞结合或细胞功能分析)或蛋白质测定(例如，蛋白质结合测定或蛋白质活性测定)。用途可以是在用于实施特定技术的自动仪器上进行，诸如自动测序仪器。测序仪器可以包含在不同的波长下操作的两种激光。
本文公开合成本公开内容的化合物的方法。式(X)和/或式(X1)、式(X2)的化合物或其盐可以被用作用于合成对称的或不对称的多次甲基染料的起始物料：
其中Ra是H、SO3-、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环。
Rb是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；并且
Rc是烷基或被取代的烷基。
如本文所使用，术语“烷基”指的是C1-C20烃并且可以包括C3-C10非芳香族碳环。在特定的实施方案中，烷基是C1-C6烷基，C1-C6烷基指的是分别包含一个和六个之间的碳原子的饱和的、直链或支链的烃基。烷基可以包含一个或更多个不饱和基团，并且因此包含烯基和炔基。
如本文使用的术语“卤素”指的是氟-(此后被指定为F)、氯-(此后被指定为Cl)、溴-(此后被指定为Br)或碘-(此后被指定为I)，并且通常涉及有机化合物中氢原子的取代，任选地，此取代是氢的完全取代。
术语“被取代的烷基”指的是如上文定义的烷基、烯基或炔基，其中它们可以任选地用但不限于卤素、氰基、SO3 -、SRa、ORa、NRbRc、氧代、CONRbRc、COOH和COORb进一步取代。Ra、Rb和Rc可以各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基和被取代的芳基。此外，所述被取代的烷基、被取代的烯基和被取代的炔基可以任选地被至少一个杂原子或选自O、NRb、S(O)t(其中t是0至2)以及类似物的基团中断。被取代的烷基还包括其中烷基包含另外的芳基或被取代的芳基部分的基团，诸如苄基。
根据本公开内容的染料可以由包括N-苯基吲哚的多种不同的起始物料合成。染料可以被对称地制造，使得相同的吲哚在三次甲基链的两端；或被不对称地制造，使得不同的吲哚在发色团的任一端。制备多次甲基染料的方法是本领域熟知的。
根据本公开内容的方面，提供适合于附接至底物部分的染料化合物，该染料化合物特别地包含能够附接至底物部分的连接基。实际上，底物部分可以是本公开内容的染料可以被缀合至的任何分子或物质，并且通过非限制性实例的方式，底物部分可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机或无机的聚合物、染色体、细胞核、活细胞以及其组合或集合物。染料可以通过包括疏水吸引力、离子吸引力和共价附接的多种手段通过任选的连接基缀合。特别地，染料通过共价附接缀合至底物。更特别地，共价附接是借助于连接基。
根据本公开内容的染料可以在取代位置中的一个处包含反应性连接基，用于将染料共价附接至另一个分子。反应性连接基团是能够形成键(例如，共价键或非共价键)的部分。在特定的实施方案中，连接基可以是可裂解的连接基。术语“可裂解的连接基”的使用不意指意味着需要将整个连接基除去。裂解位点可以位于导致连接基的一部分在裂解之后保持附接至染料和/或底物部分的连接基上的位置处。通过非限制性实例的方式，可裂解的连接基可以是亲电性可裂解的连接基、酶促可裂解的连接基、亲核性可裂解的连接基、光可裂解的连接基、在还原条件(例如包含二硫化物或叠氮化物的连接基)、氧化条件下可裂解的、经由保险栓(safety-catch)连接基的使用可裂解的以及通过消除机制可裂解的。使用可裂解的连接基以将染料化合物附接至底物部分提供除去标记物的选择，例如在检测之后，从而避免下游步骤中的任何干扰信号。
可以在PCT公布号WO2004/018493(通过引用并入本文)中发现有用的连接基，连接基的实例包括可以使用水溶性膦或由过渡金属和至少部分地水溶性配体形成的水溶性过渡金属催化剂裂解的连接基。在水溶液中，后者形成至少部分地水溶性过渡金属络合物。这类可裂解的连接基可以用于将核苷酸的碱基连接至标记物，诸如本文陈述的染料。
可以在PCT公布号WO2004/018493(通过引用并入本文)中发现特定的连接基，诸如包含下式的部分的连接基：
(其中X选自包括O、S、NH和NQ的基团，其中Q是C1-C10被取代的或未被取代的烷基，Y选自包括O、S、NH和N(烯丙基)的基团，T是氢或C1-C10被取代的或未被取代的烷基，并且*指示其中该部分连接至核苷酸或核苷的剩余部分。
在特定的实施方案中，可以改变荧光染料(荧光团)和鸟嘌呤碱基之间的连接基的长度(例如通过引入聚乙二醇间隔基)，从而增加荧光强度(相比于通过本领域已知的其他连接基附接至鸟嘌呤碱基的相同的荧光团)。示例性连接基和其性质被陈述在公布为WO07020457的英国专利申请第0517097.2号(通过引用并入本文)中。连接基的设计以及特别是其增加的长度可以允许附接至鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团在被并入多核苷酸诸如DNA中时的亮度的改进。因此，当染料用于采用附接至包含鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记物的检测的任何分析方法中时，使用具有式-((CH2)2O)n-的间隔基的连接基可以是有利的，其中n是2和50之间的整数，例如，如在WO07020457中所描述。
本公开内容还提供标记有本文陈述的染料中的一种或更多种的核苷和核苷酸的缀合物(改性的核苷酸)。标记的核苷和核苷酸可用于(诸如，通过非限制性实例的方式，在PCR扩增、等温扩增、固相扩增、多核苷酸测序(例如固相测序)、切口平移反应及类似过程中)标记通过酶促合成形成的多核苷酸。
核苷和核苷酸可以被标记在糖或核碱基上的位点处。如本领域已知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或更多个磷酸酯基组成。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即糖没有存在于核糖中的羟基。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤可以是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，并且嘧啶可以是胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)，或在RNA的环境下是尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子结合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸也是核苷的磷酸酯，其中酯化发生在附接至糖的C-3或C-5的羟基上。核苷酸通常是单磷酸酯、双磷酸酯或三磷酸酯。
“核苷”在结构上类似于核苷酸但没有磷酸酯部分。核苷类似物的实例将是其中标记物连接至碱基并且没有附接至糖分子的磷酸酯基的核苷。
虽然碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但技术人员将理解，不改变核苷酸或核苷经历沃森-克里克碱基配对的能力的衍生物和类似物是可用的。“衍生物”或“类似物”意指核心结构与母体化合物的核心结构相同或密切相似但具有化学改性或物理改性(诸如，例如，不同的或另外的侧基，所述侧基允许衍生的核苷酸或核苷连接至另一个分子)的化合物或分子。例如，碱基可以是脱氮嘌呤。在特定的实施方案中，衍生物能够经历沃森-克里克配对。“衍生物”和“类似物”还包括例如具有改性的碱基部分和/或改性的糖部分的合成的核苷酸衍生物或核苷衍生物。这类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotideanalogs(JohnWiley&Son,1980)和Uhlman等人,ChemicalReviews90:543-584,1990中被讨论。核苷酸类似物还可以具有改性的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基磷酸酯键、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)键、氨基磷酸酯键及类似物。
例如，染料可以通过连接基附接至核苷酸碱基上的任何位置。在特定的实施方案中，对于所产生的类似物，沃森-克里克碱基配对仍然可以被实施。特定的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。如上文描述的，连接基可以被用于将染料共价地附接至核苷或核苷酸。
在特定的实施方案中，标记的核苷或核苷酸可以是酶促可并入的并且酶促可延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接至化合物，使得化合物不显著地干扰通过核酸复制酶的核苷酸的总体结合和识别。因此，连接基还可以包含间隔基单元。例如，间隔基使核苷酸碱基远离裂解位点或标记物。
标记有本公开内容的染料的核苷或核苷酸可以具有下式：
其中染料是根据本公开内容的染料化合物，B是核碱基，诸如，例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤及类似物，并且L是可以存在或可以不存在的任选的连接基。R'可以是H、单磷酸酯、双磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯类似物、附接至反应性含磷基团的-O-或被阻断基团保护的-O-。R”可以是H、OH、亚磷酰胺或3'OH阻断基团，并且R”'是H或OH。
其中R”是亚磷酰胺，R”是酸可裂解的羟基保护基，所述羟基保护基允许在自动合成条件下的随后的单体偶联。
在特定的实施方案中，阻断基团是单独的并且独立于染料化合物，即不直接附接至染料化合物。在可选择的实施方案中，染料可以包含3'OH阻断基团中的全部或部分。因此，R”可以是可以包含或可以不包含本文公开的染料化合物的3'OH阻断基团。
在还另一可选择的实施方案中，在戊糖的3'碳上没有阻断基团，并且例如，附接至碱基的染料(或染料构建体和连接基构建体)可以具有足以充当对另外的核苷酸的并入的阻断物的大小或结构。因此，阻断可以是由于立体位阻或可以是由于大小、电荷和结构的组合，无论染料是否被附接至糖的3'位。
在还另一可选择的实施方案中，阻断基团存在于戊糖的2'碳或4'碳上并且可以具有足以充当对另外的核苷酸的并入的阻断物的大小或结构。
阻断基团的使用允许聚合作用诸如通过在并入改性的核苷酸时终止延伸而被控制。例如，通过非限制性实例的方式，如果阻断效应是可逆的，则通过改变化学条件或通过除去化学阻断物，延伸可以在某些点处被终止并且然后被允许继续。
在另一特定的实施方案中，3'OH阻断基团将包含WO2004/018497(通过引用并入本文)中公开的部分。例如，阻断基团可以是叠氮甲基(CH2N3)或烯丙基。
在特定的实施方案中，连接基(染料和核苷酸之间)和阻断基团二者均存在并且是单独的部分。在特定的实施方案中，连接基和阻断基团二者在大体上相似的条件下是可裂解的。因此，脱保护和去阻断过程可以是更有效的，因为将仅需要单个处理以除去染料化合物和阻断物二者。然而，在某些实施方案中，连接基和阻断基团不需要在相似的条件下是可裂解的，而在不同的条件下是单独地可裂解的。
本公开内容还涵盖并入染料化合物的多核苷酸。这类多核苷酸可以是分别包含以磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的DNA或RNA。根据本公开内容的多核苷酸可以包括与本文陈述的至少一种改性的核苷酸(例如标记有染料化合物)组合的天然存在的核苷酸、不同于本公开内容的改性的核苷酸的非天然存在的(或改性的)核苷酸或其任何组合。根据本公开内容的多核苷酸还可以包括非天然骨架连接和/或非核苷酸化学改性。还预期包括包含根据本公开内容的至少一种改性的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物的嵌合结构。
包含根据本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸(或核苷)可以在任何分析方法中被使用，诸如包括检测附接至核苷酸或核苷的荧光标记物(无论以其自身或并入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合)的方法。在本上下文中，术语“并入多核苷酸中”可以意指，5'磷酸酯以磷酸二酯键连接至自身可以形成较长多核苷酸链的一部分的第二(改性的或未改性的)核苷酸的3'羟基。本文陈述的改性的核苷酸的3'末端可以或可以不以磷酸二酯键连接至另外的(改性的或未改性的)核苷酸的5'磷酸酯。因此，在一个非限制性实施方案中，本公开内容提供检测并入多核苷酸中的改性的核苷酸的方法，所述方法包括：(a)将本公开内容的至少一种改性的核苷酸并入多核苷酸中，以及(b)通过检测来自附接至所述改性的核苷酸的染料化合物的荧光信号而检测并入多核苷酸中的改性的核苷酸。
该方法可以包括：合成步骤(a)，其中根据本公开内容的一种或更多种改性的核苷酸被并入多核苷酸中；以及检测步骤(b)，其中并入多核苷酸中的一种或更多种改性的核苷酸通过检测或定量测量它们的荧光来检测。
在本公开内容的一个实施方案中，至少一种改性的核苷酸在合成步骤中通过聚合酶的作用并入多核苷酸中。然而，可以使用将改性的核苷酸连接至多核苷酸的其他方法，诸如例如，化学寡核苷酸合成或标记的寡核苷酸与未标记的寡核苷酸的连接反应。因此，当关于核苷酸和多核苷酸使用时，术语“并入”可以涵盖通过化学方法以及酶促方法的多核苷酸合成。
在特定的实施方案中，合成步骤可以被实施并且可以任选地包括用包含本公开内容的荧光标记的改性的核苷酸的反应混合物温育模板多核苷酸链。还可以在以下条件下提供聚合酶，该条件允许在退火为模板多核苷酸链的多核苷酸链上的游离3'羟基和改性的核苷酸上的5'磷酸酯基之间形成磷酸二酯键。因此，合成步骤可以包括如通过核苷酸与模板链的互补的碱基配对引导的多核苷酸链的形成。
在本方法的所有实施方案中，在改性的核苷酸被并入其中的多核苷酸链被退火为模板链的同时，或在其中两个链被分开的变性步骤之后，可以实施检测步骤。另外的步骤，例如化学反应步骤或酶促反应步骤或纯化步骤可以被包括在合成步骤和检测步骤之间。特别地，并入改性的核苷酸的靶链可以被分离或纯化并且然后被进一步加工或在随后的分析中被使用。通过实例的方式，在合成步骤中用改性的核苷酸标记的靶多核苷酸可以随后被用作标记的探针或引物。在其他实施方案中，本文陈述的合成步骤的产物可以经受另外的反应步骤，并且如果需要，这些后续步骤的产物可以被纯化或分离。
用于合成步骤的合适的条件对于熟悉标准分子生物学技术的人员将是熟知的。在一个实施方案中，合成步骤可以类似于标准引物延伸反应，使用包括本文陈述的改性的核苷酸的核苷酸前体，以在合适的聚合酶存在下形成与模板链互补的延伸的靶链。在其他实施方案中，合成步骤本身可以形成产生标记的双链的扩增产物的扩增反应的一部分，所述标记的双链的扩增产物包括源自靶多核苷酸链和模板多核苷酸链的复制的退火的互补链。其他示例性合成步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引物DNA标记等。用于合成步骤的特别有用的聚合酶是能够催化本文陈述的改性的核苷酸中的一种或更多种的并入的聚合酶。可以使用多种天然存在的或改性的聚合酶。通过实例的方式，热稳定聚合酶可以被用于使用热循环条件实施的合成反应，然而热稳定聚合酶对于等温引物延伸反应可能不是期望的。能够并入根据本公开内容的改性的核苷酸的合适的热稳定聚合酶包括在WO2005/024010或WO06120433(其中的每个通过引用并入本文)中描述的那些。在于较低温度诸如37℃下实施的合成反应中，聚合酶不需要一定是热稳定聚合酶，因此聚合酶的选择将取决于许多因素，诸如反应温度、pH、链置换活性以及类似因素。
在特定的非限制性实施方案中，本公开内容涵盖核酸测序、再测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分的方法、或包括当并入多核苷酸中时检测标记有本文陈述的染料的改性的核苷酸或核苷的任何其他应用。受益于标记有包含荧光染料的改性的核苷酸的多核苷酸的使用的多种其他应用中的任一种可以使用标记有本文陈述的染料的改性的核苷酸或核苷。
在特定的实施方案中，本公开内容提供包含根据本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸在通过合成反应的多核苷酸测序中的用途。通过合成测序通常包括将一种或更多种核苷酸或寡核苷酸顺序地添加至使用聚合酶或连接酶在5'至3'方向上生长的多核苷酸链，以形成与待被测序的模板核酸互补的延伸的多核苷酸链。存在于添加的核苷酸中的一种或更多种中的碱基的身份可以在检测步骤或“成像”步骤中被确定。添加的碱基的身份可以在每个核苷酸并入步骤之后被确定。然后，模板的序列可以使用常规的沃森-克里克碱基配对法则来推断。例如，在单核苷酸多态性的评分中，使用标记有本文陈述的染料的改性的核苷酸用于确定单个碱基的身份可以是有用的，并且这类单碱基延伸反应在本公开内容的范围内。
在本公开内容的实施方案中，通过经由检测附接至并入的核苷酸的荧光标记物来检测将一种或更多种核苷酸并入与待被测序的模板多核苷酸互补的新生链中来确定模板多核苷酸的序列。模板多核苷酸的测序可以用合适的引物来引发(或被制备为将包含作为发卡的部分的引物的发卡构建体)，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中将核苷酸添加至引物的3'末端以阶梯式方式延伸。
在特定的实施方案中，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、G和C)中的每个可以标记有独特的荧光团，并且在3'位置还包含阻断基团以阻止不受控制的聚合作用。可选择地，四种核苷酸中的一种可以是未标记的(深色的)。聚合酶将核苷酸并入与模板多核苷酸互补的新生链中，并且阻断基团阻止核苷酸的进一步并入。任何未并入的核苷酸可以被洗去，并且来自每个并入的核苷酸的荧光信号可以通过合适的手段诸如使用激光激发和合适的发射滤光器的电荷耦合装置来光学地“读取”。然后，可以除去(脱保护)3'阻断基团和荧光染料化合物，(同时地或顺序地)以暴露新生链用于进一步的核苷酸并入。典型地，并入的核苷酸的身份将在每个并入步骤之后被确定，但这不是严格必要的。类似地，美国专利第5,302,509号(其通过引用并入本文)公开测序固定在固体支撑体上的多核苷酸的方法。
如上文例示的方法利用在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的、3'阻断的核苷酸A、G、C和T并入与固定的多核苷酸互补的生长的链中。聚合酶并入与靶多核苷酸互补的碱基，但通过3'阻断基团被阻止进一步添加。然后，并入的核苷酸的标记物可以被确定并且阻断基团通过化学裂解除去以允许进一步聚合作用发生。在通过合成反应测序中待被测序的核酸模板可以是期望测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板将通常包含具有游离3'羟基的双链区，该游离3'羟基用作用于在测序反应中添加另外的核苷酸的引物或引发点。待被测序的模板的区域将使该游离3'羟基悬垂于互补链上。待被测序的模板的悬垂区可以是单链的，但可以是双链的，条件是“切口存在”于与待被测序的模板链互补的链上以提供用于引发测序反应的游离3'OH基。在这类实施方案中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方案中，拥有游离3'羟基的引物可以作为单独组分(例如短寡核苷酸)被添加，该单独组分与待被测序的模板的单链区杂交。可选择地，引物和待被测序的模板链可以各自形成能够形成分子内双链体(诸如例如发卡环结构)的部分地自互补的核酸链的一部分。发卡多核苷酸和发卡多核苷酸可以通过其附接至固体支撑体的方法被公开在国际申请公布第WO0157248和WO2005/047301号中，这些申请中的每个通过引用并入本文。核苷酸可以被相继地添加至生长的引物，导致在5'至3'方向上合成多核苷酸链。已经被添加的碱基的性质可以特别地但不一定在每次核苷酸添加之后被确定，从而提供核酸模板的序列信息。因此，通过经由与核苷酸的5'磷酸酯基形成磷酸二酯键而将核苷酸连接至核酸链的游离3'羟基，将核苷酸并入核酸链(或多核苷酸)中。
待被测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或甚至包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸的杂交分子。核酸模板可以包含天然存在的和/或非天然存在的核苷酸以及天然或非天然的骨架连接，条件是这些不阻止测序反应中模板的复制。
在某些实施方案中，待被测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法(例如经由共价附接)附接至固体支撑体。在某些实施方案中，模板多核苷酸可以被直接地附接至固体支撑体(例如，基于二氧化硅的支撑体)。然而，在本公开内容的其他实施方案中，固体支撑体的表面可以以某种方式来改性，以便允许模板多核苷酸的直接共价附接，或以便通过自身可以非共价地附接至固体支撑体的水凝胶或聚合电解质多层固定模板多核苷酸。
其中多核苷酸已经被直接地附接至基于二氧化硅的支撑体的阵列是例如在WO00006770(通过引用并入本文)中公开的那些，其中多核苷酸通过玻璃上的侧链环氧基与多核苷酸上的内部氨基之间的反应被固定在玻璃支撑体上。此外，多核苷酸可以通过基于硫的亲核试剂与固体支撑体的反应被附接至固体支撑体，例如，如在WO2005/047301(通过引用并入本文)中描述的。固体支撑的模板多核苷酸的还另外的实例是其中模板多核苷酸被附接至被支撑在基于二氧化硅或其他的固体支撑体上的水凝胶，例如，如在WO00/31148、WO01/01143、WO02/12566、WO03/014392、美国专利第6,465,178和WO00/53812号中描述，这些专利中的每个通过引用并入本文。
模板多核苷酸可以被固定至其的特定的表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶被描述在上文引用的参考文献中和WO2005/065814中，其通过引用并入本文。
DNA模板分子可以被附接至珠或微粒，例如，如在美国专利第6,172,218号(其通过引用并入本文)中描述的。附接至珠或微粒对于测序应用可以是有用的。可以制备其中每个珠包含不同DNA序列的珠库。示例性库和用于库的产生的方法被描述在Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005)中，其中的每个通过引用并入本文。使用本文陈述的核苷酸的这类珠的阵列的测序在本公开内容的范围内。
待被测序的模板可以形成在固体支撑体上的“阵列”的一部分，在此情况下，阵列可以采取任何便利的形式。因此，本公开内容的方法可应用于所有类型的高密度阵列，包括单分子阵列、成簇的阵列和珠阵列。标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸可以用于测序在本质上任何类型的阵列(包括但不限于通过使核酸分子固定在固体支撑体上形成的阵列)上的模板。
然而，标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸在测序成簇的阵列的上下文中是特别有利的。在成簇的阵列中，阵列上不同的区域(通常称为位点或特征部)包含多个多核苷酸模板分子。通常，多个多核苷酸分子通过光学手段单独地不是可分辨的并且代替地作为总体被检测。取决于阵列如何形成，阵列上的每个位点可以包含一个单独的多核苷酸分子的多个拷贝(例如，位点对于特定的单链核酸物种或双链核酸物种是同质的)或甚至少量的不同的多核苷酸分子的多个拷贝(例如，两个不同的核酸物种的多个拷贝)。核酸分子的成簇的阵列可以使用本领域通常已知的技术来产生。通过实例的方式，WO98/44151和WO00/18957(其中的每个通过引用并入本文)描述了核酸扩增的方法，其中模板和扩增产物二者保持固定在固体支撑体上，以便形成包括固定的核酸分子的簇或“集群”的阵列。存在于根据这些方法制备的成簇的阵列上的核酸分子是用于使用标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸测序的合适的模板。
标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸在测序单分子阵列上的模板中也是有用的。如本文使用的术语“单分子阵列”或“SMA”指的是分布(或排列)在固体支撑体上的多核苷酸分子的群体，其中任何单独的多核苷酸与群体中的所有其他多核苷酸的间距为使得单独地分辨单独的多核苷酸分子是可能的。因此，在某些实施方案中，固定至固体支撑体的表面上的靶核酸分子可以能够通过光学手段分辨。这意指一个或更多个不同的信号(各自代表一种多核苷酸)将出现在所使用的特定成像装置的可分辨区域内。
可以实现单分子检测，其中阵列上相邻的多核苷酸分子之间的间距是至少100nm，更特别地至少250nm，还更特别地至少300nm，甚至更特别地至少350nm。因此，每个分子作为单分子荧光点是单独地可分辨的且可检测的，并且来自所述单分子荧光点的荧光还呈现单步光漂白。
本文使用术语“单独地分辨”和“单独分辨”来说明，当被可视化时，区别阵列上的一个分子与其邻近的分子是可能的。阵列上单独的分子之间的间隔将部分地通过用于分辨单独的分子的特定技术来确定。单分子阵列的一般特征将通过参考公布的申请WO00/06770和WO01/57248来理解，其中的每个通过引用并入本文。尽管本公开内容的改性的核苷酸的一种用途是在通过合成反应测序中，但改性的核苷酸的用途不限于这类方法。事实上，核苷酸可以有利地用于需要检测附接至并入多核苷酸中的核苷酸的荧光标记物的任何测序方法学中。
特别地，标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸可以被用于自动荧光测序方案，特别是基于Sanger和合作者的链终止测序方法的荧光染料终止子循环测序。这类方法通常使用酶和循环测序以将荧光标记的双脱氧核苷酸并入引物延伸测序反应中。所谓Sanger测序方法以及相关的方案(Sanger型)利用具有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。
因此，本公开内容还涵盖标记有染料化合物的改性的核苷酸，所述改性的核苷酸是在3'位和2'位两处均没有羟基的双脱氧核苷酸，这类改性的双脱氧核苷酸适合用于Sanger型测序方法以及类似方法中。
将认识到，并入3'阻断基团的标记有本公开内容的染料化合物的改性的核苷酸也可以在Sanger法和相关的方案中被使用，因为通过使用改性的双脱氧核苷酸实现的相同的效果可以通过使用具有3'-OH阻断基团的改性的核苷酸来实现：二者均阻止后续核苷酸的并入。在根据本公开内容且具有3'阻断基团的核苷酸将要用于Sanger型测序方法的情况下，将理解，附接至核苷酸的染料化合物或可检测的标记物不需要经由可裂解的连接基来连接，因为在本公开内容的标记的核苷酸被并入的每种情况下；核苷酸不需要被随后并入并且因此标记物不需要从核苷酸中被除去。
本公开内容还提供包括标记有染料的改性的核苷和/或核苷酸的试剂盒。这类试剂盒将通常包括标记有本文陈述的染料的至少一种改性的核苷酸或核苷连同至少一种另外的组分。另外的组分可以是在上文陈述的方法中或在下文的实施例部分中识别的组分中的一种或更多种。下文陈述了可以组合到本公开内容的试剂盒中的组分的某些非限制性实施例。
在特定的实施方案中，试剂盒可以包含标记有本文陈述的染料的至少一种改性的核苷酸或核苷连同改性的或未改性的核苷酸或核苷。例如，标记有根据本公开内容的染料的改性的核苷酸可以以与未标记的或天然的核苷酸的组合和/或以与荧光标记的核苷酸的组合或其任何组合被供应。相应地，试剂盒可以包含标记有根据本公开内容的染料的改性的核苷酸和例如标记有其他的现有技术染料化合物的改性的核苷酸。核苷酸的组合可以作为分开的单独组分(例如，一种核苷酸类型/容器或管)或作为核苷酸混合物(例如，在相同容器或管中混合的两种或更多种核苷酸)被提供。
在试剂盒包含多种、特别地两种、更特别地四种标记有染料化合物的改性的核苷酸的情况下，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物来标记，或一种核苷酸可以是深色的，不具有染料化合物。在用不同的染料化合物标记不同的核苷酸的情况下，试剂盒的特征是，所述染料化合物是光谱上可区别的荧光染料。如本文所使用，术语“光谱上可区别的荧光染料”指的是当两种或更多种这类染料存在于一个样品中时在可以通过荧光检测设备(例如，基于商业毛细管的DNA测序平台)区别的波长下发射荧光能量的荧光染料。当标记有荧光染料化合物的两种改性的核苷酸以试剂盒形式被供应时，某些实施方案的特征是，光谱上可区别的荧光染料可以在相同的波长下(诸如，例如通过相同的激光)被激发。当标记有荧光染料化合物的四种改性的核苷酸以试剂盒形式被供应时，某些实施方案的特征是，光谱上可区别的荧光染料中的两种可以在一个波长下被激发，并且另两种光谱上可区别的染料可以在另一波长下被激发。特定的激发波长是532nm、630nm至700nm、特别地660nm。
在一个实施方案中，试剂盒包含标记有本公开内容的化合物的改性的核苷酸和标记有第二染料的第二改性的核苷酸，其中染料在最大吸收度上具有至少10nm、特别地20nm至50nm的差异。更特别地，两种染料化合物具有在15-40nm之间的斯托克斯位移，其中“斯托克斯位移”是峰吸收波长和峰发射波长之间的距离。
在另外的实施方案中，试剂盒还可以包含标记有荧光染料的两种其他改性的核苷酸，其中染料通过相同的激光在600nm至700nm、特别地630nm至700nm、更特别地660nm下被激发。染料在最大吸收度上可以具有至少10nm、特别地20nm至50nm的差异。更特别地，两种染料化合物可以具有在20-40nm之间的斯托克斯位移。还更特别地，两种染料化合物可以具有在600nm以上、特别地在640nm以上的不同的最大吸收度。与本公开内容的多次甲基染料光谱上可区别的并且满足以上标准的特定的染料是如在美国专利第5,268,486(例如Cy5)或WO0226891(Alexa647；MolecularProbesA20106)号中描述的多次甲基类似物或如在美国专利第6,924,372号中公开的不对称多次甲基，这些专利中的每个通过引用并入本文。
在可选择的实施方案中，本公开内容的试剂盒可以包含其中相同的碱基被两种不同的化合物标记的核苷酸。第一核苷酸可以用本公开内容的化合物来标记。第二核苷酸可以用光谱上不同的化合物例如在大于600nm下吸收的‘红色’染料来标记。第三核苷酸可以被标记为本公开内容的化合物和光谱上不同的化合物的混合物，并且第四核苷酸可以是‘深色的’并且不包含标记物。因此，在简单的术语中，核苷酸1-4可以被标记成‘绿色’、‘红色’、‘红/绿’以及深色。为进一步简化仪器，四种核苷酸可以标记有用单一激光激发的两种染料，并且因此核苷酸1-4的标记可以是‘绿1’、‘绿2’、‘绿1/绿2’和深色。
核苷酸可以包含本公开内容的两种染料。其中R1和R4是H的染料比其中R1和R4是烷基的染料在较低的波长下吸收。试剂盒可以包含两种或更多种标记有本公开内容的染料的核苷酸。试剂盒可以包含标记有其中R1和R4是H的本公开内容的化合物的核苷酸和标记有其中R1和R4是烷基的本公开内容的化合物的第二核苷酸。试剂盒可以包含另外的核苷酸，其中核苷酸的一部分用其中R1和R4是H的本公开内容的化合物来标记，并且核苷酸的第二部分用其中R1和R4是烷基的本公开内容的化合物来标记。试剂盒还可以包含未标记的核苷酸。
尽管上文关于具有被不同的染料化合物标记的不同核苷酸的配置例示试剂盒，但将理解的是，试剂盒可以包含具有相同染料化合物的2种、3种、4种或更多种不同的核苷酸。
在特定的实施方案中，试剂盒可以包含能够催化将改性的核苷酸并入多核苷酸中的聚合酶。待被包含在这类试剂盒中的其他组分可以包括缓冲液以及类似物。标记有根据本公开内容的染料的改性的核苷酸和包括不同核苷酸的混合物的其他任何核苷酸组分，可以以待在使用之前被稀释的浓缩的形式被提供在试剂盒中。在这类实施方案中，还可以包含合适的稀释缓冲液。此外，在本文陈述的方法中识别的组分中的一种或更多种可以被包含在本公开内容的试剂盒中。
注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非清楚地且明确地限于一个指示物。对本领域技术人员将明显的是，可以对本文描述的各种实施方案做出各种修改和变型，而不偏离本教导的精神或范围。因此，意图的是，本文描述的各种实施方案覆盖在所附权利要求和其等同物的范围内的其他修改和变型。
实验细节
2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(1)
将2-亚甲基-3,3-三甲基-1-苯基-2,3-二氢-1H-吲哚(1g,4.25mmol)在温度<5℃下溶解在1ml的硫酸中，并且在搅拌下添加1ml发烟硫酸(20％)。溶液在室温下搅拌1h，然后在60℃下加热持续3h。用乙醚沉淀的产物用丙酮和乙醇洗涤。收率0.7g(52％)。结构通过NMR来确认。
2-(2-苯胺基乙烯基-1)-3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(2-1)
反应方案:
将2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(0.63g)和苯亚胺代甲酸乙酯(0.5g)的混合物在70℃下加热持续30分钟。橙色熔融物形成。产物用乙醚研磨并且滤出。收率0.7g(84％)。
2-(2-乙酰苯胺基乙烯基-1)-3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(2-2)
反应方案:
将2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(0.63g)、N,N’-二苯基甲脒(0.5g)、乙酸(1ml)和乙酸酐(2ml)的混合物在70℃下加热持续3小时并且然后在50℃下过夜。黄色溶液形成。产物被滤出并且用乙醚洗涤。收率0.69g(75％)。
1,2-二甲基-1-(4-磺丁基)-3-苯基-1H-苯并[e]吲哚鎓(3)
反应方案:
将在绝对乙醇(30ml)中的N-(2-萘基),N-苯基肼盐酸盐(19.51mmol,5.28g)、5-甲基-6-氧代庚烷磺酸(17.18mmol,3.70g)和无水ZnCl2(17.18mmol,2.34g)在室温下搅拌持续30分钟，然后在80℃搅拌持续2h。通过TLC(在CH3CN中的10％H2O)检查反应进程。在完成之后，将反应冷却下来并且将溶剂在真空下除去。将残留物溶解在DCM中并且通过硅胶快速柱纯化。收率：3.06g，42％。
质子NMR：(MeOH-D4)：8.28(0.5H,d,J＝8Hz)；8.05-8.02(1H,m)；7.89(0.5H,d,J＝8Hz)；7.75-7.66(3H,m)；7.65-7.60(1H,m)；1.49-1.43(1.5H,m)；7.31-7.25(2H,m)；7.16(.5H,d,J＝9Hz)；7.07(.5H,appt,J＝7.4Hz)；6.61(0.5H,d,J＝8Hz)；2.85-2.35(4H,m)；1.88(3H,appd,J＝9Hz)；1.75-1.4(5H,m)；1.35-1.25(0.5H,m)；1.1-0.95(0.5H,m)；0.8-0.65(0.5H,m)；0.58-0.45(0.5H,m)。
1,2-二甲基-1-(3-磺丙基)-3-苯基-1H-苯并[e]吲哚鎓(4)
反应方案:
标题化合物作为前化合物从N-(2-萘基)-N-苯基肼盐酸盐和4-甲基-5-氧代戊烷磺酸制备。产物通过硅胶快速柱纯化。收率：40％。结构通过NMR光谱确认。
2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-1-苯基-3H-吲哚鎓(5)
反应方案:
将在冰乙酸(20ml)中的N,N-二苯基肼盐酸盐(0.01mol,2.2g)、5-甲基-6-氧代庚烷磺酸(0.017mol,3.0g)在室温(～20℃)下搅拌持续一小时，然后在100℃下搅拌持续3小时(TLC检查)。将反应混合物冷却下来并且将溶剂在真空下除去。将残留物用乙醚洗涤并且通过硅胶快速柱纯化。收率：2g(56％)。结构通过NMR光谱确认。
吲哚碳菁I-2(6)
化学名称：
2-{(5-[1-苯基-3,3-二甲基)-1,2-二氢-3H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯-1-基}-3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-吲哚鎓-5-磺酸盐
反应方案:
将在乙酸酐(2ml)和乙酸(1ml)的混合物中的3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-2-(4-苯胺基乙烯基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(0.46g)和2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓高氯酸盐(0.34g)在室温(～25℃)下搅拌持续0.5小时。然后向该溶液添加吡啶(0.5ml)。将反应混合物在80℃下搅拌持续3h。通过TLC(在CH3CN中的20％H2O)并且通过UV测量来检查反应的完成。在反应完成后，将红色混合物冷却下来并且将溶剂在真空下除去。残留物通过C18快速柱(在水和乙腈中的0.1MTEAB)来纯化。收率：0.33g(55％)。
吲哚碳菁I-4(7)
化学名称：
2-{(5-[(4-磺丁基)-1-苯基-3-甲基)-1,2-二氢-3H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯-1-基}-3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-吲哚鎓-5-磺酸三乙铵盐
反应方案:
将在乙酸酐(2ml)和乙酸(1ml)的混合物中的3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-2-(4-苯胺基乙烯基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(0.46g)和2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-1-苯基-3H-吲哚鎓(0.36g)在室温(～25℃)下搅拌持续0.5小时。然后向该溶液添加吡啶(1ml)。将反应混合物在80℃下搅拌持续3h/通过TLC(在CH3CN中的20％H2O)/并且通过UV测量检查反应的完成。在反应完成后，将红色反应混合物冷却下来并且将大部分溶剂在真空下除去。将残留物通过C18快速柱(在水和乙腈中的0.1MTEAB)来纯化。收率：0.29g(35％)。
吲哚碳菁I-5(8)
化学名称：
2-{(5-[(3-苯基-1,1-二甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-2-亚基]-1-丙烯-1-基}-3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-吲哚鎓-5-磺酸盐
反应方案:
将在乙酸酐(1ml)和乙酸(1ml)的混合物中的3,3-二甲基-1-(5-羧基戊基)-2-(4-苯胺基乙烯基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(0.46g)和1,1,2-三甲基-3-苯基-3H-吲哚鎓高氯酸盐(0.39g)在室温(～25℃)下搅拌持续0.5小时。然后向该溶液添加吡啶(1ml)。将反应混合物在60℃下搅拌持续3h/通过TLC(在CH3CN中的20％H2O)/并且通过UV测量检查反应进程。在反应完成后，将红色反应混合物冷却下来并且将大部分溶剂在真空下除去。将残留物通过C18快速柱(在水和乙腈中的0.1MTEAB)来纯化。收率：0.38g(54％)。
染料缀合物(I-5-1)pppT-I-2
反应方案:
制备：
将无水DMA(5mL)和Hunig’s碱(0.06mL)添加至干燥的染料(I-2)样品(60mg)。然后将在5mL的干燥DMA中的TSTU(0.25g)的溶液添加至此。红色的活化酯形成。将反应混合物在室温下搅拌持续1h。根据TLC(在CH3CN中的20％H2O)，完成活化。在活化完成之后，将该溶液添加至pppT-LN3(0.23g)在水(7mL)中的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌持续3h。通过TLC(在CH3CN中的20％H2O)检查偶联进程。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液，并且将混合物在室温下搅拌持续10分钟。将反应混合物用在水中的0.05MTEAB溶液中的～50g的DEAE葡聚糖凝胶树脂悬浮液应用至柱并且用TEAB(浓度梯度从0.1M直至0.5M)洗涤。有色级分被收集并且蒸发然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且真空至干燥。然后，将残留物再溶解在0.1MTEAB中。将该溶液通过注射器式过滤器0.2nm孔径过滤到康宁烧瓶中并且储存在冰箱中。产物通过使用C18反相柱与乙腈-0.1MTEAB的HPLC来纯化。收率67％。
染料缀合物(I-5-2)pppT-I-4
反应方案:
制备：
将无水DMA(5mL)和Hunig’s碱(0.06mL)添加至干燥的染料(I-2)样品(82mg)。然后将在5mL的干燥DMA中的TSTU(0.25g)的溶液添加至此。红色的活化酯立刻形成。将反应混合物在室温下搅拌持续1小时。在活化完成之后(TLC：在CH3CN中的15％H2O)，将该溶液添加至pppT-LN3(0.23g)在水(7mL)中的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌持续3h。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且将混合物在室温下搅拌持续10分钟。将反应混合物用在水中的0.05MTEAB溶液中的～75g的DEAE葡聚糖凝胶树脂悬浮液应用至柱并且用TEAB(浓度梯度从0.10M直至0.75M)洗涤。红色的级分被收集，将溶剂蒸发并且然后将残留物再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且真空到干燥。然后，将染料再溶解在0.1MTEAB中。将该溶液通过注射器式过滤器0.2nm孔径过滤并且产物通过使用C18反相柱与乙腈-0.1MTEAB的HPLC来纯化。收率70％。
表1
染料 Kd uM V最大s-1 效率uM-1s-1
pppT DEG527 4.29 1.67 0.4
pppT Dy681 0.39 0.88 2.3
pppT I-2 0.33 1.51 4.5
表1证明，当与标记有可选择的染料的3’-叠氮甲基胸苷三磷酸酯类似物相比时，标记有染料I-2的3’-叠氮甲基胸苷三磷酸酯的并入比率更快大于10倍。
表2
表2证明，当与标记有可选择的染料的3’-叠氮甲基胸苷三磷酸酯类似物相比时，标记有染料I-2的3’-叠氮甲基胸苷三磷酸酯的结合亲和力更有效大于10倍，并且还比未标记的3’-叠氮甲基胸苷三磷酸酯更有效。
如由实施例示出的染料I-2对于该染料标记的核苷酸类似物的有效并入是特别有利的。这是由于其与聚合酶高得多的结合亲和力(较低Kd)。具有较高结合亲和力的核苷酸可以以与具有较低亲和力的核苷酸相同的并入效率但在低得多的浓度下使用。因此，测序试剂每循环所需要的核苷酸的量被减少，而不降低获得的测序数据的质量。

Claims (17)

1.一种式(I)的化合物或其内消旋形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机的带正电荷/带负电荷的反离子，并且
m是整数0-3；
Ra1和Ra2中的每个独立地是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环；
Rb是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；
Rc1和Rc2中的每个独立地是烷基或被取代的烷基；并且
Rb、或Rc1或Rc2中的一个包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接至另外的分子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Rb是烷基或被羧基或磺酸基或其衍生物取代的烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中Rc1或Rc2是甲基、乙基、丙基或-(CH2)qSO3 -，其中q是1-6。
4.根据权利要求1-3所述的化合物，其中Ra基团中的一个是形成式(II)的结构的另外的稠合的环：
其中Ra3是H、SO3 -、磺酰胺或卤素；并且
Rc1是烷基或被取代的烷基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述连接部分被附接至Rb。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物经由Rb附接至核苷酸或寡核苷酸。
7.一种用根据权利要求1-5所述的化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中标记物经由被取代的烷基Rb附接。
9.根据权利要求7或8所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述标记物通过连接基部分附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。
10.根据权利要求7-9所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，还包含共价地附接至所述核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’OH阻断基团。
11.一种试剂盒，包含两种或更多种核苷酸，其中至少一种核苷酸是根据权利要求7-10所述的标记的核苷酸。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述标记的核苷酸中的两种使用单种激光来激发。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中四种核苷酸中的第一核苷酸是根据权利要求7-10所述的标记的核苷酸，并且第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各自用不同的化合物标记，其中每种化合物具有不同的最大吸收度，并且所述化合物中的每种与其他三种化合物是可区别的。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中四种核苷酸中的第一核苷酸是根据权利要求7-10所述的标记的核苷酸，并且所述化合物中的两种具有在600nm以上的不同的最大吸收度。
15.根据权利要求7-10中任一项所述的核苷酸、根据权利要求7-10所述的寡核苷酸或根据权利要求11-14中任一项所述的试剂盒在测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析或蛋白质结合测定中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，是在自动测序仪器上进行，其中所述自动测序仪器包括在不同的波长下操作的两种激光。
17.一种利用以下起始物料合成根据权利要求1-8所述的化合物或其盐的方法：
其中Ra是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、或稠合至相邻碳原子的另外的环。
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