CN105263918A - 罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途。该化合物可以在核酸测序应用中用作用于核苷酸的荧光标记物。

Description

罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途
本发明涉及新的罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途。该化合物可以在核酸测序应用中用作特别地用于核苷酸标记的荧光标记物。
背景
在本申请中参考若干出版物和专利文献以便更充分地描述本发明所属的领域的现状。这些出版物和文献中的每个的公开内容通过引用并入本文。
利用荧光标记物的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要的技术。在重组DNA技术中采用的许多程序之前严重依赖于用例如32P放射性地标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允许核酸和其他感兴趣的分子的灵敏的检测。然而，在放射性同位素的使用中有严重的限制，诸如它们的费用、有限的储存期以及更重要的安全考虑。排除对放射性标记物的需求提高了安全性，同时降低了与例如试剂处置相关的环境影响和成本。经得起非放射性荧光检测的方法通过非限制性实例的方式包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。
对于许多应用，期望采用多重光谱可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在此类多重方法中，反应容器的数目可以减少，这简化了实验方案并且有助于生产特定应用的试剂盒。在多色自动DNA测序中，例如，多重荧光检测允许在单个电泳泳道中分析多种核苷酸碱基，从而使总处理能力(throughput)增加超过单色方法并且降低与泳道之间的电泳迁移率变化相关的不确定性。
然而，多重荧光检测可能是有问题的并且存在限制荧光标记物的选择的许多重要因素。首先，难以发现发射光谱被适当地光谱分辨的染料化合物。此外，当若干荧光染料一起使用时，同时激发可能是困难的，因为染料的吸收带通常被宽泛地分开。许多激发方法采用高功率激光并且因此染料必须具有足够的光稳定性以经受这样的激光激发。分子生物学方法中的特别重要的最终考虑是荧光染料必须与使用的试剂化学物质诸如例如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶相容。
随着测序技术发展，需要开发另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物和满足所有以上限制并且特别经得起高通量分子方法例如固相测序及类似方法的染料组。
申请WO2007135368描述一类适合于用作荧光标记物的罗丹明化合物。其中描述的化合物适合用于固相核酸测序方案中。固相核酸测序的技术和通量的发展特别地在荧光试剂和特定的核酸序列之间的相互作用的情况下已经导致对荧光标记物的分子设计的进一步发展和改进。
具有改进的荧光性质(诸如，荧光强度、荧光最大值的位置以及荧光带的形状)的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确性。当在基于水的生物缓冲液中和/或在较高温度下进行测量时，荧光信号强度尤其重要，因为大部分染料的荧光在这样的条件下显著较低。此外，染料被附接至的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和其他光谱染料性质。荧光染料和核碱基(nucleobase)之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特定设计来调整。荧光染料的结构的优化可以改进它们的荧光性质并且还改进核苷酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。
本文描述改进的罗丹明构建体和其作为生物分子标记物、特别地作为用于核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。可以看到在此类染料(当制备为生物分子缀合物时)的较高荧光强度上以及在使用新的荧光构建体可获得的测序读数的长度和质量上的改进。
概述
根据第一方面，本发明提供式(I)的罗丹明染料化合物及其内消旋体：
本发明的内消旋体可以包括由1a、1b或环形式1c代表的式：
在式I、Ia、Ib或Ic中，
M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
Y＝O、NR11，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可以与多种底物部分诸如例如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配体、颗粒和表面缀合。
因此根据本发明的另外的方面，提供了染料化合物，该染料化合物包含能够例如共价附接至此类底物部分的连接基。
根据另外的方面，本发明提供由式：N-L-染料定义的核苷或核苷酸化合物，其中N是核苷酸，L是任选的连接基部分并且染料是根据本发明的荧光化合物。
在另外的方面中，本发明包括使用本发明的染料化合物测序的方法。
根据另外的方面，本发明还提供包含本发明的染料化合物(游离的或以缀合物形式)的试剂盒，该试剂盒可以用于各种免疫学测定、寡核苷酸和核酸标记以及用于通过合成的DNA测序。在又另一个方面中，本发明提供包含染料‘组’的试剂盒，该试剂盒特别适合于在自动仪器平台上进行通过合成的测序的循环。
本发明的另外的方面是本发明的化合物的化学制备。
附图说明
图1示出如本文描述的染料与现有技术染料相比较低的温度降低。将染料(I-1)和(I-3)的1.10-6M溶液的归一化荧光强度与可商购的染料Atto532在不同温度下关于相同的光谱区域进行比较。测量染料在20℃、40℃和60℃下的强度。图1示出染料在每个温度下的相对强度。商业染料Atto532示出相对于I-1和I-3染料的在较高温度下荧光强度的较大损失。图1证实新的染料在基于水的溶液中的荧光随着温度是较少可变的。
图2证实基于这些新的染料的核碱基缀合物在基于水的溶液中的荧光高于可商购的染料(当被532nm的光激发时)。当pppT与可商购的染料Atto532缀合时，将染料-核碱基缀合物(I-13)-T和(I-11)-T的1.10-6M溶液的归一化荧光光谱与结构类似物相比较。在相同的核苷酸浓度下，1-3染料比atto532染料更明亮。与atto532染料相比，I-1染料发生红移。
图3证实新的染料在基于水的溶液中的荧光较小地取决于温度。将当与核碱基缀合时的染料T-(I-11)和T-(I-13)的1.10-6M溶液的归一化荧光强度与和相同的T-核碱基缀合的可商购的染料Atto532相比较。与atto-532相比，I-1染料和I-3染料二者在升高的温度下都示出较高的荧光强度。
图4证实与当相同的核碱基与可商购的染料Atto532(对照1)缀合时的标准荧光团组相比，当已用根据本发明的新染料(I-3)(泳道6)标记核碱基时更好地区分荧光信号。图4示出在Illumina4颜色测序运行中红色强度相对于绿色强度的标绘图。染料信号的组之间的较高的距离降低了误称(miss-call)的机会，并且因此提高测序的准确度。与商业染料相比，I-3染料的亮度的提高意指测序数据被改进。
详细描述
本发明涉及新颖的罗丹明染料化合物，其特别适于荧光检测和通过合成测序的方法。
根据第一方面，本发明提供式(I)的罗丹明染料化合物：
其中
M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
R16和R17可以独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。烷基可以被SO3 -取代。在R16或R17是被SO3 -被取代的烷基的情况下，SO3 -基团可以与反离子例如金属离子或铵离子配位。R16和R17可以是H。因此，本发明的化合物包括式(II)的化合物及其内消旋体：
其中M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基。
在R16和/或R17是未被取代的烷基–(CH2)nH或–(CH2)mH的情况下，n和m可以是1-6。因此，本发明的化合物包括式(IIa)的化合物：
其中M-是常见的反离子，
k、n和m独立地是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基。
n和m可以相同或不同。n可以是1、2、3、4、5或6。m可以是1、2、3、4、5或6。–(CH2)n-H或–(CH2)m-H可以是C1-6烷基，例如甲基、乙基或丙基，并且可以任选地被取代。
q可以是1、2、3、4、5或6。除(CH2)q连接基之外，连接基可以包含在任何碳原子或另外的杂原子处的取代基。例如，连接基可以包含以乙二醇类型的间隔基-(CH2CH2O)n-的形式的另外的氧原子。存在连接基以使生物分子通过以酸基团、酯基团或酰胺基团的形式的COR13残基附接至负责荧光的构建体的剩余部分并且以使生物分子从染料分子分离。
R1可以是H或烷基或被取代的烷基。R1可以被选择，使得当n是零时，R1可以不是H。R1可以是甲基或乙基。R1可以被连接至R2和/或R8以形成环结构。环可以是5元环或6元环。环可以是全部碳环，或可以含有另外的杂原子。
R2可以是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基。任选地，R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链。
R3可以是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基或烷氧基。任选地，R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链。
R4可以是H或烷基或被取代的烷基。当m是零时，R4不是H。R4可以是甲基或乙基。R4可以被连接至R3和/或R9以形成环结构。环可以是5元环或6元环。环可以是全部碳环，或可以含有另外的杂原子。
R5和R6可以是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基或烷氧基。任选地，R5可以被连接至R2，并且R6可以被连接至R3。
R8可以是H、卤素、羟基或烷氧基、烷基或被取代的烷基。任选地，R8可以与R1连接在一起以形成形成环的碳链或杂取代碳链。
R9可以是H、卤素、羟基或烷氧基、烷基或被取代的烷基。任选地，R9可以与R4连接在一起以形成形成环的碳链或杂取代碳链。
R7连同C＝O形成酸基团、酯基团或酰胺基团。特别地，R7可以是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。当R11和R12是H时，R7可以是OH或NH2。R7可以是烷氧基或具有一个或两个烷基和/或芳基的伯胺基团或仲胺基团。酯或酰胺COR7还可以任选地被取代。
R13连同C＝O形成酸基团、酯基团或酰胺基团。特别地，R13可以是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。R13可以是OH或NH2。R13可以是烷氧基或具有一个或两个烷基/芳基的伯胺或仲胺。酯或酰胺还可以任选地被取代。R13可以是NR14R15，其中R14是H或烷基并且R15是烷基或被取代的烷基。取代可以允许与生物分子的缀合。分子可以通过R13被附接至罗丹明染料核心结构片段，用于进一步使用。
本发明的化合物可以包括这样的化合物，在该化合物中R16和R17是未被取代的烷基–(CH2)nH和–(CH2)mH，其中n是1-3，R1、R4、R5、R6、R8和R9全部是H，R2和R3是H或CH3。这样的化合物在下式(III)中示出：
其中k、n和m独立地是从1至3的整数，
q是从1至6的整数，
R2和R3独立地是H或CH3，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基。
本发明的化合物可以包括这样的化合物，在该化合物中R16和R17是H，R1经由CH2基团的链被连接至R2或R8以形成环，并且R4经由CH2基团的链被连接至R3或R9以形成环。
本发明的化合物可以包括这样的化合物，在该化合物中R16和R17是H，R1经由CH2基团的链被连接至R2以形成6元环，并且R4经由CH2基团的链被连接至R3以形成6元环。这样的化合物在下式(IV)中示出：
其中k、n和m独立地是从1至3的整数，
其中，q是从1至6的整数。
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基。
本发明的染料可以包括其中R1、R4、R16或R17是H或烷基的化合物。烷基可以被SO3 -取代。本发明的化合物可以包括其中R1和R4是H并且R16和/或R17是SO3 -的化合物。
R13CO-(CH2)q-基团经由杂原子例如氧原子被连接至罗丹明染料核心结构片段。此杂原子可以被附接至罗丹明染料核心结构片段的苯环的碳原子中的任何。化合物可以作为位置异构体的混合物被制备且被使用，其中杂原子或氧原子存在于苯环的不同位置，或化合物可以作为单一异构体被制备且被使用。任选地，此类新的罗丹明染料的苯环可以含有用于进一步精细地调整它们的光谱参数的另外的取代基。
本发明的化合物包括根据式(Va)和式(Vb)的化合物，以及其混合物：
其中M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
本发明的化合物可以被附接至生物分子。本发明的化合物可以被附接至寡核苷酸。本发明的化合物可以被附接至核苷酸。化合物可以经由核苷酸碱基被附接至寡核苷酸或核苷酸。
对生物分子的附接可以经由COR7和/或R13CO(CH2)q-O-基团中的一个或经由这两个基团。R7和/或R13基团可以是烷基-、芳基-或杂氧基(heteryl-oxygroup)、具有可以用于附接的被取代的基团R15的伯胺或仲胺。特别地，COR7和/或R13CO(CH2)q-O-基团中的一个可以是最适于另外的酰胺/肽键形成的活化酯残基。
例如，R7和/或R13可以是：
本发明的化合物的实例包括：
其中，q是从1至6的整数。
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基。
另外的实例包括：
本发明的方面是用如本文描述的荧光化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有经由被取代的烷基R15附接的标记物。标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过连接基部分附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基(7-deazapurinebase)的C7位的标记物。
标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价附接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'OH阻断基团。
本文公开包含两种或更多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是用本发明的化合物标记的核苷酸。试剂盒可以包含两种或更多种标记的核苷酸。核苷酸可以用两种或更多种荧光标记物来标记。可以使用单种激发源激发标记物中的两种或更多种，该单种激发源可以是激光器。
试剂盒可以包含四种标记的核苷酸，其中四种核苷酸中的第一核苷酸用如本文公开的化合物来标记，并且第二核苷酸、第三核苷酸、和第四核苷酸各自用不同化合物来标记，其中每种化合物具有不同的最大吸收度并且化合物中的每种与其他三种化合物是可区分的。试剂盒可以使得化合物中的两种或更多种具有600nm以上的不同的最大吸收度。
本发明的化合物、核苷酸或试剂盒可以用于测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析或蛋白结合测定。该用途可以在自动测序仪器上进行。测序仪器可以包括在不同的波长下操作的两种激光。
本文公开新的式(Xa,b)的化合物，作为用于合成根据本发明的染料式(I)的起始物料，
其中q是1-6。
本文公开合成本发明的化合物的方法。式(Xa,b)的化合物可以用于与被取代的或未被取代的3-氨基苯酚衍生物或含有此结构片段的杂环衍生物的缩合反应中。
式(I)的染料已经通过优选地在高温下在用或不用路易斯酸催化剂的情况下使邻苯二甲酸衍生物(Xa,b)与3-氨基苯酚衍生物缩合来合成。反应还可以通过使用磷酸或多聚磷酸作为溶剂和/或催化剂来实现。缩合反应可以在用或不用催化剂的情况下在离子液体或高沸点极性有机溶剂如DMF、DMA、环丁砜或1,2-二氯苯中完成。
如本文使用的，术语“烷基”指的是C1-C20烃并且可以包括C3-C10非芳族的碳环。在特定的实施方案中，烷基是C1-C6烷基，该C1-C6烷基指的是分别含有一个和六个之间的碳原子的饱和的、直链的或支链的烃基。烷基可以包含一个或更多个不饱和的基团，并且因此包括烯基和炔基。
如本文使用的术语“卤素”指的是氟-(下文中指定为F)、氯-(下文中指定为Cl)、溴-(下文中指定为Br)或碘-(下文中指定为I)，并且通常涉及有机化合物中氢原子的取代，此取代任选地是氢的完全取代。
术语“被取代的烷基”，指的是如上文定义的烷基、烯基或炔基，其中它们可以任选地被(但不限于)卤素、氰基、SO3 -、SRa、ORa、NRbRc、氧代、CONRbRc、COOH和COORb进一步取代。Ra、Rb和Rc可以各自独立地选自H、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基和被取代的芳基。此外，所述被取代的烷基、被取代的烯基和被取代的炔基可以任选地通过选自O、NRb、S(O)t(其中t是0至2)以及类似物的至少一个杂原子或基团被中断。被取代的烷基还包括诸如苄基的基团，其中烷基包含另外的芳基或被取代的芳基部分。
根据本发明的染料可以由多种不同的起始物料合成，该起始物料包括3-氨基苯酚的N-和/或C-被取代的衍生物、5-羟基-和/或7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉衍生物和含有间氨基苯酚结构片段的其他类似的芳族的或杂环的起始物料。这些化合物与另外被取代的或未被取代的邻苯二甲酸衍生物式Xa,b的缩合给出如描述的染料。缩合反应通常在高温下在用或不用合适的溶剂的情况下进行，并且通过使用微波辐照来辅助。在所述缩合反应中使用离子液体作为溶剂是特别有利的。反应可以通过路易斯酸来催化。
根据本发明的染料还可以通过从羟基被取代的罗丹明染料式(XI)开始的常规烷基化方法来合成
M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
染料式(XI)可以通过3-氨基苯酚衍生物与如下描述的羟基-邻苯二甲酸衍生物的缩合来制备。
N-烷基-5-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉或N-磺酸烷基-7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉的制备可以使用化学氢化或催化氢化来实施，例如使用雷尼镍作为催化剂。有机碱或无机碱例如三乙胺的添加很大程度上提高了反应的速率。
用烷基磺内酯的3-氨基苯酚的单N-烷基化可以使用一当量的或更多当量的氨基苯酚来实施。3-氨基苯酚的双烷基化可以使用更多当量的烷基磺内酯来实现。两种生成的苯酚衍生物都可以与邻苯二甲酸酐缩合以制成如描述的荧光团。
根据本发明的方面，提供了适于附接至底物部分的染料化合物，该染料化合物特别地包含能够附接至底物部分的连接基。底物部分实际上可以是本发明的染料可以被缀合至的任何分子或物质，并且，通过非限制性实例的方式，底物部分可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机聚合物和无机聚合物、及其组合或组装物，例如染色体、细胞核、活细胞以及类似物。染料可以通过包括疏水吸引力、离子吸引力和共价附接的多种手段被任选的连接基缀合。特别地，染料通过共价附接被缀合至底物。更特别地，共价附接借助于连接基。
根据本发明的染料可以包括在取代基位置之一处的用于使染料共价附接至另一个分子的反应性连接基。反应性连接基团是能够形成共价键的部分。在特定的实施方案中，连接基可以是可裂解的连接基。术语“可裂解的连接基”的使用不意指暗示整个连接基需要被除去。裂解位点可以位于确保连接基的一部分在裂解之后仍附接至染料和/或底物部分的在连接基上的位置。通过非限制性实例的方式，可裂解的连接基可以是亲电性地可裂解的连接基、亲核性地可裂解的连接基、可光裂解的连接基、在还原条件(例如含有二硫化物或叠氮化物的连接基)、氧化条件下可裂解的、经由使用保险栓连接基可裂解的以及通过消除机理可裂解的。使用可裂解的连接基使染料化合物附接至底物部分确保标记物可以视需要在检测之后除去，避免了下游步骤中的任何干扰信号。
特定的连接基可以在未决的专利申请号WO2004/018493(通过引用并入本文)中发现，其中本发明人已经发现，使核苷酸的碱基连接至标记物诸如例如根据本发明的染料的某些连接基，可以使用水溶性磷化氢或由过渡金属和至少部分地水溶性的配体形成的水溶性过渡金属催化剂来裂解。在水溶液中，后者形成至少部分地水溶性的过渡金属络合物。
特定的连接基可以在申请人未决的国际申请WO2004/018493(通过引用并入本文)中发现并且可以包含下式的部分：
(其中X选自包含O、S、NH和NQ的基团，其中Q是C1-10被取代的或未被取代的烷基，Y选自包含O、S、NH和N(烯丙基)的基团，T是氢或C1-10被取代的或未被取代的烷基并且*指示该部分被连接至核苷酸或核苷的剩余部分)。
还又更特别地，本发明人在作为WO07020457公布的未决的英国专利申请号0517097.2(通过引用并入本文)中已确定，与通过本领域中已知的其他连接物附接至鸟嘌呤碱基的相同的荧光团相比，通过改变且特别地增加荧光染料(荧光团)和鸟嘌呤碱基之间的连接基的长度，通过引入聚乙二醇间隔基，可以增加荧光强度。当被并入至多核苷酸例如DNA中时连接基且尤其是它们的增加的长度的设计还允许附接至鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团的亮度的改进。因此，当染料用于需要检测附接至含有鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记物的任何分析方法中时，如果连接基包含式-((CH2)2O)n-的间隔基，其中n是2和50之间的整数，则是有利的，如在申请人未决的申请号GB0517097.2(WO07020457)中描述的。
本发明还提供用根据本发明的染料(改性的核苷酸)标记的核苷和核苷酸的缀合物。标记的核苷和核苷酸对于标记通过酶促合成形成的多核苷酸是有用的，例如，通过非限制性实例的方式，在PCR扩增、恒温扩增或固相扩增、包括固相测序的多核苷酸测序、切口平移反应及类似反应中。
核苷和核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处被标记。如本领域已知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或更多个磷酸酯基组成。在RNA中，糖是核糖并且在DNA中糖是脱氧核糖，即没有存在于核糖中的羟基的糖。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶是胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)或在RNA的情况下是尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9结合。核苷酸也是核苷的磷酸酯，在附接至糖的C-3或C-5的羟基上发生酯化。核苷酸通常是单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。
“核苷”在结构上与核苷酸相似但没有磷酸酯部分。核苷类似物的实例将是其中标记物被连接至碱基并且不存在附接至糖分子的磷酸酯基的那种。
尽管碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但技术人员将理解，不改变核苷酸或核苷经历沃森-克里克碱基配对的能力的衍生物和类似物是可用的。“衍生物”或“类似物”意指核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常相似但具有化学改性或物理改性(诸如例如允许衍生的核苷酸或核苷被连接至另一个分子的不同的或另外的侧基)的化合物或分子。例如，碱基可以是脱氮嘌呤。衍生物应当能够经历沃森-克里克配对。“衍生物”和“类似物”还意指具有改性的碱基部分和/或改性的糖部分的合成的核苷酸衍生物或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit，Nucleotideanalogs(JohnWiley&Son,1980)和Uhlman等人，ChemicalReviews90:543-584,1990中被讨论。核苷酸类似物还可以包含改性的磷酸二酯键，该改性的磷酸二酯键包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)键、氨基磷酸酯键以及类似物。
染料可以通过连接基被附接至核苷酸碱基上的任何位置，条件是沃森-克里克碱基配对仍旧可以进行。特定的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。如上所述，连接基可以用于将染料共价附接至核苷或核苷酸。
在特定的实施方案中，标记的核苷或核苷酸可以是酶促地可结合的和酶促地可延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接至化合物，使得该化合物不明显干扰核苷酸通过核酸复制酶的总体结合和识别。因此，连接基还可以包含间隔基单元。例如，间隔基使核苷酸碱基与裂解位点或标记物隔开。
用本发明的染料标记的核苷或核苷酸可以具有下式：
其中染料是根据发明的染料化合物，B是核碱基，诸如，例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤以及类似物并且L是可以或可以不存在的任选的连接基。R’可以是H、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯类似物、附接至反应性含磷基团的-O-或被阻断基团保护的-O-。R”可以是H、OH、亚磷酰胺或3'OH阻断基团并且R”’是H或OH。
在R”是亚磷酰胺的情况下，R’是酸可裂解的羟基保护基，所述羟基保护基允许在自动合成条件下的随后的单体偶联。
在特定的实施方案中，阻断基团是分开的并且独立于染料化合物，即不附接至染料化合物。在可选择的实施方案中，染料可以包含3'OH阻断基团的全部或一部分。因此，R”可以是可以包含或可以不包含染料化合物的3'OH阻断基团。
在还又另一个可选择的实施方案中，在戊糖的3'碳上没有阻断基团，并且附接至碱基的染料(或染料和连接基构建体)例如可以具有足以充当对另外的核苷酸从除了3'位点的点的并入的阻断物的大小或结构。因此，阻断可以归因于立体位阻或可以归因于大小、电荷和结构的组合。
当改性的核苷酸被并入时，阻断基团的使用允许聚合例如通过终止延伸来控制。如果阻断作用例如通过非限制性实例的方式通过改变化学条件或通过除去化学阻断物是可逆的，那么延伸可以在某些点终止并且然后允许继续。
在另一个特定的实施方案中，3'OH阻断基团将包含WO2004/018497(通过引用并入本文)中公开的部分。例如，阻断基团可以是叠氮甲基(CH2N3)或烯丙基。
在特定的实施方案中，连接基和阻断基团二者都存在并且是分开的部分，它们二者在大体上相似的条件下都是可裂解的。因此，脱保护和脱阻断过程可以是更有效的，因为将仅需要单次处理来除去染料化合物和阻断物二者。
本发明还包括并入根据本发明的染料化合物的多核苷酸。此类多核苷酸可以是分别包含用磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的DNA或RNA。根据本发明的多核苷酸可以包含天然存在的核苷酸、不同于本发明的改性的核苷酸的非天然存在(或改性的)的核苷酸、或其任何组合，条件是存在至少一种改性的核苷酸，即用根据本发明的染料化合物标记的。根据本发明的多核苷酸还可以包括非天然骨架连接和/或非核苷酸的化学改性。还预期包括包含根据本发明的至少一种改性的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物的嵌合结构。
包含根据本发明的染料化合物的改性的核苷酸(或核苷)可以用于需要检测附接至核苷酸或核苷的荧光标记物的任何分析方法中，无论以其自身或并入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合。在本上下文中，术语“并入多核苷酸中”要求5’磷酸酯用磷酸二酯键连接至自身可以形成较长多核苷酸链的一部分的第二(改性的或未改性的)核苷酸的3’羟基。本发明的改性的核苷酸的3’末端可以或可以不用磷酸二酯键连接至另外的(改性的或未改性的)核苷酸的5’磷酸酯。因此，在一个非限制性实施方案中，本发明提供检测并入多核苷酸中的改性的核苷酸的方法，所述方法包括：(a)将根据本发明的第三方面的至少一种改性的核苷酸并入多核苷酸中以及(b)通过检测来自附接至所述改性的核苷酸的染料化合物的荧光信号来检测并入多核苷酸中的改性的核苷酸。
该方法需要两个基本步骤：合成步骤(a)其中将根据本发明的一种或更多种改性的核苷酸并入多核苷酸中以及检测步骤(b)其中并入至多核苷酸中的一种或更多种改性的核苷酸通过检测或定量地测量它们的荧光来检测。
在本发明的一个实施方案中，在合成步骤中，至少一种改性的核苷酸通过聚合酶的作用并入多核苷酸中。然而，不排除将改性的核苷酸连接至多核苷酸的其他方法，诸如例如化学寡核苷酸合成或标记的寡核苷酸至未标记的寡核苷酸的连接。因此，在本发明的该方法的特定的情况下，术语将核苷酸“并入”多核苷酸中涵盖通过化学方法以及酶促方法的多核苷酸合成。
在特定的实施方案中，合成步骤可以包括：用包含本发明的荧光标记的改性的核苷酸和聚合酶的反应混合物在以下条件下温育模板多核苷酸链：该条件允许在退火成所述模板多核苷酸链的多核苷酸链上的游离的3'羟基和所述改性的核苷酸上的5'磷酸酯基之间形成磷酸二酯键。此实施方案包括合成步骤，其中多核苷酸链的形成通过核苷酸与模板链的互补碱基配对来引导。
在本方法的所有实施方案中，在将改性的核苷酸并入到其中的多核苷酸链被退火成模板链的同时，或在其中使两种链分开的变性步骤之后，可以实施检测步骤。另外的步骤，例如化学或酶促反应步骤或纯化步骤可以被包括在合成步骤和检测步骤之间。特别地，包含改性的核苷酸的靶链可以被分离或纯化并且然后被进一步加工或在随后的分析中被使用。通过实例的方式，在合成步骤中，用根据本发明的改性的核苷酸标记的目标多核苷酸可以随后用作标记的探针或引物。在其他实施方案中，合成步骤(a)的产物可以经受进一步的反应步骤，并且，如果需要，这些后续步骤的产物被纯化或分离。
用于合成步骤的合适的条件对于熟悉标准分子生物学技术的人员将是熟知的。在一个实施方案中，合成步骤可以类似于使用包括根据本发明的改性的核苷酸的核苷酸前体的标准引物延伸反应，以在合适的聚合酶的存在下形成与模板链互补的延伸的靶链。在其他实施方案中，合成步骤本身可以形成产生标记的双链扩增产物的扩增反应的部分，所述标记的双链扩增产物包括源自靶多核苷酸链和模板多核苷酸链的复制的退火的互补链。其他示例性“合成的”步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引物DNA标记等。在合成步骤中使用的聚合酶必须能够催化根据本发明的改性的核苷酸的并入。此外，聚合酶的精确性质不特别地受限制，但可以取决于合成反应的条件。通过实例的方式，如果使用热循环实施合成反应，那么需要热稳定的聚合酶，然而这对于标准引物延伸反应不是必要的。能够并入根据本发明的改性的核苷酸的合适的热稳定聚合酶包括在WO2005/024010或WO06120433中描述的那些。在于较低温度例如37摄氏度下实施的合成反应中，聚合酶不一定需要热稳定聚合酶，因此聚合酶的选择将取决于许多因素，例如反应温度、pH、链置换活性以及类似因素。
在特定的非限制性实施方案中，本发明涵盖用根据本发明的染料标记的改性的核苷酸或核苷在核酸测序、再测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分的方法中的应用、包括在并入多核苷酸中时检测改性的核苷酸或核苷的任何其他应用、或需要使用用包含根据本发明的荧光染料的改性的核苷酸标记的多核苷酸的任何其他应用。
在特定的实施方案中，本发明提供包含根据本发明的染料化合物的改性的核苷酸在多核苷酸“通过合成测序”反应中的用途。通过合成测序一般包括使用聚合酶或连接酶在5’至3’方向上将一种或更多种核苷酸或寡核苷酸顺次添加至生长的多核苷酸链，以便形成与待被测序的模板核酸互补的延伸的多核苷酸链。存在于添加的核苷酸的一种或更多种中的碱基的身份在检测步骤或“成像”步骤中被确定。添加的碱基的身份可以在每个核苷酸并入步骤之后被确定。然后，模板的序列可以使用常规沃森-克里克碱基配对法则来推论。使用用根据本发明的染料标记的改性的核苷酸用于确定单碱基的身份例如在单核苷酸多态性的评分中可以是有用的，并且此类单碱基延伸反应在本发明的范围内。
在本发明的实施方案中，模板多核苷酸的序列通过经由检测附接至并入的核苷酸的荧光标记物来检测将一种或更多种核苷酸并入至与待被测序的模板多核苷酸互补的新生链中而确定。模板多核苷酸的测序用合适的引物来引发(或制备为将包含作为发夹的一部分的引物的发夹构建体)，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中将核苷酸添加至引物的3’末端以阶梯式方式延伸。
在特定的实施方案中，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、G和C)中的每个可以用独特的荧光团来标记并且还包含在3’位的阻断基团以防止不受控制的聚合。可选择地，四种核苷酸中的一种可以是未被标记(深色的)。聚合酶使核苷酸并入与模板多核苷酸互补的新生链中，并且阻断基团阻止核苷酸的进一步并入。任何未并入的核苷酸被移除并且来自每个并入的核苷酸的荧光信号通过合适的手段例如采用激光激发和合适的发射滤光器的电荷耦合装置来光学地“读数”。然后，3’-阻断基团和荧光染料化合物特别地通过相同的化学方法或酶促方法移除(脱保护)，以暴露新生链用于进一步的核苷酸并入。通常，并入的核苷酸的身份将在每个并入步骤之后被确定，但这不是严格地必要的。相似地，美国专利号5,302,509公开对固定在固体支撑体上的多核苷酸测序的方法。该方法依赖于在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的、3’-阻断的核苷酸A、G、C和T并入与固定的多核苷酸互补的生长的链中。聚合酶并入与靶多核苷酸互补的碱基，但通过3’-阻断基团来阻止进一步的添加。然后，并入的核苷酸的标记物可以被确定并且阻断基团通过化学裂解除去以允许进一步的聚合发生。在通过合成测序的反应中待被测序的核酸模板可以是期望测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板将通常包含具有游离的3’羟基的双链区，该游离的3’羟基在测序反应中充当用于添加另外的核苷酸的引物或起始点。待被测序的模板的区域将使该游离的3’羟基悬垂于互补链上。待被测序的模板的悬垂区域可以是单链的，但可以是双链的，条件是“切口存在”于与待被测序的模板链互补的链上以提供用于引发测序反应的游离的3’OH基团。在此类实施方案中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方案中，包含游离的3’羟基的引物可以作为与待被测序的模板的单链区杂交的单独组分(比如，短寡核苷酸)被添加。可选择地，引物和待被测序的模板链可以各自形成能够形成分子内双链体诸如例如发夹环结构的部分地自补的核酸链的一部分。发夹多核苷酸和通过其它们可以被附接至固体支撑体的方法在申请人的共同未决的国际申请公布号WO0157248和WO2005/047301中被公开。核苷酸可以被相继地添加至游离的3’羟基，导致在5’至3’的方向上合成多核苷酸链。已经被添加的碱基的性质可以特别地但不一定地在每次核苷酸添加之后被确定，因此为核酸模板提供序列信息。在该上下文中，术语将核苷酸“并入”核酸链(或多核苷酸)中指的是经由形成具有核苷酸的5’磷酸酯基的磷酸二酯键将核苷酸连接至核酸链的游离的3’羟基。
待被测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或甚至是包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸的杂交分子。核酸模板可以包含天然存在的和/非天然存在的核苷酸以及天然或非天然的骨架连接，条件是这些不防止测序反应中的模板的复制。
在某些实施方案中，待被测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法例如经由共价附接来附接至固体支撑体。在某些实施方案中，模板多核苷酸可以被直接附接至固体支撑体(例如基于二氧化硅的支撑体)。然而，在本发明的其他实施方案中，固体支撑体的表面可以以某种方式被改性，以便允许模板多核苷酸的直接共价附接，或通过自身可以被非共价附接至固体支撑体的水凝胶或聚电解质多层使模板多核苷酸固定。
其中多核苷酸已经被直接附接至基于二氧化硅的支撑体的阵列是例如在WO00006770中公开的那些，其中多核苷酸通过玻璃上的侧环氧基团与多核苷酸上的内部氨基之间的反应被固定在玻璃支撑体上。此外，申请人在共同未决的国际专利申请公布号W02005/047301中公开例如用于制备SMA的通过基于硫的亲核体与固体支撑体的反应附接至固体支撑体的多核苷酸的阵列。固体支撑的模板多核苷酸的又另一个实例是其中模板多核苷酸被附接至被支撑于基于二氧化硅的支撑体或其他固体支撑体上的水凝胶。基于二氧化硅的支撑体通常用于支撑如在WO00/31148、WO01/01143、WO02/12566、WO03/014392、美国专利号6,465,178和WO00/53812中描述的水凝胶和水凝胶阵列。
模板多核苷酸可以被固定至的特定表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶在现有技术中被描述，它们中的某些在上文讨论。然而，特定的水凝胶在WO2005/065814中被描述。
DNA模板分子可以出于测序的目的被附接至珠或微粒，例如，如在美国专利号6,172,218中描述。制备每个珠含有不同的DNA序列的珠库的另外的实例可以在现有技术中发现(Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005))。使用如描述的核苷酸对此类珠的阵列测序在本发明的范围内。
待被测序的模板可以在固体支撑体上形成“阵列”的一部分，在这种情况下阵列可以采用任何便利的形式。因此，本发明的方法适用于所有类型的“高密度”阵列，包括单分子阵列、成簇的阵列和珠阵列。用本发明的染料化合物标记的改性的核苷酸可以用于对在通过使核酸分子固定在固体支撑体上形成的基本上任何类型的阵列且更特别地在任何类型的高密度阵列上的模板测序。然而，用本发明的染料化合物标记的改性的核苷酸在成簇的阵列的测序的情况下是特别有利的。
在多个多核苷酸(multi-polynucleotide)阵列或成簇的阵列中，阵列上的不同的区域包括多个多核苷酸模板分子。术语“成簇的阵列”指的是其中阵列上的不同的区域或位点包括通过光学手段不是单独可分辨的多个多核苷酸分子的阵列。取决于如何形成阵列，阵列上的每个位点可以包含一个单独多核苷酸分子的多个拷贝或少量的不同的多核苷酸分子的甚至多个拷贝(例如两种互补的核酸链的多个拷贝)。多个多核苷酸或核酸分子的成簇的阵列可以使用本领域通常已知的技术来产生。通过实例的方式，WO98/44151和WO00/18957二者都描述核酸的扩增的方法，其中模板和扩增产物二者都保持被固定在固体支撑体上以便形成包含固定的核酸分子的簇群或“集群”的阵列。存在于根据这些方法制备的成簇的阵列上的核酸分子是用于使用用本发明的染料化合物标记的改性的核苷酸测序的合适的模板。
用本发明的染料化合物标记的改性的核苷酸在对单分子阵列上的模板测序中也是有用的。如本文使用的术语“单分子阵列”或“SMA”指的是分布(或排列)于固体支撑体上的多核苷酸分子的群体，其中任何单独的多核苷酸与群体中的所有其他多核苷酸的间距使得可能产生多核苷酸的单独分辨。因此，固定至固体支撑体的表面上的靶核酸分子应当能够通过光学手段分辨。这意指在使用的特定成像装置的可分辨区域内，必须存在各自代表一种多核苷酸的一种或更多种不同的信号。
这可以实现，其中阵列上的相邻的多核苷酸分子之间的间距为至少100nm、更特别地为至少250nm、还更特别地为至少300nm、甚至更特别地为至少350nm。因此，每个分子作为单分子荧光点是单独地可分辨的且可检测的并且来自所述单分子荧光点的荧光还呈现单步光漂白。
本文使用术语“单独地分辨”和“单独分辨”来说明，当可视化时，可能使阵列上的一个分子与其邻近的分子相区别。阵列上的单独分子之间的分离将部分地通过用于分辨单独分子的特定技术被确定。单分子阵列的一般特征将通过参考公布的申请WO00/06770和WO01/57248来理解。尽管本发明的改性的核苷酸的一种用途是在通过合成测序的反应中，但改性的核苷酸的实用性不限于此类方法。事实上，核苷酸可以有利地用于需要检测附接至并入多核苷酸中的核苷酸的荧光标记物的任何测序方法中。
特别地，用本发明的染料化合物标记的改性的核苷酸可以用于自动荧光测序方案中，特别地用于基于Sanger及其合作者的链终止测序方法的荧光染料终止子循环测序中。此类方法一般使用酶和循环测序来将荧光标记的双脱氧核苷酸并入引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法和相关的方案(Sanger型)，依赖于具有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。
因此，本发明还涵盖用根据本发明的染料化合物标记的作为在3’位和2’位两处均没有羟基的双脱氧核苷酸的改性的核苷酸，此类改性的双脱氧核苷酸适用于Sanger型测序方法及类似方法中。
将认识到，用本发明的包含3’阻断基团的染料化合物标记的改性的核苷酸还可以具有在Sanger法和相关方案中的实用性，因为通过使用改性的的双脱氧核苷酸实现的相同的效果可以通过使用具有3’-OH阻断基团的改性的核苷酸来实现：二者都阻止后续核苷酸的并入。当根据本发明的且具有3'阻断基团的核苷酸将在Sanger型测序方法中使用时，将理解的是，附接至核苷酸的染料化合物或可检测的标记物不需要经由可裂解的连接基来连接，因为在本发明的标记的核苷酸被并入的每种情况下；不需要后续地并入核苷酸并且因此不需要从核苷酸移除标记物。
本发明还提供包含用根据本发明的染料标记的改性的核苷和/或核苷酸的试剂盒。此类试剂盒将一般包括用根据本发明的染料标记的至少一种改性的核苷酸或核苷以及至少一种另外的组分。另外的组分可以是另外的改性的或未改性的核苷酸或核苷。例如，用根据本发明的染料标记的改性的核苷酸可以以与未标记的或天然的核苷酸的组合和/或与荧光标记的核苷酸的组合或其任何组合供应。因此，试剂盒可以包含用根据本发明的染料标记的改性的核苷酸和用例如其他现有技术的染料化合物标记的改性的核苷酸。核苷酸的组合可以作为分开的单独组分或作为核苷酸混合物被提供。
当试剂盒包含用染料化合物标记的多种、特别地两种、更特别地四种的改性的核苷酸时，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物来标记，或一种可以是深色的，不具有染料化合物。当用不同的染料化合物标记不同的核苷酸时，试剂盒的特征在于，所述染料化合物是光谱地可区别的荧光染料。如本文使用的，术语“光谱地可区别的荧光染料”指的是，当两种或更多种这样的染料存在于一种样品中时，在可以通过荧光检测设备(例如，基于商用毛细管的DNA测序平台)区别的波长下发射荧光能量的荧光染料。当用荧光染料化合物标记的两种改性的核苷酸以试剂盒的形式被供应时，本发明的特征在于，光谱地可区别的荧光染料可以诸如例如通过相同的激光在相同的波长下被激发。当用荧光染料化合物标记的四种改性的核苷酸以试剂盒的形式被供应时，本发明的特征在于，光谱地可区别的荧光染料中的两种都可以在一个波长下被激发并且其他两种光谱地可区别的染料都可以以另一波长下被激发。特定的激发波长是532nm、630nm至700nm，特别是660nm。
在一个实施方案中，试剂盒包含用本发明的化合物标记的改性的核苷酸和用第二染料标记的第二改性的核苷酸，其中染料具有至少10nm、特别地20nm至50nm的最大吸收度的差异。更特别地，两种染料化合物具有15-40nm之间的斯托克斯位移，其中“斯托克斯位移”是峰值吸收波长和峰值发射波长之间的距离。
在另外的实施方案中，所述试剂盒还包含用荧光染料标记的两种其他改性的核苷酸，其中所述染料通过相同的激光在600nm至700nm、特别地630nm至700nm、更特别地660nm下被激发。其中染料具有至少10nm、特别地20nm至50nm的最大吸收度的差异。更特别地，两种染料化合物具有20-40nm之间的斯托克斯位移。还又更特别地，两种染料化合物具有600nm以上、特别地640nm以上的不同的最大吸收度。与本发明的罗丹明染料光谱地可区别的并且满足以上标准的特定染料是如在美国专利号5,268,486(例如Cy5)或WO0226891(Alexa647；MolecularProbesA20106)中描述的多次甲基类似物或如在美国专利号6,924,372中公开的不对称多次甲基。
在可选择的实施方案中，本发明的试剂盒可以包含其中相同碱基用两种不同的化合物标记的核苷酸。第一核苷酸可以用本发明的化合物标记。第二核苷酸可以用光谱地不同的化合物(例如在大于600nm处吸收的‘红色’染料)标记。第三核苷酸可以标记为本发明的化合物和光谱地不同的化合物的混合物，并且第四核苷酸可以是‘深色的’并且不含有标记物。因此，简言之，核苷酸1-4可以标记为‘绿’、‘红’、‘红/绿’以及深色。为进一步简化仪器，四种核苷酸可以用利用单种激光激发的两种染料来标记，并且因此核苷酸1-4的标记可以是‘绿1’、‘绿2’、‘绿1/绿2’和深色。
核苷酸可以包含本发明的两种染料。其中R1和R4是H的染料在比其中R1和R4是烷基的染料更低的波长处吸收。试剂盒可以包含两种或更多种用本发明的染料标记的核苷酸。试剂盒可以包含用本发明的其中R1和R4是H的化合物标记的核苷酸，以及用本发明的其中R1和R4是烷基的化合物标记的第二核苷酸。试剂盒可以包含另外的核苷酸，其中核苷酸的一部分用本发明的其中R1和R4是H的化合物来标记，并且核苷酸的第二部分用本发明的其中R1和R4是烷基的化合物来标记。试剂盒还可以包含未标记的核苷酸。
在其他实施方案中，试剂盒可以包含能够催化将改性的核苷酸并入至多核苷酸中的聚合酶。待被包含在此类试剂盒中的其他组分可以包括缓冲液及类似物。用根据本发明的染料标记的改性的核苷酸，和包括不同核苷酸的混合物的其他任何核苷酸组分可以以待在使用之前被稀释的浓缩形式被提供在试剂盒中。在此类实施方案中，还可以包括合适的稀释缓冲液。
注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非清楚地且明确地受限于一个指示物。对本领域技术人员将明显的是，可以对本文描述的各种实施方案作出各种修改和变型而不偏离本教导的精神或范围。因此，意图的是，本文描述的各种实施方案覆盖在所附权利要求及其等同物的范围内的其他修改和变型。
实验细节
4-羟基邻苯二甲酸二乙酯(2.1)
该化合物通过在浓硫酸的存在下用过量的乙醇(绝对乙醇)酯化从4-羟基邻苯二甲酸2.0来制备。
制备：
在室温下，在搅拌下向容纳绝对乙醇(250ml，～200g，～4.3mol)的0.5L的圆底烧瓶分成若干部分地添加4-羟基邻苯二甲酸2.0(15g，82.4mmol)。然后，在此之后的是添加0.5ml(～0.92g，9.4mmol)的浓硫酸。该混合物在室温下搅拌半小时，并且然后用冷凝器使其进一步回流24小时。
使用下降式冷凝器(descendedcondenser)将约一半溶剂体积蒸馏出去并且在减压下除去剩下的溶剂。将粘的油状残留物溶解在400mlDCM中。向该溶液分成小部分地小心地添加1.5g无水碳酸钾。该混合物在室温下被保持搅拌持续约2小时，然后通过～100g的硅胶过滤。硅胶用DCM进一步洗涤以洗脱更多吸收的产物。合并的有机级分用无水硫酸镁(～5g)干燥过夜。将固体滤去，并且用DCM进一步洗涤。在减压下蒸发溶剂。
作为无色油状产物获得的该酯2.1在不进一步纯化的情况下被用于下一个步骤中。
收率：22g(～99％)。
1HNMR:(400MHz,DMSO-d6)δ10.59(s,1H),7.68(d,J＝8.5Hz,1H),7.07–6.76(m,2H),4.22(dq,J＝13.4,7.1Hz,4H),1.25(td,J＝7.1,3.3Hz,6H)。
4-[(3-乙氧羰基)丙氧基]邻苯二甲酸二乙酯(2.2)
该化合物通过在乙醇中从4-羟基邻苯二甲酸二乙酯2.1开始经由3,4-双(乙氧羰基)苯酚钾的预先形成并且然后通过在相同反应锅中用4-溴丁酸乙酯烷基化来制备。
制备：
向酯2.1(2g，8.4mmol)在绝对乙醇(20ml)中的溶液缓慢地添加固体叔丁醇钾(1.1g，9.8mmol，1.15当量)。反应混合物在室温下保持一小时，并且然后添加4-溴丁酸乙酯(2g，～1.5ml)。反应在室温下保持一小时，并且然后用冷凝器在回流下加热过夜。
反应混合物用冰浴冷却(多达约0-5℃)持续3-4小时。将无机沉淀滤去并且用冷的绝对乙醇进一步洗涤。将沉淀弃去并且在减压下浓缩合并的滤液。
含有某些无机固体的残留物用DCM-石油醚的混合物(7:3，50ml)稀释并且过滤通过一段短的硅胶(～10g)柱。硅胶用DCM-MeOH(97:3，～150ml)进一步洗涤以洗脱更多吸收的产物(使用TLC监测产物洗脱的完成；如果需要，则使用更多洗脱溶剂)。合并的有机级分用无水硫酸镁(～1g)干燥过夜并且在减压下蒸发。
该酯2.2在不进一步纯化的情况下被用于下一个步骤中。收率：2g(67.6％)。
1HNMR:(400MHz,甲醇-d4)δ7.87–7.77(m,1H),7.18–7.05(m,2H),4.33(dq,J＝14.5,7.1Hz,4H),4.21–4.07(m,4H),2.53(t,J＝7.3Hz,2H),2.17–2.04(m,2H),1.36(td,J＝7.1,3.5Hz,6H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)。
4-(3-羧基丙氧基)邻苯二甲酸(2.3)
邻苯二甲酸的该衍生物通过用氢氧化钠的水溶液皂化来自前述步骤的三乙酯2.2来制备。
制备：
向配备有搅拌器和冷凝器的圆底烧瓶倾倒100ml去离子水，并且然后分成小部分地添加NaOH(5g，125mmol)。在氢氧化钠溶解之后，添加三乙酯2.2(10.5g，～30mmol)。反应混合物在110℃(加热块)下剧烈搅拌5小时。在约3小时之后，油状起始物料2.2溶解。过滤反应溶液并且将收集的滤液转移至圆底烧瓶。约10-15ml的含有在反应期间形成的乙醇和水的液体用下降式冷凝器蒸馏出去。剩下的溶液通过冰浴(0-5℃)冷却。
在搅拌下，向该冷溶液缓慢地添加浓盐酸(37％，11ml，135mmol)。该混合物的pH通过指示剂来检查以确保矿物酸的过量。在此之后，很快形成作为白色沉淀的预期产物。混合物在～0-5℃下保持一小时。过滤沉淀，用若干ml的冷水洗涤并且然后干燥过夜。
该产物2.3在不进一步纯化的情况下被用于下一个步骤中。然而，如果需要，该产物可以通过从水中结晶被纯化。收率：5.1g，64％。
1H-NMR:
(400MHz,CF3COO-d)δ11.62(d,J＝1.5Hz,6H),8.10(dd,J＝8.8,1.5Hz,1H),7.36(d,J＝2.4Hz,1H),7.23–7.14(m,1H),4.24(td,J＝5.9,1.6Hz,2H),2.76(td,J＝7.2,1.6Hz,2H),2.35–2.24(m,2H)。
4-(3-羧基丙氧基)邻苯二甲酸酐(2.4)
酸酐2.4的制备可以通过以下来实现：使酸2.3与脱水试剂如乙酸酐反应，在高温下预加热酸2.3或仅仅使酸2.3保持在具有无机脱水试剂的分析器中。
4-乙酰氧基邻苯二甲酸酐(2.5)
该化合物根据在文献(Synthesis2008，第3415页)中公布的程序从4-羟基邻苯二甲酸2.0开始用过量的乙酸酐脱水来制备。
向4-羟基邻苯二甲酸2(5.39g)在甲苯(100ml)中的溶液添加乙酸酐(25ml)，并且使混合物回流2h。第二天，滤去结晶的产物。收率2.6g(42.5％)。
染料(XI-1)合成：
向圆底烧瓶添加4-乙酰氧基邻苯二甲酸(1.03g)、3-乙基氨基甲酚(2.0g)和焦硫酸钾(1.5g)。试剂用刮刀小心地混合在一起并且在150℃(加热块)下加热6h。在此时间期间，形成越来越强的红颜色并且反应混合物凝固。TLC(乙腈-水，20％)和HPLC(280nm)二者都被用于通过监测染料和起始的3-乙基氨基甲酚的比率来检查反应进程。在约5小时之后，该比率保持大约恒定。向反应混合物添加10ml水并且滤去粉色产物。将沉淀放入圆底烧瓶中，添加甲醇(50ml)并且使混合物回流10min。在真空下除去约3/4的溶剂，并且将该红色溶液静置过夜。滤去作为红色晶体的产物。收率1g(46％)。
如果需要，可以通过色谱法分离异构体。
染料(I)合成：
作为结构异构体的混合物的目标化合物通过邻苯二甲酸2.3与7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉在高温下缩合来合成。反应通过使用作为催化剂且也作为溶剂的磷酸酐来完成。
染料(I-1)和(I-2)
反应方案:
制备：
4-(3-羧基丙氧基)邻苯二甲酸(0.268g)和0.5g的1-丁基-3-甲基-咪唑鎓硫酸氢盐(IL-HSO4)在125℃下加热1h，以用于完成酸酐(Xa-2.4)形成。添加7-羟基-四氢-二氢喹啉(0.298g)并且使反应混合物在175℃下搅拌2h。
形成具有强荧光的红色化合物。CH3CN-水(4:1)中的TLC对照确证染料形成。在175℃下的加热继续持续另外的3h。
将该粗制材料溶解在CH3CN-水混合物(10％)中并且通过硅胶快速柱色谱法来纯化。收集红色级分并且蒸发溶剂。
染料(I-1):收率18mg(16％)。
染料(I-2):收率9mg(8％)。
作为结构异构体的混合物的目标化合物通过邻苯二甲酸2.3与3-乙基氨基-4-甲基-苯酚在高温下缩合来合成。反应通过在用或不用高沸点极性有机溶剂如DMF、DMA、环丁砜或1,2-二氯苯的情况下使用磷酸酐作为催化剂来完成。
该反应可以使用二硫酸钾作为催化剂来实施。该试剂充当温和的路易斯酸，其可以刺激起始物料和/或所形成的中间体的形成和/或进一步反应。因此，反应温度是较低的并且减少了副产物的量。已使用的催化剂和溶剂的性质不仅对反应收率和产物的纯度发挥明显的作用，而且对异构体染料形成的区域选择性也发挥明显的作用。以此方式，可以实现作为普遍的异构体的一种或另一种异构体的形成。
此外，某些离子液体(IL)可以在反应收率和产物纯度二者上改进罗丹明染料形成。我们用某些IL还已经对染料(I)的合成实现了确定的改进。在我们测试的IL(1-乙基-3-甲基-咪唑鎓季盐家族和某些四烷基铵盐)之中，某些有效地促进一种或另一种异构体的形成并且供应了更清洁的产物(反应混合物中的较少的有颜色的副产物)。
染料(I-3)和(I-4)
化学名称：
(I-3)：3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧基-5-(3-羧基丙氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱
(I-4)：3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧基-4-(3-羧基丙氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱
反应方案:
制备：
向圆底烧瓶添加4-羧基丙氧基邻苯二甲酸(1.0g，3.73mmol)、3-乙基氨基-甲酚(2.0g，13.23mmol)、IL-CF3(1.72g，6.61mmol)和焦硫酸钾(1.68g，6.61mmol)。试剂用刮刀小心地混合在一起并且在150℃(加热块)下加热10h。在此时间期间，形成越来越强的红颜色并且反应混合物凝固。
TLC(乙腈-水，20％)和HPLC(280nm)二者都被用于通过监测染料和起始的3-乙基氨基甲酚的比率来检查反应进程。在10小时之后，该比率保持大约恒定。
将反应混合物冷却至室温，并且将红色固体溶解在甲醇(～20ml)中。滤去无色不可溶的无机材料。将三乙胺(2ml)添加至滤液并且将得到的溶液应用至BiotageC18Samplet(40g)。然后，将该Samplet在真空中干燥以除去大部分溶剂。
产物通过使用0.1MTEAB在水和乙腈中的混合物作为洗脱溶剂(梯度17-27)的在400gC18柱上的BiotageIsolera-4仪器上的快速色谱法来分离。产物收集波长设定为520nm，并且将对照波长设定为280nm以监测与过量的起始物料和所形成的无色副产物的分离。
收集橙黄色级分。将溶剂通过旋转蒸发仪在真空中除去。剩下的固体红色残留物用石油醚(60-95℃,25ml)研磨并且滤去作为红色粉末的产物I-3并且在空气中干燥。
收率：0.50g，(29％)。
(I-3)：
1H-NMR:
(400MHz,DMSO-d6)δ7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.18(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.58(d,J＝2.2Hz,1H),6.30(s,2H),6.25(s,2H),5.26(t,J＝5.4Hz,2H),3.95(t,J＝6.4Hz,2H),3.22–3.10(m,4H),2.30(d,J＝7.3Hz,2H),1.91(s,8H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(I-4)：
收率：0.16g，(9％)。
染料(I-5)I-3-NHS
反应方案:
制备：
染料(I-3)在高真空下干燥过夜，然后取35mg样品(68μmol)并且放入圆底烧瓶中。将无水DMF(3mL)和Hunig碱(678μmol，116μL)添加至烧瓶。混合物由于形成环状衍生物(IC)而变得几乎无色并且在氮气气氛下搅拌约20min。然后，添加TSTU(80μmol，25mg)。形成亮粉色。反应混合物在室温下搅拌1h。
通过TLC(CH3CN中20％H2O)检查进程。该内酯可以通过从溶液沉淀或仅在真空中蒸馏溶剂来分离。以此方式制备的NHS酯(I-5)在不进一步纯化和从溶液分离的情况下被用于偶联。如果需要，NHS酯可以通过沉淀例如通过用乙酸乙酯沉淀从溶液分离，滤去并干燥。
染料(I-6)I-3-PEG12
反应方案:
制备：
将NH2Peg12COOH(203μmol，126mg)在水(300μL)中的溶液添加至如上所述地制备的(I-5)的溶液并且使反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC(乙腈中20％H2O)检查反应的完成。在偶联完成之后，添加0.1MTEAB的水溶液(4mL)并且使混合物在～20℃下搅拌1h以淬灭反应性中间体。在真空下除去溶剂。将残留物溶解在10ml0.1MTEAB中。将该溶液过滤通过0.2nm孔径的注射器过滤器并且被转移至5mLHPLC小瓶中，用于HPLC纯化。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化。收集具有吸收最大值526nm的级分。收率47μmol(70％)。
染料(I-7)I-4-NHS
反应方案:
制备：
染料(I-4)在高真空下干燥过夜，然后取28mg样品。将无水DMF(3mL)和Hunig碱添加至烧瓶。混合物变成几乎无色。将环状形式的溶液在氮气气氛下搅拌约20min。然后，添加TSTU(25mg)。形成亮粉色。将反应混合物在RT下搅拌1h。通过TLC(MeCN中20％H2O)检查进程。NHS-酯Rf～0.7。在2h内完成活化。
以此方式制备的NHS酯(I-7)在不进一步纯化和从溶液分离的情况下被用于偶联。如果需要，NHS酯可以通过用乙酸乙酯沉淀从溶液分离，滤去并干燥。
染料(I-8)I-4-PEG12
反应方案:
制备：
将NH2Peg12COOH(100mg)在水(300μL)中的溶液添加至如上所述地制备的(I-7)的溶液并且使该反应混合物在RT下搅拌过夜。通过TLC(乙腈中20％H2O，真空中干燥的板)检查反应的完成(NHS酯消耗)。为了后处理，添加在水(4mL)中的0.1MTEAB并且使混合物在～20℃下搅拌1h。在真空下除去溶剂。将残留物溶解在10ml0.1MTEAB中。将该溶液过滤通过0.2nm孔径的注射器过滤器并且被转移到两个5mLHPLC小瓶中，用于通过HPLC纯化。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化。收集具有吸收最大值520nm的级分。收率41μmol(76％)。
染料(I-9)pppG-I-3-PEG12
反应方案:
制备：
将无水DMA(7mL)和Hunig碱(0.082mL)添加至(I-6)的干燥样品(52mg)。然后，添加TSTU(17mg)在1mL的干燥DMA中的溶液。系统用氮气冲洗两次并且然后使反应混合物在室温下搅拌1h。根据TLC(CH3CN中20％H2O)完成活化。
在活化开始后，pppG-LN3的溶液(3mL的备料3.5mM)抽真空至干燥。在活化完成之后，将该溶液加至pppG。将反应在氮气气氛下在室温下搅拌3h。在乙腈中的20％H2O为TLC对照。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(4mL)并且将混合物在室温下搅拌10min。
纯化：用～20g的DEAE交联葡聚糖树脂在0.05MTEAB溶液中的悬浮液将溶液应用于柱并且用TEAB洗涤，从0.1M一直到0.4M。将有色级分合并、与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。
然后，将残留物重新溶解在TEAB0.1M中。将该溶液通过0.2nm孔径的注射器过滤器过滤至康宁烧瓶中，并且然后转移至高回收率的5mLHPLC小瓶中，用于HPLC纯化。该溶液可以储存在冰箱中直到纯化。
产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB作为洗脱剂的HPLC纯化。收集具有525nm的吸收的级分。收率：54％。
染料(I-10)pppG-I-4-PEG12
反应方案:
制备：
染料(I-8)在第二制备HPLC纯化之后干燥并且溶解在无水DMA(3mL)中并且然后添加Hunig碱(0.036g)。然后，添加TSTU(11mg)在1mL的干燥DMA中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3h。根据TLC(CH3CN中20％H2O)完成活化。
pppG-LN3的溶液(1.6mL的备料35.5mM)抽真空至干燥。在完成(I-8)的活化之后，将该溶液添加至pppG。将反应在氮气气氛下在室温下搅拌2h。TLC(乙腈中20％H2O)对照指示反应进程。将反应混合物保持在～4℃下过夜，然后添加0.1MTEAB(4mL)并且使混合物在室温下搅拌10min。
离子交换纯化：用～20g的DEAE交联葡聚糖树脂在0.05MTEAB溶液中的悬浮液将该溶液应用于柱并且用TEAB洗涤，从0.1M一直到0.35M。
将以约0.35MTEAB洗脱的有色级分合并、与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。
纯化：与前述化合物相似。收率：14μmol(51％)。
染料(I-11)pppT-I-3
反应方案:
制备：
将无水DMA(15mL)和Hunig碱添加至染料(I-3)的干燥样品(60mg)。形成内酯IC的无色溶液。然后将TSTU(0.50g)在5mL的干燥DMA中的溶液添加至该溶液。形成红色的活化酯(I-6)。将反应混合物在室温下搅拌1h。根据TLC(MeCN中20％H2O)完成活化。在活化完成之后，将该溶液添加至pppT-LN3(0.23g)在水(10mL)中的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌3h。通过TLC(乙腈中20％H2O)检查偶联进程。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且将混合物在室温下搅拌10min。用在水中的0.05MTEAB溶液中的～50g的DEAE交联葡聚糖树脂悬浮液将反应混合物应用于柱并且用TEAB洗涤(浓度梯度从0.1M一直到0.5M)。收集有色级分并且蒸发，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将残留物重新溶解在TEAB0.1M中。将该溶液通过0.2nm孔径的注射器过滤器过滤至康宁烧瓶中并且储存在冰箱中。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化，收集具有在520nm处的吸收的级分。收率57％。
染料(I-12)pppT-I-4
反应方案:
制备：
将无水DMA(5mL)和Hunig碱(0.02mL)添加至染料(I-4)的干燥样品(20mg)。形成内酯IC的无色溶液。然后将TSTU(0.175g)在1mL的干燥DMA中的溶液添加至该溶液。形成红色活化酯(I-6)。将反应混合物在室温下搅拌1h。根据TLC(MeCN中20％H2O)完成活化。在活化完成之后，将该溶液添加至pppT-LN3(77mg)在水(3mL)中的的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌3h。通过TLC(乙腈中20％H2O)检查偶联进程。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(2mL)在水中的溶液并且将混合物在室温下搅拌10min。用在水中的0.05MTEAB溶液中的～20g的DEAE交联葡聚糖树脂悬浮液将反应混合物应用于柱并且用TEAB洗涤(浓度梯度从0.1M一直到0.5M)。收集有色级分并且蒸发，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将残留物重新溶解在TEAB0.1M中。将该溶液通过0.2nm孔径的注射器过滤器过滤至康宁烧瓶中并且储存在冰箱中。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化，收集具有在520nm处的吸收的级分。收率57％。
染料(I-13)pppT-I-1
反应方案:
制备：
将无水DMA(10mL)和Hunig碱(0.04mL)添加至染料(I-1)的干燥样品(40mg)。形成内酯IC的无色溶液。然后将TSTU(0.35g)在5mL的干燥DMA中的溶液添加至该溶液。形成红色的活化酯。将反应混合物在室温下搅拌1h。根据TLC(MeCN中20％H2O)，完成活化。在活化完成之后，将该溶液添加至pppT-LN3(0.18g)在水(10mL)中的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌3h。通过TLC(乙腈中20％H2O)检查偶联进程。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且使混合物在室温下搅拌10min。用在水中的0.05MTEAB溶液中的～50g的DEAE交联葡聚糖树脂悬浮液将反应混合物应用于柱并且用TEAB洗涤(浓度梯度从0.1M一直到0.5M)。收集有色级分并且蒸发，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将残留物重新溶解在TEAB0.1M中。将该溶液通过0.2nm孔径的注射器过滤器过滤至康宁烧瓶中并且储存在冰箱中。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化，收集具有在535nm处的吸收的级分。收率60％。
染料(I-14)pppT-I-2
反应方案:
制备：
将无水DMA(10mL)和Hunig碱(0.04mL)添加至染料(I-2)的干燥样品(40mg)。形成内酯IC的无色溶液。然后将TSTU(0.35g)在5mL的干燥DMA中的溶液加至该溶液。形成红色的活化酯。将反应混合物在室温下搅拌1h。根据TLC(CH3CN中20％H2O)，完成活化。在活化完成之后，将该溶液添加至pppT-LN3(0.18g)在水(10mL)中的溶液。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌3h。通过TLC(乙腈中20％H2O)监测偶联反应进程。将反应混合物用冰浴冷却至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且将混合物在室温下搅拌10min。用在水中的0.05MTEAB溶液中的～50g的DEAE交联葡聚糖树脂悬浮液将反应混合物应用于柱并且用TEAB洗涤(浓度梯度从0.1M一直到0.5M)。收集有色级分并且蒸发，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将残留物重新溶解在TEAB0.1M中。将该溶液通过0.2nm孔径的注射器过滤器过滤至康宁烧瓶中并且储存在冰箱中。产物通过使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC纯化，收集具有在535nm处的吸收的级分。收率45％。
新的染料相对于已知的染料的表征
温度强度
染料(I-1)和(I-3)的1.10-6M溶液的归一化荧光强度与可商购的染料Atto532在不同温度下关于相同的光谱区域进行比较。测量染料在20℃、40℃和60℃下的强度。图1示出染料在每个温度下的相对强度。商业染料Atto532示出相对于I-1和I-3染料的在较高温度下荧光强度的较大损失。图1证实新的染料在基于水的溶液中的荧光随着温度是较少可变的。
当与核苷酸缀合时的强度
当pppT与可商购的染料Atto532缀合时，将染料-核碱基缀合物(I-13)-T和(I-11)-T的1.10-6M溶液的归一化荧光光谱与结构类似物相比较。
图2证实基于这些新的染料的核碱基缀合物在基于水的溶液中的荧光高于可商购的染料(当被532nm的光激发时)。在相同的核苷酸浓度下，1-3染料比atto532染料更亮。与atto532染料相比，I-1染料发生红移。
图3证实新的染料在基于水的溶液中的荧光较少地取决于温度。将当与核碱基缀合时的染料T-(I-11)和T-(I-13)的1.10-6M溶液的归一化荧光强度与和相同的T-核碱基缀合的可商购的染料Atto532相比较。与atto-532相比，I-1染料和I-3染料二者在升高的温度下都示出较高的荧光强度。
测序数据
图4证实与当相同的核碱基与可商购的染料Atto532(对照1)缀合时的标准荧光团组相比，更好地区分当用根据本发明的新染料(I-3)(泳道6)标记核碱基时的荧光信号。图4示出在Illumina4颜色测序运行中红色强度相对于绿色强度的标绘图。染料信号的组之间的较高的距离降低误称的机会，并且因此提高测序的准确度。与商业染料相比，I-3染料的亮度的提高意指测序数据被改进。

Claims (24)

1.一种式I的化合物及其内消旋体：
其中M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
q是从1至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，
R13是OR14或NR14R15，其中R14和R15独立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取代的芳基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R16是烷基并且R17是烷基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中R1、R4、R5、R6、R8和R9全部是H，R2和R3是H或CH3。
4.如权利要求1所述的化合物，其中R16和R17是H。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R1经由CH2基团的链被连接至R2或R8以形成环，并且R4经由CH2基团的链被连接至R3或R9以形成环。
6.如权利要求5所述的化合物，其中R1和R2形成六元环，R3和R4形成六元环，R5、R6、R8和R9是H。
7.如权利要求1所述的化合物，其中R1、R4、R16和R17中的一种或更多种是被SO3 -基团取代的烷基。
8.如权利要求1-7所述的化合物，其中R7是OH。
9.如权利要求1-8所述的化合物，其中q是3。
10.如权利要求1-9所述的化合物，其中R13是OH。
11.如权利要求1-9所述的化合物，其中R13是NR14R15，其中R14是H或烷基并且R15是烷基或被取代的烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述化合物经由被取代的烷基R15被附接至核苷酸或寡核苷酸。
13.一种用根据权利要求1-12所述的化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。
14.根据权利要求13所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中标记物经由被取代的烷基R15被附接。
15.根据权利要求13或14所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中标记物通过连接基部分被附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。
16.根据权利要求13-15所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，还包含共价附接至所述核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'OH阻断基团。
17.一种试剂盒，包含两种或更多种核苷酸，其中至少一种核苷酸是根据权利要求13-16所述的标记的核苷酸。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述标记的核苷酸中的两种使用单种激光来激发。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中四种核苷酸的第一核苷酸是根据权利要求13-16所述的标记的核苷酸，并且第二核苷酸、第三核苷酸、和第四核苷酸各自用不同的化合物来标记，其中每种化合物具有不同的最大吸收度并且所述化合物中的每种与其他三种化合物是可区分的。
20.根据权利要求17所述的试剂盒，其中四种核苷酸的第一核苷酸是根据权利要求13-16所述的标记的核苷酸，并且所述化合物中的两种具有600nm以上的不同的最大吸收度。
21.根据权利要求13-16中任一项所述的核苷酸、根据权利要求13-16所述的寡核苷酸或根据权利要求17-20中任一项所述的试剂盒在测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析或蛋白结合测定中的用途。
22.根据权利要求22所述的用途，是在自动测序仪器上进行，其中所述自动测序仪器包括在不同波长下操作的两种光源。
23.一种合成根据权利要求1所述的化合物的方法，所述方法从邻苯二甲酸衍生物式Xa或Xb开始，
其中q是1-6。
24.一种式(XI)的化合物：
其中M+/-是常见的反离子，
k是从0至6的整数，
R1是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R2是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R2连同R1或R5是形成环的碳链或杂取代链，
R3是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羧基、甲酰胺基、羟基-或烷氧基，或R3连同R4或R6是形成环的碳链或杂取代链，
R4是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
R5和R6是H、烷基或被取代的烷基、卤素、羟基-或烷氧基，
R8是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R1是形成环的碳链或杂取代碳链，
R9是H、卤素、羟基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或连同R4是形成环的碳链或杂取代碳链，
R7是OR11或NR11R12，其中R11和R12独立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
R16和R17独立地是H或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
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