CN109476674A - 香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途 - Google Patents

香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及新的香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途。该化合物可以在核酸测序应用中被用作用于核苷酸的荧光标记物。

Description

香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途
背景
领域
本申请涉及香豆素化合物。该化合物可以被用作荧光标记物，特别是用于在核酸测序应用中的核苷酸标记。
背景
利用荧光标记物的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要的技术。在重组DNA技术中采用的许多程序先前依赖于用例如32P放射性地标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允许核酸和其他感兴趣的分子的灵敏检测。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的限制，例如它们的费用、有限的储存期以及更重要的安全性考量。消除对放射性标记物的需求增强了安全性，同时降低了与例如试剂处置有关的环境影响和成本。适合于非放射性荧光检测的方法通过非限制性实例的方式包括自动DNA测序、杂交方法、聚合酶链反应产物的实时检测以及免疫测定。
对于许多应用，合意的是，采用多个光谱上可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在这样的多重方法中，反应容器的数目可以被减少，以简化实验方案并且有助于生产特定应用的试剂盒。在多色自动DNA测序系统中，例如，多重荧光检测允许在单个电泳泳道中分析若干不同的多核苷酸碱基。与使用单色的检测系统相比，这增加了吞吐量(throughput)，并且还可以降低与泳道间的电泳迁移率变化有关的不确定性。
然而，多重荧光检测可能是有问题的并且存在限制荧光标记物的选择的许多重要因素。首先，难以找到其吸收光谱和发射光谱被适当地在光谱上分辨的染料化合物。此外，当若干荧光染料一起使用时，同时激发可能是困难的，因为用于不同光谱区的染料的吸收带可以被宽泛地分开。许多激发方法使用高功率激光并且因此染料必须具有足够的光稳定性以承受这样的激光激发。分子生物学方法中特别重要的最终考量是荧光染料必须与试剂化学相容。因此，例如，DNA合成或测序反应中使用的荧光染料必须与那些反应中使用的溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶相容。在一个实例中，PCT公布第WO 2007/135368号描述了一类用作荧光标记无的罗丹明化合物。
香豆素染料家族因其显著的光谱性质已经吸引化学家的注意力。然而，仅存在很少可商购的具有大的斯托克斯位移(Stokes shift)(LSS)的光稳定荧光染料。这些染料中的大多数还包含作为支架(scaffold)的香豆素片段。例如，来自Dyomic的大多数染料是在约480nm-520nm处吸收，并在560-630的区域内发射的香豆素衍生物。这类香豆素染料的其他实例包括如在美国公布第2014/0220588号中公开的基于磷酸化香豆素的染料和来自Abperior的可商购的染料Star440SXP和Star470SXP。另一种特别有用的香豆素染料是AlexaFluorTM430，其分别在434nm和539nm处具有吸收最大值和发射最大值。其他LSS荧光染料包括Pacific OrangeTM(吸收390nm，发射540nm；斯托克斯位移150nm，Invitrogen)和HorizonTMV500(吸收415nm，发射500nm；斯托克斯位移85nm，BD Biosciences)、ChromeoTM494(吸收494nm，发射628nm，斯托克斯位移134nm，Active Motive)。
概述
本文描述的是新颖的香豆素衍生物和其作为生物分子标记物、特别地作为用于核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。当这样的染料被用于制备生物分子缀合物(conjugate)时，由于使用这些新的荧光化合物，可以看到在可获得的测序读数(sequencing read)的长度、强度和质量方面的改进。
本文描述的某些实施方案涉及式(I)的香豆素化合物、其盐或内消旋形式：
其中R1是并且其中R1任选地被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根(sulfonate)、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的环烷基以及任选地被取代的杂环基；
每个R2、R3、R4、R5和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
每个R6、R10a、R10b和R10c独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基(sulfonyl hydroxide)、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
X选自由以下组成的组：O、S、NR11以及Se；
R11选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、羧基烷基、磺酸根烷基(sulfonatoalkyl)、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；并且
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
本文描述的某些实施方案涉及具有至少约60nm的斯托克斯位移的式(II)的荧光化合物、其盐或内消旋形式：
其中RHet是任选地被一个或更多个R10取代的5元至10元杂芳基；
每个R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
R6选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
每个R10独立地选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
本文描述的某些实施方案涉及被标记有式(I)的化合物或式(II)的化合物的核苷酸或寡核苷酸。
本文描述的某些实施方案涉及包含一种或更多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是本文描述的标记的核苷酸。
本文描述的某些另外的实施方案涉及测序的方法，所述测序的方法包括将本文描述的标记的核苷酸并入到测序测定中，以及检测标记的核苷酸。
附图简述
图1图示出了被标记有如本文描述的新的香豆素染料I-16的A-核苷酸用于测序分析的可用性。
图2图示了被标记有具有长的斯托克斯位移的商业荧光染料DY510XL的A-核苷酸用于测序分析的可用性。
图3图示了被标记有具有长的斯托克斯位移的商业荧光染料Chromeo494的A-核苷酸用于测序分析的可用性。
详述
本文描述的实施方案涉及用于用作荧光标记物的新的式(I)的结构的香豆素染料及其衍生物。另外的实施方案涉及具有至少约60nm的斯托克斯位移的式(II)的结构的荧光化合物。
这些新的荧光染料可以被用作荧光标记物，特别是用于在核酸测序应用中的核苷酸标记。还例示制备这些荧光染料的方法和利用这些染料的下游测序应用。
令人惊讶地，已经发现当用蓝色光源或绿色光源辐照时，新的染料及其生物缀合物的荧光强度几乎相同。例如，当用460nm(蓝色)和540nm(绿色)激光或LED激发染料时，在某些情况下荧光强度约相同。如下文描述的，该性质在溶液中和流动细胞上适用，这能够实现以高的品质的简化测序分析。
式(I)的化合物
本文描述的某些实施方案涉及新的式(I)的香豆素衍生物、或其盐、内消旋形式：
其中R1是并且其中R1任选地被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的环烷基以及任选地被取代的杂环基；
每个R2、R3、R4、R5和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
每个R6、R10a、R10b和R10c独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
X选自由以下组成的组：O、S、NR11以及Se；
R11选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、羧基烷基、磺酸根烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；并且
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
在式(I)的化合物的某些实施方案中，本文公开的烷基或被取代的烷基是C1-12烷基、或更优选地C1-6烷基。在某些实施方案中，本文公开的烷氧基是C1-12烷氧基、或更优选地C1-6烷氧基。在某些实施方案中，本文公开的烯基基团和炔基基团是C2-6烯基和C2-6炔基。在某些实施方案中，本文公开的卤代烷基基团、卤代烷氧基基团、氨基烷基基团、羟基烷基基团、杂烷基基团是C1-12卤代烷基、C1-12卤代烷氧基、C1-12氨基烷基、C1-12羟基烷基和C1-12杂烷基；更优选地C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C1-6氨基烷基、C1-6羟基烷基和C1-6杂烷基。在某些实施方案中，本文公开的烷氧基烷基基团是C1-6烷氧基(C1-6烷基)。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的芳基是任选地被取代的C6-10芳基，例如苯基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的杂芳基是任选地被取代的5元-10元杂芳基；更优选地，任选地被取代的5元-6元杂芳基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的碳环基是任选地被取代的3元-7元碳环基，特别是3元-7元环烷基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的杂环基是任选地被取代的3元-7元杂环基，更优选地，5元-6元杂环基。
在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2至R9中的任何可以选自烷基，所述烷基被选自以下的一种或更多种取代基取代：羧基(-CO2H)或羧酸根(CO2 -)基团、磺基(SO3H)或磺酸根(SO3 -)基团。在某些这样的实施方案中，式(I)的化合物还由具有有机阳离子或无机阳离子的其盐形式式(I’)来表示：
其中K是有机阳离子或无机阳离子，并且n是选自1至20的整数。
在式(I)的化合物或式(I’)的化合物的某些实施方案中，R1是在某些这样的实施方案中，X是O。在某些其他实施方案中，X是O。在某些这样的实施方案中，式(I)的化合物还由式(Ia)来表示：
在某些实施方案中，R1被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：烷基、卤素以及C-羧基。在一个实施方案中，R1被氯(即-CI)取代。在另一个实施方案中，R1被羧基(即-C(O)OH)取代。
在式(I)的化合物或式(I’)的化合物的某些实施方案中，R1是在某些其他实施方案中，R1是应当理解，当R10a、R10b或R10c被连接至在氮原子上带有正电荷的吡啶基基团时，R10a、R10b或R10c可以包含负电荷，使得R1整体上是电荷中性的。可选择地，R10a、R10b或R10c被连接至在氮原子上带有正电荷的吡啶基基团时，本文描述的化合物可以包含抗衡离子，使得该化合物整体上是电荷中性的。在某些这样的实施方案中，R10a、R10b或R10c是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在某些这样的实施方案中，烷基被羧基(-CO2H)、羧酸根(CO2 -)、磺基(SO3H)或磺酸根(SO3 -)取代。在某些这样的实施方案中，式(I)的化合物还由式(Ib)和式(Ic)或它们的盐式(Ib’)和(Ic’)表示：
其中Y是能够与Ib形成电荷中性化合物的阴离子。在某些实施方案中，Y是衍生自有机酸或无机酸的阴离子。在某些实施方案中，Y是卤素阴离子。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(Ia)的化合物、式(Ib)的化合物、式(Ib’)的化合物、式(Ic)的化合物或式(Ic’)的化合物的某些实施方案中，由实线和虚线表示的键是双键，并且化合物还由式(I-1)、式(I’-1)、式(Ia-1)、式(Ib-1)、式(Ib’-1)、式(Ic-1)或式(Ic’-1)表示：
在式(I)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物或式(Ic’-1)的化合物的某些实施方案中，R2是烷基。在一个实施方案中，R2是甲基。在某些其他实施方案中，R2是H。
在式(I)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物或式(Ic’-1)的化合物的某些实施方案中，R4和R5中的至少一个是烷基。在某些这样的实施方案中，每个R4和R5是烷基。在一个实施方案中，R4和R5两者均是甲基。在某些可选择的实施方案中，R4和R5中的至少一个是H。在一个这样的实施方案中，R4和R5两者均是H。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(Ia)的化合物、式(Ib)的化合物或式(Ib’)的化合物的某些实施方案中，由实线和虚线表示的键是单键，并且化合物还由式(I-2)、式(I’-2)、式(Ia-2)、式(Ib-2)、式(Ib’-2)、式(Ic-2)或式(Ic’-2)表示：
在式(I)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R2和R3中的至少一个是烷基。在某些另外的实施方案中，R2和R3两者均是烷基。在一个实施方案中，R2和R3两者均是甲基。在某些其他实施方案中，R2和R3中的至少一个是H。在一个实施方案中，R2和R3两者均是H。
在式(I)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R4和R5中的至少一个是烷基。在一个这样的实施方案中，R4和R5两者均是H。在某些可选择的实施方案中，R4和R5中的至少一个是烷基。在某些这样的实施方案中，每个R4和R5是烷基。在一个实施方案中，R4和R5两者均是甲基。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物、式(Ic’-1)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R6是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一个实施方案中，R6是被羧基取代的烷基。在某些实施方案中，R6是被-C(O)OR12取代的烷基，并且其中R12选自由以下组成的组：任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。在一个这样的实施方案中，R12是烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。在某些另外的实施方案中，R6是被-C(O)NR13R14取代的烷基，并且其中每个R13和R14独立地选自H、任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。在某些另外的实施方案中，R13和R14独立地选自烷基，所述烷基被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：羧基、羧酸根、-C(O)OR11、磺基以及磺酸根。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物、式(Ic’-1)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R7是H。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物或式(Ib’-2)的化合物的某些可选择的实施方案中，R6和R7与它们被附接至的原子连接在一起，以形成任选地被取代的3元至10元杂环基，例如任选地被取代的6元杂环基。在某些这样的实施方案中，任选地被取代的杂环基包含一个杂原子。在某些这样的实施方案中，任选地被取代的杂环基被一种或更多种烷基例如甲基取代。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物、式(Ic’-1)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R8是H。
在式(I)的化合物、式(I’)的化合物、式(I-1)的化合物、式(I’-1)的化合物、式(Ia-1)的化合物、式(Ib-1)的化合物、式(Ib’-1)的化合物、式(Ic-1)的化合物、式(Ic’-1)的化合物、式(I-2)的化合物、式(I’-2)的化合物、式(Ia-2)的化合物、式(Ib-2)的化合物、式(Ib’-2)的化合物、式(Ic-2)的化合物或式(Ic’-2)的化合物的某些实施方案中，R9是H。
在某些具体的实施方案中，示例性式(I)的化合物包括化合物I-1至化合物I-20和化合物I-22至化合物I-32，如在下面的表1中示出的：
在式(I)的化合物的某些实施方案中，化合物经由R6被共价地附接至核苷酸或寡核苷酸，并且其中R6是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一个实施方案中，R6是被羧基取代的烷基。
在某些可选择的实施方案中，化合物经由R8被共价地附接至核苷酸或寡核苷酸，并且其中R8是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一个实施方案中，R8是被羧基取代的烷基。
在某些可选择的实施方案中，化合物经由R10a、R10b或R10c被共价地附接至核苷酸或寡核苷酸，并且其中R10a、R10b或R10c中的每个是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一个实施方案中，R10a、R10b或R10c中的每个是被羧基取代的烷基。
在某些实施方案中，式(I)的化合物的结构以一种或更多种内消旋形式来表示：
式(II)的化合物
本文描述的某些实施方案涉及具有至少约60nm的斯托克斯位移的式(II)的荧光化合物、或其盐、内消旋形式：
其中RHet是任选地被一个或更多个R10取代的5元至10元杂芳基；
每个R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
R6选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
每个R10独立地选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
在某些实施方案中，式(II)的荧光化合物具有在从约60nm至约100nm，或从约60nm至约90nm的范围内的斯托克斯位移。
在式(II)的化合物的某些实施方案中，本文公开的烷基或被取代的烷基是C1-12烷基、或更优选地C1-6烷基。在某些实施方案中，本文公开的烷氧基是C1-12烷氧基、或更优选地C1-6烷氧基。在某些实施方案中，本文公开的烯基基团和炔基基团是C2-6烯基和C2-6炔基。在某些实施方案中，本文公开的卤代烷基基团、卤代烷氧基基团、氨基烷基基团、羟基烷基基团、杂烷基基团是C1-12卤代烷基、C1-12卤代烷氧基、C1-12氨基烷基、C1-12羟基烷基和C1-12杂烷基；更优选地C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C1-6氨基烷基、C1-6羟基烷基和C1-6杂烷基。在某些实施方案中，本文公开的烷氧基烷基基团是C1-6烷氧基(C1-6烷基)。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的芳基是任选地被取代的C6-10芳基，例如苯基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的杂芳基是任选地被取代的5元-10元杂芳基；更优选地，任选地被取代的5元-6元杂芳基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的碳环基是任选地被取代的3元-7元碳环基，特别是3元-7元环烷基。在某些实施方案中，本文公开的任选地被取代的杂环基是任选地被取代的3元-7元杂环基，更优选地，5元-6元杂环基。
在式(II)的化合物的某些实施方案中，R1至R8中的任何可以选自烷基，所述烷基被选自以下的一种或更多种取代基取代：羧基(-CO2H)或羧酸根(CO2 -)基团、磺基(SO3H)或磺酸根(SO3 -)基团。在某些这样的实施方案中，被取代的烷基是被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在某些这样的实施方案中，式(II)的化合物还由具有有机阳离子或无机阳离子的其盐形式式(II’)来表示：
其中K是有机阳离子或无机阳离子，并且n是选自1至20的整数。
在式(II)的化合物或式(II’)的化合物的某些实施方案中，RHet是任选地被一个或更多个R10取代的9元杂芳基。在某些这样的实施方案中，RHet选自任选地被取代的苯并噻唑基或苯并噁唑基，例如2-苯并噻唑基或2-苯并噁唑基。在某些其他实施方案中，RHet是任选地被一个或更多个R10取代的6元杂芳基。在一个这样的实施方案中，RHet是被取代的吡啶基，例如具有以下结构的4-吡啶基：应当理解，当R10被连接至在氮原子上带有正电荷的吡啶基基团时，R10可以包含负电荷，使得RHet整体上是电荷中性的。可选择地，当R10被连接至在氮原子上带有正电荷的吡啶基基团时，本文描述的化合物可以包含抗衡离子，使得该化合物整体上是电荷中性的。在某些这样的实施方案中，R10是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在某些这样的实施方案中，R10被羧基(-CO2H)、羧酸根(CO2 -)、磺基(SO3H)或磺酸根(SO3 -)取代。
在式(II)的化合物或式(II’)的化合物的某些实施方案中，在式(II)中由实线和虚线表示的键是双键，并且化合物还由式(II-1)或式(II’-1)来表示：
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物或式(II’-1)的化合物的某些实施方案中，R2是烷基。在一个实施方案中，R2是甲基。在某些其他实施方案中，R2是H。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物或式(II’-1)的化合物的某些实施方案中，R4和R5中的至少一个是烷基。在某些这样的实施方案中，每个R4和R5是烷基。在一个实施方案中，R4和R5两者均是甲基。在某些可选择的实施方案中，R4和R5中的至少一个是H。在一个这样的实施方案中，R4和R5两者均是H。
在式(II)的化合物或式(II’)的化合物的某些实施方案中，由实线和虚线表示的键是单键，并且化合物还由式(II-2)或式(II’-2)来表示：
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R2和R3中的至少一个是烷基。在某些另外的实施方案中，R2和R3两者均是烷基。在一个实施方案中，R2和R3两者均是甲基。在某些其他实施方案中，R2和R3中的至少一个是H。在一个实施方案中，R2和R3两者均是H。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R4和R5中的至少一个是H。在一个这样的实施方案中，R4和R5两者均是H。在某些可选择的实施方案中，R4和R5中的至少一个是烷基。在某些这样的实施方案中，每个R4和R5是烷基。在一个实施方案中，R4和R5两者均是甲基。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物、式(II’-1)、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R6是被取代的烷基，例如被取代的C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。在一个实施方案中，R6是被羧基取代的烷基。在某些实施方案中，R6是被-C(O)OR12取代的烷基，并且其中R12选自由以下组成的组：任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。在一个这样的实施方案中，R12是烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。在某些另外的实施方案中，R6是被-C(O)NR13R14取代的烷基，并且其中每个R13和R14独立地选自H、任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。在某些另外的实施方案中，R13和R14独立地选自烷基，所述烷基被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：羧基、羧酸根、-C(O)OR11、磺基以及磺酸根。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物、式(II’-1)、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R7是H。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物、式(II’-1)的化合物、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些可选择的实施方案中，R6和R7与它们被附接至的原子联接在一起，以形成任选地被取代的3元至10元杂环基，例如任选地被取代的6元杂环基。在某些这样的实施方案中，任选地被取代的杂环基包含一个杂原子。在某些这样的实施方案中，任选地被取代的杂环基被一种或更多种烷基例如甲基取代。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物、式(II’-1)、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R1是H。
在式(II)的化合物、式(II’)的化合物、式(II-1)的化合物、式(II’-1)、式(II-2)的化合物或式(II’-2)的化合物的某些实施方案中，R8是H。
如本领域普通技术人员所理解的，当式(I)或式(II)的化合物包含带正电荷的取代基基团或带负电荷的取代基基团时，该化合物还可以包含带负电荷的抗衡离子或带正电荷的抗衡离子，使得该化合物整体上是中性的。
定义
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。术语“包括(including)”以及其他形式例如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。术语“具有(having)”以及其他形式例如“具有(have)”、“具有(has)”和“具有(had)”的使用不是限制性的。如在本说明书中所使用的，无论是在过渡措辞中还是在权利要求的主体中，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”应被解释为具有开放式含义。也就是，上文术语应与措辞“具有至少”或“包括至少”同义地解释。例如，当在工艺的上下文中使用时，术语“包括(comprising)”意指该工艺包括至少所叙述的步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包括(comprising)”意指该化合物、组合物或装置包括至少所叙述的特征或组分，但还可以包括另外的特征或组分。
如本文使用的，常见的有机缩写定义如下：
Ac 乙酰基
Ac2O 乙酸酐
aq. 含水的
BOC或Boc 叔丁氧基羰基
BOP 六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻鎓
cat. 催化的
℃ 以摄氏度计的温度
dATP 脱氧腺苷三磷酸
dCTP 脱氧胞苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟苷三磷酸
dTTP 脱氧胸苷三磷酸
ddNTP 双脱氧核苷酸
DCM 二氯甲烷
DMA 二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
ffC 充分官能化的核苷酸缀合物
g 克
h或hr 小时
IPA 异丙醇
LCMS 液相色谱质谱法
MeCN 乙腈
mL 毫升
PG 保护基团
Ph 苯基
ppt 沉淀物
PyBOP 六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻鎓
RT、rt 室温
SBS 通过合成测序
TEA 三乙胺
TEAB 溴化四乙铵
TFA 三氟乙酸
TRIS 三(羟基甲基)氨基甲烷
Tert、t 叔
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TSTU 四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲
μL 微升
如本文所使用的，术语“共价地附接”或“共价地结合”指的是形成其特征为在原子之间共享电子对的化学结合。例如，共价地附接的聚合物涂层指的是与经由其他手段例如粘合或静电相互作用附接至表面相比，与基底的官能化的表面形成化学键的聚合物涂层。将理解的是，被共价地附接至表面的聚合物还可以经由除了共价附接之外的手段结合。
如本文所使用的，术语“卤素(halogen)”或“卤素(halo)”意指元素周期表的第7列的放射稳定性原子(radio-stable atom)中的任一种，例如氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。
如本文所使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子(无论何时其在本文中出现，数值范围例如“1至20”指的是在给定范围内的每个整数；例如，“1个至20个碳原子”意指该烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等、多达并且包括20个碳原子组成，尽管本定义还覆盖在没有指定数值范围的情况下术语“烷基”的出现)。烷基基团还可以是具有1个至9个碳原子的中等大小的烷基。烷基基团还可以是具有1个至6个碳原子的低级烷基。烷基基团可以被指定为“C1-4烷基”或类似的名称。仅通过实例的方式，“C1-6烷基”指示，在该烷基链中存在一个至六个碳原子，即该烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基以及叔丁基。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基及类似基团。
如本文所使用的，“烷氧基”指的是式-OR，其中R是如上文定义的烷基，例如“C1-9烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基以及叔丁氧基及类似基团。
如本文所使用的，“烯基”指的是包含一个或更多个双键的直链烃链或支链烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子，尽管本定义还覆盖在没有指定数值范围的情况下术语“烯基”的出现。烯基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小的烯基。烯基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被指定为“C2-6烯基”或类似的名称。仅通过实例的方式，“C2-6烯基”指示，在该烯基链中存在两个至六个碳原子，即该烯基链选自由以下组成的组：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基以及丁-1,2-二烯-4-基。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基及类似基团。
如本文所使用的，“炔基”指的是包含一个或更多个三键的直链烃链或支链烃链。炔基基团可以具有2个至20个碳原子，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“炔基”的出现。炔基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小的炔基。炔基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被指定为“C2-6炔基”或类似的名称。仅通过实例的方式，“C2-6炔基”指示，在该炔基链中存在两个至六个碳原子，即该炔基链选自由以下组成的组：乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基以及2-丁炔基。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基及类似基团。
如本文所使用的，“杂烷基”指的是在链骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的直链烃链或支链烃链。杂烷基基团可以具有1个至20个碳原子，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“杂烷基”的出现。杂烷基基团还可以是具有1个至9个碳原子的中等大小的杂烷基。杂烷基基团还可以是具有1个至6个碳原子的低级杂烷基。杂烷基基团可以被指定为“C1-6杂烷基”或类似的名称。杂烷基基团可以包含一个或更多个杂原子。仅通过实例的方式，“C1-6杂烷基”指示，在该杂烷基链中存在一个至六个碳原子并且在该链的骨架中另外存在一个或更多个杂原子。
术语“芳香族的”指的是具有共轭π电子体系的环或环体系，并且包括碳环芳香族基团(例如，苯基)和杂环芳香族基团(例如，吡啶)两者。该术语包括单环基团或稠环多环(即，共享相邻原子对的环)基团，条件是整个环体系是芳香族的。
如本文所使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“芳基”的出现。在某些实施方案中，芳基基团具有6个至10个碳原子。芳基基团可以被指定为“C6-10芳基”、“C6芳基或C10芳基”或类似的名称。芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、薁基以及蒽基。
“芳烷基”或“芳基烷基”是经由亚烷基基团连接作为取代基的芳基基团，例如“C7-14芳烷基”及类似基团，包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基以及萘基烷基。在某些情况下，亚烷基基团是低级亚烷基基团(即，C1-6亚烷基基团)。
如本文所使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧以及硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，该体系中的每一个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5-18个环成员(即，构成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”的出现。在某些实施方案中，杂芳基基团具有5个至10个环成员或5个至7个环成员。杂芳基基团可以被指定为“5-7元杂芳基”、“5-10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基以及苯并噻吩基。
“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”是经由亚烷基基团连接作为取代基的杂芳基基团。实例包括但不限于2-噻吩基甲基、3-噻吩基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基以及咪唑基烷基。在某些情况下，亚烷基基团是低级亚烷基基团(即，C1-6亚烷基基团)。
如本文所使用的，“碳环基”意指在环体系骨架中仅包含碳原子的非芳香族环状环或非芳香族环状环体系。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的方式、桥接的方式或螺连接的方式连接在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基以及环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“碳环基”的出现。碳环基基团还可以是具有3个至10个碳原子的中等大小的碳环基。碳环基基团还可以是具有3个至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被指定为“C3-6碳环基”或类似的名称。碳环基环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基以及螺[4.4]壬基。
如本文所使用的，“环烷基”意指完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。实例包括环丙基、环丁基、环戊基以及环己基。
如本文所使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环状环或非芳香族环状环体系。杂环基可以以稠合的方式、桥接的方式或螺连接的方式连接在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香族的。杂原子可以存在于环体系中的非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，构成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义还覆盖其中没有指定数值范围的术语“杂环基”的出现。杂环基基团还可以是具有3个至10个环成员的中等大小的杂环基。杂环基基团还可以是具有3个至6个环成员的杂环基。杂环基基团可以被指定为“3-6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至多达三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的实例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基(pyrrolidonyl)、吡咯烷二酮基(pyrrolidionyl)、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己二烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二硫杂环戊二烯基、1,3-二硫戊环基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、吲哚啉基、异吲哚啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基(thiamorpholinyl)、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基以及四氢喹啉。
“O-羧基(O-carboxy)”基团指的是“-OC(＝O)R”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“C-羧基(C-carboxy)”基团指的是“-C(＝O)OR”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。非限制性实例包括羧基(carboxyl)(即，-C(＝O)OH)。
“氰基”基团指的是“-CN”基团。
“磺酰基”基团指的是“-SO2R”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“磺基”或“磺酰基氢氧基”基团指的是“-S(＝O)2-OH”基团。
“亚磺基”指的是“-S(＝O)OH”基团。
“磺酸根”基团指的是“-SO3 -”。
“S-磺酰氨基”基团指的是“-SO2NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“N-磺酰氨基”基团指的是“-N(RA)SO2RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“C-酰氨基”基团指的是“-C(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“N-酰氨基”基团指的是“-N(RA)C(＝O)RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。
“氨基”基团指的是“-NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及3-10元杂环基，如本文定义的。非限制性实例包括游离的氨基(即，-NH2)。
“氨基烷基”基团指的是经由亚烷基基团连接的氨基基团。
“烷氧基烷基”基团指的是经由亚烷基基团连接的烷氧基基团，例如“C2-8烷氧基烷基”及类似基团。
如本文所使用的，被取代的基团衍生自未被取代的母体基团(parent group)，其中已经存在将一个或更多个氢原子交换为另外的原子或基团。除非另有指示，否则当基团被认为是“被取代的”时，意指该基团被独立地选自以下的一个或更多个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C7碳环基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、C3-C7-碳环基-C1-C6烷基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基-C1-C6烷基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基以及C1-C6卤代烷氧基取代)、卤素、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤代(C1-C6)烷基(例如，-CF3)、卤代(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)、C1-C6烷基硫代(C1-C6alkylthio)、芳基硫代(arylthio)、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酰基、异氰酰基、硫代氰酰基、异硫代氰酰基、亚磺酰基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根以及氧代(＝O)。在基团被描述为“任选地被取代的”任何情况下，该基团可以被上文取代基取代。
如本领域普通技术人员所理解的，如果化合物包含带正电荷的取代基基团或带负电荷的取代基基团例如SO3 -时，该化合物还可以包含带负电荷的抗衡离子或带正电荷的抗衡离子，使得该化合物整体上是中性的。
应当理解的是，取决于上下文，某些基团命名惯例(naming conventions)可以包括单基团或双基团。例如，在取代基需要两个与分子的剩余部分的附接点的情况下，应理解的是，该取代基是双基团。例如，被识别为需要两个附接点的烷基的取代基包括双基团，例如–CH2–、–CH2CH2–、–CH2CH(CH3)CH2–及类似基团。其他基团命名惯例清楚地指示，该基团是双基团，例如“亚烷基”或“亚烯基”。
当两个“邻近的”R基团被认为“连同它们被附接至的原子”形成环时，意指原子的共同单元、中间键(intervening bond)和两个R基团是所叙述的环。例如，当存在以下子结构时：
并且R1和R2被定义为选自由以下组成的组：氢和烷基，或者R1和R2连同它们被附接至的原子形成芳基或碳环基，意味着R1和R2可以选自氢或烷基，或者可选择地，子结构具有以下结构：
其中A是芳基环或包含所描绘的双键的碳环基。
标记的核苷酸
本文描述的染料化合物适合于附接至底物部分。底物部分实际上可以是本文描述的荧光染料可以被缀合至的任何分子或物质，并且，通过非限制性实例的方式，底物部分可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机聚合物和无机聚合物、及其组合或装配物(assemblage)，例如染色体、细胞核、活细胞以及类似物。染料可以通过包括疏水吸引、离子吸引和共价附接的多种手段被任选的连接基缀合。特别地，染料通过共价附接被缀合至底物。更特别地，共价附接是借助于连接基基团。在某些情况下，这样的标记的核苷酸还被称为“改性的核苷酸(modified nucleotide)”。
如本文描述的新的具有长的斯托克斯位移的荧光染料的特别有用的应用是用于标记生物分子，例如核苷酸或寡核苷酸。本申请的某些实施方案涉及被标记有如本文描述的新的荧光化合物的核苷酸或寡核苷酸。
具有改进的荧光性质(例如，斯托克斯位移、荧光强度、荧光最大值的位置以及荧光带的形状)的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确性。斯托克斯位移是在生物应用中检测荧光的关键方面。例如，当使用具有彼此非常接近(即小的斯托克斯位移)的吸收最大值和荧光最大值的荧光团时，发射的光的检测可能难以与激发光区分，因为激发波长和发射波长极大地重叠。相比之下，由于激发波长和发射波长之间的较大的分开，具有大的斯托克斯位移的荧光团易于区分。斯托克斯位移在多重荧光应用中是特别重要的，因为一个荧光团的发射波长可以重叠，并且因此激发同一样品中的另一个荧光团。此外，当在基于水的生物缓冲液中和/或在较高的温度进行测量时，荧光信号强度尤其重要，因为大部分染料的荧光在这样的条件下显著较低。此外，染料被附接至的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和其他光谱染料性质。荧光染料和核碱基(nucleobase)之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特定设计来调整。荧光染料的结构的优化可以改进它们的荧光性质并且还改进核苷酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。
与生物分子的附接可以经由式(I)或式(II)的化合物的R6部分、R8部分、R10a部分、R10b部分、R10c部分或R10部分。在某些实施方案中，R6、R8、R10a、R10b、R10c或R10是被取代的烷基，例如被羧基(即-CO2H)或羧基基团的活化形式，例如酰胺或酯取代的烷基，所述被取代的烷基可以被用于附接至生物分子的氨基基团。在一个实施方案中，R6、R8、R10a、R10b、R10c或R10可以包含最适合于另外的酰胺键/肽键形成的活化的酯残余物或酰胺残余物。如本文所使用的术语“活化的酯”指的是能够在温和条件下例如与包含氨基基团的化合物反应的羧基基团衍生物。活化的酯的非限制性实例包括但不限于对硝基苯基、五氟苯基以及琥珀酰亚氨基酯。
在某些实施方案中，染料化合物可以经由核苷酸碱基被共价地附接至寡核苷酸或核苷酸。例如，标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过连接基部分被附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基(7-deaza purine base)的C7位的标记物。标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有被共价地附接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'OH阻断基团。
连接基
如本文描述的染料化合物可以包括在取代基位置中的一个处的用于使化合物共价附接至另一个分子的反应性连接基基团。反应性连接基团是能够形成共价键的部分。在特定的实施方案中，连接基可以是可裂解的连接基。术语“可裂解的连接基”的使用不意指意味着整个连接基需要被移除。裂解位点可以位于连接基上的一位置，该位置确保连接基的一部分在裂解之后仍附接至染料和/或底物部分。通过非限制性实例的方式，可裂解的连接基可以是亲电性地可裂解的连接基、亲核性地可裂解的连接基、可光裂解的连接基、在还原条件可裂解的(例如包含二硫化物或叠氮化物的连接基)、在氧化条件下可裂解的、经由使用保险栓连接基可裂解的以及通过消除机制可裂解的。使用可裂解的连接基以将染料化合物附接至底物部分确保标记物可以视需要在检测之后除去，避免下游步骤中的任何干扰信号。
连接基基团的非限制性实例包括那些在PCT公布第WO2004/018493号(通过引用并入本文)中公开的连接基基团，所述连接基基团将核苷酸的碱基连接至标记物，比如例如本文描述的新的荧光化合物。这些连接基可以使用水溶性膦或由过渡金属和至少部分地水溶性配体形成的水溶性过渡金属催化剂来裂解。在水溶液中，后者形成至少部分地水溶性的过渡金属络合物。可以使用的另外的合适的连接基包括那些在PCT公布第WO2004/018493号和第WO 2007/020457号中公开的连接基(两个PCT公布均通过引用并入本文)。据发现，与通过本领域中已知的其他连接物附接至鸟嘌呤碱基的相同的荧光团相比，通过改变并且特别地增加荧光染料(荧光团)和鸟嘌呤碱基之间的连接基的长度，通过引入聚乙二醇间隔基基团，可以增加荧光强度。当被并入到多核苷酸例如DNA中时，连接基并且尤其是它们的增加的长度的设计还允许被附接至鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团的亮度的改进。因此，当染料用于需要检测被附接至包含鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记物的任何分析方法中时，如果连接基包含式-((CH2)2O)n-的间隔基基团，其中n是在2和50之间的整数，则是有利的，如在WO2007/020457中描述的。
核苷和核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处被标记。如本领域普通技术人员理解的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或更多个磷酸酯基团组成。在RNA中，糖是核糖并且在DNA中糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶是胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)或在RNA的上下文中是尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子结合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸还是核苷的磷酸酯，其中在被附接至糖的C-3或C-5的羟基基团上发生酯化。核苷酸通常是单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。
“核苷”在结构上与核苷酸类似但没有磷酸酯部分。核苷类似物的实例将是其中标记物被连接至碱基并且不存在被附接至糖分子的磷酸酯基团的核苷类似物。
虽然碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但技术人员将理解，不改变核苷酸或核苷经历沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)的能力的衍生物和类似物是可用的。“衍生物”或“类似物”意指其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常相似但其具有化学改性或物理改性的化合物或分子，例如比如不同的或另外的侧基，其允许衍生的核苷酸或核苷被连接至另一个分子。例如，碱基可以是脱氮嘌呤。衍生物应当能够经历沃森-克里克配对。“衍生物”和“类似物”还意指具有改性的碱基部分和/或改性的糖部分的合成的核苷酸衍生物或核苷衍生物。这样的衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人Chemical Reviews 90:543-584,1990中被讨论。核苷酸类似物还可以包含改性的磷酸二酯键，该改性的磷酸二酯键包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)键、氨基磷酸酯键以及类似物。
染料可以通过连接基被附接至核苷酸碱基上的任何位置，条件是沃森-克里克碱基配对仍可以进行。特定的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。如上文所描述的，连接基基团可以被用于将染料共价地附接至核苷或核苷酸。
在特定的实施方案中，标记的核苷或核苷酸可以是酶促地可并入的和酶促地可延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接至化合物，使得该化合物不明显地干扰核酸复制酶对核苷酸的整体结合和识别。因此，连接基还可以包含间隔基单元。例如，间隔基使核苷酸碱基远离裂解位点或标记物。
被标记有本文描述的新的荧光染料的核苷或核苷酸可以具有下式：
其中染料是染料化合物，B是核碱基，比如例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤及类似物，并且L是可以存在或可以不存在的任选的连接基基团。R’可以是H、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯类似物、被附接至反应性含磷基团的-O-或被阻断基团保护的-O-。R”可以是H、OH、亚磷酰胺或3’-OH阻断基团，并且R”’是H或OH；其中R”是亚磷酰胺，R是酸可裂解的羟基保护基团，其允许在自动合成条件下随后的单体偶联。
在某些情况下，阻断基团是分开的并且独立于染料化合物，即不附接至染料化合物。可选择地，染料可以包含3'OH阻断基团的全部或一部分。因此，R”可以是可以包含染料化合物或可以不包含染料化合物的3'OH阻断基团。在另外可选择的实施方案中，在戊糖的3'碳上不存在阻断基团，并且被附接至碱基的染料(或染料和连接基构建体)例如可以具有足以充当对另外的核苷酸从除了3'位点的点的并入的阻断物(block)的大小或结构。因此，阻断可以是由于立体位阻或可以是由于大小、电荷和结构的组合。
当改性的核苷酸被并入时，阻断基团的使用允许聚合例如通过终止延伸来控制。如果阻断作用例如通过非限制性实例的方式通过改变化学条件或通过除去化学阻断物是可逆的，那么延伸可以在某些点停止并且然后允许继续。3’-OH阻断基团的非限制性实例包括那些在WO 2004/018497和WO 2014/139596中公开的3’-OH阻断基团，它们据此通过引用并入。例如，阻断基团可以是叠氮基甲基(-CH2N3)或被取代的叠氮基甲基(例如-CH(CHF2)N3或CH(CH2F)N3)，或烯丙基。
在特定的实施方案中，连接基和阻断基团两者均存在并且是分开的部分，它们两者在大体上相似的条件下均是可裂解的。因此，脱保护和脱阻断过程可以是更有效的，因为将仅需要单次处理来除去染料化合物和阻断基团两者。
本公开内容还涉及涵盖并入本文描述的染料化合物的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是分别包含以磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的DNA或RNA。多核苷酸可以包含天然存在的核苷酸、不同于本文描述的标记的核苷酸的非天然存在(或改性的)的核苷酸、或其任何组合，条件是存在根据本申请的至少一种标记有染料化合物的核苷酸。多核苷酸还可以包括非天然骨架连接和/或非核苷酸的化学改性。还预期包括包含至少一种标记的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物的嵌合结构。
如本文描述的非限制性示例性标记的核苷酸包括：
其中：L表示连接基，并且R表示如上文描述的糖残基。
在某些实施方案中，非限制性示例性的荧光染料缀合物在下文中示出：
试剂盒
本文公开的某些实施方案是包含标记有本文描述的新的荧光染料的核苷和/或核苷酸的试剂盒。这样的试剂盒通常将包含标记有染料的至少一种核苷酸或核苷连同至少一种另外的组分。另外的组分可以是另外的改性的或未改性的核苷酸或核苷。例如，标记有染料的核苷酸可以与未标记的核苷酸或天然的核苷酸组合和/或与荧光标记的核苷酸组合或其任何组合被供应。核苷酸的组合可以作为分开的单独组分或作为核苷酸混合物被提供。在某些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种核苷酸，其中至少一种核苷酸是标记有本文描述的新的荧光化合物的核苷酸。试剂盒可以包含两种或更多种标记的核苷酸。核苷酸可以标记有两种或更多种荧光标记物。标记物中的两种或更多种可以使用单激发源来激发，所述单激发源可以是激光器。
试剂盒可以包含四种核苷酸，其中四种核苷酸中的第一核苷酸被标记有如本文公开的化合物，并且第二核苷酸、第三核苷酸、和第四核苷酸各自标记有不同化合物，其中每种化合物具有有区别的荧光最大值并且化合物中的每种与其他三种化合物是可区分的。试剂盒可以为使得化合物中的两种或更多种具有类似的吸光度最大值，但不同的斯托克斯位移。
本文描述的荧光染料化合物、标记的核苷酸或试剂盒可以用于测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析或蛋白结合测定。该用途可以在自动测序仪器上进行。测序仪器可以包括在不同的波长下操作的两种激光器。
在试剂盒包含标记有染料化合物的多种核苷酸、特别地两种核苷酸、更特别地四种核苷酸的情况下，不同的核苷酸可以标记有不同的染料化合物，或一种核苷酸可以是深色的，不具有染料化合物。在不同的核苷酸标记有不同的染料化合物的情况下，试剂盒的特征是，所述染料化合物是光谱上可区别的荧光染料。如本文所使用的，术语“光谱上可区别的荧光染料”指的是，当两种或更多种这样的染料存在于一种样品中时，在可以通过荧光检测设备(例如，基于商用毛细管的DNA测序平台)区别的波长发射荧光能量的荧光染料。当标记有荧光染料化合物的两种核苷酸以试剂盒形式被供应时，在某些实施方案中，光谱上可区别的荧光染料可以在相同的波长(比如例如通过相同的激光器)被激发。当标记有荧光染料化合物的四种核苷酸以试剂盒形式被供应时，在某些实施方案中，光谱上可区别的荧光染料中的两种可以两者均在一个波长被激发，并且另两种光谱上可区别的染料可以两者均在另一波长被激发。特定的激发波长是约460nm。
在某些实施方案中，至少一种核苷酸可以被标记有染料，该染料用具有不同波长的两种激光器可激发。
在一个实施方案中，试剂盒包含被标记有本文描述的化合物的核苷酸和被标记有第二染料的第二核苷酸，其中染料具有至少10nm、特别地20nm至50nm的吸光度最大值的差异。更特别地，两种染料化合物具有在15nm-40nm之间或在20nm-40nm之间的斯托克斯位移。如本文所使用的，术语“斯托克斯位移”是峰值吸收波长和峰值发射波长之间的距离。
在另外的实施方案中，所述试剂盒还包含被标记有荧光染料的两种其他核苷酸，其中所述染料通过激光器在约440nm至约560nm处被激发。
在可选择的实施方案中，试剂盒可以包含其中相同碱基被标记有两种不同的化合物的核苷酸。第一核苷酸可以被标记有本文描述的化合物。第二核苷酸可以被标记有光谱上有区别的化合物，例如在大于600nm处吸收的‘红色’染料。第三核苷酸可以被标记为本文描述的荧光染料化合物和光谱上有区别的化合物的混合物，并且第四核苷酸可以是‘深色的’并且不包含标记物。因此，简言之，核苷酸1-4可以被标记为‘绿色’、‘红色’、‘红色/绿色’以及深色。为了进一步简化仪器，四种核苷酸可以被标记有用单一激光器激发的两种染料，并且因此核苷酸1-4的标记可以是‘绿1’、‘绿2’、‘绿1/绿2’和深色。
在其他实施方案中，试剂盒可以包含能够催化将核苷酸并入到多核苷酸中的聚合酶。待被包含在这样的试剂盒中的其他组分可以包括缓冲剂及类似物。标记有本文描述的新的荧光染料的核苷酸和包括不同核苷酸的混合物的其他任何核苷酸组分，可以以在使用之前待被稀释的浓缩的形式被提供在试剂盒中。在这样的实施方案中，还可以包括合适的稀释缓冲剂。
测序的方法
包含本文描述的新的荧光染料的核苷酸(或核苷)可以用于需要检测被附接至核苷酸或核苷的荧光标记物的任何分析方法中，无论以其自身还是被并入到较大的分子结构或缀合物中或者与较大的分子结构或缀合物缔合。本申请的某些实施方案涉及测序的方法，所述测序的方法包括：(a)将如本文描述的至少一种标记的核苷酸并入到多核苷酸中；以及(b)通过检测来自被附接至所述改性的核苷酸的新的荧光染料的荧光信号，检测被并入到多核苷酸中的标记的核苷酸。
在某些实施方案中，在合成步骤中，至少一种标记的核苷酸通过聚合酶的作用被并入到多核苷酸中。然而，不排除将标记的核苷酸并入到多核苷酸中的其他方法，例如化学寡核苷酸合成或标记的寡核苷酸与未标记的寡核苷酸的连接。因此，术语将核苷酸“并入”到多核苷酸中涵盖通过化学方法以及酶促方法的多核苷酸合成。
在本方法的所有实施方案中，在将标记的核苷酸并入到其中的多核苷酸链被退火成模板链的同时，或者在其中使两种链分开的变性步骤之后，可以进行检测步骤。另外的步骤，例如化学或酶促反应步骤或纯化步骤可以被包括在合成步骤和检测步骤之间。特别地，并入标记的核苷酸的靶链(target strand)可以被分离或纯化并且然后被进一步加工或者被用于随后的分析中。通过实例的方式，在合成步骤中标记有如本文描述的改性的核苷酸的靶多核苷酸可以随后被用作标记的探针或引物。在其他实施方案中，合成步骤(a)的产物可以经受另外的反应步骤，并且，如果需要，这些随后步骤的产物被纯化或分离。
用于合成步骤的合适的条件对于熟悉标准分子生物学技术的人员将是熟知的。在一个实施方案中，合成步骤可以类似于使用包括根据本公开内容的改性的核苷酸的核苷酸前体的标准引物延伸反应，以在合适的聚合酶的存在下形成与模板链互补的延伸的靶链。在其他实施方案中，合成步骤本身可以形成产生标记的双链扩增产物的扩增反应的一部分，所述标记的双链扩增产物包括源自靶多核苷酸链和模板多核苷酸链的复制的退火的互补链。其他示例性的“合成”步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引导的DNA标记(randomprimed DNA labelling)等。在合成步骤中使用的聚合酶必须能够催化根据本公开内容的改性的核苷酸的并入。此外，聚合酶的精确性质不特别地受限制，但可以取决于合成反应的条件。通过实例的方式，如果使用热循环进行合成反应，那么需要热稳定的聚合酶，然而这对于标准引物延伸反应可能不是必要的。能够并入根据本公开内容的改性的核苷酸的合适的热稳定聚合酶包括在WO2005/024010或WO2006120433中描述的那些热稳定聚合酶。在较低的温度例如37℃进行的合成反应中，聚合酶不一定需要是热稳定聚合酶，因此聚合酶的选择将取决于许多因素，例如反应温度、pH、链置换活性以及类似因素。
在特定的非限制性实施方案中，标记有根据本申请的新的具有较长斯托克斯位移的荧光染料的改性的核苷酸或核苷可以被用于核酸测序、再测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分的方法中、涉及在被并入到多核苷酸中时检测改性的核苷酸或核苷的任何其他应用、或需要使用被标记有包含根据本申请的荧光染料的改性的核苷酸的多核苷酸的任何其他应用。
在特定的实施方案中，本申请提供了包含本文描述的染料化合物的改性的核苷酸在多核苷酸“通过合成测序”反应中的用途。通过合成测序通常涉及使用聚合酶或连接酶在5’至3’方向上将一种或更多种核苷酸或寡核苷酸相继添加至生长的多核苷酸链，以便形成与待被测序的模板核酸互补的延伸的多核苷酸链。存在于添加的核苷酸的一种或更多种中的碱基的同一性(identity)在检测步骤或“成像”步骤中被确定。添加的碱基的同一性可以在每个核苷酸并入步骤之后被确定。然后，模板的序列可以使用常规的沃森-克里克碱基配对法则来推论。使用标记有根据本公开内容的染料的改性的核苷酸用于确定单碱基的同一性例如在单核苷酸多态性的评分中可以是有用的，并且这样的单碱基延伸反应在本申请的范围内。
在实施方案中，模板多核苷酸的序列通过经由检测被附接至并入的核苷酸的荧光标记物来检测将一种或更多种核苷酸并入到与待被测序的模板多核苷酸互补的新生链中而确定。模板多核苷酸的测序用合适的引物来引发(或者被制备为将包含作为发夹(hairpin)的一部分的引物的发夹构建体)，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中将核苷酸添加至引物的3’末端以阶梯式方式延伸。
在特定的实施方案中，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、G和C)中的每个可以被标记有独特的荧光团并且还包含在3’位的阻断基团以防止不受控制的聚合。可选择地，四种核苷酸中的一种可以是未被标记的(深色的)。聚合酶使核苷酸并入到与模板多核苷酸互补的新生链中，并且阻断基团防止核苷酸的进一步并入。任何未并入的核苷酸被除去并且来自每个并入的核苷酸的荧光信号通过合适的手段例如使用激光激发和合适的发射滤光器的电荷耦合装置来光学地“读数”。然后，3’-阻断基团和荧光染料化合物特别地通过相同的化学方法或酶促方法被除去(脱保护)，以暴露新生链用于另外的核苷酸并入。典型地，并入的核苷酸的同一性将在每个并入步骤之后被确定，但这不是严格地必要的。类似地，美国专利第5,302,509号公开了对固定在固体支撑体上的多核苷酸测序的方法。该方法依赖于在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的、3’-阻断的核苷酸A、G、C和T并入到与固定的多核苷酸互补的生长的链中。聚合酶并入与靶多核苷酸互补的碱基，但通过3’-阻断基团来防止进一步的添加。然后，可以确定并入的核苷酸的标记物并且阻断基团通过化学裂解除去以允许进一步的聚合发生。在通过合成测序反应中待被测序的核酸模板可以是期望测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板将典型地包含具有游离的3’羟基基团的双链区，所述游离的3’羟基基团在测序反应中充当用于另外的核苷酸的添加的引物或起始点。待被测序的模板的区域将使该游离的3’羟基基团悬垂在互补链上。待被测序的模板的悬垂区域可以是单链的，但可以是双链的，条件是，“切口存在”于与待被测序的模板链互补的链上以提供用于引发测序反应的游离的3’OH基团。在这样的实施方案中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方案中，带有游离的3’羟基基团的引物可以作为与待被测序的模板的单链区杂交的单独组分(例如，短寡核苷酸)被添加。可选择地，引物和待被测序的模板链可以各自形成能够形成分子内双链体(duplex)例如比如发夹环结构的部分地自补的核酸链的一部分。发夹多核苷酸和它们可以附接至固体支撑体的方法在PCT公布第WO 2001/057248号和第WO 2005/047301号中公开。核苷酸被连续地添加至游离的3’-羟基基团，这导致在5’至3’方向上合成多核苷酸链。已经被添加的碱基的性质可以特别地但不一定地在每次核苷酸添加之后被确定，因此为核酸模板提供序列信息。在该上下文中，术语将核苷酸“并入”核酸链(或多核苷酸)中指的是经由形成具有核苷酸的5’磷酸酯基团的磷酸二酯键将核苷酸连接至核酸链的游离的3’羟基基团。
待被测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或者甚至包含脱氧核苷酸和核糖核苷酸的混合分子(hybrid molecule)。核酸模板可以包含天然存在的核苷酸和/或非天然存在的核苷酸以及天然的或非天然的骨架连接，条件是这些不阻止测序反应中的模板的复制。
在某些实施方案中，待被测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法例如经由共价附接被附接至固体支撑体。在某些实施方案中，模板多核苷酸可以被直接地附接至固体支撑体(例如基于二氧化硅的支撑体)。然而，在其他实施方案中，固体支撑体的表面可以以某种方式来改性，以便允许模板多核苷酸的直接共价附接，或者以便通过水凝胶或聚合电解质多层固定模板多核苷酸，所述水凝胶或聚合电解质多层自身可以被非共价地附接至固体支撑体。
其中多核苷酸已经被直接地附接至基于二氧化硅的支撑体的阵列是例如在PCT公布第WO2000/006770号中公开的那些，其中多核苷酸通过玻璃上的侧接环氧基团与多核苷酸上的内部氨基基团之间的反应被固定在玻璃支撑体上。此外，PCT公布第W02005/047301号中公开了例如用于在制备SMA中使用的通过基于硫的亲核体与固体支撑体的反应被附接至固体支撑体的多核苷酸的阵列。固体支撑的模板多核苷酸的又另一个实例是其中模板多核苷酸被附接至水凝胶，所述水凝胶被支撑在基于二氧化硅的支撑体或其他固体支撑体上。基于二氧化硅的支撑体典型地用于支撑如在PCT公布第WO00/31148号、第WO01/01143号、第WO02/12566号、第WO03/014392号、第WO00/53812号和美国专利第6,465,178号中描述的水凝胶和水凝胶阵列。
模板多核苷酸可以被固定至的特定的表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶在现有技术中被描述，它们中的某些在上文讨论。可以用于本申请的具体水凝胶包括在WO 2005/065814和美国公布第2014/0079923中描述的那些。在一个实施方案中，水凝胶是PAZAM(聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺))。
为了测序的目的，DNA模板分子可以被附接至珠或微粒；例如，如在美国专利第6,172,218号中描述的。制备其中每个珠包含不同的DNA序列的珠库(bead library)的另外的实例可以在Margulies等人，Nature.437,376-380(2005)；Shendure等人，Science.309,5741,1728-1732(2005)中找到。使用如所描述的核苷酸对这样的珠的阵列测序在本申请的范围内。
待被测序的模板可以在固体支撑体上形成“阵列”的一部分，在这种情况下，阵列可以采用任何方便的形式。因此，本公开内容的方法可应用于所有类型的“高密度”阵列，包括单分子阵列、成簇的阵列和珠阵列。标记有本申请的染料化合物的改性的核苷酸可以被用于对在通过将核酸分子固定在固体支撑体上形成的基本上任何类型的阵列上的模板测序，并且更特别地对任何类型的高密度阵列上的模板测序。然而，标记有本文描述的新的荧光染料的改性的核苷酸在测序成簇的阵列的上下文中是特别有利的。
在多个多核苷酸(multi-polynucleotide)阵列或成簇的阵列中，阵列上的有区别的区域包括多个多核苷酸模板分子。术语“成簇的阵列”指的是其中阵列上的有区别的区域或位点包括通过光学手段不是单独可分辨的多个多核苷酸分子的阵列。取决于如何形成阵列，阵列上的每个位点可以包含一个单独的多核苷酸分子的多个拷贝或者甚至少量的不同的多核苷酸分子的多个拷贝(例如两种互补的核酸链的多个拷贝)。多个多核苷酸或核酸分子的成簇的阵列可以使用本领域通常已知的技术来产生。通过实例的方式，WO 98/44151和WO00/18957两者均描述了核酸的扩增的方法，其中模板和扩增产物两者均保持被固定在固体支撑体上以便形成包含固定的核酸分子的簇或“集群”的阵列。存在于根据这些方法制备的成簇的阵列上的核酸分子是用于使用标记有本文描述的新的荧光染料的改性的核苷酸测序的合适的模板。
标记有本申请的染料化合物的改性的核苷酸在测序单分子阵列上的模板中也是有用的。如本文使用的术语“单分子阵列”或“SMA”指的是分布(或排列)在固体支撑体上的多核苷酸分子的群体，其中任何单独的多核苷酸与群体中的所有其他多核苷酸的间距使得可以产生多核苷酸的单独分辨。因此，被固定在固体支撑体的表面上的靶核酸分子应当能够通过光学手段分辨。这意指在使用的特定成像装置的可分辨区域内，必须存在各自代表一种多核苷酸的一种或更多种有区别的信号。
这可以实现，其中阵列上的相邻的多核苷酸分子之间的间距是至少100nm、更特别地至少250nm、还更特别地至少300nm、甚至更特别地至少350nm。因此，每个分子作为单分子荧光点是单独地可分辨的且可检测的，并且来自所述单分子荧光点的荧光还呈现出单步光漂白。
术语“单独地分辨(individually resolved)”和“单独的分辨(individualresolution)”在本文中用于说明，当可视化时，可以使阵列上的一个分子与其邻近的分子相区别。阵列上的单独分子之间的分离将部分地通过用于分辨单独分子的特别的技术来确定。单分子阵列的一般特征将通过参考PCT公布第WO 2000/006770号和第WO 2001/057248号来理解。虽然本公开内容的改性的核苷酸的一种应用是在通过合成测序反应中，但这样的标记的核苷酸的效用不限于这样的方法。事实上，核苷酸可以被有利地用于需要检测被附接至并入到多核苷酸中的核苷酸的荧光标记物的任何测序方法中。
特别地，标记有本申请的染料化合物的改性的核苷酸可以被用于自动荧光测序方案，特别是基于Sanger和合作者的链终止测序方法的荧光染料终止子循环测序。这样的方法通常使用酶和循环测序以将荧光标记的双脱氧核苷酸并入到引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法和相关的方案(Sanger型)依赖于具有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。
因此，本公开内容还涵盖标记有如本文描述的染料化合物的改性的核苷酸，所述改性的核苷酸是在3'位和2'位两处均缺少羟基基团的双脱氧核苷酸，这样的改性的双脱氧核苷酸适合用于在Sanger型测序方法以及类似方法中使用。
实施例
在以下实施例中进一步详细地公开了另外的实施方案，这些实施例不以任何方式意图限制权利要求的范围。
实施例1
4-[3-(苯并[d]噻唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-7,8-二氢-2H-吡喃并[3,2-g] 喹啉-9(6H)-基]丁酸叔丁酯(化合物I-1)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)丁酸叔丁酯(0.19g)溶解在乙醇(2mL)中。添加2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙酸乙酯(0.124g)，并将混合物在室温搅拌持续15min。添加哌啶(5μL)，并且使反应混合物的颜色变成红黄色。将反应混合物留在室温搅拌过夜。第二天，使粗反应混合物经历含水后处理(aqueous workup)、干燥以及通过色谱法的纯化(硅胶，其中石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂)，以得到化合物I-1。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为518.22。实测为：(-)517(M-1)。
实施例2
4-[3-(苯并[d]噻唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-7,8-二氢-2H-吡喃并[3,2-g] 喹啉-9(6H)-基]丁酸(化合物I-2)
将化合物I-1(51.8mg)溶解在DCM(5mL)中，并经由注射器添加三氟乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物留在室温搅拌过夜。使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏出，残余物用水(5mL)磨碎，滤出固体并干燥以得到化合物I-2。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为462.16。实测为：(-)461(M-1)。
实施例3
4-[3-(苯并[d]噻唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-9 (6H)-基]丁酸叔丁酯(化合物I-3)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-喹啉-1(2H)-基)丁酸叔丁酯(0.19g)溶解在乙醇(2mL)中。添加2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙酸乙酯(0.124g)，并将混合物在室温搅拌持续15min。添加哌啶(5μL)，并且使反应混合物的颜色变为红黄色。将反应混合物留在室温过夜，并且使粗反应混合物经历含水后处理、干燥以及通过色谱法的纯化(硅胶，其中石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂)，以得到化合物I-3。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为516.22。实测为：(-)515(M-1)；(+)517(M+1)。
实施例4
4-[3-(苯并[d]噻唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-9 (6H)-基]丁酸(化合物I-4)
将化合物I-3(51.7mg)溶解在DCM(6mL)中，并且经由注射器添加三氟乙酸(1mL)，并将反应混合物留在室温搅拌过夜。使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏掉，并且残余物用水(5mL)磨碎。将形成的固体滤出并且干燥以得到化合物I-4。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为460.15。实测为：(+)461(M+1)。
实施例5
4-[3-(苯并噁唑基-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-7,8-二氢-2H-吡喃并[3,2-g] 喹啉-9(6H)-基]丁酸叔丁酯(化合物I-5)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)丁酸叔丁酯(0.18g)溶解在乙醇(3mL)中。添加2-(苯并噁唑基)乙酸乙酯(0.124g)，并且将混合物在室温搅拌持续15min。添加哌啶(5μL)。使反应混合物的颜色变成红黄色。将反应混合物留在室温搅拌过夜。使粗反应混合物经历含水后处理、干燥以及通过色谱法的纯化(硅胶，其中石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂)，以得到化合物I-5。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为502.25。实测为：(-)501(M-1)。
实施例6
4-[3-(苯并噁唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-7,8-二氢-2H-吡喃并[3,2-g]喹 啉-9(6H)-基]丁酸(化合物I-6)
将化合物I-5(50mg)溶解在DCM(5mL)中，并且经由注射器添加三氟乙酸(0.5mL)，并将反应混合物留在室温搅拌过夜。使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏掉，并且残余物用水(5mL)磨碎。将形成的固体滤出并且干燥以得到化合物I-6。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为446.16。实测为：(-)445(M-1)。
实施例7
4-[3-(苯并噁唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-7,8-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-9 (6H)-基]丁酸乙酯(化合物I-7)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-3,4-喹啉-1(2H)-基)丁酸乙酯(0.17g)溶解在无水乙醇(2.5mL)中。添加2-(苯并噁唑-2-基)乙酸乙酯(0.102g)，并且将混合物在室温搅拌持续15min。添加哌啶(5μL)。将反应混合物留在室温搅拌过夜。使粗反应混合物经历含水后处理、干燥以及通过色谱法的纯化(硅胶，其中石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂)，以得到化合物I-7。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为472.20。实测为：(+)473(M+1)。
实施例8
4-[3-(苯并噁唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-9(6H)- 基]丁酸(化合物I-8)
将化合物I-7(51.8mg)溶解在乙酸(2.5mL)中，并且添加盐酸(5mL)，并将反应混合物留在60℃搅拌过夜。使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏出，并且残余物用水(5mL)磨碎。将化合物I-8滤出，并在真空中干燥。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为444.17。实测为：(+)445(M+1)。
实施例9
3-[4-(3-(苯并噁唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-2H-吡喃[3,2-g]喹啉-9(8H)- 基)-N-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)丁酰氨基]-丙-1-磺酸(化合物I-9)
将化合物I-8(50mg，112μmol)溶解在二甲基甲酰胺(1mL)中，并且然后将溶剂在真空中蒸馏出。该操作再重复两次，然后在室温，将干燥的化合物I-8再溶解在DMF(1mL)中。将六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻鎓((benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)(PyBOP，1.5当量，64mg，169μmol)添加至烧瓶中，然后经由微量移液管添加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，3当量，336μmol，43mg，58μL)。将反应烧瓶密封在氮气下。在反应完成后，将在DMF中的活化染料溶液与3-[(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)氨基]丙-1-磺酸盐(1.5当量，224μmol，63mg)混合。添加更多DIPEA(3当量，336μmol，43mg，58μL)。将烧瓶再次密封在氮气下并留在室温过夜。反应进程通过TLC、HPLC和(LCMS)来监测。当反应完成时，添加水(2mL)，将反应混合物搅拌持续15min并且然后在真空中在室温将溶剂从反应混合物中蒸馏出。化合物I-9被用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
实施例10
4-[4-(3-(苯并噁唑-2-基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-9 (8H)-基]-N-(3-磺基丙基)丁酰氨基]丁酸(化合物I-10)
将干燥的粗化合物I-9再溶解在二氯甲烷(2mL)中。添加三氟乙酸(0.5mL)并将反应留在室温过夜。反应用在真空中浓缩的水猝灭，并且然后通过制备型HPLC纯化。产物的纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为651.23。实测为：(-)650(M-1)。
实施例11
4-[3-(苯并噁唑-2-基)-8,8-二甲基-2-氧代-6-(磺基甲基)-2H-吡喃并[3,2-g] 喹啉-9(8H)-基]丁酸(化合物I-11)
将硫酸(2.5mL)冷却下来至约5℃，然后添加化合物I-8(45mg)，并且将反应混合物在20℃-25℃搅拌持续1h。将反应混合物保持在室温过夜。在外部冷却的存在下，反应混合物用无水醚缓慢地稀释。滤出沉淀物，溶解在水(5mL)和乙腈(5mL)的混合物中。将溶液过滤并通过制备型HPLC纯化。产物的纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为524.13。实测为：(-)623(M-1)。
实施例12
1-[(5-羧基戊基)-4-(11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并 [3,2,1-ij]喹啉-10-基]吡啶鎓溴化物(化合物I-12)
将8-羟基-2,3,6,7-四氢-1H,5H-吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-9-甲醛(0.217g)溶解在乙醇(6mL)中。向该溶液中添加1-[(5-羧基戊基)-(4-乙氧基羰基)甲基吡啶鎓溴化物(0.36g)，并且将混合物在室温搅拌持续15min。添加由在乙醇(5mL)中的哌啶(20mg)和乙酸(20mg)制备的哌啶乙酸盐(piperidine acetate)的溶液，并且将该反应混合物在60℃搅拌持续5小时，然后在室温搅拌过夜。将溶剂蒸馏出，并将残余物溶解在水(15mL)和乙腈(15mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化。将该化合物转化成更稳定的氢溴酸盐形式，以得到化合物I-12。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为432.20。实测为：(+)433(M+1)。
实施例13
1-(5-羧基戊基)-4-(1,1,7,7-四甲基-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃 并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基)吡啶-1-鎓溴化物(化合物I-13)
将8-羟基-2,3,6,7-四氢-1,1,7,7-四甲基-1H,5H-吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-9-甲醛(0.27g)溶解在乙醇(7mL)中。添加1-[(5-羧基戊基)-(4-乙氧基羰基)甲基吡啶鎓溴化物(0.36g)，并且将混合物在室温搅拌持续30min。添加在乙醇(5mL)中的由哌啶(20mg)和乙酸(20mg)制备的哌啶乙酸盐的溶液。将该反应混合物在60℃搅拌持续5小时，然后在室温搅拌过夜。将溶剂蒸馏出，并将红色残余物溶解在水(15mL)和乙腈(15mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化。通过与在乙酸(10％，0.3mL)中的HBr溶液反应，将该化合物转化成更稳定的氢溴酸盐形式，以得到化合物I-13。
纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为488.27。实测为：(+)489(M+1)。
实施例14
1-(5-羧基戊基)-4-(9-乙基-2-氧代-6,7,8,9-四氢-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-3- 基)吡啶-1-鎓溴化物(化合物I-14)
将1-乙基-7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-甲醛(0.2g)溶解在乙醇(10mL)中。添加1-[(5-羧基戊基)-(4-乙氧基羰基)甲基吡啶鎓溴化物(0.36g)，并且将混合物在室温搅拌持续30min。添加由在乙醇(5mL)中的哌啶(20mg)和乙酸(20mg)制备的哌啶乙酸盐的溶液。将该反应混合物在80℃搅拌持续2小时，然后在室温搅拌过夜。将溶剂蒸馏出，并将残余物溶解在水(10mL)和乙腈(10mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化。通过与在乙酸(10％，0.3mL)中的HBr溶液反应，将该化合物转化成更稳定的氢溴酸盐形式，以得到化合物I-14。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为420.20。实测为：(+)421(M+1)。
实施例15
4[4-(9-(4-(叔丁氧基-4-氧代丁基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-6,7,8,9-四氢-2H- 吡喃并[3,2-g]喹啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(化合物I-15)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-基)丁酸叔丁酯(0.72g)溶解在乙醇(25mL)中。添加4[4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(0.60g)，并将混合物在室温搅拌持续30min。添加由在乙醇(15mL)中的哌啶(50mg)和乙酸(50mg)制备的哌啶乙酸盐的溶液。将该反应混合物在80℃搅拌持续3小时，然后在室温搅拌过夜。将溶剂蒸馏出，并将残余物溶解在水(20mL)和乙腈(20mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化，以得到化合物I-15。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为598.20。实测为：(+)599(M+1)。
实施例16
4-[4-(9-(3-羧基丙基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-6,7,8,9-四氢-2H-吡喃并[3,2- g]喹啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(化合物I-16)
将化合物I-15溶解在DCM(5ml)中并添加TFA。将反应混合物在室温搅拌过夜。将溶剂在真空中蒸馏出。向残余物中添加水(1.5ml)和乙腈(10mL)，并将溶剂再次蒸馏出以除去TFA。将剩余的橙色结晶产物溶解在水(12mL)和乙腈(12mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为542.21。实测为：(+)543(M+1)。
实施例17
4[4-(9-(4-(叔丁氧基-4-氧代丁基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-8,9-二氢-2H-吡喃 并[3,2-g]喹啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(化合物I-17)
将4-(6-甲酰基-7-羟基-2,2,4-三甲基-喹啉-1(2H)-基)丁酸叔丁酯(0.36g)悬浮在乙醇(5mL)中。添加4[4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(0.30g)，并将混合物在室温搅拌持续30min。添加由在乙醇(15mL)中的哌啶(50mg)和乙酸(50mg)制备的哌啶乙酸盐的溶液。将该反应混合物在50℃搅拌持续5小时，然后在室温搅拌过夜。将溶剂蒸馏出，并将残余物溶解在水(10mL)和乙腈(10mL)的混合物中。将产生的溶液过滤并通过制备型HPLC纯化，以得到化合物I-17。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为596.26。实测为：(+)597(M+1)。
实施例18
4-[4-(9-(3-羧基丙基)-6,8,8-三甲基-2-氧代-8,9-二氢-2H-吡喃并[3,2-g]喹 啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基]丁-1-磺酸盐(化合物I-18)
将化合物I-17溶解在DCM(5ml)中并添加TFA。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后将溶剂在真空中蒸馏出。向残余物中添加水(2ml)和乙腈(10mL)，并将溶剂再次蒸馏出以除去残余的TFA。剩余的橙色结晶产物用乙醚磨碎，滤出并通过制备HPLC纯化，以得到化合物I-18。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为540.19。实测为：(-)539(M-1)；(+)541(M+l)。
实施例19
4-(4-(9-(4-((4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)(3-磺基丙基)氨基)-4-氧代丁基)-6, 8,8-三甲基-2-氧代-8,9-二氢-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基)丁-1-磺酸 盐(化合物-19)
将化合物I-8(50mg)溶解在DMF(1mL)中，并且然后将溶剂在真空中蒸馏出。重复该操作两次。在室温，将干燥的化合物I-8再溶解在DMF(1.5mL)中。将六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻鎓(PyBOP，1.5当量，64mg，169μmol)添加至烧瓶中，然后添加过量的DIPEA(60μL)。将反应烧瓶密封在氮气下。在反应完成后，将在DMF中的活化的染料溶液与3-[(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)氨基]丙-1-磺酸盐(63mg)混合。添加更多的DIPEA(58μL)。将烧瓶再次密封在氮气下并留在室温过夜。反应进程通过TLC、HPLC和(LCMS)来监测。当反应完成时，添加水(2mL)。将反应混合物搅拌持续15min，并且然后在室温在真空中，将溶剂从反应混合物中蒸馏出，以得到化合物I-19。该化合物被用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
实施例20
4-(4-(9-(4-((3-(羧基丙基))(3-磺基丙基)氨基)-4-氧代丁基)-6,8,8-三甲基- 2-氧代-8,9-二氢-2H-吡喃并[3,2-g]喹啉-3-基)吡啶-1-鎓-1-基)丁-1-磺酸盐(化合物I- 20)
将干燥的化合物I-19溶解在二氯甲烷(5mL)中。添加三氟乙酸(0.5mL)并且将反应留在室温过夜。反应用水(0.5mL)猝灭，在真空中浓缩并且然后通过制备型HPLC纯化。产物的纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为747.25。实测为：(-)746(M-1)。
实施例21
1-(5-羧基戊基)-4-(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)吡啶-1-鎓溴化物 (化合物I-21)
将4-二乙基氨基水杨醛(0.19g)溶解在乙醇(5mL)中。添加1-[(5-羧基戊基)-(4-乙氧基羰基)甲基吡啶鎓溴化物(0.36g)，并将混合物在室温搅拌持续30min。添加由在乙醇(5mL)中的哌啶(10mg)和乙酸(10mg)制备的哌啶乙酸盐的溶液。将该反应混合物在70℃搅拌持续5小时，然后在室温搅拌过夜。将产物滤出，悬浮在乙酸中的HBr溶液中(20％，1mL)。将该悬浮液在室温搅拌持续2小时，并且将最终产物滤出以得到更稳定的HBr盐形式化合物I-21。该染料被用于下一步骤而无需进一步纯化。纯度、结构和组成通过HPLC、NMR和LCMS来确认。MS(DUIS):MW计算为408.20。实测为：(+)409(M+l),817(2M+1)。
表2总结了实施例中公开的新的香豆素荧光染料的收率、表征数据和光谱性质。
表2.
实施例22
用于合成充分官能化的核苷酸缀合物的一般程序
在羧酸基团的活化之后，将本文公开的香豆素荧光染料与合适的氨基取代的核苷酸A-LN3-NH2或C-LN3-NH2偶联：
将染料(10μmol)溶解在二甲基甲酰胺(1ml)中，并且然后将溶剂在真空中蒸馏出。将该程序再重复两次。在室温，将干燥的染料溶解在5mL圆底烧瓶中的N,N-二甲基乙酰胺(DMA，0.2mL)中。
将四氟硼酸N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲(TSTU，1.5当量，15μmol，4.5mg)添加至烧瓶中，然后将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，3当量，30μmol，3.8mg，5.2μL)经由微量移液管添加至该溶液中。将反应烧瓶密封在氮气下。在15分钟后，反应进程通过TLC(洗脱剂H2O/乙腈1:9)和HPLC来监测。同时，将合适的N-LN3-NH2衍生物的溶液(20mM，1.5当量，15μmol，0.75mL)在真空中浓缩，然后再溶解在水(20μL)中。将在DMA中的活化染料的溶液转移至包含N-LN3-NH2的溶液的烧瓶中。添加更多的DIPEA(3当量，30μmol，3.8mg，5.2μL)连同三乙胺(1μL)。偶联的进程通过TLC、HPLC和LCMS来每小时地监测。
当反应完成时，经由移液管添加三乙胺碳酸氢盐缓冲液(TEAB，约0.05M，3mL)。充分官能化的核苷酸的初始纯化通过使猝灭的反应混合物通过柱(Sephadex倾倒入空的25g Biotage筒(cartridge)中，溶剂体系TEAB/MeCN)来进行。这除去大部分剩余的染料。
将来自Sephadex柱的级分在真空中浓缩。在通过20μm尼龙过滤器(Nylon filter)过滤之前，将原材料(crude material)再溶解在最小体积的水和乙腈中。过滤的溶液通过制备型HPLC来纯化。制备的化合物的组成由LCMS来确认。
表3总结了被标记有本文公开的新的香豆素染料的多种核苷酸的结构和光谱性质。ffA-LN3-染料指的是具有LN3连接基并被标记有本文公开的香豆素染料的充分官能化的A核苷酸。ffC-LN3-染料指的是具有LN3连接基并被标记有本文公开的香豆素染料的充分官能化的C核苷酸。结构的每个中的R基团指的是缀合后的香豆素染料部分。
表3.
被标记有新的具有长的斯托克斯位移的香豆素染料I-16的A核苷酸的效率通过与被标记有商业染料DY510XL和ChromeoTM 494(CH494)的适当的A核苷酸的比较来展示。在此测序实例中，使用双通道检测方法(two-channel detection method)。关于本文描述的双通道方法，核酸可以利用在美国专利申请公布第2013/0079232中描述的方法和系统来测序，该专利申请公布的公开内容通过引用以其整体并入本文。在双通道检测中，核酸可以通过提供在第一通道中检测的第一核苷酸类型、在第二通道中检测的第二核苷酸类型、在第一通道和第二通道两者中检测的第三核苷酸类型以及缺少在任一通道中未检测到的或最少检测到的标记物的第四核苷酸类型来测序。散点图通过实验的RTA 2.0.93分析来产生，以比较被标记有I-16、Dy510XL和ChromeoTM 494的充分官能化的A核苷酸的相对强度。通过再杂交(rehybridize)测序引物并进行短的(26个循环)SBS运行，在同一运行(相同的流动细胞和测序试剂)中进行比较。图1至图3中图示的散点图在26个循环运行的每个的循环5。
图1图示出了充分官能化的核苷酸(ffN)混合物在具有Pol812的并入缓冲液(incorporation buffer)中的散点图，所述充分官能化的核苷酸(ffN)混合物包含：A-I-16(2μΜ)、C-NR440(2μΜ)、暗G(2μΜ)以及T-NR550S0(1μΜ)(蓝色暴露(通道1)500ms，绿色暴露(通道2)1000ms；在扫描混合中扫描的)。
图2图示出了ffN混合物在具有Pol812的并入缓冲液中的散点图，所述ffN混合物包含：A-DY510XL(2μΜ)、C-NR440(2μΜ)、暗G(2μΜ)以及T-NR550S0(1μΜ)(蓝色暴露(通道1)500ms，绿色暴露(通道2)1000ms；在SRE中扫描的)。
图3图示出了ffN混合物在具有Pol812的并入缓冲液中的散点图，所述ffN混合物包含：A-CH494(2μΜ)、C-NR440(2μΜ)、暗G(2μΜ)以及T-NR550S0(1μΜ)(蓝色暴露(通道1)500ms，绿色暴露(通道2)1000ms；在扫描混合中扫描的)。
在图1-图3的每个中，“G”核苷酸未被标记，并且被示出为左下的云(cloud)(“暗G”)。来自新的香豆素染料I-16、DY510XL和CH4 94标记的“A”核苷酸的信号分别在图1、图2和图3中被示出为右上的云。来自NR550S0染料标记的“T”核苷酸的信号由左上的云指示，而NR440染料标记的“C”核苷酸的信号由右下的云指示。X轴示出了对于一个通道的信号强度，而Y轴示出了对于另一个通道的信号强度。它示出，与商业长的斯托克斯位移染料DY510XL和CH494相比，被标记有染料I-16的充分官能化的A核苷酸缀合物提供足够的信号强度和大体上更好的云分离。NR440的结构在美国临时申请第62/402,635中公开。

Claims (66)

1.一种式(I)的化合物或其盐、内消旋形式：
其中R1是并且其中R1任选地被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的环烷基以及任选地被取代的杂环基；
每个R2、R3、R4、R5和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
每个R6、R10a、R10b和R10c独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
X选自由以下组成的组：O、S、NR11以及Se；
R11选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、羧基烷基、磺酸根烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；并且
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1是
3.如权利要求2所述的化合物，其中X是O。
4.如权利要求2所述的化合物，其中X是S。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R1是
6.如权利要求1所述的化合物，其中R1是
7.如权利要求5或6所述的化合物，其中每个R10a和R10b是被取代的烷基。
8.如权利要求5至7中任一项所述的化合物，其中每个R10a和R10b是被羧基、羧酸根、磺基或磺酸根取代的烷基。
9.如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中R1被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：烷基、卤素以及C-羧基。
10.如权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中由实线和虚线表示的键是双键。
11.如权利要求10所述的化合物，其中R2是烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中R2是甲基。
13.如权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中每个R4和R5是H。
14.如权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是烷基。
15.如权利要求14所述的化合物，其中每个R4和R5是烷基。
16.如权利要求15所述的化合物，其中每个R4和R5是甲基。
17.如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中由实线和虚线表示的键是单键。
18.如权利要求17所述的化合物，其中R2和R3中的至少一个是烷基。
19.如权利要求18所述的化合物，其中R2和R3中的每个是烷基。
20.如权利要求17所述的化合物，其中R2和R3中的至少一个是H。
21.如权利要求20所述的化合物，其中R2和R3中的每个是H。
22.如权利要求17至21中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是H。
23.如权利要求17至21中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是烷基。
24.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中R6是被取代的烷基。
25.如权利要求24所述的化合物，其中R6是被羧基取代的烷基。
26.如权利要求24所述的化合物，其中R6是被-C(O)OR12取代的烷基，并且其中R12选自由以下组成的组：任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。
27.如权利要求24所述的化合物，其中R6是被-C(O)NR13R14取代的烷基，并且其中每个R13和R14独立地选自H、任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。
28.如权利要求27所述的化合物，其中每个R13和R14独立地选自烷基，所述烷基被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：羧基、羧酸根、-C(O)OR12、磺基以及磺酸根。
29.如权利要求1至28中任一项所述的化合物，其中R7是H。
30.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中R6和R7与它们被附接至的原子被连接在一起以形成任选地被取代的6元杂环基。
31.如权利要求30所述的化合物，其中所述任选地被取代的6元杂环基包含一个杂原子。
32.如权利要求30或31所述的化合物，其中所述6元杂环基被一个或更多个烷基取代。
33.如权利要求1至32中任一项所述的化合物，其中R8是H。
34.如权利要求1至33中任一项所述的化合物，其中R9是H。
35.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自由以下组成的组：
或其盐、内消旋形式。
36.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物经由R6被共价地附接至核苷酸或寡核苷酸，并且其中R6是被取代的烷基。
37.如权利要求1至34中任一项所述的化合物，其中所述化合物经由R10a、R10b或R10c被共价地附接至核苷酸或寡核苷酸，并且其中R10a、R10b和R10c中的每个是被取代的烷基。
38.一种式(II)的荧光化合物或其盐、内消旋形式，具有至少约60nm的斯托克斯位移：
其中RHet是任选地被一个或多更个R10取代的5元至10元杂芳基；
每个R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
R6选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
每个R7和R8独立地选自由以下组成的组：H、烷基、被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤素、氰基、羟基、羟基烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的杂环基；
可选择地，R6和R7连同它们被附接至的原子形成选自由以下组成的组的环或环体系：任选地被取代的5元-10元杂芳基或任选地被取代的5元-10元杂环基；
每个R10独立地选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的碳环基以及任选地被取代的杂环基；
由实线和虚线表示的键选自由单键和双键组成的组，条件是当是双键时，那么R3不存在。
39.如权利要求38所述的荧光化合物，其中RHet是任选地被一个或更多个R10取代的6元杂芳基。
40.如权利要求39所述的荧光化合物，其中RHet是
41.如权利要求38所述的荧光化合物，其中RHet是任选地被一个或更多个R10取代的9元杂芳基。
42.如权利要求41所述的荧光化合物，其中RHet选自苯并噻唑基或苯并噁唑基，每个任选地被一个或更多个R10取代。
43.如权利要求38至42中任一项所述的化合物，其中由实线和虚线表示的键是双键。
44.如权利要求43所述的化合物，其中R2是烷基。
45.如权利要求38至44中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是烷基。
46.如权利要求38至42中任一项所述的化合物，其中由实线和虚线表示的键是单键。
47.如权利要求46所述的化合物，其中R2和R3中的至少一个是烷基。
48.如权利要求46所述的化合物，其中R2和R3中的至少一个是H。
49.如权利要求46至48中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是烷基。
50.如权利要求46至48中任一项所述的化合物，其中R4和R5中的至少一个是H。
51.如权利要求38至50中任一项所述的化合物，其中R6是被取代的烷基。
52.如权利要求51所述的化合物，其中R6是烷基，所述烷基被选自羧基、-C(O)OR12和-C(O)NR13R14的一种或更多种取代基取代，其中R12选自由以下组成的组：任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基，并且其中每个R13和R14独立地选自H、任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基以及任选地被取代的3元至7元环烷基。
53.如权利要求52所述的化合物，其中每个R13和R14独立地选自烷基，所述烷基被选自由以下组成的组的一种或更多种取代基取代：羧基、羧酸根、-C(O)OR12、磺基以及磺酸根。
54.如权利要求38至50中任一项所述的化合物，其中R6和R7与它们被附接至的原子被连接在一起以形成任选地被取代的6元杂环基。
55.一种核苷酸或寡核苷酸，所述核苷酸或寡核苷酸被标记有根据权利要求1至54中任一项所述的化合物。
56.如权利要求55所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物经由R6被共价地附接至所述核苷酸或寡核苷酸，并且其中R6是被取代的烷基。
57.如权利要求55所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物经由R10被共价地附接至所述核苷酸或寡核苷酸，并且其中R10是被取代的烷基。
58.如权利要求55至57中任一项所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物通过连接基部分被附接至所述核苷酸或寡核苷酸的嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。
59.如权利要求55至58中任一项所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，还包含被共价地附接至所述核苷酸或寡核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’-OH阻断基团。
60.一种试剂盒，包含一种或更多种核苷酸，其中至少一种核苷酸是根据权利要求55至59所述的标记的核苷酸。
61.如权利要求60所述的试剂盒，包含两种或更多种标记的核苷酸。
62.如权利要求61所述的试剂盒，其中所述标记的核苷酸中的两种使用单一激光器来激发。
63.如权利要求61或62所述的试剂盒，还包含第三核苷酸和第四核苷酸，其中第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸中的每种被标记有不同的化合物，其中每种化合物具有有区别的吸光度最大值并且所述化合物中的每种与其他化合物是可区分的。
64.一种测序的方法，包括将根据权利要求55至59中任一项所述的核苷酸并入到测序测定中。
65.如权利要求64所述的方法，还包括检测所述核苷酸。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中所述测序测定在自动测序仪器上进行，并且其中所述自动测序仪器包括在不同波长处操作的两种光源。
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