CN115916908A - 长斯托克斯位移色烯并喹啉染料及其在测序应用中的用途 - Google Patents

长斯托克斯位移色烯并喹啉染料及其在测序应用中的用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及长斯托克斯位移色烯并喹啉染料及其作为荧光标记的用途。例如，这些染料可以用于标记核苷酸以用于核酸测序应用。这些色烯并喹啉染料具有式(I)。
Figure DDA0004022583560000011

Description

长斯托克斯位移色烯并喹啉染料及其在测序应用中的用途
技术领域
本公开涉及色烯并喹啉染料及其作为荧光标记的用途。具体地，这些化合物可以作为核苷酸标记用于核酸测序应用。
背景技术
带有荧光标记的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要技术。在重组DNA技术中采用的许多程序以前依赖于使用带有放射性标记的核苷酸或多核苷酸，例如32P。放射性化合物允许灵敏地检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的局限性，诸如它们的费用、有限的保质期、不足的灵敏度和更重要的安全考虑因素。消除对放射性标记的需求同时降低了安全性风险以及与例如试剂处理相关的环境影响和成本。适合于非放射性荧光检测的方法包括以非限制性示例的方式进行的自动化DNA测序、杂交方法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。
对于许多应用而言，希望采用多个光谱可区分的荧光标记，以便实现对多个空间重叠分析物的独立检测。在此类多重方法中，可以减少反应容器的数量，从而简化实验方案并且促进专用试剂盒的生产。例如，在多色自动化DNA测序系统中，多重荧光检测允许在单个电泳通道中分析多个核苷酸碱基，从而通过单色方法提高吞吐量，并且降低与通道间电泳迁移率变化相关的不确定性。
然而，多重荧光检测可能存在问题，并且存在的许多重要因素会限制适当荧光标记的选择。首先，在给定的应用中可能难以找到具有基本上分辨的吸收和发射光谱的染料化合物。另外，当若干荧光染料一起使用时，通过同时激发在可区分光谱区域中产生荧光信号可能是复杂的，因为这些染料的吸收带通常很分开，所以即使是两种染料也难以达到相当的荧光激发效率。许多激发方法使用高功率光源，如激光，因此染料必须具有足够的光稳定性以承受此类激发。对分子生物学方法特别重要的最后一个考虑因素是荧光染料必须与试剂化学组成(诸如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶)相容的程度。
随着测序技术进展，还需要开发满足所有上述限制并且特别适用于高通量分子方法(诸如固相测序等)的另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物和多个染料组。
具有改进的荧光特性(诸如合适的荧光强度、形状以及荧光带的波长最大值)的荧光染料分子可以提高核酸测序的速度和准确性。当在水基生物缓冲液中并且在较高温度下进行测量时，强荧光信号尤其重要，因为大多数有机染料的荧光强度在此类条件下显著较低。此外，染料所附接的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和染料的其他光谱特性。核碱基与荧光染料之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特异性设计来定制。荧光染料结构的优化可以提高核苷酸掺入的效率、降低测序误差的水平，并且减少核酸测序中试剂的使用，从而降低核酸测序的成本。
一些光学和技术的开发已引起图像质量的极大改善，但是最终受到光学分辨率差的限制。一般来讲，光学显微镜法的光学分辨率限于以所使用的光的波长的大约一半间隔开的对象。实际上，只有相距相当远(至少200nm至350nm)的对象才可以通过光学显微镜法分辨。提高图像分辨率并且增加每单位表面积的可分辨对象数量的一种方法是使用较短波长的激发光。例如，如果用相同的光学器件将光波长缩短Δλ约100nm，则分辨率将更好(约Δ50nm/(约15％))，将记录较少失真的图像，并且可识别区域上的对象的密度将增加约35％。
某些核酸测序方法采用激光来激发染料标记的核苷酸并对其进行检测。这些仪器使用较长波长的光，诸如红色激光，连同能够在660nm处激发的适当染料。为了在保持可用分辨率的同时检测更密集堆积的核酸测序簇，可以使用较短波长的蓝色光源(450nm至460nm)。在这种情况下，光学分辨率将不受较长波长红色荧光染料的发射波长的限制，而是受能够由次长波长光源(例如，由532nm处的“绿色激光”)激发的染料的发射的限制。因此，需要用于测序应用中的荧光检测的蓝色染料标记。
色烯并喹啉染料已在文献中报道用作荧光探针或线粒体标记。参见Geng等人，Sensors&Actuators:B.Chemical，2018年，第273卷：第1670-1675页，以及Liu等人，Chemical Communications，2018年，第54卷第12期：第1509-1512页。然而，这些色烯并喹啉染料中的大多数具有红光发射并且它们在用于核苷酸测序的水性条件下的稳定性仍然未知。因此，设计具有定制的吸附波长和荧光斯托克斯位移、具有良好的稳定性的色烯并喹啉染料仍然是染料开发中的关键挑战。
发明内容
本文描述了适合于核苷酸标记和测序应用的具有长斯托克斯位移和改进的荧光强度和化学稳定性的色烯并喹啉染料。这些色烯并喹啉染料在蓝光和绿光激发下都具有强荧光(例如，这些色烯并喹啉染料可以具有约450nm至约530nm、约460nm至约520nm、约475nm至约510nm或约490nm至约500nm的吸收波长)。此外，与用于合成测序的市售染料相比，这些色烯并喹啉染料在高pH缓冲液中具有更高的稳定性。
本公开的一些方面涉及式(I)的化合物或其盐或内消旋形式：
Figure BDA0004022583540000031
其中R1、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11、R12a和R12b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；
R2和R3中的每一者独立地是H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；并且
R6是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；
另选地，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者
另选地，R3和R4连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者
另选地，R8和R9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的3元至10元碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基。在一些实施方案中，当R2和R3中的每一者是乙基；R1、R4、R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，当R1和R2连同它们所附接的原子一起形成哌啶基，并且R3和R4连同它们所附接的原子一起形成哌啶基时，使得该化合物具有以下结构
Figure BDA0004022583540000041
R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，该式(I)的化合物也由式(Ia)或其盐或内消旋形式表示：
Figure BDA0004022583540000042
其中R13a、R13b、R14a和R14b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；并且由实线和虚线
Figure BDA0004022583540000043
表示的键选自由单键和双键组成的组，前提条件是当
Figure BDA0004022583540000051
是双键时，则R14b不存在。
在式(I)或式(Ia)的化合物的一些实施方案中，R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一者包含羧基基团(-C(O)OH)。在其他实施方案中，R2或R3包含羧基基团。
在一些方面，本公开的化合物被如以下等底物部分标记或与该底物部分缀合：核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配体、颗粒、细胞、半固体表面(例如，凝胶)或固体表面。标记或缀合可经由羧基基团进行，该羧基基团可以使用本领域已知的方法与部分(如核苷酸)或结合到其上的连接基上的氨基或羟基基团进行反应以形成酰胺或酯。
本公开的一些其他方面涉及包含连接基基团的染料化合物，以实现例如与底物部分共价附接。可以在染料的任何位置处(包括在R基团中的任一者处)进行连接。在一些实施方案中，连接可经由R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一者或经由式(I)的R2或R3进行。在一些另外的实施方案中，连接可经由R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一者或经由式(Ia)的R2进行。
本公开的一些其他方面提供由下式定义的标记的核苷或核苷酸化合物：
N-L-染料
其中N是核苷或核苷酸；
L是任选的连接基部分；并且
染料是根据本公开的式(I)或式(Ia)的荧光化合物的部分，其中该式(I)或式(Ia)的化合物的官能团(例如，羧基基团)与连接基部分或核苷/核苷酸的氨基或羟基基团进行反应以形成共价键合。
本公开的一些另外的方面涉及用式(I)或式(Ia)的化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。
本公开的一些另外的方面涉及一种试剂盒，该试剂盒包含可以用于各种免疫学测定、寡核苷酸或核酸标记或用于DNA合成测序的染料化合物(游离或标记形式)。在又一方面，本公开提供了包含染料“组”的试剂盒，该染料“组”特别适合于在自动化仪器平台上的合成测序循环。在一些方面是包括一种或多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是本文所述的标记的核苷酸。
本公开的另外的方面是一种确定靶多核苷酸的序列的方法，该方法包括：
(a)使引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物与一种或多种标记的核苷酸(例如，A、G、C和T或dATP、dGTP、dCTP和dTTP)接触，其中所述标记的核苷酸中的至少一种标记的核苷酸是本文所述的用式(I)或式(Ia)的色烯并喹啉染料标记的核苷酸，并且其中该引物多核苷酸与该靶多核苷酸的至少一部分互补；
(b)将标记的核苷酸掺入所述引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物；以及
(c)对所述延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物进行一个或多个荧光测量以确定所掺入的核苷酸的身份。
附图说明
图1示出了与色烯并喹啉染料I-1至I-6和I-8缀合的ffA核苷酸作为2μM溶液在Universal Scan Mix(USM)中的吸收光谱。
图2A至图2B示出了分别使用520nm或450nm作为激发波长在USM中获得的与色烯并喹啉染料I-1、I-2、I-5和I-6缀合的ffA核苷酸的荧光发射光谱。
图2C至图2D示出了分别使用520nm或450nm作为激发波长在USM中获得的与色烯并喹啉染料I-3、I-4和I-8缀合的ffA核苷酸的荧光发射光谱。
图3A显示了在45℃在乙醇胺缓冲液中与色烯并喹啉染料I-3和I-4缀合的两种ffA的剩余荧光百分比，与在相同条件下与香豆素参比染料A缀合的ffC的剩余荧光百分比相比。
图3B示出了与在45℃下在甘氨酸缓冲液中与香豆素参考染料A缀合的ffC相比，在相同条件下与色烯并喹啉染料I-3和I-4缀合的两种ffA的剩余的荧光百分比。
图3C示出了与在40℃下在TRIS缓冲液中与香豆素参考染料A缀合的ffC相比，在相同条件下与色烯并喹啉染料I-3和I-4缀合的两种ffA的剩余的荧光百分比。
图3D示出了与在40℃下在MOPS缓冲液中与香豆素参考染料A缀合的ffC相比，在相同条件下与色烯并喹啉染料I-3和I-4缀合的两种ffA的剩余的荧光百分比。
图4A至图4E示出了在因美纳iSeqTM100仪器上使用掺入混合物获得的散点图，该掺入混合物具有分别用色烯并喹啉染料I-1、I-2、I-3、I-4和I-5标记的ffA核苷酸。
图4F示出了使用掺入混合物在1×300个循环上的定相和预定相度量，该掺入混合物具有用色烯并喹啉染料I-1、I-2、I-3、I-4和I-5标记的ffA核苷酸。
具体实施方式
本公开的实施方案涉及具有增强的荧光强度、长斯托克斯位移和改进的化学稳定性(特别是在高pH水性环境中)的色烯并喹啉染料。这些色烯并喹啉染料还具有宽的激发波长，并且可以由蓝色光源和绿色光源两者激发。在一些实施方案中，本文所述的色烯并喹啉染料可以用于具有两通道CMOS检测(绿光激发和蓝光激发)的因美纳公司(Illumina)的iSeqTM平台中。
定义
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。
应注意，如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非清楚和明确地限于一指代物。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本教导的精神或范围的情况下，可以对本文描述的各种实施方案进行各种修改和变化。因此，本文描述的各种实施方案旨在覆盖在所附权利要求书及其等效物的范围内的其他修改和变化。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式(诸如“包括(include/includes/included)”)的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式(诸如“具有(have/has/had)”)的使用不是限制性的。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
如本文所用，常见的有机缩写的定义如下：
℃             温度(以摄氏度计)
dATP           脱氧腺苷三磷酸
dCTP           脱氧胞苷三磷酸
dGTP           脱氧鸟苷三磷酸
dTTP           脱氧胸苷三磷酸
ddNTP          双脱氧核苷三磷酸
ffA            完全官能化A核苷酸
ffC            完全官能化C核苷酸
ffG            完全官能化G核苷酸
ffN            完全官能化核苷酸
ffT            完全官能化T核苷酸
h              小时
RT             室温
SBS            合成测序
如本文所用，术语“阵列”是指附接到一个或多个底物的一组不同的探针分子，使得这些不同的探针分子可根据相对位置彼此区分。阵列可包括各自位于底物上的不同可寻址位置的不同探针分子。另选地或附加地，阵列可包括各自带有不同探针分子的单独底物，其中可根据底物在底物所附接到的表面上的位置或根据底物在液体中的位置来识别不同的探针分子。其中单独底物位于表面上的示例性阵列包括但不限于包括孔中的珠粒的那些，例如如美国专利6,355,431B1、US 2002/0102578和PCT公开WO 00/63437中所述。例如，在美国专利6,524,793中描述了可用于本发明中的例如使用微流体装置(诸如荧光激活细胞分选器(FACS))来区分液体阵列中的珠粒的示例性形式。可用于本发明的阵列的另外的示例包括但不限于美国专利5,429,807；5,436,327；5,561,071；5,583,211；5,658,734；5,837,858；5,874,219；5,919,523；6,136,269；6,287,768；6,287,776；6,288,220；6,297,006；6,291,193；6,346,413；6,416,949；6,482,591；6,514,751和6,610,482；和WO 93/17126；WO 95/11995；WO 95/35505；EP 742 287；和EP 799 897中描述的那些。
如本文所用，术语“共价连接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价连接的聚合物涂层是指与底物的官能化表面形成化学键的聚合物涂层，这与经由其他方式(例如，粘附或静电相互作用)粘附到该表面形成比较。应当理解，共价连接到表面的聚合物也可以经由除共价连接之外的方式键合。
如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意味着元素周期表第7列的放射性稳定原子中的任一种，例如，氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。
如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”是指烷基、烯基或炔基基团中的碳原子数，或环烷基或芳基基团的环原子数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的环和芳基的环可以含有“a”至“b”个(包括端值在内)的碳原子。例如，“C1至C4烷基”基团是指具有1个至4个碳的所有烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-；C3至C4环烷基基团是指具有3至4个碳原子的所有环烷基基团，即环丙基和环丁基。类似地，“4至6元杂环基”基团是指具有4至6个总环原子的所有杂环基基团，例如氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噁唑啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉等。如果对于烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基基团没有指定“a”和“b”，则将假设这些定义中描述的最广泛范围。如本文所用，术语“C1-C6”包括C1、C2、C3、C4、C5和C6，以及由这两个数字中的任一者定义的范围。例如，C1-C6烷基包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基、C2-C6烷基、C1-C3烷基等。类似地，C2-C6烯基包括C2烯基、C3烯基、C4烯基、C5烯基和C6烯基、C2-C5烯基、C3-C4烯基等；并且C2-C6炔基包括C2炔基、C3炔基、C4炔基、C5炔基和C6炔基、C2-C5炔基、C3-C4炔基等。C3-C8环烷基各自包括含有3、4、5、6、7和8个碳原子或由任何两个数字限定的范围的烃环，诸如C3-C7环烷基或C5-C6环烷基。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可以具有1至20个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至20”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意味着烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括20个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级烷基。仅以举例的方式，“C1-6烷基”或“C1-C6烷基”表示烷基链中存在一个至六个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烷氧基”是指式–OR(其中R为如上文所定义的烷基)，诸如“C1-9烷氧基”或“C1-C9烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级烯基。仅以举例的方式，“C2-C6烯基”或“C2-6烯基”表示烯基链中存在两个至六个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“炔基”。炔基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小炔基。炔基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级炔基。仅以举例的方式，“C2-6炔基”或“C2-C6炔基”表示炔基链中存在两个至六个碳原子，即，炔基链选自由乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基组成的组。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
术语“芳族”是指具有共轭π电子体系的环或环系，并且包括碳环芳族基团(例如，苯基)和杂环芳族基团(例如，吡啶)这两者。该术语包括单环基团或稠环多环(即，共用相邻原子对的环)基团，前提条件是整个环系是芳族的。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C6-C10芳基”、“C6或C10芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。
“芳烷基”或“芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的芳基基团，诸如“C7-14芳烷基”等，包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基和萘基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C1-6亚烷基基团)。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。
“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的杂芳基基团。示例包括但不限于2-噻吩基甲基、3-噻吩基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C1-6亚烷基基团)。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“碳环基”。碳环基基团也可以是具有3至10个碳原子的中等大小碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被命名为“C3-6碳环基”、“C3-C6碳环基”或类似的名称。碳环基环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。杂原子可以存在于环系中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可以具有3至20个环元(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环基”。杂环基基团也可以是具有3至10个环元的中等大小杂环基。杂环基基团也可以是具有3至6个环元的杂环基。杂环基基团可以被命名为“3至6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的示例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。
如本文所用，“烷氧基烷基”或“(烷氧基)烷基”是指通过亚烷基基团连接的烷氧基基团，诸如C2-C8烷氧基烷基或(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基，例如–(CH2)1-3-OCH3。
“O-羧基”基团是指其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-OC(＝O)R”基团，如本文所定义的。
“C-羧基”基团是指其中R选自由氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基组成的组的“-C(＝O)OR”基团，如本文所定义的。非限制性示例包括羧基(即，-C(＝O)OH)。
“磺酰基”基团是指其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO2R”基团，如本文所定义的。
“亚磺酸基”基团是指“-S(＝O)OH”基团。
“磺基”基团是指“-S(＝O)2OH”或“-SO3H”基团。
“磺酸根”基团是指“-SO3-”基团。
“硫酸根”基团是指“-SO4-”基团。
“S-亚磺酰氨基”基团是指其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO2NRARB”基团，如本文所定义的。
“N-亚磺酰氨基”基团是指其中RA和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(RA)SO2RB”基团，如本文所定义的。
“C-酰氨基”基团是指其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-C(＝O)NRARB”基团，如本文所定义的。
“N-酰氨基”基团是指其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(RA)C(＝O)RB”基团，如本文所定义的。
“氨基”基团是指其中RA和RB各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-NRARB”基团，如本文所定义的。非限制性示例包括游离氨基(即，-NH2)。
“氨基烷基”基团是指经由亚烷基基团连接的氨基基团。
“烷氧基烷基”基团是指经由亚烷基基团连接的烷氧基基团，诸如“C2-C8烷氧基烷基”等。
当基团被描述为“任选地取代的”时，其可以是未取代的或取代的。同样，当基团被描述为“取代的”时，取代基可以选自所指示的取代基中的一者或多者。如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“经取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，该取代基独立地选自：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C3-C7碳环基(任选被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、C3-C7碳环基-C1-C6-烷基(任选被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3至10元杂环基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3至10元杂环基-C1-C6-烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、卤基、-CN、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤基(C1-C6)烷基(例如，–CF3)、卤基(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基、-SO3H、磺酸根、硫酸根、亚磺酸基、-OSO2C1-C4烷基和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。在一些实施方案中，当烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基基团被取代时，它们各自独立地被选自由以下项组成的组的一个或多个取代基取代：卤基、-CN、-SO3 -、-OSO3 -、-SO3H、-SRA、-ORA、-NRBRC、氧代基、-CONRBRC、-SO2NRBRC、-COOH和-COORB，其中RA、RB和RC各自独立地选自H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
如本领域的普通技术人员所理解的，本文所述的化合物可以以离子化形式存在，例如，-CO2 -、-SO3 -或–O-SO3-。如果化合物包含带正电荷或带负电荷的取代基基团，例如，-SO3 -，则其还可以包含带负电荷或带正电荷的抗衡离子，使得该化合物整体为中性的。在其他方面，该化合物可以以盐形式存在，其中抗衡离子由共轭酸或碱提供。
应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基或二基。例如，当取代基需要两个与分子其余部分的连接点时，应当理解，该取代基为二基。例如，被识别为需要两个连接点的烷基的取代基包括二基，诸如–CH2–、–CH2CH2–、–CH2CH(CH3)CH2–等。其他基团命名惯例清楚地指示该基团为二基，诸如“亚烷基”或“亚烯基”。
当两个“相邻的”R基团据称“连同它们所附接的原子一起”形成环时，这意味着原子、居间键和两个R基团的集合体为所述的环。例如，当存在以下子结构时：
Figure BDA0004022583540000161
并且R1和R2被限定为选自由氢和烷基组成的组，或者R1和R2连同它们所附接的原子一起形成芳基或碳环基，这意味着R1和R2可以选自氢或烷基，或者替代性地，该子结构具有结构：
Figure BDA0004022583540000162
其中A为含有所描绘的双键的芳环或碳环基。
当取代基被描述为二基(即，具有与分子的其余部分的两个连接点)时，应理解，除非另外指明，否则取代基可以任何定向构型连接。因此，例如，描绘为-AE-或
Figure BDA0004022583540000163
的取代基包括被定向成使得A连接在分子的最左侧连接点的取代基，以及其中A连接在所述分子的最右侧连接点处的取代基。另外，如果基团或取代基被描绘为
Figure BDA0004022583540000164
则L定义为任选地存在的连接基部分；当L不存在(或没有)时，此类基团或取代基等同于
Figure BDA0004022583540000165
在示出本文所述化合物的单一内消旋形式的每种情况下，同样设想了替代性的内消旋形式。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。它们是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物，诸如7-脱氮腺嘌呤或7-脱氮鸟嘌呤。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。
如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子已被碳取代和/或碳已被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。另外，核苷可以掺入较大的DNA和/或RNA聚合物和低聚物中。
术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、脱氮嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。
如本文所用，当寡核苷酸或多核苷酸被描述为“包含”本文所述的核苷或核苷酸时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。类似地，当核苷或核苷酸被描述为寡核苷酸或多核苷酸的一部分，诸如“掺入到”寡核苷酸或多核苷酸中时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。在一些此类实施方案中，共价键在寡核苷酸或多核苷酸的3'羟基与在本文中描述为寡核苷酸或多核苷酸的3'碳原子与核苷酸的5'碳原子之间的磷酸二酯键的核苷酸的5'磷酸基团之间形成。
如本文所用，术语“可裂解的连接基”并不意在暗示需要去除整个连接基。裂解位点可以位于连接基上确保该连接基的一部分在裂解后保持附接到可检测标记和/或核苷或核苷酸部分的某个位置处。
如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文定义的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。
如本文所用，术语“磷酸酯”以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其质子化形式(例如，
Figure BDA0004022583540000181
)。如本文所用，术语“单磷酸”、“二磷酸”和“三磷酸”以本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包括质子化形式。
如本文所用，术语“定相”是指SBS中的现象，该现象是由3'终止子和荧光团的不完全去除和/或未能通过在给定测序循环下通过聚合酶完成簇内DNA链的一部分掺入所引起的。预定相是由掺入不具有有效3'终止子的核苷酸引起的，其中掺入事件由于终止失败而提前1个周期。定相和预定相导致特定循环的测量信号强度由来自当前循环的信号以及来自前一个和后一个循环的噪声组成。随着循环的数量增加，受到定相和预定相影响的每个簇的序列分数增加，妨碍对正确碱基的识别。预定相可以由在通过合成测序(SBS)期间存在痕量的不受保护或未封端的3'-OH核苷酸引起。未保护的3'-OH核苷酸可以在制造过程期间或可能在储存和试剂处理过程期间产生。因此，降低预定相发生率的核苷酸类似物的发现是令人惊讶的，并且相对于现有核苷酸类似物，在SBS应用中提供了巨大优势。例如，所提供的核苷酸类似物可以产生更快的SBS循环时间、较低的定相和预定相值以及较长的测序读段长度。
式(I)的色烯并喹啉染料
本公开的一些方面涉及式(I)的色烯并喹啉染料以及其盐和内消旋形式：
Figure BDA0004022583540000191
其中R1、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11、R12a和R12b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；
R2和R3中的每一者独立地是H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；并且
R6是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；
另选地，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者
另选地，R3和R4连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；并且/或者
另选地，R8和R9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的3元至10元碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基；
前提条件是当R2和R3中的每一者是乙基；R1、R4、R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基；并且
前提条件是当R1和R2连同它们所附接的原子一起形成哌啶基，并且R3和R4连同它们所附接的原子一起形成哌啶基时，使得该化合物具有以下结构
Figure BDA0004022583540000201
R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基。
在式(I)的化合物的任何实施方案中，当基团被定义为取代的C1-C6烷基时，它可以是被羧基、羧酸根、磺基、磺酸根、–C(O)OR15或–C(O)NR16R17取代的C1、C2、C3、C4、C5或C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是H或被羧基、羧酸根、-C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，R2和R3中的至少一者是H。在一些另外的实施方案中，R2和R3都是H。在其他实施方案中，R2是H，并且R3是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。在其他实施方案中，R2和R3中的每一者独立地是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。经取代的C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、2-丁基、正戊基、2-戊基、正己基等，这些烷基被以下如以下等一个或多个取代基取代：羧基、羧酸根(-C(O)O-)、磺基(-SO3H)、磺酸根(-SO3 -)、硫酸根(–O-SO3 -)、任选地取代的氨基(如Boc保护的氨基基团)、–C(O)OR15或–C(O)NR16R17，其中R15是任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基，并且其中R16和R17中的每一者独立地是H、任选地取代的C1-C6烷基，任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基。在一个实施方案中，R2和R3中的每一者是乙基。在另一个实施方案中，R2是H，并且R3是被羧基取代的正丙基。
在式(I)的化合物的任何实施方案中，当基团被定义为取代的C1-C6烷基时，它可以是被羧基、羧酸根、磺基、磺酸根、–C(O)OR15或–C(O)NR16R17取代的C1、C2、C3、C4、C5或C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是H或被羧基、羧酸根、-C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
式(I)的化合物的一些实施方案也由式(Ia)表示，其中式(I)的R3和R4连同它们所附接的原子一起形成具有以下结构的任选地取代的6元杂环基：
Figure BDA0004022583540000211
其盐或内消旋形式：
其中R13a、R13b、R14a和R14b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；并且
由实线和虚线
Figure BDA0004022583540000212
表示的键选自由单键和双键组成的组，前提条件是当
Figure BDA0004022583540000213
是双键时，则R14b不存在。
在式(Ia)的化合物的一些实施方案中，由实线和虚线
Figure BDA0004022583540000214
表示的键是双键。在一些此类实施方案中，R14a是H或C1-C6烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、2-丁基、正戊基、2-戊基或正己基等)。在一个实施方案中，R14a是甲基。在式(Ia)的化合物的其他实施方案中，由实线和虚线
Figure BDA0004022583540000215
表示的键是单键。在一些此类实施方案中，R14a是H，并且R14b是C1-C6烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、2-丁基、正戊基、2-戊基或正己基等)。在一些此类实施方案中，R14a和R14b中的每一者是H。在一些实施方案中，R13a和R13b中的每一者是H。在其他实施方案中，R13a和R13b中的每一者是C1-C6烷基。在一个实施方案中，R13a和R13b中的每一者是甲基。
在式(Ia)的化合物的一些实施方案中，R2是H。在其他实施方案中，R2是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、2-丁基、正戊基、2-戊基或正己基等)。在一些另外的实施方案中，R2是被选自由以下项组成的组的一个或多个取代基取代的C1-C6烷基：羧基(–C(O)OH)、羧酸根(–C(O)O-)、磺基(–SO3H)、磺酸根(–SO3 -)、–C(O)OR15和–C(O)NR16R17，其中R15是任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基，并且其中R16和R17中的每一者独立地是H、任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基。在一些另外的实施方案中，R2是被羧基或–C(O)NR16R17取代的C1-C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，取代位于直链C2烷基、C3烷基、C5烷基、C6烷基或C6烷基的末端处。在一个实施方案中，R3是被羧基取代的正丙基。
在式(I)或(Ia)的化合物的一些实施方案中，R1是H。在其他实施方案中，R1和R2与它们所附接的原子连接在一起以形成任选地取代的5元、6元或7元杂环基。在一些此类实施方案中，R1和R2与它们所附接的原子连接在一起以形成被一个或多个C1-C6烷基取代的6元杂环基。
在式(I)或式(Ia)的化合物的一些实施方案中，R6是C1-C6烷基。在一个实施方案中，R6是甲基。在其他实施方案中，R6是被羧基或–C(O)NR16R17取代的C1-C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
在式(I)或式(Ia)的化合物的一些实施方案中，R5是H。在一些另外的实施方案中，R11是H。在一些另外的实施方案中，R12a和R12b中的每一者是H。
在式(I)或(Ia)的化合物的一些实施方案中，R7、R8R9和R10中的至少一者是H。在一个这样的实施方案中，R7、R8、R9和R10中的每一者是H。在另一个这样的实施方案中，R7、R8和R10中的每一者是H。在另一个这样的实施方案中，R7和R10是H。在其他实施方案中，R7、R8、R9和R10中的至少一者独立地是C1-C6烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、2-丁基、正戊基、2-戊基或正己基等)或C1-C6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、正戊氧基、2-戊氧基、正己氧基等)。在一个这样的实施方案中，R9是甲基或甲氧基。在另一个这样的实施方案中，R8和R9中的每一者是甲基或甲氧基。在又一个实施方案中，R8、R9和R10中的每一者是甲基或甲氧基。在其他实施方案中，R7、R8、R9和R10中的至少一者是C1-C6烷基取代的羧基、羧酸根、磺基、磺酸根、-C(O)OR15或–C(O)NR16R17，并且其中每个R16和R17独立地是H或被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。在其他实施方案中，R8和R9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元或6元杂环基，例如具有诸如以下结构的那些：
Figure BDA0004022583540000231
Figure BDA0004022583540000232
式(I)或(Ia)的化合物的另外的实施方案包括以下：
Figure BDA0004022583540000233
Figure BDA0004022583540000241
和它们的盐和内消旋形式。非限制性示例为对应的C1-C6烷基羧酸酯(如由化合物的羧基基团形成的甲酯、乙酯、异丙酯和叔丁酯)。
环辛四烯(COT)光保护部分
在一些实施方案中，可以进一步修饰本文所述的荧光化合物(式(I)或(Ia))以引入与它们共价键合的光保护部分，例如，环辛四烯部分包括结构
Figure BDA0004022583540000242
其中
R1A和R2A中的每一者独立地是H、羟基、卤基、叠氮基、硫醇、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羧基、-C(O)OR5A、-C(O)NR6AR7A、任选地取代的C1-6烷基、任选地取代的C1-6烷氧基、任选地取代的C1-6卤代烷基、任选地取代的C1-6卤代烷氧基、任选地取代的C2-6烯基、任选地取代的C2-6炔基、任选地取代的C6-10芳基、任选地取代的C7-14芳烷基、任选地取代的C3-7碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基；
X1和Y1各自独立地为键、-O-、-S-、-NR3A-、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-NR4A-、-S(O)2-、-NR3A-C(＝O)-NR4A、-NR3A-C(＝S)-NR4A-、任选地取代的C1-6亚烷基或任选地取代的亚杂烷基，其中至少一个碳原子被O、S或N取代；
Z不存在，为任选地取代的C2-6亚烯基或任选地取代的C2-6亚炔基；
R3A和R4A中的每一者独立地是H、任选地取代的C1-6烷基或任选地取代的C6-10芳基；
R5A为任选地取代的C1-6烷基、任选地取代的C6-10芳基、任选地取代的C7-14芳烷基、任选地取代的C3-7碳环基、任选地取代的5至10元杂芳基或任选地取代的3至10元杂环基；
R6A和R7A中的每一者独立地是H、任选地取代的C1-6烷基、任选地取代的C6-10芳基、任选地取代的C7-14芳烷基、任选地取代的C3-7碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基；
在
Figure BDA0004022583540000251
中R1A和R2A所附接的碳原子任选地被O、S或N取代，前提条件是当所述碳原子被O或S取代时，则R1A和R2A两者均不存在；当所述碳原子被N取代时，则R2A不存在；并且m为介于0和10之间的整数。在一些实施方案中，X和Y均不是键。
在一些实施方案中，环辛四烯部分包含结构
Figure BDA0004022583540000252
Figure BDA0004022583540000253
在一些此类实施方案中，R1A和R2A中的至少一者是氢。在一些另外的实施方案中，R1A和R2A两者都是氢。在一些其他实施方案中，R1A是H并且R2A是任选地取代的氨基、羧基或-C(O)NR6AR7A。在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5或6，并且R1A和R2A中的每一者独立地为氢、任选地取代的氨基、羧基、-C(O)NR6AR7A或它们的组合。在一些另外的实施方案中，当m是2、3、4、5或6时，一个R1A是氨基、羧基或-C(O)NR6AR7A，并且其余R1A和R2A是氢。在一些实施方案中，在
Figure BDA0004022583540000254
中R1A和R2A所附接的至少一个碳原子被O、S或N取代。在一些此类实施方案中，
Figure BDA0004022583540000255
中的一个碳原子被氧原子取代，并且附接到所述取代的碳原子的R1A和R2A两者都不存在。在一些其他实施方案中，当
Figure BDA0004022583540000256
中的一个碳原子被氮原子替代时，连接到所述替代的碳原子的R2A不存在，并且连接到所述替代的碳原子的R1A是氢或C1-6烷基。在R1A和R2A的任何实施方案中，当R1A或R2A是-C(O)NR6AR7A时，R6A和R7A可以独立地是H、C1-6烷基或取代的C1-6烷基(例如，被-CO2H、-NH2、-SO3H或-SO3 -取代的C1-6烷基)。
在一些另外的实施方案中，本文所述的荧光染料包含以下结构的环辛四烯部分：
Figure BDA0004022583540000261
Figure BDA0004022583540000262
本文所述的COT部分可以由本文所述的荧光染料的官能团(例如，羧基基团)与COT衍生物的氨基基团之间的反应形成酰胺键(其中未示出酰胺键的羰基基团)产生。
标记的核苷酸或寡核苷酸
根据本公开的一个方面，本文所述的染料化合物适用于附接到底物部分，特别是包含连接基基团以使得能够附接到底物部分的染料化合物。底物部分事实上可以是本公开的染料可以与之缀合的任何分子或物质，并且以非限制性示例的方式，可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机聚合物和无机聚合物、染色体、核、活细胞，以及它们的组合或装配物。染料可以通过任选的连接基通过多种方式(包括疏水吸引、离子吸引和共价连接)缀合。在一些方面，染料通过共价附接缀合至底物。更具体地讲，共价连接借助于连接基基团实现。在一些情况下，此类标记的核苷酸也被称为“经修饰的核苷酸”。
本公开的一些方面涉及用如本文所述的式(I)或式(Ia)的染料或其内消旋形式的盐，或含有本文所述的光保护部分COT的其衍生物标记的核苷酸或寡核苷酸。标记的核苷酸或寡核苷酸可以经由羧基(-CO2H)或烷基-羧基基团附接到本文所公开的染料化合物以形成酰胺或烷基-酰胺键。在一些另外的实施方案中，羧基基团可以呈羧基基团的活化形式，例如酰胺或酯的形式，其可以用于连接到核苷酸或寡核苷酸的氨基或羟基基团。如本文所用的术语“活化酯”，是指能够在温和条件下与例如含有氨基基团的化合物反应的羧基基团衍生物。活化酯的非限制性示例包括但不限于对硝基苯基、五氟苯基和琥珀酰亚胺酯。
例如，式(I)的染料化合物可经由式(I)的R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一者或R2/R3中的一者附接到核苷酸或寡核苷酸。在一些此类实施方案中，式(I)的R9包含-CO2H或-(CH2)1-6-CO2H，并且该附接在R9的羧基官能团与核苷酸或核苷酸连接基的氨基官能团之间形成酰胺部分。作为一个示例，标记的核苷酸或寡核苷酸可以包含具有以下结构的染料部分：
Figure BDA0004022583540000271
在其他实施方案中，式(I)的R2或R3包含-CO2H或-(CH2)1-6-CO2H，并且该附接使用–CO2H基团形成酰胺。例如，标记的核苷酸或寡核苷酸可以包含以下染料部分：
Figure BDA0004022583540000272
类似地，式(Ia)的染料化合物可经由式(Ia)的R6、R7、R8、R9、R10和R11中的一者(例如，R9)或R2，通过在化合物的羧基官能团与核苷酸或核苷酸连接基的氨基官能团之间形成酰胺部分来附接到核苷酸或寡核苷酸。例如，标记的核苷酸或寡核苷酸可以包含以下染料部分：
Figure BDA0004022583540000281
在其他实施方案中，式(I)或式(Ia)的R6包括-CO2H或-(CH2)1-6-CO2H，并且该连接使用–CO2H基团形成酰胺。
在一些实施方案中，染料化合物可以经由核苷酸碱基共价附接到寡核苷酸或核苷酸。在一些此类实施方案中，标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有任选地通过连接基部分附接到嘧啶碱基的C5位置或7-脱氮嘌呤碱基的C7位置的染料。例如，核碱基可以为7-脱氮腺嘌呤，并且染料任选地通过连接基在C7位置处连接到7-脱氮腺嘌呤。核碱基可以是7-脱氮鸟嘌呤，并且染料任选地通过连接基连接到7-脱氮鸟嘌呤的C7位置处。核碱基可以是胞嘧啶，并且染料任选地通过连接基连接到胞嘧啶的C5位置处。作为另一示例，核碱基可以是胸腺嘧啶或尿嘧啶，并且染料任选地通过连接基在C5位置处附接到胸腺嘧啶或尿嘧啶。
3'羟基封端基团
标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价连接到核苷酸的核糖或脱氧核糖的封端基团。该封端基团可以连接在核糖或脱氧核糖上的任何位置处。在特定实施方案中，该封端基团位于核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'OH位置处。各种3'OH封端基团公开于WO2004/018497和WO2014/139596中，这些申请特此以引用方式并入。例如，封端基团可以为叠氮甲基(-CH2N3)或取代的叠氮甲基(例如，-CH(CHF2)N3或CH(CH2F)N3)、或连接至核糖或脱氧核糖部分的3'氧原子的烯丙基。在一些实施方案中，3'封端基团为叠氮甲基，与核糖或脱氧核糖的3'碳形成3′-OCH2N3。
在一些其他实施方案中，3'封端基团和3'氧原子形成共价附接到核糖或脱氧核糖的3'碳的结构
Figure BDA0004022583540000282
的缩醛基团，其中：
R1a和R1b各种独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、氰基、卤素、任选地取代的苯基或任选地取代的芳烷基；
R2a和R2b各种独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、氰基或卤素；
替代地，R1a和R2a与其所连接的原子一起形成任选地取代的五至八元杂环基基团；
RF是H、任选地取代的C2-C6烯基、任选地取代的C3-C7环烯基、任选地取代的C2-C6炔基或任选地取代的(C1-C6亚烷基)Si(R3a)3；并且
每个R3a独立地为H、C1-C6烷基或任选地取代的C6-C10芳基。
附加的3'OH封端基团公开于美国公开2020/0216891 A1中，该公开全文以引用方式并入。缩醛封端基团的非限制性示例为
Figure BDA0004022583540000291
(AOM)、
Figure BDA0004022583540000292
Figure BDA0004022583540000293
各自共价连接到核糖或脱氧核糖的3'碳。
3'羟基封端基团的脱保护
在一些实施方案中，可以通过使用水溶性膦试剂去除或脱保护叠氮甲基3'羟基保护基团。非限制性示例包括三(羟甲基)膦(THMP)、三(羟乙基)膦(THEP)或三(羟丙基)膦(THP或THPP)。本文所述的3'-缩醛封端基团可以在各种化学条件下去除或裂解。对于含有乙烯基或烯基部分的缩醛封端基团
Figure BDA0004022583540000294
非限制性裂解条件包括在膦配体，例如三(羟甲基)膦(THMP)或三(羟丙基)膦(THP或THPP)的存在下的Pd(II)络合物，诸如Pd(OAc)2或烯丙基氯化Pd(II)二聚体。对于含有炔基基团(例如，乙炔基)的那些封端基团，其也可以通过在膦配体(例如，THP或THMP)的存在下的Pd(II)络合物(例如，Pd(OAc)2或烯丙基氯化Pd(II)二聚体)去除。
钯裂解试剂
在一些实施方案中，本文所述的3'羟基封端基团可以被钯催化剂裂解。在一些此类实施方案中，Pd催化剂是水溶性的。在一些此类实施方案中，为Pd(0)络合物(例如，三(3,3′,3″-次膦基三(苯磺酸基)钯(0)九钠盐九水合物)。在一些情况下，Pd(0)络合物可以通过试剂诸如烯烃、醇、胺、膦或金属氢化物还原Pd(II)络合物而原位生成。合适的钯源包括Na2PdCl4、Pd(CH3CN)2Cl2、(PdCl(C3H5))2、[Pd(C3H5)(THP)]Cl、[Pd(C3H5)(THP)2]Cl、Pd(OAc)2、Pd(Ph3)4、Pd(dba)2、Pd(Acac)2、PdCl2(COD)和Pd(TFA)2。在一个此类实施方案中，Pd(0)络合物由Na2PdCl4原位产生。在另一个实施方案中，钯源是烯丙基氯化钯(II)二聚体[(PdCl(C3H5))2]。在一些实施方案中，Pd(0)络合物通过将Pd(II)络合物与膦混合而在水溶液中产生。合适的膦包括水溶性膦，诸如三(羟丙基)膦(THP)、三(羟甲基)膦(THMP)、1,3,5-三氮杂-7-磷杂金刚烷(PTA)、双(对磺酸基苯基)苯基膦二水合物钾盐、三(羧乙基)膦(TCEP)和三苯基膦-3,3',3'-三磺酸三钠盐。
在一些实施方案中，Pd(0)通过将Pd(II)络合物[(PdCl(C3H5))2]与THP原位混合来制备。Pd(II)络合物和THP的摩尔比可以为约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一些另外的实施方案中，可以添加一种或多种还原剂，诸如抗坏血酸或其盐(例如，抗坏血酸钠)。在一些实施方案中，裂解混合物可以含有另外的缓冲液试剂，诸如伯胺、仲胺、叔胺、碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐，或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液试剂包括乙醇胺(EA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸钠、磷酸钠、硼酸钠、2-二甲基乙醇胺(DMEA)、2-二乙基乙醇胺(DEEA)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)或N,N,N′,N′-四乙基乙二胺(TEEDA)或它们的组合。在一个实施方案中，缓冲剂是DEEA。在另一个实施方案中，缓冲剂含有一种或多种无机盐，诸如碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐，或它们的组合。在一个实施方案中，无机盐为钠盐。
连接基
如本文所公开的染料化合物可以在取代基位置之一处包括反应性连接基基团，用于将该化合物共价连接至底物或另一分子。反应性连接基团是能够形成键(例如，共价键或非共价键)、特别是共价键的部分。在一个特定实施方案中，连接基可以是可裂解的连接基。使用术语“可裂解的连接基”并不意在暗示需要除去整个连接基。裂解位点可以位于连接基上确保该连接基的一部分在裂解后保持连接到染料和/或底物部分的某个位置处。以非限制性示例的方式，可裂解的连接基可以是亲电可裂解的连接基、亲核可裂解的连接基、可光裂解的连接基、在还原条件下可裂解的(例如含有二硫化物或叠氮化物的连接基)、在氧化条件下可裂解的、通过使用安全捕获连接基可裂解的，以及通过消除机制可裂解的。使用可裂解的连接基将染料化合物连接到底物部分确保了如果需要的话，可以在检测后移除标记，从而避免下游步骤中的任何干扰信号。
可用的连接基基团可以见于PCT公开WO2004/018493(以引用方式并入本文)中，其示例包括可以使用水溶性膦或由过渡金属和至少部分水溶性的配体形成的水溶性过渡金属催化剂裂解的连接基。在水性溶液中，后者形成至少部分水溶性的过渡金属络合物。此类可裂解的连接基可以用于将核苷酸的碱基连接到标记，诸如本文所示的染料。
特定的连接基包括PCT公开WO2004/018493(以引用方式并入本文)中所公开的那些，诸如包括下式的部分的那些：
Figure BDA0004022583540000311
(其中X选自包括O、S、NH和NQ的组，其中Q为C1-10取代或未取代的烷基基团，Y选自包括O、S、NH和N(烯丙基)的组，T为氢或C1-C10取代或未取代的烷基基团，并且*指示所述部分与核苷酸或核苷的其余部分连接的位置)。在一些方面，连接基将核苷酸的碱基连接到标记，诸如，本文所述的染料化合物。
连接基的附加示例包括美国公开2016/0040225(以引用方式并入本文)中所公开的那些，诸如包括下式的部分的那些：
Figure BDA0004022583540000321
(其中*指示所述部分与核苷酸或核苷的其余部分连接的位置)。本文所展示的连接基部分可以包括核苷酸/核苷与标记之间的全部或部分连接基结构。本文所展示的连接基部分可以包括核苷酸/核苷与标记之间的全部或部分连接基结构。
连接基的附加示例包括下式的部分：
Figure BDA0004022583540000322
Figure BDA0004022583540000323
其中B是核碱基；Z是–N3(叠氮基)、–O-C1-C6烷基、–O-C2-C6烯基或–O-C2-C6炔基；并且Fl包括染料部分，所述染料部分可以含有另外的连接基结构。本领域普通技术人员理解，本文所述的染料化合物通过使染料化合物的官能团(例如，羧基)与连接基的官能团(例如，氨基)反应而共价键合到连接基。在一个实施方案中，可裂解连接基包含
Figure BDA0004022583540000331
(“AOL”连接基部分)，其中Z为–O-烯丙基。
在特定实施方案中，荧光染料(荧光团)和鸟嘌呤碱基之间的连接基的长度可以改变，例如，通过引入聚乙二醇间隔区基团，从而与通过本领域已知的其他键附接到鸟嘌呤碱基的相同荧光团相比增加了荧光强度。示例性连接基及其特性在PCT公开WO2007020457(以引用方式并入本文)中示出。连接基的设计，尤其是其增加的长度，可以允许当掺入到多核苷酸(诸如DNA)中时，改善连接到鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团的亮度。因此，当染料用于需要检测附接到含有鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记的任何分析方法中时，有利的是连接基包含式–((CH2)2O)n–的间隔区基团，其中n为介于2和50之间的整数，如WO 2007/020457中所述。
核苷和核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处标记。如本领域所知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或多个磷酸基团组成。在RNA中，该糖是核糖，而在DNA中是脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶为胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，或在RNA的情况下为尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸也是核苷的磷酸酯，其中酯化发生在附接到糖的C-3或C-5的羟基基团上。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。
“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。
虽然碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但是技术人员将理解，可获得不改变核苷酸或核苷经历Watson-Crick碱基配对的能力的衍生物和类似物。“衍生物”或“类似物”意味着这样的化合物或分子：其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常类似，但其具有允许衍生的核苷酸或核苷与另一分子连接的化学或物理修饰，诸如不同的或附加的侧基。例如，碱基可以为脱氮嘌呤。在特定实施方案中，衍生物应当能够经历Watson-Crick配对。“衍生物”和“类似物”还包括例如具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键、氨基磷酸酯键等。
染料可以例如通过连接基附接到核苷酸碱基上的任何位置。在特定实施方案中，仍然可以对所得的类似物进行Watson-Crick碱基配对。特定的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位置或7-脱氮嘌呤碱基的C7位置。如上所述，连接基基团可以用于将染料共价连接到核苷或核苷酸。
在特定实施方案中，标记的核苷酸或寡核苷酸可以是可酶促掺入的和可酶促延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得该化合物不显著干扰核酸复制酶对核苷酸的总体结合与识别。因此，连接基还可以包含间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。
用本文所述的染料标记的核苷或核苷酸可以具有下式：
Figure BDA0004022583540000341
其中染料是本文所述的色烯并喹啉染料化合物(标记)部分(在染料的官能团与连接基“L”的官能团之间的共价键合之后)；B为核碱基，诸如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤等；L是可以存在或可以不存在的任选的连接基；R'可以是H，或者-OR'是单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根、硫代磷酸根、磷酸酯类似物、附接到反应性含磷基团的–O–，或者被封端基团保护的–O–；R”是H或OH；并且R”'是H、本文所述的3'OH封端基团，或-OR”'形成亚磷酰胺。其中-OR”'为亚磷酰胺，R'为酸可裂解的羟基保护基团，其允许随后在自动化合成条件下进行单体偶联。在一些另外的实施方案中，B包括
Figure BDA0004022583540000351
Figure BDA0004022583540000352
或它们的任选地取代的衍生物和类似物。在一些另外的实施方案中，标记的核碱基包括结构
Figure BDA0004022583540000353
在一个特定实施方案中，封端基团是与染料化合物分开的并且独立于染料化合物，即，不与后者附接。替代性地，染料可以包含3'-OH封端基团的全部或部分。因此，R”'可以是可以构成或可以不构成染料化合物的3'OH封端基团。
在又一个替代性的实施方案中，戊糖的3'碳上不存在封端基团，并且附接到碱基的染料(或染料和连接基构造)例如可以具有足以充当掺入另外的核苷酸的障碍的尺寸或结构。因此，该障碍可以归因于空间位阻或可以归因于尺寸、电荷和结构的组合，无论染料是否附接到糖的3’位置。
在另外又一个替代性的实施方案中，该封端基团存在于戊糖的2'或4'碳上，并且可以具有足以充当掺入另外的核苷酸的障碍的尺寸或结构。
使用封端基团允许对聚合进行控制，诸如当掺入标记的核苷酸时通过停止延伸来控制。如果封闭效应是可逆的，例如，以非限制性示例的方式，则通过改变化学条件或通过除去化学障碍，可以在某些点处停止延伸，然后允许其继续。
在一个特定实施方案中，连接基(在染料和核苷酸之间)和封端基团两者均存在并且为单独的部分。在特定实施方案中，连接基和封端基团两者在相同或基本上类似的条件下都是可裂解的。因此，脱保护和脱封闭过程可能更有效，因为只需要单一处理就可以除去染料化合物和封闭基团这两者。然而，在一些实施方案中，连接基和封端基团不需要可在类似条件下裂解，而是可在不同条件下单独裂解。
本公开还涵盖掺入了染料化合物的多核苷酸。此类多核苷酸可以为分别由以磷酸二酯键接合的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的DNA或RNA。多核苷酸可以包含与如本文示出的至少一种经修饰的核苷酸(例如，用染料化合物标记)组合的天然存在的核苷酸、除本文所述的标记的核苷酸之外的非天然存在的(或经修饰的)核苷酸或它们的任何组合。根据本公开的多核苷酸还可以包括非天然的骨架键和/或非核苷酸化学修饰。还设想了由包含至少一种标记的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物组成的嵌合结构。
如本文所述的非限制性示例性标记的核苷酸包括：
Figure BDA0004022583540000361
Figure BDA0004022583540000371
其中L表示连接基，并且R表示如上所述的核糖或脱氧核糖部分，或具有被单磷酸、二磷酸或三磷酸取代的5'位置的核糖或脱氧核糖部分。
在一些实施方案中，非限制性示例性荧光染料缀合物在下文示出：
Figure BDA0004022583540000372
Figure BDA0004022583540000381
Figure BDA0004022583540000391
其中PG代表本文所述的3'OH封端基团；p为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；并且k为0、1、2、3、4或5。在一个实施方案中，–O–PG是AOM。在另一个实施方案中，–O–PG为–O–叠氮甲基。在一个实施方案中，k为5。在一些另外的实施方案中，p为1、2或3；并且k为5。
Figure BDA0004022583540000401
是指作为连接基部分的氨基与染料的羧基基团之间的反应的结果的染料与可裂解连接基的连接点。在本文所述的标记的核苷酸的任何实施方案中，核苷酸为核苷酸三磷酸。
本公开的另外的方面涉及包含本文所述的标记的核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，靶多核苷酸被固定在固体载体上。在一些另外的实施方案中，固体载体包含多个固定的靶多核苷酸的阵列。在另外的实施方案中，固体载体包括图案化流动池。在另外的实施方案中，图案化流动池被制造在CMOS芯片上。在另外的实施方案中，图案化流动池包括多个纳米孔。在其他另外的实施方案中，多个纳米孔直接在每个CMOS光电二极管(像素)上对准。
试剂盒
本文提供了包括用本公开的色烯并喹啉化合物(即，第一标记)标记的第一核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包括第二标记的核苷酸，其用第二化合物(即，第二标记)标记，该第二化合物不同于第一标记的核苷酸中的色烯并喹啉。在一些实施方案中，可使用单个激发源激发第一标记的核苷酸和第二标记的核苷酸，该单个激发源可以是具有第一激发波长的第一光源。例如，第一标记和第二标记的激发带可以至少部分地重叠，使得在光谱重叠区域中的激发引起这两种标记发射荧光。在一些另外的实施方案中，试剂盒可以包括第三核苷酸，其中第三核苷酸用不同于第一标记和第二标记的第三化合物(即，第三标记)进行标记。在一些此类实施方案中，第一标记的核苷酸和第三标记的核苷酸可使用第二激发源激发，该第二激发源可以是具有与第一激发波长不同的第二激发波长的第二光源。例如，第一标记和第三标记的激发带可以至少部分地重叠，使得在光谱重叠区域中的激发引起这两种标记发射荧光。在一些另外的实施方案中，试剂盒还可以包括第四核苷酸。在一些此类实施方案中，第四核苷酸未标记(暗色)。在其他实施方案中，与第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸相比，第四核苷酸用不同的化合物进行标记，并且每种标记具有可与其他标记区分开的不同吸光度最大值。在仍其他实施方案中，第四核苷酸未标记。在一些实施方案中，第一激发光源具有约500nm至约550nm、约510nm至约540nm或约520nm至约530nm(例如520nm)的波长。第二光源具有约400nm至约480nm、约420nm至约470nm或450nm至约460nm(例如，450nm)的激发波长。在另选的实施方案中，第一光源具有约400nm至约480nm、约420nm至约470nm或450nm至约460nm(例如，450nm)的激发波长。第二激发光源具有约500nm至约550nm、约510nm至约540nm或约520nm至约530nm(例如520nm)的波长。第二光源具有约400nm至约480nm、约420nm至约470nm或450nm至约460nm(例如，450nm)的激发波长。在另外的实施方案中，第一标记、第二标记和第三标记中的每一种标记具有可以在单个发射收集滤光器或通道中收集的发射光谱。
在一些实施方案中，该试剂盒可以包括四种标记的核苷酸(A、C、G和T或U)，其中这四种核苷酸中的第一核苷酸用如本文所公开的化合物进行标记。在这种试剂盒中，这四种核苷酸中的每一种核苷酸可以用与其他三种核苷酸上的标记相同或不同的化合物进行标记。可替代地，这四种核苷酸中的第一核苷酸是本文所描述的标记的核苷酸，这四种核苷酸中的第二核苷酸携带第二标记，第三核苷酸携带第三标记，并且第四核苷酸未标记(暗色)。作为另一示例，这四种核苷酸中的第一核苷酸是本文所述的标记的核苷酸，这四种核苷酸中的第二核苷酸携带第二标记，第三核苷酸携带两个标记的混合物，并且第四核苷酸未标记(暗色)。因此，标记的化合物中的一者或多者可以具有不同的吸光度最大值和/或发射最大值，使得所述化合物能够与其他化合物区分开。例如，每种化合物可以具有不同的吸光度最大值和/或发射最大值，使得这些化合物中的每一种化合物在光谱上能够与其他三种化合物(或如果第四核苷酸未标记，则两种化合物)区分开。应当理解，吸收光谱和/或发射光谱中除最大值之外的部分可以不同，并且可以利用这些差异来区分化合物。该试剂盒可以是这样的：即，这些化合物中的两种或更多种化合物具有不同的吸光度最大值。本文所公开的色烯并喹啉染料通常吸收低于500nm的区域中的光。例如，这些色烯并喹啉染料可以具有约450nm至约530nm、约460nm至约520nm、约475nm至约510nm或约490nm至约500nm的吸收波长。
本文示出的化合物、核苷酸或试剂盒可以用于检测、测量或识别生物系统(包括例如其过程或组分)。可以采用所述化合物、核苷酸或试剂盒的示例性技术包括测序、表达分析、杂交分析、遗传分析、RNA分析、细胞测定(例如，细胞结合或细胞功能分析)或者蛋白质测定(例如，蛋白质结合测定或蛋白质活性测定)。该用途可以是在用于执行特定技术的自动化仪器(诸如自动化测序仪器)上。测序仪器可以包括以不同波长操作的两个光源。
在一个特定实施方案中，本文所描述的标记的核苷酸可以与未标记或天然核苷酸或其任何组合进行组合供应。核苷酸的组合可以作为独立的单独组分(例如，每个容器或管一个核苷酸类型)或作为核苷酸混合物(例如，在同一容器或管中混合的两种或更多种核苷酸)提供。
在试剂盒包含多种，特别地是两种或三种、或者更特别地是四种核苷酸的情况下，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物标记，或者一种可以是暗色的，没有染料化合物。在不同的核苷酸用不同的染料化合物标记的情况下，试剂盒的一个特征是染料化合物是光谱上可区分的荧光染料。如本文所用，术语“光谱上可区分的荧光染料”是指当一个样品中存在两种或更多种此类染料时，以能够通过荧光检测设备(例如，商业的基于毛细管的DNA测序平台)区分的波长发射荧光能量的荧光染料。当用荧光染料化合物标记的两种核苷酸以试剂盒形式提供时，一些实施方案的特征在于光谱上可区分的荧光染料能够以相同的波长激发，例如，通过相同的光源激发。当用荧光染料化合物标记的四种核苷酸以试剂盒形式提供时，一些实施方案的特征在于光谱上可区分的荧光染料中的两种荧光染料均能够以一个波长激发，并且另外两种光谱上可区分的染料均能够以另一个波长激发。染料的特定激发波长在450nm至460nm、490nm至500nm，或520nm或以上(例如，532nm)。
在一些实施方案中，试剂盒包括用本公开的色烯并喹啉染料标记的第一核苷酸和用第二染料标记的第二核苷酸，其中染料具有至少10nm，具体地20nm至50nm或30nm至40nm的吸光度最大值差值。更具体地，第一标记可以具有高于50nm、高于60nm、高于70nm或高于80nm的斯托克斯位移。第二标记可以具有约80nm、高于90nm或高于100nm的斯托克斯位移(其中“斯托克斯位移”是峰吸收波长和峰发射波长之间的距离)。此外，第一标记可以具有约460nm至约520nm、约475nm至约510nm或约490nm至约500nm的吸收最大值。第二标记可以具有约400nm至约470nm或约450nm至约460nm的吸收最大值。在另外的实施方案中，试剂盒还可以第三标记的核苷酸，其中第三标记具有高于520nm的吸收最大值。第三标记可以具有高于20nm、高于30nm或高于40nm的斯托克斯位移，或介于20nm-40nm之间的斯托克斯位移。试剂盒可以还包括未标记的第四核苷酸。在另外的实施方案中，第一标记、第二标记和第三标记中的每一种标记具有大于540nm、大于550nm、大于560nm、大于570nm、大于580nm、大于590nm或大于600nm的发射最大值。在一些实施方案中，可以在单个发射收集通道或滤光器(例如，从约580nm至约700nm的收集区域)中检测或收集第一标记、第二标记和第三标记的发射光谱。
在一个替代性的实施方案中，本公开的试剂盒可以包含其中相同的碱基用两种不同的化合物标记的核苷酸。第一核苷酸可以用本公开的化合物标记。第二核苷酸可以用光谱上不同的化合物标记，例如在小于600nm处吸收的“绿色”染料。第三核苷酸可以被标记为本公开的化合物和光谱上不同的化合物的混合物，并且第四核苷酸可以是“暗色”并且不含标记。因此，简单地讲，核苷酸1至4可以被标记为“蓝色”、“绿色”、“蓝色/绿色”和暗色。为了进一步简化仪器，可以用单个光源所激发的两种染料标记四种核苷酸，并且因此核苷酸1至4的标记可以是“蓝色1”、“蓝色2”、“蓝色1/蓝色2”和暗色。
尽管本文以具有用不同染料化合物标记的不同核苷酸的构型为例来说明试剂盒，但是应当理解，试剂盒可以包括具有相同染料化合物的2种、3种、4种或更多种不同核苷酸。
除了标记的核苷酸之外，试剂盒还可以一起包含至少一种附加组分。所述另外的组分可以是在本文示出的方法中或在下文的实施例部分中识别的组分中的一种或多种组分。可以结合到本公开的试剂盒中的组分的一些非限制性示例在下文示出。在一些实施方案中，试剂盒还包含DNA聚合酶(诸如突变DNA聚合酶)和一种或多种缓冲液组合物。一种缓冲液组合物可以包含抗氧化剂，诸如抗坏血酸或抗坏血酸钠，该抗氧化剂可以用于在检测期间保护染料化合物免受光损伤。另外的缓冲液组合物可以包含可用于裂解3'封端基团和/或可裂解连接基的试剂。例如，由过渡金属和至少部分水溶性配体(诸如钯络合物)形成的水溶性膦或水溶性过渡金属催化剂。试剂盒的各种组分可以以在使用前稀释的浓缩形式提供。在此类实施方案中，还可以包括合适的稀释缓冲液。同样，在本文示出的方法中识别的组分中的一种或多种组分可以被包括在本公开的试剂盒中。在本文所述的核苷酸或标记的核苷酸的任何实施方案中，核苷酸包含3'羟基封闭基团。
测序方法
包含根据本公开的染料化合物的核苷酸可以用于任何分析方法，诸如包括检测附接到此类核苷酸的荧光标记的方法，无论是以其本身使用，还是掺入到较大的分子结构或缀合物中或者与较大的分子结构或缀合物相关联。在该语境中，术语“掺入到多核苷酸中”可以意味着5'磷酸以磷酸二酯键与第二核苷酸的3'羟基基团接合，该第二核苷酸本身可以形成较长多核苷酸链的一部分。本文示出的核苷酸的3'端可以以磷酸二酯键或可以不以磷酸二酯键与另外的核苷酸的5'磷酸接合。因此，在一个非限制性实施方案中，本公开提供了检测掺入到多核苷酸中的标记的核苷酸的方法，该方法包括：(a)将至少一种本公开的标记的核苷酸掺入到多核苷酸中，以及(b)通过检测来自附接到所述核苷酸的染料化合物的荧光信号，来确定掺入到多核苷酸中的核苷酸的身份。
该方法可以包括：合成步骤(a)，其中将根据本公开的一种或多种标记的核苷酸掺入到多核苷酸中；以及检测步骤(b)，其中通过检测或定量测量掺入到多核苷酸中的一种或多种标记的核苷酸的荧光，来检测所述核苷酸。
本申请的一些实施方案涉及一种确定靶多核苷酸(例如，单链靶多核苷酸)的序列的方法，该方法包括：(a)使引物多核苷酸与一种或多种标记的核苷酸(诸如核苷三磷酸A、G、C和T)接触，其中所述标记的核苷酸中的至少一者是本文所述的标记的核苷酸，并且其中该引物多核苷酸与该靶多核苷酸的至少一部分互补；(b)将标记的核苷酸掺入到所述引物多核苷酸中；以及(c)执行一次或多次荧光测量以确定所掺入的核苷酸的身份。在一些此类实施方案中，引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物通过使靶多核苷酸和与靶多核苷酸的至少一部分互补的引物多核苷酸接触来形成。在一些实施方案中，该方法还包括(d)从掺入到引物多核苷酸中的核苷酸中去除标记部分和3'羟基封端基团。在一些另外的实施方案中，该方法还可以包括(e)从引物多核苷酸链洗掉去除的标记部分和3'封闭基团。在一些实施方案中，重复步骤(a)至步骤(d)或步骤(a)至步骤(e)，直至确定靶多核苷酸链的至少一部分的序列。在一些情况下，步骤(a)至(d)或步骤(a)至(e)重复至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个循环。在一些实施方案中，在单一化学反应中去除来自掺入到引物多核苷酸链中的核苷酸的标记部分和3'封端基团。在一些另外的实施方案中，该方法在自动化测序仪器上执行，并且其中该自动化测序仪器包含在不同波长下操作的两个光源。在一些实施方案中，在完成本文所述的测序步骤的重复循环之后进行序列确定。
本公开的一些实施方案涉及一种用于确定靶多核苷酸(例如，单链靶多核苷酸)的序列的方法，该方法包括：(a)使引物多核苷酸与包含四种不同类型的核苷酸缀合物中的一种或多种核苷酸缀合物的掺入混合物接触，其中第一类型的核苷酸缀合物包含第一标记，第二类型的核苷酸缀合物包含第二标记，并且第三类型的核苷酸缀合物包含第三标记，其中第一标记、第二标记和第三标记中的每一种标记在光谱上彼此不同，并且其中引物多核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分互补；(b)将来自混合物的一种核苷酸缀合物掺入引物多核苷酸以产生延伸的引物多核苷酸；(c)使用第一激发光源执行第一成像事件并且检测来自延伸的多核苷酸的第一发射信号；以及(d)使用第二激发光源执行第二成像事件并且检测来自延伸的多核苷酸的第二发射信号；其中所述第一激发光源和所述第二激发光源具有不同波长；并且其中第一发射信号和第二发射信号在单个发射检测通道中检测或收集。在一些实施方案中，本文所述的色烯并喹啉染料可以用作该方法中描述的第一标记、第二标记或第三标记中的任一种标记。在一些实施方案中，该方法不包括在第一成像事件之后并且在第二成像事件之前对混合物中的任何核苷酸缀合物的化学修饰。在一些另外的实施方案中，掺入混合物还包含第四类型的核苷酸，其中第四类型的核苷酸未标记或者用不发射来自第一成像事件或第二成像事件的信号的荧光部分标记。在此测序方法中，基于第一成像事件和第二成像事件的检测模式确定每种所掺入的核苷酸缀合物的身份。例如，第一类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件中的信号态和第二成像事件中的暗态来确定。第二类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件中的暗态和第二成像事件中的信号态来确定。第三类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件和第二成像事件两者中的信号态来确定。第四类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件和第二成像事件两者中的暗态来确定。在另外的实施方案中，步骤(a)至(d)以重复循环进行(例如，至少30、50、100、150、200、250、300、400或500次)，并且该方法还包括基于每种顺序掺入的核苷酸缀合物的身份依次确定单链靶多核苷酸的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一激发光源相比第二激发光源具有更短的波长。在一些此类实施方案中，第一激发光源具有约400nm至约480nm、约420nm至约470nm或约450nm至约460nm的波长(即“蓝光”)。在一个实施方案中，第一激发光源具有约450nm的波长。第二激发光源具有约500nm至约550nm、约510nm至约540nm或约520nm至约530nm(即“绿光”)的波长。在一个实施方案中，第二激发光源具有约520nm的波长。在其他实施方案中，第一激发光源相比第二激发光源具有更长的波长。在一些此类实施方案中，第一激发光源具有约500nm至约550nm、约510nm至约540nm或约520nm至约530nm(即“绿光”)的波长。在一个实施方案中，第二激发光源具有约520nm的波长。第二激发光源具有约400nm至约480nm、约420nm至约470nm或约450nm至约460nm的波长(即“蓝光”)。在一个实施方案中，第二激发光源具有约450nm的波长。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸在合成步骤中通过聚合酶的作用被掺入到多核苷酸(诸如本文所述的单链引物多核苷酸)中。然而，可以使用将核苷酸接合到多核苷酸的其他方法，诸如，化学寡核苷酸合成或者将标记的寡核苷酸与未标记的寡核苷酸连接。因此，当术语“掺入”关于核苷酸和多核苷酸使用时，可以涵盖通过化学方法以及酶促方法进行的多核苷酸合成。
在一个特定实施方案中，进行了合成步骤并且该合成步骤可以任选地包括将模板或靶多核苷酸链与包含本公开的荧光标记的核苷酸的反应混合物一起温育。还可以在允许在退火到模板或靶多核苷酸链的多核苷酸链上的游离3'羟基基团和标记的核苷酸上的5'磷酸基团之间形成磷酸二酯键的条件下提供聚合酶。因此，合成步骤可以包括通过核苷酸与模板/靶链的互补碱基配对来指导多核苷酸链的形成。
在所述方法的所有实施方案中，检测步骤可以在向其中掺入了标记的核苷酸的多核苷酸链退火到模板/靶链上时进行，或者在其中将两条链分离的变性步骤之后进行。在合成步骤和检测步骤之间可以包括另外的步骤，例如化学反应步骤或酶促反应步骤，或者纯化步骤。具体地讲，可以分离或纯化掺入了标记的核苷酸的多核苷酸链，然后进一步加工或用于后续的分析。以举例的方式，在合成步骤中掺入了如本文所述的标记的核苷酸的多核苷酸链随后可以用作标记的探针或引物。在其他实施方案中，本文示出的合成步骤的产物可以经受进一步的反应步骤，并且如果需要，这些后续步骤的产物被纯化或分离。
用于合成步骤的合适条件将为熟悉标准分子生物学技术的人员所熟知。在一个实施方案中，合成步骤可以类似于标准引物延伸反应，该标准引物延伸反应在合适的聚合酶的存在下使用核苷酸前体(包括如本文所述的标记的核苷酸)形成与模板/靶链互补的延伸的多核苷酸链(引物多核苷酸链)。在其他实施方案中，合成步骤本身可以形成产生标记的双链扩增产物的扩增反应的一部分，该标记的双链扩增产物由来源于引物多核苷酸链和模板多核苷酸链的复制的退火互补链组成。其他示例性合成步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引发的DNA标记等。用于合成步骤的特别有用的聚合酶是能够催化如本文示出的标记的核苷酸的掺入的聚合酶。可以使用多种天然存在的或突变的/经修饰的聚合酶。以举例的方式，热稳定聚合酶可以用于使用热循环条件进行的合成反应，而热稳定聚合酶可能不是等温引物延伸反应所期望的。能够掺入根据本公开的标记的核苷酸的合适的热稳定聚合酶包括WO 2005/024010或WO06120433中描述的那些，这些公开中的每一篇以引用方式并入本文。在较低温度诸如37℃下进行的合成反应中，聚合酶不必是热稳定聚合酶，因此对聚合酶的选择将取决于许多因素，诸如反应温度、pH、链置换活性等。
在具体的非限制性实施方案中，本公开涵盖以下的方法：核酸测序、重新测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分以及涉及当用本文示出的染料标记的经修饰的核苷酸或核苷掺入到多核苷酸中时对其进行检测的任何其他应用。
本公开的特定实施方案提供了包含根据本公开的染料部分的标记的核苷酸在多核苷酸边合成边测序反应中的用途。合成测序通常涉及使用聚合酶或连接酶在5'至3'方向上将一个或多个核苷酸或寡核苷酸顺序添加至生长的多核苷酸链，以便形成与待测序的模板/靶核酸互补的延伸多核苷酸链。存在于一个或多个添加的核苷酸中的碱基的身份可以在检测或“成像”步骤中确定。添加的碱基的身份可以在每个核苷酸掺入步骤之后测定。然后可以使用常规的Watson-Crick碱基配对规则来推断模板的序列。使用用本文示出的染料标记的核苷酸来确定单个碱基的身份可能是有用的，例如，在单核苷酸多态性的评分中，并且此类单碱基延伸反应在本公开的范围内。
在本公开的一个实施方案中，模板/靶多核苷酸的序列通过检测附接到掺入的核苷酸的荧光标记，检测一个或多个核苷酸掺入到与待测序的模板多核苷酸互补的新生链中来确定。模板多核苷酸的测序可以用合适的引物(或制备成发夹构建体，其将包含引物作为发夹的一部分)引发，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中向引物的3'端添加核苷酸而以逐个方式延伸。
在特定实施方案中，不同的核苷酸三磷酸(A、T、G和C)中的每一种可以用独特的荧光团进行标记，并且还在3'位置处包含封端基团以防止不受控制的聚合。替代性地，四种核苷酸中的一种可以是未标记的(暗色)。聚合酶将核苷酸掺入到与模板/靶多核苷酸互补的新生链中，并且封端基团防止核苷酸的进一步掺入。任何未掺入的核苷酸都可以被洗掉，并且来自每种掺入的核苷酸的荧光信号可以通过合适的装置(如使用光源激发和合适的发射滤光器的电荷耦合装置)以光学方式“读取”。然后可以(同时或顺序地)除去(脱保护)3'封端基团和荧光染料化合物，以暴露新生链用于进一步掺入核苷酸。通常，将在每个掺入步骤之后确定所掺入的核苷酸的身份，但这不是严格必需的。类似地，美国专利5,302,509(其以引用方式并入本文)公开了对固定在固体载体上的多核苷酸进行测序的方法。
如上文所例示，该方法利用了在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的3'-封闭的核苷酸A、G、C和T掺入到与固定的多核苷酸互补的生长链中。聚合酶掺入与靶多核苷酸互补的碱基，但是被3'-封闭基团防止进一步添加。然后可以确定掺入的核苷酸的标记，并且通过化学裂解除去封闭基团以允许发生进一步的聚合。在合成测序反应中待测序的核酸模板可以是期望测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板将通常包含具有游离的3'羟基基团的双链区域，该双链区域充当用于在测序反应中添加另外的核苷酸的引物或起始点。待测序模板的该区域将在互补链上悬垂该游离的3'羟基基团。待测序模板的悬垂区域可以是单链的，但也可以是双链的，前提条件是在与待测序的模板链互补的链上存在“切口”，以提供用于引发测序反应的游离3'OH基团。在此类实施方案中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方案中，可以添加带有游离的3'羟基基团的引物，作为与待测序模板的单链区域杂交的单独组分(例如，短寡核苷酸)。替代性地，待测序的引物和模板链可以各自形成能够形成分子内双链体(诸如发夹环结构)的部分自身互补核酸链的一部分。发夹多核苷酸及其可以附接到固体载体的方法在PCT公开号WO0157248和WO2005/047301中公开，这些公开中的每一篇以引用方式并入本文。核苷酸可以被连续地添加到生长引物，导致在5'至3'方向上合成多核苷酸链。可以确定已添加的碱基的性质，特别是但不必在每次添加核苷酸之后，从而提供核酸模板的序列信息。因此，通过经由与核苷酸的5'磷酸基团形成磷酸二酯键而将核苷酸接合到核酸链的游离的3'羟基基团，从而将该核苷酸掺入到核酸链(或多核苷酸)中。
待测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或者甚至是由脱氧核苷酸和核糖核苷酸组成的杂合分子。核酸模板可以包含天然存在的和/或非天然存在的核苷酸以及天然或非天然的骨架键，前提条件是这些不阻止测序反应中模板的复制。
在某些实施方案中，待测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法(例如经由共价附接)附接到固体载体。在某些实施方案中，模板多核苷酸可以直接附接到固体载体(例如，基于二氧化硅的载体)。然而，在本公开的其他实施方案中，固体载体的表面可以以某种方式修饰，以便允许模板多核苷酸的直接共价附接，或者通过本身可以非共价地附接到固体载体的水凝胶或聚电解质多层来固定模板多核苷酸。
其中多核苷酸已直接附接到载体(例如，基于二氧化硅的载体，诸如WO00/06770(以引用方式并入本文)中所公开的那些)的阵列，其中通过玻璃上的环氧侧基与多核苷酸上的内部氨基基团之间的反应将多核苷酸固定在玻璃载体上。此外，可以通过硫基亲核物质与固体载体的反应将多核苷酸附接到固体载体，例如，如W02005/047301(以引用方式并入本文)中所述。固体支撑的模板多核苷酸的其他另外的示例是模板多核苷酸附接到在基于二氧化硅或其他固体载体上负载的水凝胶，例如如WO00/31148、WO01/01143、WO02/12566、WO03/014392、美国专利6,465,178和WO00/53812中所述，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文。
模板多核苷酸可以固定于其上的特定表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶描述于上文引用的参考文献和WO2005/065814中，该专利以引用方式并入本文。可以使用的特定水凝胶包括WO2005/065814和美国公开2014/0079923中所述的那些。在一个实施方案中，水凝胶为PAZAM(聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺))。
DNA模板分子可以附接到珠粒或微粒，例如，如美国专利6,172,218(其以引用方式并入本文)中所述。与珠粒或微粒的附接可以用于测序应用。可以制备珠粒文库，其中每个珠粒包含不同的DNA序列。示例性文库及其产生方法描述于Nature,437,376-380(2005)；Science,309,5741,1728-1732(2005)，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。使用本文示出的核苷酸对此类珠粒的阵列进行测序在本公开的范围内。
待测序的模板可以形成固体载体上的“阵列”的一部分，在这种情况下，阵列可以采取任何方便的形式。因此，本公开的方法适用于所有类型的高密度阵列，包括单分子阵列、成簇阵列和珠粒阵列。用本公开的染料化合物标记的核苷酸可以用于对基本上任何类型的阵列上的模板(包括但不限于通过将核酸分子固定在固体载体上而形成的那些)进行测序。
然而，用本公开的染料化合物标记的核苷酸在对成簇阵列进行测序的背景中是特别有利的。在成簇阵列中，阵列上的不同区域(通常称为位点或特征)包含多个多核苷酸模板分子。一般来讲，所述多个多核苷酸分子不能通过光学手段单独地分辨，而是作为整体被检测到。取决于阵列的形成方式，阵列上的每个位点可以包含一个单独多核苷酸分子的多个拷贝(例如，该位点对于特定的单链核酸种类或双链核酸种类是同质的)或甚至少量不同多核苷酸分子的多个拷贝(例如，两个不同核酸种类的多个拷贝)。核酸分子的成簇阵列可以使用本领域中公知的技术产生。以举例的方式，WO 98/44151和WO00/18957(这些专利中的每一篇以引用方式并入本文)描述了扩增核酸的方法，其中模板和扩增产物均保持固定在固体载体上，以便形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。根据这些方法制备的成簇阵列上存在的核酸分子是使用用本公开的染料化合物标记的核苷酸进行测序的合适模板。
用本公开的染料化合物标记的核苷酸也可用于对单分子阵列上的模板进行测序。如本文所用的术语“单分子阵列”或“SMA”，是指分布(或排列)在固体载体上的多核苷酸分子群，其中任何单独的多核苷酸与该分子群的所有其他多核苷酸的间距使得有可能单独地分辨单独的多核苷酸分子。因此，在一些实施方案中，固定到固体载体的表面上的靶核酸分子能够通过光学手段分辨。这意味着一个或多个不同的信号(每个信号代表一种多核苷酸)将出现在所用的特定成像装置的可分辨区域内。
可以实现单分子检测，其中阵列上的相邻多核苷酸分子之间的间距为至少100nm，更具体地讲至少250nm，还更具体地讲至少300nm，甚至更具体地讲至少350nm。因此，每个分子能够作为单分子荧光点来单独地分辨和检测，并且来自所述单分子荧光点的荧光也表现出单步光漂白。
术语“单独分辨的”和“单独分辨”在本文中用于规定，当可视化时，有可能将阵列上的一个分子与其相邻分子区分开。阵列上各个分子之间的间隔将部分地通过用于分辨各个分子的特定技术来确定。通过参考已公布的申请WO00/06770和WO 01/57248将理解单分子阵列的一般特征，这些申请中的每个申请以引用方式并入本文。虽然本公开的标记的核苷酸的一种用途是用于合成测序反应，但此类核苷酸的效用却不限于此类方法。事实上，本文所述的标记的核苷酸可以有利地用于需要检测附接到掺入到多核苷酸中的核苷酸的荧光标记的任何测序方法。
具体地讲，用本公开的染料化合物标记的核苷酸可以用于自动化荧光测序方案，尤其是基于Sanger和同事的链终止测序方法的荧光染料-终止子循环测序。此类方法通常使用酶和循环测序将荧光标记的双脱氧核苷酸掺入引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法和相关方案(Sanger型)利用带有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。
因此，本公开还涵盖用染料化合物标记的核苷酸，这些染料化合物是在3'位置和2'位置处都缺乏羟基基团的双脱氧核苷酸，此类经修饰的双脱氧核苷酸适合在Sanger型测序方法等中使用。
应当理解，用掺入3'封端基团的本公开的染料化合物标记的核苷酸也可以用于Sanger方法和相关方案，因为通过使用具有3'OH封端基团的核苷酸可以实现与通过使用双脱氧核苷酸所实现的效果相同的效果：两者均防止随后的核苷酸的掺入。在根据本公开的并且具有3'封闭基团的核苷酸将用于Sanger型测序方法的情况下，应当理解，附接到核苷酸的染料化合物或可检测标记不需要经由可裂解的连接基连接，因为在掺入本公开的标记的核苷酸的每种情况下；随后不需要掺入核苷酸，因此不需要从核苷酸上除去标记。
另选地，还可以使用未标记的核苷酸和含有本文所述的荧光染料的亲和试剂来进行本文所述的测序方法。例如，在步骤(a)的掺入混合物中，四种不同类型的核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)中的一种类型、两种类型、三种类型或每种类型可以未被标记。四种类型的核苷酸中的每一种类型的核苷酸(例如，dNTP)具有3'羟基封端基团，以确保仅单个碱基可以通过聚合酶添加到引物多核苷酸的3'端。在步骤(b)中掺入未标记的核苷酸后，洗掉剩余未掺入的核苷酸。然后引入亲和试剂，其特异性地识别并结合掺入的dNTP以提供包含掺入的dNTP的标记的延伸产物。在WO 2018/129214和WO 2020/097607中已经公开了未标记的核苷酸和亲和试剂在合成测序中的用途。使用未标记核苷酸的本公开的修饰的测序方法可以包括以下步骤：
(a')使引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物与一种或多种未标记的核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)接触，其中引物多核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分互补；
(b')将核苷酸掺入到引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；
(c')使延伸的引物多核苷酸与一组亲和试剂在一种亲和试剂特异性结合掺入的未标记的核苷酸的条件下接触，以提供标记的延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物；
(d')对标记的延伸的引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物执行一次或多次荧光测量，以确定掺入的核苷酸的身份。
在本文所述的修改的测序方法的一些实施方案中，掺入混合物中的未标记的核苷酸中的每一种核苷酸含有3'羟基封端基团。在另外的实施方案中，在下一掺入循环之前去除所掺入的核苷酸的3'羟基封闭基团。在其他另外的实施方案中，该方法还包括从掺入的核苷酸中去除亲和试剂。在又一些另外的实施方案中，在相同反应中去除3'羟基封端基团和亲和力试剂。在一些实施方案中，亲和试剂组可以包含特异性结合第一类型的核苷酸的第一亲和试剂、特异性结合第二类型的核苷酸的第二亲和试剂和特异性结合第三类型的核苷酸的第三亲和试剂。在一些另外的实施方案中，第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂中的每一种亲和试剂包含光谱可区分的可检测标记。在一些实施方案中，亲和试剂可以包括蛋白质标签、抗体(包括但不限于抗体的结合片段、单链抗体、双特异性抗体等)、适体、打结素、affimer或以合适的特异性和亲和力结合掺入的核苷酸的任何其他已知的试剂。在一个实施方案中，至少一种亲和试剂是抗体或蛋白质标签。在另一个实施方案中，第一类型的亲和试剂、第二类型的亲和试剂和第三类型的亲和试剂中的至少一种是包含一个或多个可检测标记(例如，相同可检测标记的多个拷贝)的抗体或蛋白质标签，其中可检测标记是或包括本文所述的色烯并喹啉染料部分。
实施例
在以下实施例中更详细地公开了附加的实施方案，这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。
实施例1.色烯并喹啉染料的合成
色烯并喹啉染料中间体的合成
Figure BDA0004022583540000541
将γ-(7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉-1-基)丁酸叔丁基酯(1)(3.94g，13.5mmol)与无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)(3×10mL)共蒸发。在0℃下，将三氯氧磷(1.9mL，20mmol)加入到30mL无水DMF中。在15分钟后，溶液变为浅粉色，加入1在10mL DMF中的溶液。在RT下，将反应物搅拌3小时，然后用10mL饱和NaHCO3水溶液淬灭。在5分钟后，减压除去挥发物，留下深绿色油。加入300mL饱和NaHCO3水溶液，并且将溶液用5×200mL乙酸乙酯萃取。将汇集的有机相经MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发或干燥。取残余物通过硅胶快速色谱法纯化，得到化合物2。收率：3.656g，绿色油(11.4mmol，84％)。LC-MS(ES和CI):(正离子)m/z 320(M+H+)；(负离子)m/z 318(M-H+)。
将γ-(6-甲酰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉-1-基)丁酸叔丁基酯(2)(2.46g，7.72mmol)溶解在无水DMF中，然后加入K2CO3(2.13g，15.4mmol)、碘化四丁基铵(258mg，0.70mmol)和炔丙基溴(甲苯中80重量％，1.28mL，11.6mmol)。在RT下，将反应体系搅拌过夜，然后用150mL水淬灭，然后用200mL乙酸乙酯萃取。分离水相，并用2×100mL乙酸乙酯萃取。然后将合并的有机相再次用2×100mL水萃取。将有机相经MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发或干燥。取残余物通过硅胶快速色谱法纯化，得到化合物3。收率：2.01g，黄色固体(5.65mmol，73％)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 358(M+H+),380(M+Na+)。
Figure BDA0004022583540000551
根据针对化合物3所述的方法，由γ-(1-二甲基-3-甲基-6-甲酰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢喹啉-1-基)丁酸叔丁基酯(4)合成化合物5，为灰白色固体。收率：351mg(0.86mmol，86％)。LC-MS(ES和CI):(正离子)m/z 400(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000552
根据针对化合物3所述的方法，由4-(二乙基氨基)水杨醛(6)合成化合物7，为浅粉色固体。收率：2.263mg(9.97mmol，95％)。LC-MS(ES和CI):(正离子)m/z 232(M+H+)。
色烯并喹啉染料的一般合成
Figure BDA0004022583540000553
在N2下，将取代的4-氨基-2-炔丙基氧基-苯甲醛(0.336mmol)和取代的苯胺(0.37mmol)溶解在无水DMF中，然后加入醋酸(10μL，0.16mmol)并将溶液加热至60℃持续1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯1∶1)示出形成黄色中间体。然后，加入CuI(13mg，0.067mmol)，并在60℃至100℃下搅拌反应体系直至完成。将反应体系用30mL乙酸乙酯稀释，在硅胶塞上过滤，然后通过快速色谱法纯化。
化合物8a：从中间体3和对氨基苯甲醚开始，获得化合物8a，产率为31％，为黄色固体。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 461(M+H+)。
化合物8b：从中间体3和4-甲基苯胺开始，获得化合物8b，产率为35％，为黄色固体(89mg，0.20mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 445(M+H+)。
化合物8c：从中间体3和3,4-二甲基苯胺开始，获得化合物8c，为两种区域异构体的6∶4混合物，产率为21％，为黄色固体(32mg，0.07mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 459(M+H+)。
化合物8d：从中间体3和3.4-二甲氧基苯胺开始，获得化合物8d，产率为48％，为黄色固体(68mg，0.138mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z491(M+H+)。
化合物8e：从中间体5和对氨基苯甲醚开始，获得化合物8e，产率为40％，为黄色固体(76mg，0.151mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 503(M+H+)。
化合物8f：从中间体7和(4-氨基苯基)乙酸甲酯开始，获得化合物8f，产率为39％，为黄色固体(321mg，0.85mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 377(M+H+)。
化合物8g：从中间体3和3,4-(亚甲二氧基)苯胺开始，获得化合物8g，产率为40％，为黄色固体(65mg，0.137mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 475(M+H+)。
化合物8h：从中间体3和3,4,5-三甲氧基苯胺开始，获得化合物8h，产率为35％，为黄色固体(65mg，0.117mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 521(M+H+)。
化合物8i：从中间体3和5-氨基-2,3-二氢苯并呋喃开始，获得化合物8i，产率为31％，为黄色固体(50mg，0.117mmol)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 473(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000571
在压力管中将化合物8a(82mg，0.178mmol)溶解在干燥1,4-二氧戊环(2mL)中。加入碘甲烷(0.5mL，8mmol)，并在100℃下加热反应体系。在2小时后，将其冷却，在减压下除去挥发物并通过快速柱色谱法纯化粗产物。然后将中间体溶解在干燥DCM(1mL)中，并加入0.5mL三氟乙酸，并将反应体系在RT下搅拌1.5小时。然后在减压下除去挥发物并通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到化合物I-1，为红色固体。收率：28mg(0.067mmol，37％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ(ppm)8.38(s,1H,Ar-CH),7.64(dd,J＝9.5,2.9Hz,1H,Ar-CH),7.57(s,1H,Ar-CH),7.51(d,J＝2.9Hz,1H,Ar-CH),6.52(s,1H,Ar-CH),5.18(s,2H,CH2-O),4.46(s,3H,NCH3),3.99(s,3H,OCH3),3.55–3.45(m,4H,CH2-N),2.86(t,J＝6.2Hz,2H,CH2-Ar),2.41(t,J＝6.9Hz,2H,CH2-COO),2.07–1.90(m,4H,CH2-CH2-N)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 419(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000572
在压力管中将化合物8b(89mg，0.20mmol)溶解在干燥1,2-二氯乙烷(2mL)中。加入三氟甲磺酸甲酯(0.45mL，4mmol)和K2CO3(138mg，1mmol)，并将反应体系在110℃下加热。在18小时后，将反应体系冷却，在减压下除去挥发物并通过快速柱色谱法纯化粗产物。然后将中间体溶解在甲醇(10mL)中并加入0.5mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌18小时。然后，用1N HCl中和该溶液，在减压下除去挥发物，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-2，为红色固体。收率：30μmol(15％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ(ppm)8.33(s,1H,Ar-CH),8.10(d,J＝8.8Hz,1H,Ar-CH),7.92–7.84(m,2H,Ar-CH),7.57(s,1H,Ar-CH),6.53(s,1H,Ar-CH),5.16(s,2H,CH2-O),4.44(s,3H,NCH3),3.56–3.52(m,2H,CH2-N),3.50–3.43(m,2H,CH2-N),2.85(t,J＝6.2Hz,2H,CH2-Ar),2.59(s,3H,CH3),2.25(t,J＝7.2Hz,2H,CH2-COO),2.06–1.89(m,4H,CH2-CH2-N)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 403(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000581
在压力管中将化合物8c(30mg，0.065mmol)溶解在干燥1,2-二氯乙烷(1mL)中。加入三氟甲磺酸甲酯(1mL)和二异丙基乙胺(0.5mL。在RT下在1小时后，将混合物用DCM(20mL)稀释，并用20mL饱和NaHCO3水溶液萃取该溶液。将有机相经MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发或干燥。通过快速柱色谱法纯化红色残余物。然后将中间体溶解在甲醇(10mL)中并加入0.15mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌18小时。然后，用1N HCl(0.6mL)中和该溶液，在减压下除去挥发物，并通过RP色谱法在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-3，为两种区域异构体的6∶4混合物，为红色固体。收率：15μmol(35％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ(ppm)8.71(s,0.4H,Ar-CH,isom B),8.32(s,0.6H,isom A),8.00(s,0.6H,Ar-CH,isom A),7.96(d,J＝9.0Hz,0.4H,Ar-CH,isom B),7.85(d,J＝9.0Hz,0.4H,Ar-CH,isom B),7.82(s,0.6H,Ar-CH,isom A),7.56(s,1H,Ar-CH),6.54(s,0.4H,Ar-CH,isom B),6.53(s,1H,0.6H,Ar-CH,isom A),5.21(s,0.8H,CH2-O,isom B),5.15(s,1.2H,CH2-O,isom A),4.44(s,3H,CH3-N),3.71–3.57(m,TEAB),3.57–3.51(m,2H,CH2-N),3.50–3.43(m,2H,CH2-N),2.85(t,J＝6.2Hz,2H,Ar-CH2),2.69(s,1H,CH3 isom B),2.63(s,2H,CH3 isom A),2.56(s,1H,CH3isom B),2.51(s,2H,CH3 isom A),2.27(t,J＝7.2,2H,CH2-COO),2.06–1.91(m,4H,CH2-CH2-N),1.20(t,J＝7.0Hz,TEAB)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 417(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000591
将化合物8d(65mg，0.132mmol)溶解在干燥二氯甲烷(1mL)中。在N2气氛下，加入二异丙基乙胺(114μL，0.66mmol)和三氟甲磺酸甲酯(300μL，2.65mmol)。在1小时后，在减压下除去挥发物。然后将粗产物溶解在甲醇(10mL)中并加入0.5mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌18小时。然后，用乙酸(0.15mL)中和该溶液，在减压下除去挥发物。残余物首先通过快速柱色谱法纯化，然后通过RP色谱法在C18柱上纯化，得到化合物I-4，为红色固体。收率：92μmol(69％)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3):δ(ppm)8.26(s,1H,Ar-CH),7.71(s,1H,Ar-CH),7.43(s,1H,,Ar-CH),7.42(s,1H,Ar-CH),6.48(s,1H,Ar-CH),5.12(s,2H,CH2-O),4.44(s,3H,CH3-N),4.15(s,3H,CH3-O),4.03(s,3H,CH3-O),3.70–3.55(m,1H,TEAB),3.50(d,J＝5.6Hz,2H,CH2-N),3.44(d,J＝7.7Hz,2H,CH2-N),2.82(t,J＝6.2Hz,2H,Ar-CH2),2.25(t,J＝7.2Hz,2H,CH2-COO),2.06–1.85(m,4H,CH2-CH2-N),1.17(t,J＝7.0Hz,1H,TEAB)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 449(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000601
在压力管中将化合物8e(80mg，0.159mmol)溶解在干燥1,2-二氯乙烷(2mL)中。在N2气氛下，加入三氟甲磺酸甲酯(360μL，3.18mmol)和K2CO3(109mg，0.795mmol)，并将反应体系加热至110℃持续24小时。减压除去挥发物，并通过快速柱色谱法纯化红色残余物。然后将中间体溶解在甲醇(5mL)中并加入0.35mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌18小时。然后，用1N HCl(0.15mL)中和该溶液。减压除去挥发物，并将粗产物首先通过快速柱色谱法纯化，然后通过RP色谱法在C18柱上纯化，得到化合物I-5，为红色固体。收率：69μmol(43％)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3):δ(ppm)8.36(s,1H,Ar-CH),8.16(d,J＝9.5Hz,1H,Ar-CH),7.69–7.63(m,2H,Ar-CH),7.51(d,J＝2.9Hz,1H,Ar-CH),6.54(s,1H,Ar-CH),5.19(d,J＝13.7Hz,1H,O-CHH),5.12(d,J＝13.7Hz,1H,O-CHH),4.47(s,3H,CH3-N),4.00(s,3H,CH3-O),3.63(q,J＝7.1Hz,1H,TEAB),3.58–3.47(m,1H,CHH-N),3.36–3.29(m,CHH-N underMeOH),3.03–2.89(m,1H,Ar-CH),2.27(d,J＝7.1Hz,2H,CH2-COO),2.04–1.84(m,4H,CH2-CH2-N),1.47(s,3H,CH3),1.46(d,J＝6.5Hz,3H,CH3),1.35(s,3H,CH3),1.20(t,J＝7.0Hz,2H,TEAB)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 461(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000611
在压力管中将化合物8f(310mg，0.182mmol)溶解在干燥1,4-二氧戊环(2mL)中。加入碘甲烷(0.5mL，8mmol)，并在黑暗中在100℃下加热反应体系。在2天后，减压除去挥发物，然后将中间体溶解在甲醇(5mL)中，并加入1mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌18小时。然后，用1N HCl(0.15mL)中和该溶液。在减压下除去挥发物，并通过制备型RP-HPLC在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-6，为红色固体。收率：28μmol(15％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ(ppm)8.47(s,1H,Ar-CH),8.15(d,J＝9.0Hz,1H,Ar-CH),8.02(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H,Ar-CH),7.98(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-CH),7.91(d,J＝9.4Hz,1H,Ar-CH),6.80(dd,J＝9.4,2.6Hz,1H,Ar-CH),6.51(d,J＝2.7Hz,1H,Ar-CH),5.25(s,2H,CH2-O),4.49(s,3H,NCH3),3.73(s,3H,OCH3),3.59(q,J＝7.1Hz,4H,CH2-N),2.65(q,J＝7.2Hz,6H,TEAB),1.29(t,J＝7.1Hz,6H,CH3 Et),1.10(t,J＝7.2Hz,9H,TEAB)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 377(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000612
将化合物8g(65mg，0.137mmol)溶解在干燥二氯甲烷(2mL)中。在0℃下在N2气氛下，加入三氟甲磺酸甲酯(77μL，0.68mmol)和N,N-二异丙基乙胺(118μL，0.68mmol)，然后在RT下搅拌4小时。加入另一份三氟甲磺酸甲酯(77μL，0.68mmol)和N,N-二异丙基乙胺(118μL，0.68mmol)和2mL干燥DCM。再过2小时后，在减压下除去挥发物。通过快速柱色谱法纯化红色残余物。然后将中间体溶解在甲醇(10mL)中并加入0.375mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在60℃下搅拌2小时。然后，用乙酸(0.09mL)中和该溶液。在减压下除去挥发物，并通过RP色谱法在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-7，为红色固体。收率：9.8μmol(7％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ(ppm)8.24(s,1H,Ar-CH),7.62(s,1H,Ar-CH),7.47(s,1H,Ar-CH),7.34(s,1H,Ar-CH),6.48(s,1H,Ar-CH),6.29(s,2H,O-CH2-O),5.08(s,2H,CH2-O),4.38–4.31(m,3H,CH3-N),3.50(t,J＝5.4Hz,2H,CH2-N),3.44(t,J＝7.8Hz,2H,CH2-N),2.81(m,2H,Ar-CH2),2.25(m,2H,CH2-COO),2.02–1.87(m,4H,CH2-CH2-N),1.20(t,J＝7.0Hz,2H,TEAB)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 433(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000621
将化合物8h(65mg，0.117mmol)溶解在干燥二氯甲烷(2mL)中。在0℃下在N2气氛下，加入三氟甲磺酸甲酯(27μL，0.234mmol)和N,N-二异丙基乙胺(41μL，0.234mmol)，然后在RT下搅拌2小时。然后再加入三氟甲磺酸甲酯(54μL，0.46mmol)和N,N-二异丙基乙胺(82μL，0.46mmol)，并将反应体系在RT下搅拌2小时。然后，再加入三氟甲磺酸甲酯(100μL，0.88mmol)和N,N-二异丙基乙胺(82μL，0.46mmol)，并将反应体系在RT下搅拌1小时，然后在减压下除去挥发物。将中间体溶解在甲醇(2mL)中并加入0.5mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌过夜。然后，用乙酸(0.24mL)中和该溶液。在减压下除去挥发物，并通过RP色谱法在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-8，为红色固体。收率：70μmol(60％)。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3):δ(ppm)8.49(s,1H,Ar-CH),7.51(s,1H,Ar-CH),7.23(s,1H,Ar-CH),6.49(s,1H,Ar-CH),5.09(s,2H,CH2-O),4.40(s,3H,CH3-N),4.16(s,3H,CH3-O),4.15(s,3H,CH3-O),3.98(s,3H,CH3-O),3.54–3.50(m,2H,CH2-N),3.47–3.41(m,2H,CH2-N),2.84(t,J＝6.2Hz,2H,Ar-CH2),2.24(t,J＝7.2Hz,2H,CH2-COO),2.04–1.89(m,4H,CH2-CH2-N)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 479(M+H+)。
Figure BDA0004022583540000631
将化合物8i(50mg，0.1mmol)溶解在干燥二氯甲烷(1mL)中。在0℃下在N2气氛下，加入N,N-二异丙基乙胺(208μL，1.2mmol)和三氟甲磺酸甲酯(600μL，5mmol)，然后在RT下搅拌2小时。然后再加入三氟甲磺酸甲酯(600μL，5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(208μL，1.2mmol)，并将反应体系在RT下搅拌2小时。然后，在减压下除去挥发物。通过快速柱色谱法纯化红色残余物。将中间体溶解在甲醇(5mL)中并加入0.25mL 4M NaOH水溶液。将反应体系在RT下搅拌过夜。然后，用乙酸(0.06mL)中和该溶液。在减压下除去挥发物，并通过RP色谱法在C18柱上纯化粗产物，得到化合物I-9，为红色固体。收率：4.1μmol(4％)，为红色固体。1H NMR(400MHz,MeOD/CDCl3):δ(ppm)8.30(s,1H,Ar-CH),8.13(s,1H,Ar-CH),7.54(s,1H,Ar-CH),7.28(s,1H,Ar-CH),6.54(s,1H,Ar-CH),5.17–5.14(m,2H,CH2-O),4.80(t,J＝8.4Hz,2H,CH2-CH2-O),4.49–4.40(m,3H,CH3-N),3.70–3.44(m,6H,CH2-N,CH2-CH2-O),2.85(t,J＝6.2Hz,2H,Ar-CH2),2.27(t,J＝7.2Hz,2H,CH2-COO),2.04–1.93(m,4H,CH2-CH2-N)。LC-MS(ESI):(正离子)m/z 431(M+H+)。
实施例2.色烯并喹啉染料标记的核苷酸的一般合成
将式(I)的色烯并喹啉染料(0.020mmol)与2×2mL的无水N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)共蒸发，然后溶于2mL无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMA)中。加入N,N-二异丙基乙胺(28.4μL，0.163mmol)，之后加入N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐的0.1M无水DMA溶液(TSTU，232μL，0.023mmol)。在RT下，将反应物在氮气下搅拌30分钟。同时，将2'-脱氧三磷酸腺苷-连接基(0.01mmol)的水溶液在减压下蒸发至干燥，并重悬于200μL的0.1M三乙基碳酸氢铵(TEAB)水溶液中。将活化的色烯并喹啉染料溶液加入到三磷酸中，并将反应体系在RT下搅拌18小时。首先在DEAE-Sephadex A25(25g)上通过离子交换色谱法纯化粗产物。汇集含有三磷酸盐的级分，并将溶剂在减压下蒸发至干燥。使用YMC-Pack-Pro C18柱通过制备型RP-HPLC进一步纯化粗材料。最终化合物通过LC-MS、分析型RP-HPLC和UV-Vis光谱法表征。
Figure BDA0004022583540000641
化合物ffA-LN3-I-1：产率：2.7μmol(54％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1346(M-H+),673(M-2H+)。UV-VISλmax＝503nm。荧光发射λmax＝590nm。
Figure BDA0004022583540000651
化合物ffA-LN3-I-2：产率：6.8μmol(68％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1330(M-H+),665(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝582nm。
Figure BDA0004022583540000652
化合物ffA-sPA-LN3-I-3：产率：6.3μmol(63％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1343(M-H+),671(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝578nm。
Figure BDA0004022583540000653
化合物ffA-sPA-LN3-I-4：产率：7.8μmol(78％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1375(M-H+),687(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝578nm。
Figure BDA0004022583540000661
化合物ffA-LN3-I-5：产率：7.3μmol(73％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1388(M-H+),694(M-2H+)。UV-VISλmax＝501nm。荧光发射λmax＝585nm。
Figure BDA0004022583540000662
化合物ffA-LN3-I-6：产率：3.1μmol(31％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1304(M-H+),652(M-2H+)。UV-VISλmax＝495nm。荧光发射λmax＝574nm。
Figure BDA0004022583540000671
化合物ffA-sPA-LN3-I-8：产率：6.9μmol(69％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1405(M-H+),702(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝583nm。
Figure BDA0004022583540000672
化合物ffA-AOM-AOL-I-4：产率：10μmol(50％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z 1405(M-H+),702(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝578nm。
Figure BDA0004022583540000673
化合物ffA-(DB)-AOM-AOL-I-4：产率：2.1μmol(21％)。LC-MS(ES):(负离子)m/z1407(M-H+),703(M-2H+)。UV-VISλmax＝500nm。荧光发射λmax＝578nm。
实施例3.与色烯并喹啉染料缀合的ffA核苷酸的光谱性质
在该实施例中，表征了与本文所述的色烯并喹啉染料缀合的几种完全官能化的A核苷酸(ffA)的光谱性质。图1示出了与色烯并喹啉染料I-1至I-6和I-8缀合的ffA核苷酸作为2μM溶液在Universal Scan Mix(USM，1M Tris pH 7.5，0.05％吐温，20mM抗坏血酸钠，10mM没食子酸乙酯)中的荧光吸收光谱。图2A至图2D示出了使用450nm或520nm作为激发波长在USM中获得的与色烯并喹啉染料I-1至I-6和I-8缀合的ffA核苷酸的荧光发射光谱。使用石英或塑料比色皿在Agilent Cary 100UV-Vis分光光度计上和在Cary Eclipse荧光分光光度计上获取光谱。观察到本文所述的色烯并喹啉染料可在蓝色和绿色光源下激发，并且还具有强荧光发射。
实施例4.色烯并喹啉染料标记的ffA的稳定性
化合物ffA-sPA-I-3和ffA-sPA-I-4在高pH水溶液中的稳定性通过在两种缓冲液中温育给定化合物的10μM溶液来评估：1)50mM乙醇胺缓冲液，pH 9.6、50mM NaCl、1mMEDTA、0.02％ CHAPS、4mM MgSO4；2)50mM甘氨酸缓冲液，pH 9.8、50mM NaCl、1mM EDTA、0.2％ CHAPS、4mM MgSO4，在45℃下在黑暗中6天。在设定的时间点，使用石英比色皿在Agilent Cary 100UV-Vis分光光度计上和在Cary Eclipse荧光分光光度计上测量溶液的UV-VIS吸收和荧光发射。另外，取等分溶液并通过分析型HPLC进行分析。图3A和图3B示出ffA-sPA-I-3和ffA-sPA-I-4的荧光发射随时间推移非常缓慢地降低，表明与在相同条件下用亮香豆素参考染料A标记的ffC相比，色烯并喹啉染料I-3和I-4在这些条件下是稳定的。香豆素参考染料A公开于美国专利公布号2018/0094140中，当与ffC缀合时具有结构部分
Figure BDA0004022583540000681
另外，通过在两种缓冲液：1)10mM Tris缓冲液，pH 8.0；2)100mM MOPS缓冲液，pH7.0中，温育10μM溶液，在40℃下在黑暗中温育14天，评估化合物ffA-sPA-I-3和ffA-sPA-I-4在适于核苷酸储存的缓冲液中的稳定性。在设定的时间点，使用石英比色皿在AgilentCary 100UV-Vis分光光度计上和在Cary Eclipse荧光分光光度计上测量溶液的UV-VIS吸收和荧光发射。另外，取等分溶液并通过分析型HPLC进行分析。图3C和图3D示出，与在相同条件下的香豆素参考染料A相比，ffA-sPA-I-3和ffA-sPA-I-4在Tris pH 8.0中在14天后保持>90％的荧光，在MOPS pH 7.0中在14天后保持>75％的荧光。
实施例5.因美纳iSeqTM100仪器上的测序实验
在因美纳iSeqTM100仪器上测试了用本文所述的色烯并喹啉染料标记的ffA，该仪器已经设置为在绿色激发光(约520nm)的情况下拍摄第一图像并且在蓝色激发光(约450nm)的情况下拍摄第二图像。修改测序配方以便执行标准SBS循环(掺入，之后进行成像，之后进行裂解)，达到1×300个循环。在这些实验的每一者中使用的掺入混合物在50mM乙醇胺缓冲液、pH 9.6、50mM NaCl、1mM EDTA、0.2％ CHAPS、4mM MgSO4和DNA聚合酶中含有以下四种ffN：用式(I)的色烯并喹啉染料标记的ffA、用450nm的蓝光可激发的ffC(例如ffC-连接基-香豆素参考染料A)、用绿光可激发的ffT(例如ffT-连接基-NR550s0)和未标记的ffG(暗ffG)。图4A至图4E示出了所获得的掺入混合物的散点图，该掺入混合物具有在循环26时分别用色烯并喹啉染料I-1、I-2、I-3、I-4和I-5标记的ffA核苷酸。图4F示出了1×300个循环上的定相和预定相度量。所有测试的ffA示出优异的质量散点图和测序度量。
表1示出了在因美纳iSeqTM100仪器上运行的2×300个循环的定相、预定相、PhiX错误率和％Q30度量，使用含有ffA-sPA-LN3-I-4的掺入混合物进行。仪器被设置为在绿色激发光的情况下拍摄第一图像并且在蓝色激发光的情况下拍摄第二图像，并且修改配方以针对2×300个循环执行标准SBS循环(掺入，随后成像，随后进行切割)。在这些实验中使用的掺入混合物在50mM乙醇胺缓冲液、pH 9.6、50mM NaCl、1mM EDTA、0.2％CHAPS、4mM MgSO4和DNA聚合酶中含有核苷酸ffA-sPA-LN3-I-4、用450nm的蓝光可激发的ffC(例如ffC-连接基-香豆素参考染料A)、用绿光可激发的ffT(例如ffT-连接基-NR550s0)和暗ffG。
表1.使用ffA-sPA-LN3-I-4的iSeqTM100测序度量(2×300个循环)
Figure BDA0004022583540000701
表2示出了在因美纳iSeqTM100仪器上运行的2×150个循环和2×300个循环的定相、预定相、PhiX错误率和％Q30度量，使用含有ffA-AOM-AOL-I-4的掺入混合物进行。仪器被设置为在绿色激发光的情况下拍摄第一图像并且在蓝色激发光的情况下拍摄第二图像，并且修改配方以针对2×300个循环执行标准SBS循环(掺入，随后成像，随后进行切割)。在这些实验中使用的掺入混合物在50mM甘氨酸缓冲液、pH 9.8、50mM NaCl、1mM EDTA、0.2％CHAPS、4mM MgSO4和DNA聚合酶中含有核苷酸ffA-AOM-AOL-I-4、用450nm的蓝光可激发并用钯络合物可裂解的ffC、用520nm的绿光可激发并用钯络合物可裂解的ffT和用钯络合物可裂解的暗ffG。这些实验中使用的裂解溶液含有100mM二乙基乙醇胺缓冲液pH 9.5、100mM三(羟丙基)膦、10mM[烯丙基氯化钯(AllylPdCl)]2、10mM抗坏血酸钠、1M NaCl、0.1％吐温20。
表2.使用ffA-AOM-AOL-I-4的iSeqTM100测序度量(2×150个循环和2×300个循环)
Figure BDA0004022583540000702

Claims (51)

1.一种式(I)的化合物、其盐或内消旋形式：
Figure FDA0004022583530000011
其中R1、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11、R12a和R12b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；
R2和R3中的每一者独立地是H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；并且
R6是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基；
另选地，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；
另选地，R3和R4连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的5元至10元杂环基；
另选地，R8和R9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的3元至10元碳环基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的3元至10元杂环基；
前提条件是当R2和R3中的每一者是乙基；R1、R4、R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基；并且
前提条件是当R1和R2连同它们所附接的原子一起形成哌啶基，并且R3和R4连同它们所附接的原子一起形成哌啶基时，使得所述化合物具有结构
Figure FDA0004022583530000021
R5、R7、R8、R10、R11、R12a和R12b中的每一者是H；并且R6是甲基时；则R9是包含羧基的经取代的C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R2是H，并且R3是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R2和R3中的每一者独立地是C1-C6烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物也由式(Ia)、其盐或内消旋形式表示：
Figure FDA0004022583530000022
其中R13a、R13b、R14a和R14b中的每一者独立地是H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、任选地取代的氨基、氨基(C1-C6烷基)、卤基、氰基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、硝基、磺酰基、磺基、亚磺酸基、磺酸根、S-亚磺酰氨基或N-亚磺酰氨基；并且
由实线和虚线
Figure FDA0004022583530000023
表示的键选自由单键和双键组成的组，前提条件是当
Figure FDA0004022583530000024
是双键时，则R14b不存在。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中由实线和虚线
Figure FDA0004022583530000025
表示的键是双键。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中R14a是H或C1-C6烷基。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中R14a是甲基。
8.根据权利要求4所述的化合物，其中由实线和虚线
Figure FDA0004022583530000031
表示的键是单键。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R14a是H，并且R14b是C1-C6烷基。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中R14a和R14b中的每一者是H。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的化合物，其中R13a和R13b中的每一者是H。
12.根据权利要求4至10中任一项所述的化合物，其中R13a和R13b中的每一者是C1-C6烷基。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中R13a和R13b中的每一者是甲基。
14.根据权利要求4至13中任一项所述的化合物，其中R2是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中R2是被选自由以下项组成的组的一个或多个取代基取代的C1-C6烷基：羧基(–C(O)OH)、羧酸根(–C(O)O-)、磺基(–SO3H)、磺酸根(–SO3 -)、–C(O)OR15和–C(O)NR16R17，其中R15是任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基，并且其中R16和R17中的每一者独立地是H、任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C6-C10芳基、任选地取代的5元至10元杂芳基或任选地取代的C3-C7环烷基。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中R2是被羧基或–C(O)NR16R17取代的C1-C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中R1是H。
18.根据权利要求1和4至13中任一项所述的化合物，其中R1和R2与它们所附接的原子连接在一起以形成任选地取代的6元杂环基。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述6元杂环基被一个或多个C1-C6烷基取代。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中每个R5和R11是H。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中R6是C1-C6烷基。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中R6是被羧基或–C(O)NR16R17取代的C1-C6烷基，并且其中每个R16和R17独立地是被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其中R7、R8、R9和R10中的至少一者独立地是C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其中R7、R8、R9和R10中的至少一者是C1-C6烷基取代的羧基、羧酸根、磺基、磺酸根、-C(O)OR15或–C(O)NR16R17，并且其中每个R16和R17独立地是H或被羧基、羧酸根、–C(O)OR15、磺基或磺酸根取代的C1-C6烷基。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其中R8和R9连同它们所附接的原子一起形成任选地取代的5元或6元杂环基。
26.根据权利要求25所述的化合物，其中所述任选地取代的5元或6元杂环基是
Figure FDA0004022583530000041
27.根据权利要求1至26中任一项所述的化合物，其中R12a和R12b中的每一者是H。
28.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物选自由以下项组成的组：
Figure FDA0004022583530000051
Figure FDA0004022583530000052
以及它们的盐和内消旋形式。
29.一种核苷酸或寡核苷酸，所述核苷酸或寡核苷酸用根据权利要求1至28中任一项所述的化合物标记。
30.根据权利要求29所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物经由式(I)的R2或R6的羧基基团附接到所述核苷酸或寡核苷酸。
31.根据权利要求29所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物经由式(I)的R7、R8、R9和R10中的一者的羧基基团附接到所述核苷酸或寡核苷酸。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述化合物通过连接基部分附接到嘧啶碱基的C5位置或7-脱氮嘌呤碱基的C7位置。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，所述标记的核苷酸或寡核苷酸还包括共价附接到所述核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'OH封端基团。
34.根据权利要求29至33中的任一项所述的核苷酸或寡核苷酸，其中所述核苷酸或寡核苷酸是与靶多核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸。
35.根据权利要求34所述的寡核苷酸，其中所述靶多核苷酸被固定在固体载体上。
36.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述固体载体包含多个固定的靶多核苷酸的阵列。
37.一种试剂盒，所述试剂盒包括用根据权利要求29至33中任一项的第一化合物标记的第一核苷酸。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二核苷酸，其中所述第二核苷酸用第二化合物标记，所述第二化合物不同于所述第一标记的核苷酸的所述第一化合物。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述第一标记的核苷酸和所述第二标记的核苷酸能够使用第一光源波长激发。
40.根据权利要求38或39所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第三核苷酸，其中所述第三核苷酸用不同于所述第一化合物和所述第二化合物的第三化合物标记，并且其中所述第一标记的核苷酸和所述第三标记的核苷酸能够使用第二光源波长激发。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第四核苷酸，并且其中所述第四核苷酸未标记(暗色)。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的试剂盒，所述第一标记的核苷酸、所述第二标记的核苷酸和所述第三标记的核苷酸中的每种标记的核苷酸具有能够在单个检测通道中检测的发射光谱。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和一种或多种缓冲液组合物。
44.一种确定靶多核苷酸的序列的方法，所述方法包括：
(a)使引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物与一种或多种标记的核苷酸接触，其中所述标记的核苷酸中的至少一者是根据权利要求29至33中任一项所述的核苷酸，并且其中所述引物多核苷酸与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；
(b)将标记的核苷酸掺入所述引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；以及
(c)对所述延伸的引物多核苷酸进行一个或多个荧光测量以确定所述掺入的核苷酸的身份。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物通过使所述靶多核苷酸和与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的引物多核苷酸接触来形成。
46.根据权利要求44或45所述的方法，所述方法还包括(d)从掺入到所述引物多核苷酸中的所述核苷酸中去除所述标记和所述3'封端基团。
47.根据权利要求45所述的方法，所述方法还包括(e)将所述去除的标记和所述3'封端基团从所述引物多核苷酸上洗掉。
48.根据权利要求47所述的方法，所述方法还包括重复步骤(a)至步骤(e)，直至确定所述模板多核苷酸链的至少一部分的序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中重复所述步骤(a)至步骤(e)至少50次。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中在单一化学反应中去除来自掺入到所述引物多核苷酸中的所述核苷酸的所述标记和所述3'封端基团。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中所述方法在自动化测序仪器上执行，并且其中所述自动化测序仪器包含在不同波长下操作的两个光源。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023186815A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Labeled avidin and methods for sequencing
US20230357845A1 (en) 2022-03-31 2023-11-09 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
AU2023244351A1 (en) 2022-03-31 2024-01-18 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
WO2024044214A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 University Of Connecticut Hemicyanine push-pull dyes based on chromene electron donors
US20240140939A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104710816A (zh) * 2013-12-17 2015-06-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种大斯托克斯位移和近红外荧光发射的新型罗丹明类荧光染料及其合成方法
CN105504860A (zh) * 2014-10-20 2016-04-20 中南大学 一类吡喃喹啉类荧光染料的合成及其应用
CN109476674A (zh) * 2016-12-22 2019-03-15 伊鲁米纳剑桥有限公司 香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途
CN111094276A (zh) * 2017-10-16 2020-05-01 伊鲁米纳剑桥有限公司 仲胺取代的香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
DE3924454A1 (de) 1989-07-24 1991-02-07 Cornelis P Prof Dr Hollenberg Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips)
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
ES2097925T3 (es) 1991-09-18 1997-04-16 Affymax Tech Nv Metodo para sintetizar diversas colecciones de oligomeros.
CA2124087C (en) 1991-11-22 2002-10-01 James L. Winkler Combinatorial strategies for polymer synthesis
AU3728093A (en) 1992-02-19 1993-09-13 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US5583211A (en) 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US5472672A (en) 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
DE69433180T2 (de) 1993-10-26 2004-06-24 Affymetrix, Inc., Santa Clara Felder von nukleinsaeuresonden auf biologischen chips
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US5429807A (en) 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
EP0852004B1 (en) 1995-10-11 2011-01-19 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens
US5658734A (en) 1995-10-17 1997-08-19 International Business Machines Corporation Process for synthesizing chemical compounds
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
EP1591541B1 (en) 1997-04-01 2012-02-15 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
US6087102A (en) 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
US6287776B1 (en) 1998-02-02 2001-09-11 Signature Bioscience, Inc. Method for detecting and classifying nucleic acid hybridization
JP3944996B2 (ja) 1998-03-05 2007-07-18 株式会社日立製作所 Ｄｎａプローブアレー
US6031078A (en) 1998-06-16 2000-02-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. MTbx protein and nucleic acid molecules and uses therefor
CA2339121A1 (en) 1998-07-30 2000-02-10 Shankar Balasubramanian Arrayed biomolecules and their use in sequencing
GB0002310D0 (en) 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
DK1923471T3 (da) 1999-04-20 2013-04-02 Illumina Inc Detektion af nukleinsyrereaktioner på bead-arrays
US6664061B2 (en) 1999-06-25 2003-12-16 Amersham Biosciences Ab Use and evaluation of a [2+2] photoaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
WO2002012566A2 (en) 2000-08-09 2002-02-14 Motorola, Inc. The use and evaluation of a [2+2] photocycloaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
DK1560838T3 (da) 2002-08-23 2009-09-07 Illumina Cambridge Ltd M rkede nuklotider
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
GB0326073D0 (en) 2003-11-07 2003-12-10 Solexa Ltd Improvements in or relating to polynucleotide arrays
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
US8623628B2 (en) 2005-05-10 2014-01-07 Illumina, Inc. Polymerases
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US9593373B2 (en) 2013-03-15 2017-03-14 Illumina Cambridge Limited Modified nucleosides or nucleotides
GB201414098D0 (en) 2014-08-08 2014-09-24 Illumina Cambridge Ltd Modified nucleotide linkers
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
WO2018129214A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Complete Genomics, Inc. Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides
US20220162693A1 (en) 2018-11-09 2022-05-26 Mgi Tech Co., Ltd. Massively parallel sequencing using unlabeled nucleotides
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104710816A (zh) * 2013-12-17 2015-06-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种大斯托克斯位移和近红外荧光发射的新型罗丹明类荧光染料及其合成方法
CN105504860A (zh) * 2014-10-20 2016-04-20 中南大学 一类吡喃喹啉类荧光染料的合成及其应用
CN109476674A (zh) * 2016-12-22 2019-03-15 伊鲁米纳剑桥有限公司 香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途
CN111094276A (zh) * 2017-10-16 2020-05-01 伊鲁米纳剑桥有限公司 仲胺取代的香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANI GENG等: "An aqueous methylated chromenoquinoline-based fluorescent probe for instantaneous sensing of thiophenol with a red emission and a large Stokes shift", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》, vol. 273, pages 1670 - 1675, XP055915647, DOI: 10.1016/j.snb.2018.07.088 *

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