CN114829369A

CN114829369A - 含环辛四烯的染料和组合物

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Publication number: CN114829369A
Application number: CN202080082558.2A
Authority: CN
Inventors: 吴晓琳; 刘小海; 尼古拉·尼古拉耶维奇·罗曼诺夫; A·弗朗西斯; 帕特里克·麦考利; 迈克尔·科林翰姆; 卡罗尔·阿纳斯塔西
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-07-29
Also published as: US11597969B2; MX2022005327A; WO2021104845A1; US20230265502A1; IL292961A; EP4065646A1; IL292961B2; IL292961B1; KR20220107231A; CA3157457A1; JP2023510454A; ZA202205000B; AU2020389779A1; US20210155983A1; US20230265503A1; BR112022010248A2

Abstract

本公开的实施方案涉及含有环辛四烯(COT)的染料及其作为荧光标记的用途。本发明提供包含式(I)的光保护环辛四烯部分的荧光化合物。还提供含有环辛四烯(COT)的组合物。所述染料和组合物能够用于各种生物应用，诸如核酸测序。

Description

含环辛四烯的染料和组合物

以引用方式并入优先权申请

本申请要求2019年11月27日提交的美国临时申请62/941,583的优先权权益，该临时申请据此全文以引用方式并入。

技术领域

本公开涉及含有环辛四烯或其任选地取代的衍生物的荧光化合物和组合物。具体地讲，荧光化合物和组合物可以用于各种生物应用，诸如核酸测序应用。

背景技术

背景

利用荧光标记物进行核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要技术。在重组DNA技术中采用的许多程序以前依赖于使用带有放射性标记的核苷酸或多核苷酸，例如³²P。放射性化合物允许灵敏地检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的局限性，诸如它们的费用、有限的保质期和更重要的安全考虑因素。消除对放射性标记物的需求提高了安全性，同时降低了与例如试剂处理相关的环境影响和成本。适合于非放射性荧光检测的方法包括以非限制性示例的方式进行的自动化DNA测序、杂交方法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。

对于许多应用而言，希望采用多个光谱可区分的荧光标记，以便实现对多个空间重叠分析物的独立检测。在此类多重方法中，可以减少反应容器的数量以简化实验方案并且促进专用试剂盒的生产。例如，在多色自动化DNA测序系统中，多重荧光检测允许在单个电泳通道中分析多个核苷酸碱基，从而通过单色方法提高吞吐量，并且降低与通道间电泳迁移率变化相关的不确定性。

然而，多重荧光检测可能存在问题，并且存在的许多重要因素可能会限制适当荧光标记物的选择。首先，在给定的应用中可能难以找到具有适当分辨的吸收和发射光谱的染料化合物。另外，当若干荧光染料一起使用时，通过同时激发在可区分光谱区域中产生荧光信号可能是复杂的，因为这些染料的吸收带通常很分开，所以即使是两种染料也可能难以达到相当的荧光激发效率。对分子生物学方法特别重要的另一个考虑因素是荧光染料必须与试剂化学性质相容的程度，诸如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶。另外，由于许多激发方法使用高功率光源，如激光，因此这些荧光染料必须具有足够的光稳定性以承受多次激发。

对于核碱基的高精度荧光鉴定，通常涉及在强烈暴露于光下扫描荧光标记的核苷酸。然而，强烈的激光辐照可能会漂白荧光染料和/或损坏溶液中/流通池表面上的核苷酸样品或与荧光染料缀合的那些核苷酸样品。此类暴露于光中也可能引起DNA样品损伤。因此，在多重荧光DNA测序中特别需要保护荧光染料免受光漂白和保护核苷酸免受光诱导损伤。光漂白和光损伤的类型和程度可以根据例如化合物的化学结构和它们的一些物理化学特性(如氧化还原电位、特定生物标记的激发光谱、特定光源辐照的强度和在特定测量中暴露的时间)而变化。由于较低波长的光源输送较高能量的光子，因此具有短(400nm-500nm)波长发射(例如，450nm-460nm)的蓝色LED/激光器更容易引起染料的光漂白，并且与光DNA损伤相关。

在阵列环境(诸如合成测序)中执行荧光检测步骤，可能会引起荧光信号强度损失。造成这种信号损失的可能机制有很多，并且可能包括从固体载体上裂解单个核酸单元。在荧光检测中也存在许多化学途径，通过这些化学途径可能会在辐照期间引起核酸损伤。例如，已经表明暴露于紫外线(UV)辐射可以经由胸腺嘧啶或胞嘧啶的直接光化学[2+2]光环加成反应提供含有融合嘧啶二聚体(诸如TT、TC和CC)的环丁烷，从而引起DNA损伤。此类直接光环加成反应可以发生在从约100nm起延伸至约315nm的UV B区域和UV C区域中。在穿过可见光区域的一部分(从约315nm起跨至约500nm)的UV A区域中，间接机制的复杂混合物也可以通过其他组分的光敏作用引起DNA损伤。此类间接机制可以经由与不同的光诱导活性物质(例如，活性氧物质(ROS)(诸如单态氧、超氧阴离子和羟基自由基))相互作用导致氧化DNA修饰。最后，还已知相当多的ROS是由氧气分子与处于激发态的染料分子相互作用产生的。由观察到的各种反应引起的直接或间接核酸损伤的任何组合都可能是在阵列环境中观察到的荧光信号强度损失的潜在原因。

抗氧化剂、自由基清除剂、三重态消除剂和不同的其他化合物(如三重态猝灭剂(TSQ))已引起关注，因为它们有可能在高辐照度下减轻荧光团的光漂白，即使在氧气的存在下也是如此(参见例如美国专利公开2010/0181535A1)。针对“绿色”和“红色”花青染料探索了最强烈的此类添加剂及其缀合物(参见例如美国公开2015/0011731A1)。然而，仍然需要将高性能荧光生物标记库进一步扩展到光诱导DNA损伤最明显的较低激发波长(例如，400nm～500nm)区域。另外，需要进一步减少荧光信号强度损失以应用于合成测序，从而促进长核苷酸序列(包含50、75、100、200和500个或更多个核苷酸的序列)的测序。本文描述了适用于核酸测序的含有环辛四烯(COT)或其任选地取代的衍生物的荧光化合物和组合物。

发明内容

本文描述了含有共价键合的环辛四烯或其衍生物的荧光化合物和含有环辛四烯或其衍生物的组合物、制备方法和在生物应用中的用途。特别地，当用于核酸测序应用时，此类荧光化合物和组合物可以保护或减轻由荧光标记化合物的DNA和/或核苷酸的光损伤和光漂白引发或相关的光诱导荧光信号损失。

本公开的一些方面涉及荧光化合物，该荧光化合物包含与其共价连接的部分，并且该部分可以改变光吸收分子的激发态的数量/占有率，并且可以用作光保护基团。在某些实施方案中，光保护部分可以包含具有式(I)的结构的任选地取代的环辛四烯部分：

其中：

R¹和R²中的每一者各自独立地选自由以下项组成的组：H、羟基、卤素、叠氮基、硫醇、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羧基、-C(O)OR⁵、-C(O)NR⁶R⁷、任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的卤代烷基、任选地取代的卤代烷氧基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的芳烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

X和Y各自独立地选自由以下项组成的组：键、-O-、-S-、-NR³-、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-NR⁴-、-S(O)₂-、-NR³-C(＝O)-NR⁴、-NR³-C(＝S)-NR⁴-、任选地取代的C_1--6亚烷基和任选地取代的亚杂烷基；

Z不存在，为任选地取代的C_2-6亚烯基或任选地取代的C_2-6亚炔基；

R³和R⁴中的每一者独立地为H、任选地取代的C_1-6烷基或任选地取代的C_6-10芳基；

R⁵为任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的C_6-10芳基、任选地取代的C_7-14芳烷基、任选地取代的C_3-7碳环基、任选地取代的5至10元杂芳基或任选地取代的3至10元杂环基；

R⁶和R⁷中的每一者独立地为H、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的C_6-10芳基、任选地取代的C_7-14芳烷基、任选地取代的C_3-7碳环基、任选地取代的5至10元杂芳基或任选地取代的3至10元杂环基；

在

中R¹和R²所连接的碳原子任选地被O、S或N取代，前提条件是当所述碳原子被O或S取代时，则R¹和R²均不存在；当所述碳原子被N取代时，则R²不存在；并且m为介于0和10之间的整数。在一些实施方案中，X和Y均不是键。在一些另外的实施方案中，荧光化合物不是花青染料。在一些另外的实施方案中，荧光化合物不是闭链花青染料。在一些另外的实施方案中，荧光化合物可以由具有介于约350nm和约500nm、约420nm和约480nm，或约450nm和约460nm之间的波长的光源激发。

在一些实施方案中，环辛四烯部分可以包含式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构：

本公开的一些方面涉及用具有COT部分的荧光化合物标记的核苷酸或核苷，该COT部分包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构。

本公开的一些方面涉及保护荧光染料免于光漂白的方法，该方法包括将荧光染料共价连接至由如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构构成的COT部分。本公开的一些另外的方面涉及保护核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，该方法包括将该核苷或核苷酸共价连接至包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的COT部分的荧光化合物。

本公开的一些另外的方面涉及在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，该方法包括：

(a)将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中，其中该核苷酸包含3'封端基团并且用包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的荧光化合物标记；

(b)在第一缓冲液组合物的存在下检测掺入到所述复制链中的所述核苷酸的身份；

(c)从掺入到所述复制多核苷酸链中的所述核苷酸中化学去除所述标记和所述3'封端基团；以及

(d)用洗涤溶液将所述化学去除的标记和所述3'封端基团从所述复制链上洗掉。

本公开的一些另外的方面涉及与测序装置一起使用的试剂盒，该试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中该多种组合物包括：用于将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂，其中该核苷酸包含3'封端基团并且用包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的荧光化合物标记；包含至少一种抗氧化剂的缓冲液组合物；用于从掺入到所述复制链中的所述封端的、标记的核苷酸中化学去除标记和封端部分的试剂；以及洗涤溶液。

本公开的一些方面涉及用于防止或减少荧光染料的光漂白的组合物，该组合物包含环辛四烯或其任选地取代的衍生物，以及选自由以下项组成的组的一种或多种抗氧化剂：黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素和trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。在一些另外的实施方案中，该组合物包含环辛四烯和槲皮素，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。

本公开的一些方面涉及保护荧光染料免于光漂白的方法，该方法包括使该荧光染料与如本文所述的含有环辛四烯的组合物接触。一些另外的方面涉及保护标记的核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，该方法包括使该标记的核苷或核苷酸与本文所述的组合物接触。

本公开的一些方面涉及在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，该方法包括：

(a)将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中，其中所述核苷酸包含标记和3'封端基团；

(d)用洗涤溶液将所述化学去除的标记和所述3'封端基团从所述复制链上洗掉；

其中所述第一缓冲液组合物包含环辛四烯或其任选地取代的衍生物，以及选自由以下项组成的组的一种或多种抗氧化剂：黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素和trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。

本公开的一些另外的方面涉及与测序装置一起使用的试剂盒，该试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中该多种组合物包括：用于将3'封端的、标记的核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂；包含如本文所述的含有环辛四烯的组合物的缓冲液组合物；用于从掺入到所述复制链中的所述封端的、标记的核苷酸中化学去除标记和封端部分的试剂；以及洗涤溶液。

附图说明

图1示出了在标准检测溶液中经蓝色LED光辐照30分钟后，与如本文所述的含有环辛四烯和槲皮素的溶液相比，四种荧光染料的光漂白速率。

图2示出了当分别使用标准检测溶液和含有环辛四烯和槲皮素的溶液时，荧光染料在掺入到流通池表面上的簇后的光漂白速率。

图3A示出了当在测序的扫描步骤期间使用标准检测溶液时，在曝光量增加的测序期间的DNA簇的相位值。

图3B示出了当在测序的扫描步骤期间使用含有环辛四烯和槲皮素的溶液时，在曝光量增加的测序期间的DNA簇的相位值。

图4A示出了在标准检测溶液中，与包含共价键合的COT部分的相同标记的核苷酸的标准化荧光强度相比，标记的核苷酸的标准化荧光强度。

图4B示出了经溶液中的LED辐照30分钟后，图4A中的两个标记的核苷酸的光漂白速率。

图5A至图5B分别示出了在测序运行150个循环后，在不同的曝光量(1倍、2倍、5倍和10倍)下，标记的核苷酸和具有共价键合的COT部分的相同标记的核苷酸的荧光信号衰减。

图6A示出了在标准检测溶液中，与各自包含共价键合的COT部分的相同三个标记的核苷酸的标准化荧光强度相比，三个标记的核苷酸的标准化荧光强度。

图6B示出了经溶液中的LED辐照30分钟后，图6A中所述的六个标记的核苷酸的光漂白速率。

图7示出了当标记的核苷酸暴露于1倍和10倍的蓝色光辐照时，两种标记的核苷酸与各自包含共价键合的COT部分的相同两个标记的核苷酸的散点图相比的散点图。

图8示出了当暴露于1倍和10倍的蓝色光辐照时，图7所述的四个标记的核苷酸的光漂白速率。

具体实施方式

本公开涉及染料化合物及其作为生物分子的荧光标记的应用。具体地讲，本文公开了与光保护有机小分子共价键合的荧光化合物。还包括了含有此类有机小分子的组合物。荧光化合物与这些有机小分子的缀合物对光诱导降解具有更高的稳定性。例如，此类有机小分子可以是三重态消除剂，例如类似于1,3,5-7-环辛四烯或其任选地取代的衍生物的化合物可以改变荧光化合物的激发态的数量/占有率。本文所述的荧光化合物和组合物可以用于核酸测序应用。

本文所述的实施方案涉及荧光化合物，这些荧光化合物包含与其共价连接的光保护部分。光保护部分可以包含任选地取代的环辛四烯(COT)部分。该COT部分可以包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构。这些荧光化合物可以用作核酸测序应用的标记，例如在合成测序期间作为核苷酸标记。

本文所述的另外的实施方案涉及用于在测序运行的检测或扫描步骤期间使用的组合物，其中标记的核苷酸暴露于光源，特别是来自蓝色LED或激光器的辐射。该组合物包含环辛四烯和一种或多种抗氧化剂。例如，该一种或多种抗氧化剂可以选自包括黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素和trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合的组。该组合物还可以包含抗坏血酸或其盐，例如抗坏血酸钠。

如下文详细描述的，本文所述的含有COT的荧光化合物和组合物在暴露于光源照射时，特别是暴露于波长介于约400nm至约500nm(例如，约450nm至约460nm)之间的蓝光时可增强染料的光稳定性。这些化合物和组合物还在测序运行期间减少或防止DNA损伤。

定义

本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式(诸如“包括(include/includes/included)”)的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式(诸如“具有(have/has/had)”)的使用不是限制性的。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。

如本文所用，术语“共价连接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价连接的聚合物涂层是指与底物的官能化表面形成化学键的聚合物涂层，这与经由其他方式(例如，粘附或静电相互作用)粘附到该表面形成比较。应当理解，共价连接至表面的聚合物也可以经由除共价连接之外的方式键合。

如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意味着元素周期表第7列的放射性稳定原子中的任一种，例如，氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。

如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“C_a-C_b”或“C_a-b”是指烷基、烯基或炔基基团中的碳原子数，或环烷基或芳基基团的环原子数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的环和芳基的环可以含有“a”至“b”个(包括端值在内)的碳原子。例如，“C_1-4烷基”基团是指具有1至4个碳的所有烷基基团，即CH₃-、CH₃CH₂-、CH₃CH₂CH₂-、(CH₃)₂CH-、CH₃CH₂CH₂CH₂-、CH₃CH₂CH(CH₃)-和(CH₃)₃C-；C₃至C₄环烷基基团是指具有3至4个碳原子的所有环烷基基团，即环丙基和环丁基。类似地，“4至6元杂环基”基团是指具有4至6个总环原子的所有杂环基基团，例如氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噁唑啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉等。如果对于烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基基团没有指定“a”和“b”，则将假设这些定义中描述的最广泛范围。如本文所用，术语“C_1-6”包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆，以及由这两个数字中任一个定义的范围。例如，C₁-₆烷基包括C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基和C₆烷基、C₂-C₆烷基、C₁-C₃烷基等。类似地，C₂-C₆烯基包括C₂烯基、C₃烯基、C₄烯基、C₅烯基和C₆烯基、C₂-C₅烯基、C₃-C₄烯基等；并且C₂-C₆炔基包括C₂炔基、C₃炔基、C₄炔基、C₅炔基和C₆炔基、C₂-C₅炔基、C₃-C₄炔基等。C₃-C₈环烷基各自包括含有3、4、5、6、7和8个碳原子或由任何两个数字限定的范围的烃环，诸如C₃-C₇环烷基或C₅-C₆环烷基。

如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可以具有1至20个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至20”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意味着烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括20个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级烷基。烷基基团可以被命名为“C_1-4烷基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C_1-6烷基”表示烷基链中存在一个至六个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

如本文所用，“烷氧基”是指式–OR(其中R为如上文所定义的烷基)，诸如“C_1-9烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。

如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被命名为“C_2-6烯基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C_2-6烯基”表示烯基链中存在两个至六个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。

如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“炔基”。炔基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小炔基。炔基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被命名为“C_2-6炔基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C_2-6炔基”表示炔基链中存在两个至六个碳原子，即，炔基链选自由乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基组成的组。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。

如本文所用，“杂烷基”是指在链骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的直链或支链烃链。杂烷基基团可以具有1至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂烷基”。杂烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小杂烷基。杂烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级杂烷基。杂烷基基团可以被命名为“C_1-6杂烷基”或类似的名称。杂烷基基团可以含有一个或多个杂原子。仅以举例的方式，“C_4-6杂烷基”表示杂烷基链中存在四个至六个碳原子，并且此外在链的骨架中存在一个或多个杂原子。

如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C_6-10芳基”、“C₆或C₁₀芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。

如本文所用，“芳烷基”或“芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的芳基基团，诸如“C_7-14芳烷基”等，包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基和萘基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C_1-6亚烷基基团)。

如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。

如本文所用，“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的杂芳基基团。示例包括但不限于2-噻吩基甲基、3-噻吩基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C_1-6亚烷基基团)。

如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“碳环基”。碳环基基团也可以是具有3至10个碳原子的中等大小碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被命名为“C_3-6碳环基”或类似的名称。碳环基环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。

如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。杂原子可以存在于环系中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可以具有3至20个环元(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环基”。杂环基基团也可以是具有3至10个环元的中等大小杂环基。杂环基基团也可以是具有3至6个环元的杂环基。杂环基基团可以被命名为“3至6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的示例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。

如本文所用，“氰基”基团是指“-CN”基团。

如本文所用，“羧基”基团是指“–C(＝O)OH”基团。

如本文所用，“叠氮基”基团是指“-N₃”基团。

如本文所用，“硫醇”基团是指其中R为氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、C_7-14芳烷基、5至10元杂芳基或3至10元杂环基的“-SR”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“氨基”基团是指-NH₂。“任选地取代的氨基”是指其中一个或两个氢被C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、C_7-14芳烷基、5至10元杂芳基或3至10元杂环基取代的–NH₂，如本文所定义的。

如本文所用，“氨基烷基”基团是指经由亚烷基基团连接的氨基基团。

如本文所用，“O-羧基”基团是指其中R选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-OC(＝O)R”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“C-羧基”基团是指其中R选自由氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基组成的组的“-C(＝O)OR”基团，如本文所定义的。非限制性示例包括羧基(即，-C(＝O)OH)。

如本文所用，“磺酰基”基团是指其中R选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO₂R”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“亚磺酸基”基团是指“-S(＝O)OH”基团。

“磺基”基团是指“-S(＝O)₂OH”或“-SO₃H”基团。

“磺酸根”基团是指“-SO₃ˉ”基团。

如本文所用，“S-亚磺酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO₂NR_AR_B”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“N-亚磺酰氨基”基团是指其中R_A和R_b各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(R_A)SO₂R_B”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“C-酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-C(＝O)NR_AR_B”基团，如本文所定义的。

如本文所用，“N-酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(R_A)C(＝O)R_B”基团，如本文所定义的。

“O-氨甲酰基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-OC(＝O)NR_AR_B”基团，如本文所定义的。

“N-氨甲酰基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5至10元杂芳基和5至10元杂环基的“-N(R_A)OC(＝O)R_B”基团，如本文所定义的。

如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₁-C₆炔基、C₁-C₆杂烷基、C₃-C₇碳环基(任选被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、C₃-C₇碳环基-C₁-C₆-烷基(任选被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、3至10元杂环基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、3至10元杂环基-C₁-C₆-烷基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、芳基(C₁-C₆)烷基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(C₁-C₆)烷基(任选地被卤基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、卤基、氰基、羟基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基(C₁-C₆)烷基(即，醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤基(C₁-C₆)烷基(例如，–CF₃)、卤基(C₁-C₆)烷氧基(例如，–OCF₃)、C₁-C₆烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C₁-C₆)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根基和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。

在一些实施方案中，取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基或碳环基基团被一个或多个选自由以下项组成的组的取代基取代：卤基、-CN、SO₃ ^-、-SO₃H、-SR^A、-OR^A、-NR^BR^C、氧代基、-CONR^BR^C、-SO₂NR^BR^C、

-COOH和-COOR^B，其中R^A、R^B和R^C各自独立地为H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基。

应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基或二基。例如，当取代基需要两个与分子其余部分的连接点时，应当理解，该取代基为二基。例如，被识别为需要两个连接点的烷基的取代基包括二基，诸如–CH₂–、–CH₂CH₂–、–CH₂CH(CH₃)CH₂–等。其他基团命名惯例清楚地指示该基团为二基，诸如“亚烷基”或“亚烯基”。

当取代基被描述为二基(即，具有与分子的其余部分的两个连接点)时，应理解，除非另外指明，否则取代基可以任何定向构型连接。因此，例如，描绘为-AE-或

的取代基包括被定向成使得A连接在分子的最左侧连接点的取代基，以及其中A连接在所述分子的最右侧连接点处的取代基。另外，如果基团或取代基被描绘为

并且L被定义为键或L不存在，则此类基团或取代基等同于

如本文所用，“环辛四烯”(COT)是具有结构

和化学式C₈H₈的化合物，也称为1,3,5,7-环辛四烯、环辛-1,3,5,7-四烯或[8]轮烯。COT的二价阴离子(即，环辛四烯离子、COT^2-或[C₈H₈]^2-)是芳族的。在一些实施方案中，COT还可以指其带正电荷或负电荷的离子、(聚)离子、自由基或带正电荷或负电荷的离子自由基。

如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。它们是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物，诸如脱氮嘌呤。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。

如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子已被碳取代和/或碳已被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。另外，核苷可以掺入较大的DNA和/或RNA聚合物和低聚物中。

术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、脱氮嘌呤、7-脱氮嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。

如本文所用，当寡核苷酸或多核苷酸被描述为“包含”本文所述的核苷或核苷酸时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。类似地，当核苷或核苷酸被描述为寡核苷酸或多核苷酸的一部分，诸如“掺入到”寡核苷酸或多核苷酸中时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。在一些此类实施方案中，共价键在寡核苷酸或多核苷酸的3'羟基与在本文中描述为寡核苷酸或多核苷酸的3'碳原子与核苷酸的5'碳原子之间的磷酸二酯键的核苷酸的5'磷酸基团之间形成。

如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文定义的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。

如本文所用，术语“磷酸酯”以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其质子化形式(例如，

)。如本文所用，术语“单磷酸”、“二磷酸”和“三磷酸”以本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包括质子化形式。

如本文所用，术语“保护基团(protecting group/protecting groups)”是指添加到分子中以便防止分子中的现有基团经历不希望的化学反应的任何原子或原子团。有时，“保护基团”和“封端基团”可以互换使用。

如本文所用，前缀“光”或“光-”意指与光或电磁辐射有关。术语可以涵盖全部或部分的电磁光谱，包括但不限于一个或多个通常被称为光谱的无线电、微波、红外、可见光、紫外线、X射线或γ射线部分的范围。光谱的部分可以是由表面的金属区域(如本文所阐述的那些金属)阻挡的部分。替代地或另外地，光谱的部分可以是穿过表面的间隙区域的光谱部分，诸如由玻璃、塑料、二氧化硅或本文所阐述的其他材料制成的区域。在特定实施方案中，可以使用能够穿过金属的辐射。替代地或另外地，可以使用由玻璃、塑料、二氧化硅或本文所阐述的其他材料遮蔽的辐射。

如本文所用，术语“定相”是指SBS中的现象，所述现象是由3'封端基团和荧光标记的不完全去除以及未能通过在给定测序循环下通过聚合酶完成簇内DNA链的一部分掺入所引起的。预定相是由掺入不具有有效3'封端基团的核苷酸引起的，其中掺入事件由于终止失败而提前1个周期。定相和预定相导致特定循环的测量信号强度由来自当前循环的信号以及来自前一个和后一个循环的噪声组成。随着循环的数量增加，受到定相和预定相影响的每个簇的序列分数增加，妨碍对正确碱基的识别。预定相可以由在通过合成测序(SBS)期间存在痕量的未封端的3'-OH核苷酸引起。未封端的3'-OH核苷酸可以在制造过程期间或可能在储存和试剂处理过程期间产生。

如本文所用，术语“检测溶液”是指在测序的检测步骤期间使用的基于水的溶液，其采用光照射来将掺入的核苷酸或用荧光染料标记的核苷酸识别为与模板DNA互补的多核苷酸链的拷贝。检测溶液通常含有一种或多种抗氧化剂或试剂(诸如酚类化合物)，其可以充当在检测步骤期间形成的氧自由基或其他自由基的清除剂或淬灭剂。检测溶液减少核酸阵列暴露于光照时的光诱导降解。在一些实施方案中，检测溶液包含如本文所述的含有COT的组合物。

如本文所用，术语“缓冲液”在单独使用时是指不用作检测溶液的缓冲溶液。缓冲溶液包括在使用检测溶液之前或之后进行的聚合酶反应、杂交、洗涤或任何其他操作中使用的那些溶液。

如本文所用，术语“酚类化合物”和“多酚化合物”是指在苯或其他芳族环或杂环上具有一个或多个羟基基团(即酚基)的芳族化合物。苯或其他芳族环/杂环可以任选地被其他取代基和/或稠环取代。示例性多酚化合物包括但不限于trolox、没食子酸和它们的低级烷基酯、它们的单甲基醚以及它们的低级烷基酯和单甲基醚的组合、连苯三酚和对苯二酚，诸如叔丁基对苯二酚(TBHQ)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)。

如本文所用，术语“光诱导降解”意指通过暴露于光照对核酸阵列中一个或多个核酸或多核苷酸链的光诱导损伤。此类降解包括从阵列所连接的载体完全或部分去除单个核酸。例如，光诱导降解可以包括在单个核酸内的任何核苷酸处裂解磷酸二酯主链。此类降解还可以包括核酸碱基或荧光标签的去除或反应，从而引起杂交或荧光功能的丧失。光诱导降解还可以包括核苷酸的光诱导交联。光诱导降解的结果可以表现为当通过重复检测步骤循环时，阵列核酸的一个或多个区域或子阵列中荧光检测灵敏度的降低，如例如当执行合成测序，通过连接和微阵列扫描进行测序时可以观察到的。当与术语“抑制”结合使用时，这是指在损伤程度上的完整或部分阻断，例如，如可通过观察到的荧光发射强度定量的。光诱导损伤可以表现为例如荧光信号强度衰减与在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤数目的函数。此过程有时被称为信号强度衰减。光损伤的另一种评估可以作为测序误差率与在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤数目的函数来估计。

如本文所用，术语“花青染料”是指属于多次甲基基团的染料家族，其中发色体系包括连接两个端基的共轭双键：电子受体和电子供体。存在三种类型的花青染料：(1)一般结构的闭合链花青

(2)具有以下通式结构的半菁：

以及(3)具有以下通式结构的开链花青：

闭合链花青染料的非限制性示例包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7以及它们的类似物。

具有共价键合的COT部分的荧光化合物

本文所述的一些实施方案涉及具有环辛四烯部分的荧光化合物，所述环辛四烯部分包含式(I)的结构：

其中：

R¹和R²中的每一者各自独立地选自由以下项组成的组：H、羟基、卤素、叠氮基、硫醇、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羧基、-C(O)OR⁵、-C(O)NR⁶R⁷、任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的卤代烷基、任选地取代的卤代烷氧基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的芳烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基以及它们的组合；

X和Y各自独立地选自由以下项组成的组：键、-O-、-S-、-NR³-、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-NR⁴-、-S(O)₂-、-NR³-C(＝O)-NR⁴、-NR³-C(＝S)-NR⁴-、任选地取代的C_1-6亚烷基和任选地取代的亚杂烷基，其中至少一个碳原子被O、S或N取代；

在

中R¹和R²所连接的碳原子任选地被O、S或N取代，前提条件是当所述碳原子被O或S取代时，则R¹和R²均不存在；当所述碳原子被N取代时，则R²不存在；并且

m为介于0和10之间的整数。在一些实施方案中，

部分可以任选地被取代。在一些实施方案中，X和Y均不是键。在一些另外的实施方案中，荧光化合物不是花青染料。在一些另外的实施方案中，荧光化合物不是闭链花青染料。在一些另外的实施方案中，R¹和R²中的每一者各自独立地选自由以下项组成的组：H、羟基、卤素、叠氮基、硫醇、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羧基、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的C_1-6烷氧基、任选地取代的C_1-6卤代烷基、任选地取代的C_1-6卤代烷氧基、任选地取代的C_2-6烯基、任选地取代的C_2-6炔基、任选地取代的C_6-10芳基、任选地取代的C_7-14芳烷基、任选地取代的C_3-7碳环基、任选地取代的5至10元杂芳基和任选地取代的3至10元杂环基。

在本文所述的荧光化合物的一些实施方案中，Z不存在，并且环辛四烯部分包含式(I')的结构：

在其他实施方案中，Z为任选地取代的C_2-6亚烯基。在一个实施方案中，Z为

在其他实施方案中，Z为任选地取代的C_2-6亚炔基。

在本文所述的荧光化合物的一些实施方案中，X为-C(＝O)-或-C(＝O)NR⁴-。在一些此类实施方案中，R⁴为H。在一些其他实施方案中，R⁴为C_1-6烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基)。在一些其他实施方案中，R⁴为取代的C_1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自独立地被一个或多个基团，诸如氨基、羧基、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷取代。在一个示例中，R⁴为被羧基取代的正丙基。在一些实施方案中，Y为-C(＝O)O-、-NR³-或-S(O)₂-。在一些另外的实施方案中，Y为-NR³-并且R³为H。在其他实施方案中，Y为-NR³-并且R³为取代的C_1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ、–O-SO₃ˉ、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷取代。在一些另外的实施方案中，R⁵为C_1-6烷基(例如，乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自可以独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。在一些其他实施方案中，R⁵为C_6-10芳基(诸如苯基，其任选地被卤基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、羟基、氰基、氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。在一些另外的实施方案中，R⁶为H。在一些另外的实施方案中，R⁶和R⁷均为H。在一些另外的实施方案中，R⁶为任选地取代的C_1-6烷基(例如，乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自可以独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。在一些另外的实施方案中，R⁶为H并且R⁷为任选地取代的C_1-6烷基，或R⁶和R⁷均独立地为任选地取代的C_1-6烷基(例如，乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自可以独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。在一些实施方案中，X和Y均不能是键，例如，当X为键时，Y不为键。

X、Y和Z组合的其他非限制性示例在下表1中举例说明。

表1：式(I)的环辛四烯部分中的示例性X、Y和Z

在一些实施方案中，环辛四烯部分包含式(Ia)的结构：

在一些其他实施方案中，环辛四烯部分包含式(Ib)的结构：

在一些其他实施方案中，环辛四烯部分包含式(Ic)的结构：

在一些其他实施方案中，环辛四烯部分包含式(Id)的结构：

在包含式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的COT部分的荧光化合物的一些实施方案中，R¹和R²中的至少一者为氢。在一些另外的实施方案中，R¹和R²均为氢。在一些其他实施方案中，R¹为H并且R²为任选地取代的氨基或羧基。在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5或6，并且R¹和R²中的每一者独立地为氢、任选地取代的氨基或羧基或它们的组合。在一些另外的实施方案中，当m为2、3、4、5或6时，一个R¹为氨基或羧基，并且剩余的R¹和R²为氢。在一些实施方案中，在

中R¹和R²所连接的至少一个碳原子被O、S或N取代。在一些此类实施方案中，

中的一个碳原子被氧原子取代，并且连接到所述取代的碳原子的R¹和R²均不存在。在一些其他实施方案中，当

中的一个碳原子被氮原子取代，连接到所述取代的碳原子的R²不存在，并且连接到所述取代的碳原子的R¹为氢或C_1-6烷基。在一些另外的实施方案中，m为2、3、4、5或6，并且R¹和R²中的每一者为氢。在一些另外的实施方案中，m为2、3、4、5或6，其中R¹和R²中的每一者在

中为氢；并且其中R¹为H，并且在其余的

中，R²为氨基、羧基、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷(例如，其余的

可以位于

链的末端，或位于

链的中间。在一些另外的实施方案中，当R¹为H并且R²为-C(O)OR⁵时，R⁵为H、C_1-6烷基或任选地取代的苯基。在一些另外的实施方案中，当R¹为H并且R²为-C(O)NR⁶R⁷时，R⁶和R⁷均为H。在一些另外的实施方案中，当R¹为H并且R²为-C(O)OR⁵时，R⁵为任选地取代的C_1-6烷基(例如，乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自可以独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。在一些另外的实施方案中，当R¹为H并且R²为-C(O)NR⁶R⁷时，R⁶为H并且R⁷为任选地取代的C_1-6烷基，或R⁶和R⁷均独立地为任选地取代的C_1-6烷基(例如，乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基或异己基，各自可以独立地被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ或–O-SO₃ˉ取代)。

的另外的非限制性示例包括以下结构：

其中每个R²独立地为如本文所述的氨基、羧基、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷。在另外的实施方案中，任一个CH₂碳原子也可被O、S或NH取代。

在一些另外的实施方案中，本文所述的荧光化合物包含以下结构的环辛四烯部分：

本文公开的烷基或取代的烷基为C_1-12烷基，或更优选C_1-6烷基。在一些实施方案中，本文公开的烷氧基为C_1-12烷氧基，或更优选C_1-6烷氧基。在一些实施方案中，本文公开的烯基和炔基基团为C_2-6烯基和C_2-6炔基。在一些实施方案中，本文公开的卤代烷基和卤代烷氧基为C_1-12卤代烷基和C_1-12卤代烷氧基，更优选C_1-6卤代烷基和C_1-6卤代烷氧基。在一些实施方案中，本文公开的任选地取代的芳基为任选地取代的C_6-10芳基，例如苯基。在一些实施方案中，本文公开的任选地取代的芳烷基为任选地取代的C_7-14芳烷基，例如苄基。在一些实施方案中，本文公开的任选地取代的杂芳基为任选地取代的5至10元杂芳基；更优选地，任选地取代的5至6元杂芳基。在一些实施方案中，本文公开的任选地取代的碳环基为任选地取代的3至7元碳环基，特别是3至7元环烷基。在一些实施方案中，本文公开的任选地取代的杂环基为任选地取代的3至7元杂环基，更优选地5至6元杂环基。

在一些实施方案中，含有共价键合的COT部分的荧光化合物可以由发射波长介于约350nm和约500nm之间的光源激发。在一些另外的实施方案中，荧光化合物可以由发射波长介于约420nm和约480nm，或约450nm至约460nm之间的光源激发。

在如本文所述的包含COT部分的荧光化合物的一些实施方案中，荧光化合物不为花青染料，例如，荧光化合物不为Cy2、Cy3、Cy5或Cy7染料或它们的衍生物，或它们的任选地取代的类似物。在另外的实施方案中，荧光化合物不为Cy5或它们的衍生物和任选地取代的类似物。

含有COT的缓冲液组合物

本公开的一些实施方案涉及用于防止或减少荧光标记的光漂白和/或预防、减少或减轻DNA损伤的组合物，该组合物包含环辛四烯或其任选地取代的衍生物，以及选自由以下项组成的组的一种或多种抗氧化剂：黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素、没食子酸衍生物、trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。在一些另外的实施方案中，该组合物包含环辛四烯和槲皮素，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。在一些实施方案中，荧光染料可以由发射波长介于约350nm和约500nm之间的光源激发。在一些实施方案中，荧光染料可以由波长介于约420nm和约480nm，或约450nm至约460nm之间的光源激发。在一些实施方案中，荧光染料是如本文所述的COT部分键合的化合物。

在一些实施方案中，组合物呈水溶液形式，例如水基缓冲溶液。在一些此类实施方案中，组合物呈检测溶液形式。在一些另外的实施方案中，水溶液中的环辛四烯或任选地取代的衍生物的浓度为约0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM，或由前述值中的任意两个限定的范围。在一些另外的实施方案中，环辛四烯或任选地取代的衍生物的浓度为约0.1mM至约100mM、或约1mM至约50mM、约2mM至约25mM、约5mM至约15mM，或约10mM。在一些实施方案中，水溶液中的槲皮素或任选地取代的衍生物的浓度为约0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM或10mM，或由前述值中的任意两个限定的范围。在一些另外的实施方案中，槲皮素或任选地取代的衍生物的浓度为约0.01mM至约10mM、约0.02mM至约5mM、约0.05mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约0.2mM至约0.5mM，或约0.25mM。

在一些实施方案中，组合物还包含另外的抗氧化剂，例如抗坏血酸或其盐(诸如抗坏血酸钠)或一种或多种多酚化合物。组合物可以进一步包含一种或多种荧光染料。

本公开的一些实施方案涉及保护荧光染料免于光漂白的方法，该方法包括使荧光染料与如本文所述的含有环辛四烯的组合物接触。另外的实施方案涉及保护标记的核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，该方法包括使标记的核苷或核苷酸与本文所述的组合物接触。在一些实施方案中，将标记的核苷酸掺入多核苷酸链中。在一些实施方案中，标记的核苷酸与本文所述的含有COT的组合物的接触在测序运行的检测步骤期间进行。

荧光化合物

本文所述的光保护COT部分可以共价连接至适用于测序分析的各种荧光染料，例如，通过合成技术测序，目的是防止或减少测序运行期间染料的光漂白和/或荧光信号衰减。此外，在将用荧光化合物标记的核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的多核苷酸链中之后，包含本文所述的含有COT的组合物的检测溶液还可以适用于防止或减少核酸测序应用的检测步骤期间的DNA损伤。

在一些实施方案中，用于核苷酸标记的荧光化合物被称为“蓝色染料”，意味着其可以由介于400nm至500nm之间，更具体地介于450nm至460nm之间的短波长光源(LED或激光器)激发。这些化合物已经描述于美国公开2018/0094140和2018/0201981，以及美国序列62/812837和62/812732中，所述专利各自通过引用整体并入本文。

式(A)的荧光化合物

在一些实施方案中，荧光化合物由式(A)或其盐或内消旋形式表示：

其中：

X为O、S、Se或NRⁿ，其中Rⁿ为H、C_1-6烷基或C_6-10芳基；

环A为3至10元杂环基；

R、R¹、R²和R⁴各自独立地为H、卤基、-CN、-CO₂H、氨基、-OH、C-酰氨基、N-酰氨基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的氨基烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；

每个R³独立地为卤基、-CN、-CO₂H、-(CH₂)_p-CO₂R^c、-(CH₂)_q-C(O)NR^dR^e、氨基、-OH、C-酰胺基、N-酰胺基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的C_2-6烯基、任选地取代的C_2-6炔基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，或两个R³形成氧代基(＝O)；

其中p和q各自为1、2、3或4；

每个R⁵独立地为卤基、-CN、-CO₂R^f、氨基、-OH、C-酰氨基、N-酰氨基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的氨基烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；

R^a和R^b各自独立地为H或任选地取代的C_1-6烷基；

R^c、R^d、R^e和R^f各自独立地为H、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；

m为0、1、2、3或4；并且

n为0、1、2、3、4或5。

式(B)的荧光化合物

在一些实施方案中，荧光化合物由式(B)或其盐或内消旋形式表示：

其中：

X为O、S、Se或NRⁿ，其中Rⁿ为H、C_1-6烷基或C_6-10芳基；

R¹、R²和R⁵中的每一者独立地为H、卤基、-CN、-CO₂H、氨基、-OH、C-酰氨基、N-酰氨基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的氨基烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；

R为H、卤基、-CN、-CO₂H、氨基、-OH、C-酰氨基、N-酰氨基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的氨基烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基或任选地取代的杂芳基；

R³和R⁴各自独立地为C_1-6烷基、-(CH₂)_p-CO₂R^c、-(CH₂)_q-C(O)NR^dR^e、

-(CH₂)_n-SO₃H、-(CH₂)_t-SO₂NR^aR^b，并且其中p、q、n和t各自独立地为1、2、3、4、5或6；

每个R⁶独立地为卤基、-CN、-CO₂R^f、氨基、-OH、C-酰氨基、N-酰氨基、-NO₂、-SO₃H、-SO₂NR^aR^b、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的氨基烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；

R^a和R^b各自独立地为H或任选地取代的C_1-6烷基；

R^c、R^d、R^e和R^f各自独立地为H、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的碳环基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；并且

m为0、1、2、3或4。

式(C)的荧光化合物

在一些实施方案中，荧光化合物由式(C)或其盐或内消旋形式表示：

其中R¹为

并且其中R¹任选地被一个或多个选自由以下项组成的组的取代基取代：烷基、取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤基、氰基、羟基、羟烷基、杂烷基、羧基、C-羧基、O-羧基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的环烷基和任选地取代的杂环基；

R²、R³、R⁴、R⁵和R⁹各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤基、氰基、羟基、羟烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、任选地取代的碳环基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

R⁶、R^10a、R^10b和R^10c各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧化物、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；

R⁷和R⁸各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、卤基、氰基、羟基、羟烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、任选地取代的碳环基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

替代地，R⁶和R⁷与其所连接的原子一起形成选自由任选地取代的5至10元杂芳基或任选地取代的5至10元杂环基组成的组的环或环系；

X选自由以下项组成的组：O、S、NR¹¹和Se；

R¹¹选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、羧基烷基、磺酸根烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；并且

由实线和虚线

表示的键选自由单键和双键组成的组，前提条件是当

是双键时，则R³不存在。

式(D)的荧光化合物

在一些实施方案中，荧光化合物由式(D)或其盐或内消旋形式表示：

其中R¹、R²和R^1’各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、氨基磺酰基、卤基、氰基、羟基、羟烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、磺酰基卤化物、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、任选地取代的碳环基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

替代地，R¹和R^1’与其所连接的原子一起形成环或环系，所述环或环系选自由以下项组成的组：任选地取代的碳环基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

R³和R⁴各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺酰基氢氧化物、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；

替代地，R¹和R³与其所连接的原子一起形成选自由任选地取代的5至10元杂芳基或任选地取代的5至10元杂环基组成的组的环或环系；

替代地，R²和R⁴与其所连接的原子一起形成选自由任选地取代的5至10元杂芳基和任选地取代的5至10元杂环基组成的组的环或环系；

R⁵和R⁶独立地选自由以下项组成的组：烷基、取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、氨基磺酰基、卤基、氰基、羟基、羟烷基、杂烷基、C-羧基、O-羧基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、磺酰基、磺基、亚磺基、磺酸根、磺酰基卤化物、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、任选地取代的碳环基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基和任选地取代的杂环基；

R选自-OR⁷或-NR⁸R⁹；

R⁷选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；

R⁸和R⁹各自独立地选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、羧基烷基、磺酸根烷基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基烷基、磺基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；

X选自由以下项组成的组：O、S、NR¹⁰和Se；

R¹⁰选自由以下项组成的组：H、烷基、取代的烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的碳环基和任选地取代的杂环基；

m为0至4的所选整数；并且

n为0至4的所选整数。

在一些具体实施方案中，非限制性示例性蓝色染料化合物如下所示：

另外的示例性染料化合物公开于美国临时申请63/057758，所述申请通过引用并入本文。

COT键合的染料的合成

本公开的一些方面涉及保护荧光染料免于光漂白的方法，该方法包括将荧光染料共价连接至由如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构构成的COT部分。本公开的一些另外的方面涉及保护核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，该方法包括将核苷或核苷酸共价连接至包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的COT部分的荧光化合物。

本文所述的荧光染料可以通过各种方法共价连接至COT部分。例如，可以通过使含有氨基反应性官能团的取代的COT化合物与例如荧光化合物的羧基基团(-CO₂H)、磺基(-SO₃H)或磺酸根基团(-SO₃ˉ)反应来将COT部分引入荧光化合物中。

在其他示例中，可以通过使含有COT部分的化合物的羧基、磺基或磺酸根基团与染料的氨基基团反应来将COT部分引入荧光化合物中。

标记的核苷酸

本文所述的COT部分键合的荧光化合物适用于连接到底物部分。底物部分事实上可以是本文所述的染料可以与之缀合或接合的任何分子或物质，并且以非限制性示例的方式，可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机聚合物和无机聚合物、以及它们的组合或装配物，诸如染色体、核、活细胞等。染料可以通过任选的连接基通过多种方式(包括疏水吸引、离子吸引和共价连接)固定。具体地讲，染料通过共价连接缀合至底物。更具体地讲，共价连接借助于连接基基团实现。在一些情况下，此类标记的核苷酸也被称为“经修饰的核苷酸”。

如本文所述的COT部分键合的荧光染料的特别有用的应用是用于标记生物分子，例如，核苷酸或寡核苷酸。本申请的一些实施方案涉及用如本文所述的荧光化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。

具有适当光谱特性(如斯托克斯偏移、吸收和荧光强度、吸收和荧光最大值的位置以及吸收和荧光带的形状)的荧光染料分子可以提高核酸测序的速度和准确性。在一些情况下，斯托克斯偏移可以是生物应用中荧光检测的关键方面。例如，当使用吸收和荧光最大值彼此非常接近(即，小斯托克斯偏移)的荧光团时，发射光的检测可能难以与激发光区分开，因为激发波长和发射波长极大地重叠。相比之下，具有大斯托克斯偏移的荧光团由于激发波长和发射波长之间的更大间隔而易于区分。斯托克斯位移在多重荧光应用中特别关键，因为一个荧光团的发射波长可以重叠，并因此激发相同样品中的另一个荧光团。此外，当在水基生物缓冲液中和/或在较高温度下进行测量时，荧光信号强度尤其重要，因为大多数染料的荧光在此类条件下显著较低。此外，染料所连接的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和其他光谱染料特性。荧光染料与核碱基之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特异性设计来定制。荧光染料结构的优化可以调节其荧光特性，并且还可以提高核苷酸掺入的效率、降低测序误差的水平，并且减少核酸测序中试剂的使用，并因此降低核酸测序的成本。

在一些实施方案中，本文所述的荧光化合物可以经由核苷酸碱基共价连接至寡核苷酸或核苷酸。例如，标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过连接基部分连接到嘧啶碱基的C5位置或7-脱氮嘌呤碱基的C7位置的标记。标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价连接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'-OH封端基团。

在一些实施方案中，如本文所述的共价连接的COT部分不改变染料的荧光特性或基本上改变染料的荧光特性(诸如斯托克斯偏移、荧光强度、荧光最大值的位置和荧光带形状)。

3'-OH封端基团

记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价连接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的封端基团。该封端基团可以连接在核糖或脱氧核糖上的任何位置处。在特定实施方案中，该封端基团位于核苷酸的核糖或脱氧核糖的3′-OH位置处。各种3'-OH封端基团公开于WO2004/018497、WO2014/139596和美国公开2020/0216891中，所述申请特此以引用方式并入。例如，封端基团可以为叠氮甲基(-CH₂N₃)或取代的叠氮甲基(例如，-CH(CHF₂)N₃或CH(CH₂F)N₃)、或连接至核糖或脱氧核糖部分的3'氧原子的烯丙基。在一些实施方案中，3'封端基团为叠氮甲基，与核糖或脱氧核糖的3'碳形成3′-OCH₂N₃。

在一些其他实施方案中，3'封端基团和3'氧原子形成共价连接至核糖或脱氧核糖的3'碳的结构的缩醛基团，其中：

R^1a和R^1b各种独立地为H、C₁-C₆烷基、C_1-C₆卤代烷基、C_1-C₆烷氧基、C_1-C₆卤代烷氧基、氰基、卤素、任选地取代的苯基或任选地取代的芳烷基；

R^2a和R^2b各种独立地为H、C_1-C₆烷基、C_1-C₆卤代烷基、氰基或卤素；

替代地，R^1a和R^2a与其所连接的原子一起形成任选地取代的五至八元杂环基基团；

R^F为H、任选地取代的C_2-C₆烯基、任选地取代的C_3-C₇环烯基、任选地取代的C_2-C₆炔基或任选地取代的(C_1-C₆亚烷基)Si(R^3a)₃；并且

每个R^3a独立地为H、C_1-C₆烷基或任选地取代的C_6-C₁₀芳基。

附加的3′-OH封端基团公开于美国公开2020/0216891A1中，该公开全文以引用方式并入。缩醛封端基团的非限制性示例为

各自共价连接至核糖或脱氧核糖的3'碳。

3'-OH封端基团的脱保护

在一些实施方案中，可以通过使用水溶性膦试剂去除或脱保护叠氮甲基3'羟基保护基团。非限制性示例包括三(羟甲基)膦(THMP)、三(羟乙基)膦(THEP)或三(羟丙基)膦(THP或THPP)。本文所述的3'-缩醛封端基团可以在各种化学条件下去除或裂解。对于含有乙烯基或烯基部分的缩醛封端基团

非限制性裂解条件包括在膦配体，例如三(羟甲基)膦(THMP)或三(羟丙基)膦(THP或THPP)的存在下的Pd(II)络合物，诸如Pd(OAc)₂或烯丙基氯化Pd(II)二聚体。对于含有炔基基团(例如，乙炔基)的那些封端基团，其也可以通过在膦配体(例如，THP或THMP)的存在下的Pd(II)络合物(例如，Pd(OAc)₂或烯丙基氯化Pd(II)二聚体)去除。

钯裂解试剂

在一些实施方案中，本文所述的3'羟基封端基团可以被钯催化剂裂解。在一些此类实施方案中，Pd催化剂是水溶性的。在一些此类实施方案中，为Pd(0)络合物(例如，三(3,3',3”-次膦基三(苯磺酸基)钯(0)九钠盐九水合物)。在一些情况下，Pd(0)络合物可以通过试剂诸如烯烃、醇、胺、膦或金属氢化物还原Pd(II)络合物而原位生成。合适的钯源包括Na₂PdCl₄、Pd(CH₃CN)₂Cl₂、(PdCl(C₃H₅))₂、[Pd(C₃H₅)(THP)]Cl、[Pd(C₃H₅)(THP)₂]Cl、Pd(OAc)₂、Pd(Ph₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)和Pd(TFA)₂。在一个此类实施方案中，Pd(0)络合物由Na₂PdCl₄原位产生。在另一个实施方案中，钯源是烯丙基氯化钯(II)二聚体[(PdCl(C₃H₅))₂]。在一些实施方案中，Pd(0)络合物通过将Pd(II)络合物与膦混合而在水溶液中产生。合适的膦包括水溶性膦，诸如三(羟丙基)膦(THP)、三(羟甲基)膦(THMP)、1,3,5-三氮杂-7-磷杂金刚烷(PTA)、双(对磺酸基苯基)苯基膦二水合物钾盐、三(羧乙基)膦(TCEP)和三苯基膦-3,3',3'-三磺酸三钠盐。

在一些实施方案中，Pd(0)通过将Pd(II)络合物[(PdCl(C₃H₅))₂]与THP原位混合来制备。Pd(II)络合物和THP的摩尔比可以为约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一些另外的实施方案中，可以添加一种或多种还原剂，诸如抗坏血酸或其盐(例如，抗坏血酸钠)。在一些实施方案中，裂解混合物可以含有另外的缓冲液试剂，诸如伯胺、仲胺、叔胺、碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐，或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液试剂包括乙醇胺(EA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸钠、磷酸钠、硼酸钠、2-二甲基乙醇胺(DMEA)、2-二乙基乙醇胺(DEEA)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)或N,N,N',N'-四乙基乙二胺(TEEDA)或它们的组合。在一个实施方案中，缓冲剂是DEEA。在另一个实施方案中，缓冲剂含有一种或多种无机盐，诸如碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐，或它们的组合。在一个实施方案中，无机盐为钠盐。

连接基

如本文所公开的染料化合物可以在取代基位置之一处包括反应性连接基基团，用于将该化合物共价连接至底物或另一分子。反应性连接基团是能够形成键(例如，共价键或非共价键)、特别是共价键的部分。在一个特定实施方案中，连接基可以是可裂解的连接基。使用术语“可裂解的连接基”并不意在暗示需要除去整个连接基。裂解位点可以位于连接基上确保该连接基的一部分在裂解后保持连接到染料和/或底物部分的某个位置处。以非限制性示例的方式，可裂解的连接基可以是亲电可裂解的连接基、亲核可裂解的连接基、可光裂解的连接基、在还原条件下可裂解的(例如含有二硫化物或叠氮化物的连接基)、在氧化条件下可裂解的、通过使用安全捕获连接基可裂解的，以及通过消除机制可裂解的。使用可裂解的连接基将染料化合物连接到底物部分确保了如果需要的话，可以在检测后移除标记，从而避免下游步骤中的任何干扰信号。

可用的连接基基团可以见于PCT公开WO2004/018493(以引用方式并入本文)中，其示例包括可以使用水溶性膦或由过渡金属和至少部分水溶性的配体形成的水溶性过渡金属催化剂裂解的连接基。在水性溶液中，后者形成至少部分水溶性的过渡金属络合物。此类可裂解的连接基可以用于将核苷酸的碱基连接到标记，诸如本文所示的染料。

特定的连接基包括PCT公开WO2004/018493(以引用方式并入本文)中所公开的那些，诸如包括下式的部分的那些：

(其中X选自包括O、S、NH和NQ的组，其中Q为C1-10取代或未取代的烷基基团，Y选自包括O、S、NH和N(烯丙基)的组，T为氢或C₁-C₁₀取代或未取代的烷基基团，并且*指示所述部分与核苷酸或核苷的其余部分连接的位置)。在一些方面，连接基将核苷酸的碱基连接到标记，诸如，本文所述的染料化合物。

连接基的附加示例包括美国公开2016/0040225(以引用方式并入本文)中所公开的那些，诸如包括下式的部分的那些：

(其中*指示所述部分与核苷酸或核苷的其余部分连接的位置)。本文所展示的连接基部分可以包括核苷酸/核苷与标记之间的全部或部分连接基结构。

连接基的附加示例包括美国公开2019/0017111和2020/0216891(以引用方式并入本文)中所公开的那些，诸如包括下式的部分的那些：

其中B是核碱基；Z是–N₃(叠氮基)、–O-C₁-C₆烷基、–O-C₂-C₆烯基或–O-C₂-C₆炔基；并且Fl包括染料部分，所述染料部分可以含有另外的连接基结构。本领域普通技术人员理解，本文所述的染料化合物通过使染料化合物的官能团(例如，羧基)与连接基的官能团(例如，氨基)反应而共价键合到连接基。在一个实施方案中，可裂解连接基包含

(“AOL”连接基部分)，其中Z为–O-烯丙基。

在特定实施方案中，荧光染料(荧光团)和核碱基，例如取代的鸟嘌呤碱基之间的连接基的长度可以改变，例如，通过引入聚乙二醇间隔区基团，从而与通过本领域已知的其他键连接到鸟嘌呤碱基的相同荧光团相比增加了荧光强度。示例性连接基及其特性在PCT公开WO2007020457(以引用方式并入本文)中示出。连接基的设计，尤其是其增加的长度，可以允许当掺入到多核苷酸(诸如DNA)中时，改善连接到鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团的亮度。因此，当染料用于需要检测连接到含有鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记的任何分析方法中时，有利的是连接基包含式–((CH₂)₂O)_n–的间隔区基团，其中n为介于2和50之间的整数，如WO2007/020457中所述。

核苷和核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处标记。如本领域所知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或多个磷酸基团组成。在RNA中，糖为核糖，而在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶为胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，或在RNA的情况下为尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸也是核苷的磷酸酯，其中酯化发生在连接到糖的C-3或C-5的羟基基团上。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。

“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。

虽然碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但是技术人员将理解，可获得不改变核苷酸或核苷经历Watson-Crick碱基配对的能力的衍生物和类似物。“衍生物”或“类似物”意味着这样的化合物或分子：其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常类似，但其具有允许衍生的核苷酸或核苷与另一分子连接的化学或物理修饰，诸如不同的或附加的侧基。例如，碱基可以为脱氮嘌呤。在特定实施方案中，衍生物应当能够经历Watson-Crick配对。“衍生物”和“类似物”还包括例如具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键、氨基磷酸酯键等。

荧光染料可以通过连接基连接到核苷酸碱基上的任何位置，前提条件是仍可以进行Watson-Crick碱基配对。特定的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位置或7-脱氮嘌呤碱基的C7位置。如上所述，连接基基团可以用于将染料共价连接至核苷或核苷酸。

在特定实施方案中，标记的核苷或核苷酸可以是可酶促掺入的和可酶促延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得化合物不显著干扰核酸复制酶的核苷酸位点的总体结合和识别。因此，连接基还可以包含间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。

用本文所述的COT部分键合的荧光染料标记的核苷或核苷酸可以具有下式：

其中染料是含有共价键合的COT部分的染料化合物，所述COT部分包含式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构；B为核碱基，诸如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤等；并且L为可以存在或可以不存在的任选的连接基基团。R'可以为H，或-OR'为单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根、硫代磷酸根、磷酸酯类似物、连接至反应性含磷基团的–O–，或者被封端基团保护的–O–。R”可以为H、亚磷酰胺或3'-OH封端基团；并且R”'是H或OH；其中R”为亚磷酰胺，R'为酸可裂解的羟基保护基团，其允许随后在自动化合成条件下进行单体偶联。在一些另外的实施方案中，B包括

或它们的任选地取代的衍生物和类似物。在一些另外的实施方案中，标记的核碱基包括结构

在一些实施方案中，封端基团是与染料化合物分开的并且独立于染料化合物，即，不与后者连接。替代性地，染料可以包含3'-OH封端基团的全部或部分。因此，R”可以为可以构成或可以不构成染料化合物的3'-OH封端基团。在附加的替代性的实施方案中，戊糖的3'碳上不存在封端基团，并且连接到碱基的染料(或染料和连接基构造)例如可以具有足以充当从不同于3'位点的点掺入另外的核苷酸的障碍的尺寸或结构。因此，该障碍可以归因于空间位阻或可以归因于尺寸、电荷和结构的组合。

使用封端基团允许对聚合进行控制，诸如当掺入标记的核苷酸时通过停止延伸来控制。如果封端效应是可逆的，例如，以非限制性示例的方式，则通过改变化学条件或通过除去化学障碍，可以在某些点处停止延伸，然后允许其继续。3'-OH封端基团的非限制性示例包括WO2004/018497和WO2014/139596以及美国公开2020/0216891中公开的那些，所述专利特此通过引用并入。例如，封端基团可以为叠氮甲基(-CH₂N₃)或取代的叠氮甲基(例如，-CH(CHF₂)N₃或CH(CH₂F)N₃)、烯丙基或

(AOM)。

在一个具体实施方案中，连接基和封端基团均存在，并且是在基本上类似的条件下可裂解的单独部分。因此，脱保护和脱封端过程可能更有效，因为只需要单一处理就可以除去染料化合物和封端基团这两者。

本公开还涉及涵盖掺入本文所述的染料化合物的多核苷酸。此类多核苷酸可以为分别由以磷酸二酯键接合的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的DNA或RNA。多核苷酸可以包含天然存在的核苷酸、除本文所述的标记的核苷酸之外的非天然存在的(或经修饰的)核苷酸或它们的任何组合，前提条件是存在至少一个用含COT部分的荧光染料标记的核苷酸。多核苷酸还可以包括非天然的骨架键和/或非核苷酸化学修饰。还设想了由包含至少一种标记的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物组成的嵌合结构。

如本文所述的非限制性示例性标记的核苷酸包括以下结构。如每个结构中所示的“染料”可以指如本文所述的含有共价键合的COT部分的荧光化合物，或不含COT部分的荧光化合物，如式(A)、(B)、(C)或(D)的那些。

其中：L表示连接基，并且R表示如上所述的核糖或脱氧核糖部分，或具有被单磷酸、二磷酸或三磷酸取代的5'位置的核糖或脱氧核糖部分。在一些实施方案中，非限制性示例性荧光染料缀合物在下文示出。

其中PG代表本文所述的3’OH封端基团；n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；并且m为0、1、2、3、4或5。在一个实施方案中，–O–PG是AOM。在另一个实施方案中，–O–PG为–O–叠氮甲基。在一个实施方案中，n为5。

是指作为连接基部分的氨基与染料的羧基基团之间的反应的结果的染料与可裂解连接基的连接点。在每个结构中，当m为0时，染料的羧基基团通过与连接基的氨基部分反应形成酰胺键而直接连接到ffN连接基。在一些情况下，连接基“sPA”也被称为“sPA-LN3”。

在本文所述的标记的核苷酸的任何实施方案中，核苷酸为核苷酸三磷酸。

本公开的另外的方面涉及包含本文所述的标记的核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，靶多核苷酸被固定在固体载体上。在一些另外的实施方案中，固体载体包含多个固定的靶多核苷酸的阵列。

试剂盒

本文公开的一些实施方案是包括用本文所述的COT修饰的荧光染料标记的核苷和/或核苷酸的试剂盒。此类试剂盒通常将包括至少一种用染料标记的核苷酸或核苷，以及至少一种另外的组分。另外的组分可以是进一步标记或未标记的核苷酸或核苷。例如，用染料标记的核苷酸可以与未标记的或天然的核苷酸和/或与荧光标记的核苷酸或它们的任何组合结合提供。核苷酸的组合可以作为单独的单个组分或作为核苷酸混合物提供。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个核苷酸，其中至少一个核苷酸是用本文所述的COT部分键合的荧光化合物标记的核苷酸。该试剂盒可以包括两种或更多种标记的核苷酸。这些核苷酸可以用两种或更多种荧光标记物进行标记。可以使用单个激发源来激发这些标记中的两种或更多种标记，该激发源可以是激光器。

试剂盒可以含有四个标记的核苷酸(例如，A、C、T、G)，其中四个核苷酸中的第一个用如本文所公开的COT修饰的荧光化合物标记，并且第二个、第三个和第四个核苷酸各自可以用不同的荧光化合物(各自也可以是COT修饰的)标记，其中每种荧光化合物具有不同的荧光最大值，并且每种荧光化合物可与其他三种化合物区分开来。该试剂盒可以是这样的：即，荧光化合物中的两种或更多种化合物具有类似的吸光度最大值，但具有不同的斯托克斯位移(Stokes shift)。

本文所述的COT修饰的荧光化合物、用COT修饰的化合物标记的核苷酸或试剂盒可以用于测序、表达分析、杂交分析、遗传分析、RNA分析或蛋白质结合测定。可以在自动测序仪器上使用。测序仪器可以包含在不同波长下操作的两个激光器。

在试剂盒包括用染料化合物标记的多种，特别地是两种，更特别地是四种核苷酸的情况下，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物标记，或者一种可以是暗色的，没有染料化合物。在不同的核苷酸用不同的染料化合物标记的情况下，试剂盒的一个特征是所述染料化合物是光谱上可区分的荧光染料。如本文所用，术语“光谱上可区分的荧光染料”是指当一个样品中存在两种或更多种此类染料时，以能够通过荧光检测设备(例如，商业的基于毛细管的DNA测序平台)区分的波长发射荧光能量的荧光染料。当用荧光染料化合物标记的两种核苷酸以试剂盒形式提供时，在一些实施方案中光谱上可区分的荧光染料能够以相同的波长激发，诸如，通过相同的激光器激发。当用荧光染料化合物标记的四种核苷酸以试剂盒形式提供时，在一些实施方案中光谱上可区分的荧光染料中的两种荧光染料均能够以一个波长激发，并且另外两种光谱上可区分的染料均能够以另一个波长激发。特定的激发波长为约460nm。

在一些实施方案中，至少一个核苷酸可以用染料标记，所述染料可用具有不同波长的两种激光器激发。

在一个实施方案中，试剂盒包括用本文所述的COT修饰的染料标记的核苷酸和用第二染料标记的第二核苷酸，其中染料具有至少10nm，特别地20nm至50nm的吸光度最大值差值。更具体地讲，两种染料化合物具有介于15nm-40nm之间或介于20nm-40nm之间的斯托克斯位移。如本文所用，术语“斯托克斯位移”是介于峰吸收波长和峰发射波长之间的距离。

在另外的实施方案中，所述试剂盒进一步包括用荧光染料标记的两种其他核苷酸，其中所述染料可以由在约440nm至约560nm处发射的光源激发。

在一个替代性的实施方案中，试剂盒可以包含其中相同的碱基用两种不同的化合物标记的核苷酸。第一核苷酸可以用本文所述的COT修饰的染料标记。第二核苷酸可以用光谱上不同的染料标记，例如在大于600nm处吸收的“红色”染料。第三核苷酸可以被标记为本文所述的COT修饰的染料和光谱上不同的染料的混合物，并且第四核苷酸可以是“暗色”并且不含标记。因此，简单地讲，核苷酸1-4可以被标记为“绿色”、“红色”、“红色/绿色”和暗色。为了进一步简化仪器，可以用单个光源所激发的两种染料标记四种核苷酸，并且因此核苷酸1-4的标记可以是‘绿色1’、‘绿色2’、‘绿色1/绿色2’和暗色。

在其他实施方案中，试剂盒可以包括能够催化核苷酸掺入到多核苷酸中的聚合酶。待被包括在此类试剂盒中的其他组分可以包括缓冲液等。用本文所述的COT部分键合的荧光染料标记的核苷酸，以及包括不同核苷酸的混合物在内的其他任何核苷酸组分，可以在试剂盒中以浓缩形式提供，在使用之前进行稀释。在此类实施方案中，还可以包括合适的稀释缓冲液。

本公开的一些另外的实施方案涉及与测序装置一起使用的试剂盒，该试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中该多种组合物包括：用于将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂，其中该核苷酸包含3’封端基团并且用包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的COT修饰的荧光化合物标记；包含至少一种抗氧化剂的缓冲液组合物；用于从掺入到所述复制链中的所述封端的、标记的核苷酸中化学去除标记和封端部分的试剂；以及洗涤溶液。在一些实施方案中，荧光化合物是蓝色染料。在一些另外的实施方案中，荧光化合物举例说明为式(A)、(B)、(C)和(D)。在一些实施方案中，缓冲溶液可以包括COT、槲皮素、抗坏血酸或抗坏血酸钠、没食子酸衍生物或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液组合物还可以包含清除剂，例如，具有二硫化物或叠氮基部分的化合物、硫辛酸或3,3’-二硫代二丙酸(DDPA)。在一些实施方案中，用于将核苷酸掺入多核苷酸链中的试剂包括聚合酶。在一些实施方案中，用于化学去除掺入的核苷酸的标记和封端部分的试剂包括膦，诸如三烷基膦。三烷基膦的非限制性示例包括三(3-羟丙基)膦(THP)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THMP)或三(2-羟乙基)膦(THEP)。在一些实施方案中，3’封端基团含有叠氮基基团(例如，叠氮甲基)。在一些实施方案中，洗涤溶液还可以包括ROS或自由基清除剂。

本公开的一些另外的实施方案涉及与测序’置一起使用的试剂盒，该试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中该多种组合物包括：用于将3’封端的、标记的核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂；包含如本文所述的含有环辛四烯的组合物的缓冲液组合物；用于从掺入到所述复制链中的所述封端的、标记的核苷酸中化学去除标记和封端部分的试剂；以及洗涤溶液。在一些实施方案中，缓冲液组合物还可以包含槲皮素、抗坏血酸或抗坏血酸钠、没食子酸衍生物或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液组合物还可以包含ROS或/和自由基清除剂，例如，具有二硫化物或叠氮基部分的化合物、硫辛酸或3,3’-二硫代二丙酸(DDPA)。在一些实施方案中，用于将核苷酸掺入多核苷酸链中的试剂包括聚合酶。在一些实施方案中，用于化学去除掺入的核苷酸的标记和封端部分的试剂包括膦，诸如三烷基膦。三烷基膦的非限制性示例包括三(3-羟丙基)膦(THP)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THMP)或三(2-羟乙基)膦(THEP)。在一些实施方案中，3’封端基团含有叠氮基基团(例如，叠氮甲基)。在一些实施方案中，洗涤溶液还可以包括清除剂。

测序方法

包含本文所述的COT部分键合的荧光染料的核苷酸(或核苷)可以用于需要检测连接到核苷酸或核苷的荧光标记的任何分析方法中，无论是以其本身使用，还是掺入到较大的分子结构或缀合物中或者与较大的分子结构或缀合物缔合。本申请的一些实施方案涉及测序方法，所述方法包括：(i)将至少一种如本文所述的标记的核苷酸掺入到多核苷酸中；以及(ii)通过检测来自连接到所述核苷酸的COT部分键合的荧光染料的荧光信号来检测掺入到多核苷酸中的标记的核苷酸。

在一些实施方案中，至少一种标记的核苷酸在合成步骤中通过聚合酶的作用被掺入到多核苷酸中。然而，不排除将标记的核苷酸掺入到多核苷酸的其他方法，诸如，化学寡核苷酸合成或者将标记的寡核苷酸与未标记的寡核苷酸连接。因此，术语将核苷酸“掺入”到多核苷酸涵盖通过化学方法以及酶促方法进行的多核苷酸合成。

本公开的一些具体实施方案涉及在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，该方法包括：

(a)将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中，其中所述核苷酸包含标记和3’封端基团；

从掺入到所述复制多核苷酸链中的所述核苷酸中化学去除所述标记和所述3’封端基团；以及

(d)用洗涤溶液将所述化学去除的标记和所述3’封端基团从所述复制链上洗掉；其中所述第一缓冲液组合物包含环辛四烯或其任选地取代的衍生物，以及选自由以下项组成的组的一种或多种抗氧化剂：黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素和trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。

在本文所述的方法的一些实施方案中，缓冲液组合物还可以包含槲皮素、抗坏血酸或抗坏血酸钠、没食子酸或其衍生物或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液组合物包含环辛四烯和槲皮素两者，或它们的任选地取代的衍生物。在一些另外的实施方案中，环辛四烯或任选地取代的衍生物的浓度为约0.1mM至约100mM、或约1mM至约50mM、约2mM至约25mM、约5mM至约15mM，或约10mM。在一些另外的实施方案中，槲皮素或任选地取代的衍生物的浓度为约0.01mM至约10mM、约0.02mM至约5mM、约0.05mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约0.2mM至约0.5mM，或约0.25mM。

本文提供的一些另外的实施方案涉及在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，该方法包括：

(a)将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中，其中该核苷酸包含3’封端基团并且用包含如本文所述的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)的结构的COT修饰的荧光化合物标记；

(d)用洗涤溶液将化学去除的标记和所述3’封端基团从所述复制链上洗掉。

在本文所述的测序方法的一些实施方案中，荧光化合物是蓝色染料。在一些另外的实施方案中，荧光化合物举例说明为式(A)、(B)、(C)和(D)。在一些实施方案中，缓冲溶液可以包含抗坏血酸或抗坏血酸钠，或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液组合物还可以包含清除剂，例如，具有二硫化物或叠氮基部分的化合物、硫辛酸或3,3’-二硫代二丙酸(DDPA)。在一些实施方案中，用于将核苷酸掺入多核苷酸链中的试剂包括聚合酶。在一些实施方案中，3’封端基团含有叠氮基基团(例如，叠氮甲基)。在一些实施方案中，洗涤溶液还可以包括清除剂。在一些另外的实施方案中，洗涤溶液包括第一缓冲溶液。在一些实施方案中，重复步骤(a)至(d)，直至确定所述模板多核苷酸链的所述部分的序列。在一些此类实施方案中，步骤(a)至(d)重复至少50次、至少75次、至少100次、至少125次或至少150次。在一些实施方案中，步骤(b)包括通过在第一缓冲液组合物的存在下用光源照射掺入核苷酸的复制多核苷酸链来执行一种或多种荧光测量。在一些此类实施方案中，光源具有约400nm至约500nm的波长。在一些实施方案中，从掺入到复制多核苷酸链中的核苷酸中去除标记和3’封端基团包括使复制链与膦诸如三烷基膦接触。三烷基膦的非限制性示例包括三(3-羟丙基)膦(THP)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THMP)或三(2-羟乙基)膦(THEP)。在本文所述的方法的任何实施方案中，标记的核苷酸为核苷酸三磷酸。在本文所述的方法的任何实施方案中，模板多核苷酸链连接到固体载体，诸如流通池。

在本文所述的方法的一些实施方案中，与没有COT修饰的相同荧光化合物相比，如本文所述的COT修饰的荧光化合物在测序运行中作为核苷酸标记的使用可以将由光照射引起的光漂白或DNA损伤减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些此类实施方案中，光漂白或DNA损伤通过10分钟、20分钟或30分钟光照射之后，或在1次、10次、25次、50次、75次、100次、125次或150次测序运行之后的剩余荧光强度百分比来测量。在一些此类实施方案中，光漂白由波长介于450nm至460nm之间的蓝光引起。在一些此类实施方案中，在如本文所述的检测溶液中测量荧光强度。在其他实施方案中，在固体载体表面诸如流通池上测量荧光强度。

在本文所述的方法的一些实施方案中，与不含COT和槲皮素的检测溶液相比，在测序期间在检测溶液中使用如本文所述的含有COT和槲皮素的缓冲液组合物可以将由光照射引起的光漂白或DNA损伤减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些此类实施方案中，光漂白或DNA损伤通过10分钟、20分钟或30分钟光照射之后，或在1次、10次、25次、50次、75次、100次、125次或150次测序运行之后的剩余荧光强度百分比来测量。在一些此类实施方案中，光漂白由波长介于450nm至460nm之间的蓝光引起。在一些此类实施方案中，在如本文所述的检测溶液中测量荧光强度。在其他实施方案中，在固体载体表面诸如流通池上测量荧光强度。

在所述方法的所有实施方案中，检测步骤可以在向其中掺入了标记的核苷酸的多核苷酸链退火到模板链上时进行，或者在其中将两条链分离的变性步骤之后进行。在合成步骤和检测步骤之间可以包括另外的步骤，例如化学反应步骤或酶促反应步骤，或者纯化步骤。具体地讲，可以分离或纯化掺入了标记的核苷酸的靶链，然后进一步加工或用于后续的分析。以举例的方式，在合成步骤中用如本文所述的COT修饰的核苷酸标记的靶多核苷酸随后可以用作标记的探针或引物。在其他实施方案中，合成步骤(a)的产物可以经受进一步的反应步骤，并且如果需要，这些后续步骤的产物被纯化或分离。

用于合成步骤的合适条件将为熟悉标准分子生物学技术的人员所熟知。在一个实施方案中，合成步骤可以类似于标准引物延伸反应，该标准引物延伸反应在合适的聚合酶的存在下使用核苷酸前体(包括根据本公开的标记的核苷酸)形成与模板链互补的延伸的靶链。在其他实施方案中，合成步骤本身可以形成产生标记的双链扩增产物的扩增反应的一部分，该标记的双链扩增产物由来源于靶多核苷酸链和模板多核苷酸链的复制的退火互补链组成。其他示例性“合成”步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引发的DNA标记等。合成步骤中使用的聚合酶必须能够催化根据本公开的标记核苷酸的掺入。另外，聚合酶的精确性质没有特别限制，但可取决于合成反应的条件。以举例的方式，如果使用热循环进行合成反应，则需要热稳定聚合酶，而这对于标准引物延伸反应可能不是必需的。能够掺入根据本公开的标记的核苷酸的合适的热稳定聚合酶包括WO 2005/024010或WO 2006/120433中描述的那些。在较低温度诸如37℃处进行的合成反应中，聚合酶不必是热稳定聚合酶，因此对聚合酶的选择将取决于许多因素，诸如反应温度、pH、链置换活性等。

在具体的非限制性实施方案中，根据本申请用具有较长斯托克斯位移的COT部分键合的荧光染料标记的核苷酸或核苷可以用于核酸测序、重新测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分的方法、涉及在掺入多核苷酸时检测标记的核苷酸或核苷的任何其他应用，或需要使用包含根据本申请的荧光染料的核苷酸标记的多核苷酸的任何其他应用中。

在一个特定实施方案中，本申请提供包含本文所述的COT修饰的染料化合物的核苷酸在多核苷酸“合成测序”反应中的用途。合成测序通常涉及使用聚合酶或连接酶在5’至3’方向上将一个或多个核苷酸或寡核苷酸顺序添加至生长的多核苷酸链，以便形成与待测序的模板核酸互补的延伸多核苷酸链。存在于一个或多个添加的核苷酸中的碱基的身份在检测或“成像”步骤中测定。添加的碱基的身份可以在每个核苷酸掺入步骤之后测定。然后可以使用常规的Watson-Crick碱基配对规则来推断模板的序列。使用用根据本公开的染料标记的核苷酸来测定单个碱基的身份可能是有用的，例如，在单核苷酸多态性的评分中，并且此类单碱基延伸反应在本申请的范围内。

在一个实施方案中，模板多核苷酸的序列通过检测连接到掺入的核苷酸的荧光标记，检测一个或多个核苷酸掺入到与待测序的模板多核苷酸互补的新生链中来确定。模板多核苷酸的测序用合适的引物(或制备成发夹构建体，其将包含引物作为发夹的一部分)引发，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中向引物的3’端添加核苷酸而以逐个方式延伸。

在特定实施方案中，不同的核苷酸三磷酸(A、T、G和C)中的每一种可以用独特的荧光团进行标记，并且还在3’位置处包含封端基团以防止不受控制的聚合。替代性地，四种核苷酸中的一种可以是未标记的(暗色)。聚合酶将核苷酸掺入到与模板多核苷酸互补的新生链中，并且封端基团防止核苷酸的进一步掺入。任何未掺入的核苷酸都可以被去除，并且来自每个掺入的核苷酸的荧光信号通过合适的装置(诸如使用激光激发和合适的发射滤光器的电荷耦合器件)以光学方式“读取”。然后除去(脱保护)3’-封端基团和荧光染料化合物，特别是通过相同的化学或酶方法，以暴露新生链用于进一步掺入核苷酸。通常，将在每个掺入步骤之后确定所掺入的核苷酸的身份，但这不是严格必需的。类似地，美国专利5,302,509公开了一种对固定在固体载体上的多核苷酸进行测序的方法。该方法依赖于在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的3’-封端的核苷酸A、G、C和T掺入到与固定的多核苷酸互补的生长链中。聚合酶掺入与靶多核苷酸互补的碱基，但是被3’-封端基团防止进一步添加。然后可以确定掺入的核苷酸的标记，并且通过化学裂解除去封端基团以允许发生进一步的聚合。在合成测序反应中待测序的核酸模板可以是期望测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板将通常包含具有游离的3’羟基基团的双链区域，该双链区域充当用于在测序反应中添加另外的核苷酸的引物或起始点。待测序模板的该区域将在互补链上悬垂该游离的3’羟基基团。待测序模板的悬垂区域可以是单链的，但也可以是双链的，前提条件是在与待测序的模板链互补的链上存在“切口”，’提供用于引发测序反应的游离3’OH基团。在此类实施方案中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方案中，可以添加带有游离的3’羟基基团的引物，作为与待测序模板的单链区域杂交的单独组分(例如，短寡核苷酸)。替代性地，待测序的引物和模板链可以各自形成能够形成分子内双链体(诸如发夹环结构)的部分自身互补核酸链的一部分。PCT公开WO 2001/057248和WO 2005/047301中公开了发夹多核苷酸和其可以连接到固体载体的方法。将核苷酸连续地添加到游离的3’-羟基基团中，导致在5’至3’方向上合成多核苷酸链。可以确定已添加的碱基的性质，特别是但不必在每次添加核苷酸之后，从而提供核酸模板的序列信息。本文中，术语将核苷酸“掺入”到核酸链(或多核苷酸)中是指通过经由与核苷酸的5’磷酸基团形成磷酸二酯键来将核苷酸接合’核酸链的游离的3’羟基基团。

待测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或者甚至是由脱氧核苷酸和核糖核苷酸组成的杂合分子。核酸模板可以包含天然存在的和/或非天然存在的核苷酸以及天然或非天然的骨架键，前提条件是这些不阻止测序反应中模板的复制。

在某些实施方案中，待测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法(例如经由共价连接)连接到固体载体。在某些实施方案中，模板多核苷酸可以直接连接到固体载体(例如，基于二氧化硅的载体)。然而，在其他实施方案中，固体载体的表面可以以某种方式修饰，以便允许模板多核苷酸的直接共价连接，或者通过水凝胶或聚电解质多层来固定模板多核苷酸，所述多层本身可以非共价地连接到固体载体。

其中多核苷酸已直接连接到基于二氧化硅的载体的阵列是例如在PCT公开WO2000/006770中所公开的那些，其中通过玻璃上的环氧侧基与多核苷酸上的内部氨基基团之间的反应将多核苷酸固定在玻璃载体上。此外，PCT公开WO2005/047301公开了连接到固体载体的多核苷酸阵列，例如用于通过硫基亲核试剂与固体载体的反应来制备SMA。固体载体的模板多核苷酸的另外的示例是其中模板多核苷酸连接到基于二氧化硅或其他固体载体负载的水凝胶。基于二氧化硅的载体通常用于支撑水凝胶和水凝胶阵列，如PCT公开WO00/31148、WO 01/01143、WO02/12566、WO03/014392、WO 00/53812和美国专利6,465,178中所述。

模板多核苷酸可以固定于其上的特定表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶描述于现有技术中，其中一些论述于上文中。本申请中可以使用的特定水凝胶包括WO2005/065814和美国公开2014/0079923中所述的那些。在一个实施方案中，水凝胶为PAZAM(聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺))。

出于测序的目的，可以将DNA模板分子连接到珠粒或微粒上；例如，如美国专利6,172,218中所述。在Margulies中可以找到其中每个珠粒含有不同的DNA序列的制备珠粒文库的另外的示例可见于Margulies等人,Nature 437,376-380(2005)；Shendure等人,Science.309(5741):1728-1732(2005)中。使用本文所述的核苷酸对此类珠粒的阵列进行测序在本申请的范围内。

待测序的模板可以形成固体载体上的“阵列”的一部分，在这种情况下，阵列可以采取任何方便的形式。因此，本公开的方法适用于所有类型的“高密度”阵列，包括单分子阵列、成簇阵列和珠粒阵列。用本申请的染料化合物标记的核苷酸可以用于对基本上任何类型的阵列上的模板进行测序，所述阵列通过将核酸分子固定在固体载体上而形成，并且更具体地是任何类型的高密度阵列。然而，用本文所述的COT部分键合的荧光染料标记的核苷酸在对成簇阵列进行测序的情况下特别有利。

在多重多核苷酸或成簇阵列中，阵列上的不同区域包括多个多核苷酸模板分子。术语“成簇阵列”是指其中阵列上的不同区域或位点包括无法通过光学手段单独分辨的多个多核苷酸分子的阵列。取决于阵列的形成方式，阵列上的每个位点可以包含一个单独多核苷酸分子的多个拷贝或甚至少量不同多核苷酸分子的多个拷贝(例如，两个互补核酸链的多个拷贝)。核酸分子的多重多核苷酸或成簇阵列可以使用本领域中公知的技术产生。以举例的方式，WO 98/44151和WO 00/18957均描述了扩增核酸的方法，其中模板和扩增产物均保持固定在固体载体上，以便形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。根据这些方法制备的成簇阵列上存在的核酸分子是使用本文所述的COT部分键合的荧光染料标记的核苷酸进行测序的合适模板。

用本申请的染料化合物标记的核苷酸也可用于对单分子阵列上的模板进行测序。如本文所用的术语“单分子阵列”或“SMA”是指分布(或排列)在固体载体上的多核苷酸分子群，其中任何单独的多核苷酸与该分子群的所有其他多核苷酸的间距使得有可能实现多核苷酸的单独分辨。因此，固定到固体载体的表面上的靶核酸分子应该能够通过光学手段分辨。这意味着在所用的特定成像装置的可分辨区域内，必须存在一个或多个不同的信号，每个信号代表一个多核苷酸。

这可以实现，其中阵列上的相邻多核苷酸分子之间的间距为至少100nm，更具体地讲至少250nm，还更具体地讲至少300nm，甚至更具体地讲至少350nm。因此，每个分子能够作为单分子荧光点来单独地分辨和检测，并且来自所述单分子荧光点的荧光也表现出单步光漂白。

术语“单独分辨的”和“单独分辨”在本文中用于规定，当可视化时，有可能将阵列上的一个分子与其相邻分子区分开。阵列上各个分子之间的间隔将部分地通过用于分辨各个分子的特定技术来确定。通过参考PCT公开WO 2000/006770和WO 2001/057248，将理解单分子阵列的一般特征。虽然本公开的核苷酸的一种应用是用于合成测序反应，但此类标记的核苷酸的效用却不限于此类方法。事实上，这些核苷酸可以有利地用于需要检测连接于掺入到多核苷酸中的核苷酸的荧光标记的任何测序方法。

具体地讲，本公开的标记的核苷酸可以用于自动化荧光测序方案，尤其是基于Sanger和同事的链终止测序方法的荧光染料-终止子循环测序。此类方法通常使用酶和循环测序将荧光标记的双脱氧核苷酸掺入引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法和相关方案(Sanger型)依赖于带有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。

因此，本公开还涵盖标记的核苷酸，所述核苷酸是在3’位置和2’位置处都缺乏羟基基团的双脱氧核苷酸，此类经修饰的双脱氧核苷酸适合在Sanger型测序方法等中使用。

实施例

在以下实施例中更详细地公开了附加的实施方案，这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。

实施例1

在此实施例中，在除了对照检测溶液之外还含有10mM环辛四烯和0.25mM槲皮素(“COT混合物”)的检测溶液中测试四种标记的完全官能化的核苷酸(ffC-sPA-染料1、ffA-染料2、ffA-染料3和ffA-染料4)相对于仅含有通用扫描混合物(“USM”)的对照检测溶液的光漂白速率。在蓝色LED光照射30分钟后，测量标记的核苷酸中的每个的剩余荧光强度百分比并且结果示出于图1中。结果表明，对于每个标记的核苷酸，染料的光漂白速率在COT混合物中显著降低。

在单独实验中，在将标记的核苷酸掺入到流通池的表面上的簇中之后测量用染料4标记的ffA的光漂白速率。图2示出当分别使用标准检测溶液(对照)和COT混合物时，在照射10次、20次和50次之后测量的剩余荧光强度百分比。结果表明，将环辛四烯和槲皮素添加到对照检测溶液中对染料漂白的减少速率具有积极影响。

在Illumina测序平台

上使用光照射对DNA簇进行的进一步实验也表明，添加COT和槲皮素可以防止在测序运行的检测步骤期间由曝光量引起的DNA损伤。当使用标准扫描混合物(USM)时，测序矩阵显示相位值随曝光量而增加(图3A)，而当使用“COT混合物”时，相位值没有增加(图3B)。

实施例2

在此实施例中，经由羧基活化由COT-COOH制备1,3,5,7-环辛四烯基羧酸的各种新的氨基官能化的N-取代的酰胺。示例性化合物如下所示：

COT化合物的合成

羧基环辛-1,3,5,7-四烯(COT-COOH)按照J.Am.Chem.Soc.1952,74,第168-172页和第173-175页中所述的通用步骤通过两个步骤由COT制备。将COT-COOH(10mmol，1.48g)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS，10mmol，1.15g)溶解于二噁烷中。使用冰浴将黄色溶液冷却至0℃，然后添加呈固体形式的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC，10mmol，2.06g)。将反应混合物在0℃处搅拌15分钟。然后去除冰浴，并且在搅拌的情况下使反应混合物升温至室温(RT)。如TLC所指示，在1小时后完成反应。通过LC-MS确认COT-NHS酯，并且将其用于合成COT化合物1至COT化合物6而无需进一步纯化。

通用程序：将COT-NHS酯(245mg，1.0mmol)溶解于DMF(6mL)中，并在0℃处添加到含有适当胺(1.25mmol)、水(6mL)和三乙胺(0.41mL，3mmol)的烧瓶中。使反应混合物升温至室温并搅拌4小时。添加饱和NH₄Cl水溶液并用CH₂Cl₂(DCM)(2x10mL)从反应混合物中萃取产物。将水相进一步用1M HCl水溶液酸化，并再次用另外的2x10mL的DCM萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥。将溶液过滤并真空浓缩。通过柱色谱法纯化粗残余物。

化合物1：N-(2-氨基乙基)环辛-1,3,5,7-四烯-1-甲酰胺

在配备有搅拌棒、氮气管线和滴液漏斗的圆底烧瓶中，将1,2-乙二胺(10当量)于DCM中的溶液冷却至0℃。将如上所述制备的COT-NHS溶液转移到滴液漏斗中，并在10分钟内添加到乙二胺溶液中。用更多的DCM冲洗滴液漏斗，并将溶液添加到烧瓶中。使反应混合物升温至室温并在室温处搅拌三小时。通过TLC和LCMS确认反应完成。蒸馏出大部分溶剂并通过快速色谱法纯化残余物。产率：76％。通过LCMS和NMR确认纯度、结构和组成。

化合物2(BOC保护)：2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺基)丙酸

将Boc-L-2,3-二氨基丙酸(12.5mmol，2.55g)溶解于用Et₃N(30mmol，4.2mL)处理的去离子水(35mL)中。将溶液冷却至0℃。逐滴添加COT-NHS(10mmol)于DMF(35ml)中的溶液，保持温度在0℃处。升温至室温并搅拌90分钟。LCMS证实转化成所需产物，所有起始材料都消耗。通过用氯化铵水溶液稀释并用DCM萃取来进行反应。将水层用1M HCl酸化并再次用另外量的DCM萃取。将合并的DCM级分通过无水硫酸镁干燥，蒸发溶剂，并且通过快速色谱法纯化残余物。产率64％。

化合物2：2-氨基-3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺基)丙酸

用TFA(1mL)处理含化合物2(BOC保护)(250mg，0.75mmol)的DCM(5mL)，并且将混合物在室温处搅拌17小时。然后将溶液真空浓缩并添加Et₂O，形成白色沉淀。倾倒溶剂，并且用另外的Et₂O洗涤沉淀。将所得沉淀在真空下干燥，得到呈灰白色固体状的化合物2的三氟乙酸盐(TFA盐)(257mg，产率98％)。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ6.82(s,1H),6.14(dd,J＝11.4,3.1Hz,1H),6.03–5.86(m,5H),4.17–4.08(m,1H),3.89–3.66(m,2H)。¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ170.50,169.93,139.68,136.24,135.22,133.79,132.13,131.66,130.16,127.82,53.83,39.57。¹⁹F NMR(376MHz,氧化氘)δ-75.64。

化合物2’(BOC保护)：2-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺基)丁酸

按照化合物2(BOC保护)的合成中描述的程序从Boc-L-2,4-二氨基丁酸开始制备该中间体。

化合物2’：2-氨基-4-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺基)丁酸

按照化合物2的合成中描述的程序从化合物2’(BOC保护)开始制备化合物2’。通过HPLC将其纯化。通过LCMS和NMR确认纯度、结构和组成。

化合物3：N-(3-氨基丙基)环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺

将COT-NHS酯(1.0mmol)和1,3-二氨基丙烷(0.84mL，10mmol)在室温处搅拌4小时。将粗残余物通过柱色谱法纯化，得到呈橙色油状物的化合物3(197mg，97％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.89–6.79(m,1H),6.53(s,1H),6.07–5.63(m,6H),3.41–3.26(m,2H),2.74(t,J＝6.3Hz,2H),1.68–1.48(m,2H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.86,137.99,136.41,135.30,132.66,132.37,131.40,130.87,128.80,40.22,38.48,32.00。

化合物4(BOC保护)：N²-(叔丁氧羰基)-N⁶-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-羰基)-L-赖氨酸

将COT-NHS酯(2.57mmol)和L-BOC-赖氨酸(3.21mmol)在室温处搅拌2小时。如上所述处理反应混合物，并且将粗残余物通过柱色谱法纯化，得到呈浅黄色固体状的化合物4(BOC保护)(产率＝561mg，58％)。

化合物4：N⁶-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-羰基)-L-赖氨酸

按照如化合物2的合成中所述的程序，用含TFA的DCM处理来自先前步骤的化合物4(BOC保护)，得到呈灰白色固体状的化合物4(109mg，66％)。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ6.63(s,1H),6.11-5.70(m,6H),3.91(t,J＝6.2Hz,1H),3.14(t,J＝6.9Hz,2H),1.99-1.68(m,2H),1.53–1.21(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ172.34,168.63,138.43,136.00(2C),133.56,132.12,131.67,130.31,128.07,52.93,39.15,29.45,27.98,21.63。¹⁹F NMR(376MHz,D₂Oj)δ-75.64。

化合物5：2-(2-环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺基)乙基)氨基)乙烷-1-磺酸

按照化合物1的合成中所述的程序，由COT-NHS酯(1mmol)、2-[(2-氨基乙基)氨基]乙磺酸钠(238mg，1.25mmol)、Et₃N(0.07mL，0.5mmol)在DMF 7mL中制备化合物5。将反应混合物在室温处搅拌4小时，并且通过柱色谱法纯化粗残余物。获得呈淡红色胶状物的化合物5(169mg)。产率57％。¹H NMR(400MHz,氧化氘)δ6.75(s,1H),6.05(s,1H),5.95–5.74(m,5H),3.51(t,J＝5.4Hz,2H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),3.24–3.15(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ176.76,167.38,138.95,135.89,135.30,133.27,131.94,130.50,128.65,47.75,46.65,44.13,36.60。

化合物6：N-(6-氨基己基)环辛-1,3,5,7-四烯-1-基-甲酰胺

按照化合物1的合成中所述的程序制备化合物6。将COT-NHS酯(1mmol)和己二胺(1.46g，12.5mmol)在室温处在DMF(7mL)中搅拌4小时。蒸馏出溶剂，并将粗残余物通过柱色谱法纯化，得到呈橙色油状物的化合物6(195mg)。产率79％。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.97-6.89(s,1H),6.19–5.67(m,6H),3.31(br s,1H),2.79(t,J＝7.0Hz,2H),1.63-1.47(m,4H),1.46-1.30(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.73,138.11,136.34,135.66,132.69,132.47,131.30,130.81,128.60,41.94,39.80,33.21,29.50,26.72,26.46。

化合物7：2-氨基-3-[3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酰胺基]丙酸

将甲酰基环辛四烯(212mg，1.60mmol)于THF(15mL)中的溶液冷却至0℃并用氢化钠(96mg，2.41mmol)处理。将混合物在0℃处搅拌45分钟，并添加含2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(0.57mL，2.89mmol)的THF(5mL)。将反应混合物在室温处搅拌2小时，并且然后用过量的饱和氯化铵水溶液淬灭。将产物用乙酸乙酯萃取，将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将粗残余物通过柱纯化，得到呈橙色油状物的3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酸乙酯。产率：374mg(95％)。

将3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酸乙酯(383mg，16mmol)于乙醇(8mL)中的溶液用2M LiOH(水溶液)(8mL，1.6mmol)处理，并且在室温处搅拌18小时。将混合物用2M HCl(水溶液)酸化，并且用乙酸乙酯萃取产物。合并的有机物经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，得到呈棕色固体状的3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酸。产率：234mg(72％)。LC-MS(-):173(M-1)。

将含3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酸(100mg，0.49mmol)的DMF(4mL)用PyBOP(283mg，0.54mmol)和DIPEA(1mL)处理并在室温处搅拌10分钟。然后添加L 3-氨基-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙酸(120mg，0.59mmol)，并将混合物在室温处搅拌18小时。然后将反应混合物用1M盐酸酸化并用另外的水稀释。将产物用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机物用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱色谱法纯化粗残余物。在真空浓缩后，将残余物再溶解于DCM中并用TFA(1mL)处理。将反应混合物在室温处搅拌5小时，并且然后真空浓缩。将残余物用乙醚研磨，并将所得固体在真空下干燥，得到呈棕色固体状的化合物7的三氟乙酸盐。产率132mg(72％)。¹H NMR(400MHz,D₂O):δ7.14(d,J＝15.6Hz,1H),6.18(d,J＝3.9Hz,1H),6.06–5.73(m,7H),4.12(dd,J＝6.0,4.1Hz,1H),3.83(dd,J＝15.0,4.1Hz,1H),3.68(dd,J＝15.0,6.0Hz,1H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ170.34,169.92,143.61,140.09,139.22,134.02,133.05,131.89,131.69,131.22,129.19,118.93,53.69,39.24。LC-MS(-):261(M-1)。

化合物8：4-[N-(2-氨基乙基)环辛-1,3,5,7-四烯-1-甲酰胺基]丁酸

将含羧基环辛-1,3,5,7-四烯(COT-CO₂H，674mg，4.56mmol)的DMF(10mL)用PyBOP(2.6g，5.0mmol)和DIPEA(2mL)处理。将混合物在室温处搅拌10分钟，并且然后添加4-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)氨基)丁酸4-甲氧基苄酯(2.17g，5.92mmol)。将反应混合物在室温处搅拌18小时，并且然后真空浓缩。将残余物用乙酸乙酯稀释并用水和盐水洗涤。有机物经无水硫酸钠干燥，并且然后真空浓缩。将粗残余物通过柱色谱法纯化，得到呈橙色油状物的4-{N-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙基]环辛-1,3,5,7-四烯-1-甲酰胺基}-丁酸4-甲氧基苄酯。

产率：1.58g(70％)。LC-MS(-):495(M-1)。

将含4-{N-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙基]环辛-1,3,5,7-四烯-1-甲酰胺基}-丁酸4-甲氧基苄酯(1.58g，3.18mmol)的DCM(20mL)用TFA(3mL)处理并在室温处搅拌16小时。将反应混合物真空浓缩，并将残余物用乙醚研磨。倾倒溶剂并将残余物用乙醚洗涤，然后真空干燥，得到呈棕色胶状物的化合物8的三氟乙酸盐。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ6.13–5.77(m,7fH),3.62(t,J＝6.4Hz,4H),3.16(d,J＝6.3Hz,2H),2.36(t,J＝7.2Hz,2H),1.95–1.83(m,2H)。LC-MS(+):277(M+1)。

染料-COT化合物的合成

此外，例如通过使荧光化合物的活化羧基与COT化合物的氨基反应，将本文所述的COT化合物共价连接至荧光化合物，例如具有蓝光区域中的发射波长的那些荧光化合物(“蓝色染料”)。

染料5(75μmol)通过与DMF(3x3mL)共蒸发而干燥，并且然后在高真空下干燥过夜。将搅拌棒和PyBOP(75μmol)置于具有干燥的染料5的烧瓶中。在氮气下添加DMF(1.5mL)，然后添加DIPEA(30μl)用于活化反应。在搅拌15分钟后，通过HPLC和TLC检查反应进程。当完成羧基取代的染料5的活化时，添加化合物1于DMF(100mg/ml，60μmol)中的溶液，并将反应混合物在室温处搅拌四小时。使用TLC和HPLC检查反应完成，然后真空蒸馏溶剂。将残余物溶解于DCM(10ml)中并在氮气下冷却至0℃。添加三氟乙酸(4mL)，然后去除冰浴，将反应混合物搅拌，同时升温至室温。根据TLC在约4小时后完成反应。真空去除TFA和溶剂。添加50％TEAB(0.5M)/MeCN(20mL)并过滤，然后注入到制备型HPLC中用于纯化(Axia柱，24％-44％MeCN)。产率：25％。在1:1混合物H₂O-MeCN(含有1％三乙胺)中测量吸收(409nm)和荧光(464nm)最大值。

按照染料5-COT的合成中所述的类似程序，将含染料4(15mg，40μmol)的DMA(0.8mL)用PyBOP(23mg，44μmol)和DIPEA(0.2mL)处理，随后用化合物2(48μmol)处理。通过制备型HPLC(40％-70％；MeCN:0.1M TEAB)纯化反应混合物，得到染料4-COT。产率：61％。在乙醇中测量吸收光谱(最大446nm)。

将含2-(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)苯并噁唑-5-羧酸(染料4，11mg，30μmol)的无水二甲基乙酰胺(DMA，0.8mL)用PyBOP(17mg，33μmol)和DIPEA(0.2mL)处理。将反应混合物在室温处搅拌10分钟，并且然后添加2-氨基-3-[3-(环辛-1,3,5,7-四烯-1-基)丙烯酰胺基]丙酸(化合物7，15mg，36μmol)。将混合物在室温处再搅拌18小时，并且然后用0.1M TEAB淬灭。将残余物通过反相制备型HPLC纯化，得到染料4-COT-A。产率：32％。LC-MS(-):619(M-1)。

将含2-(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)苯并噁唑-5-羧酸(染料4，7.6mg，20μmol)的DMF(2mL)用TNTU(11mg，30μmol)和DIPEA(35μL，200μmol)处理。将混合物在室温处搅拌30分钟，并且然后添加含4-[N-(2-氨基乙基)环辛-1,3,5,7-四烯-1-甲酰胺基]丁酸三氟乙酸盐(化合物8，24μmol)的DMF。将反应混合物在室温处搅拌18小时，并且然后用0.1M TEAB(水溶液)淬灭。将残余物通过制备型HPLC纯化，得到染料4-COT-B。产率：64％。LC-MS(-):637(M-1)。

将含染料6(8.5mg，25μmol)的DMF(0.4mL)用PyBOP(14mg，28μmol)和DIPEA(0.2mL)以进行如上所述的羧基活化，然后用化合物2(10.4mg，30μmol)处理，并且将反应混合物在室温处搅拌18小时。将粗残余物通过反相制备型HPLC(40％-60％MeCN/0.1M TEAB)纯化，得到染料6COT。产率：65％。在水中测量吸收光谱(最大448nm)。

将含染料7(20μmol)的DMA(0.4mL)用PyBOP(11.5mg，22μmol)和DIPEA(0.1mL)处理，然后用化合物2(24μmol)处理，并且将反应混合物在室温处搅拌18小时。将粗残余物通过反相制备型HPLC(20％-40％MeCN/0.1M TEAB)纯化，得到染料7COT。产率：57％。在水中测量吸收光谱(最大437nm)。

ffN-染料-COT化合物的合成

最后，用本文所述的含COT的染料标记完全官能化的核苷酸(ffN)。以下描述合成方案和程序。

染料-COT+ffN-连接基→ffN-连接基-染料-COT

一般程序：将染料-COT化合物(1.0当量)溶解于DIPEA-DMF(1:2)混合物中，并且然后添加活化剂，例如PyBOP(1.1当量)，并将反应混合物在室温处搅拌10分钟。添加ffN-连接子(1.2当量)，并将反应混合物在室温处搅拌18小时。将该反应混合物用0.1M TEAB溶液淬灭，并且将产物分离并通过反相制备型HPLC纯化。

通过与DMF共蒸发三次来干燥染料5-COT。将干燥的染料5-COT(10μmol)溶解于DMA(0.5mL)中。添加O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU，15μmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，30μmol)。将反应混合物在室温处在氮气下搅拌15分钟。通过HPLC和TLC检查活化反应进程。

将三磷酸-脱氧C-sPA(dCTP-sPA)(12μmol，20mM溶液于H₂O中)真空干燥，然后重新溶解于H₂O(0.1ml)中。将活化的染料5-COT转移到含有dCTP-sPA的烧瓶中。通过HPLC和TLC监测反应进程。在反应完成后，将0.1M TEAB(约2mL)添加到反应烧瓶中。使用Sephadex柱纯化粗反应混合物。将级分合并并真空干燥，并且通过制备型HPLC进一步纯化。将所有相关级分合并并真空干燥，再溶解于10mM TRIS pH 8缓冲液中以制备0.1mM的ffC-sPA-染料5-COT溶液。通过分析性HPLC检查纯度并通过LCMS确认质量。产率48％。在通用扫描混合物(USM)中测量吸收(最大443nm)和荧光光谱(最大484nm)。

按照上文所述的类似程序，将含染料4-COT(24μmol)的DMA(1mL)用TSTU(7.8mg，26μmol)和DIPEA(36μL，200μmol)处理，然后用含dCTP-sPA(20μmol)的0.1M TEAB(100μL)和Et₃N(10μL)处理并在室温处搅拌8小时。使用反相制备型HPLC(YMC柱，10mL/min，38％-58％MeCN/0.1M TEAB)纯化粗残余物，得到ffC-sPA-染料4-COT。产率：57％。在USM中测量吸收(最大460nm)和荧光光谱(最大505nm)。

ffC-sPA-染料4-COT-A和ffA-sPA-染料4-COT-B也按照本文所述的类似程序制备。ffC-sPA-染料4-COT-A：最大吸收455nm(在USM中)；最大荧光503nm(在USM中，激发450nm)。ffA-sPA-染料4-COT-B：最大吸收455nm(在USM中)；最大荧光502nm(在USM中，激发450nm)。

按照上文所述的类似程序，将含染料-6-COT(16μmol)的DMA(0.5mL)用TSTU(5.3mg，17.6μmol)和DIPEA(17μL，100μmol)处理，然后用含dCTP-sPA(10μmol)的0.1M TEAB(50μL)和Et₃N(10μL)处理并在室温处搅拌4小时。使用反相制备型HPLC(YMC柱，10mL/min，45％-65％MeCN/0.1M TEAB)纯化粗残余物，得到ffC-sPA-染料6-COT。产率40％。在USM中测量吸收(最大455nm)和荧光光谱(最大493nm)。

将含染料-7-COT(11.3μmol)的DMA(0.5mL)用TSTU(3.8mg，12.4μmol)和DIPEA(17μL，100μmol)处理，然后用含dCTP-sPA(11.3μmol)的0.1M TEAB(50μL)和Et₃N(10μL)处理并在室温处搅拌4小时。使用反相制备型HPLC纯化粗残余物，得到ffC-sPA-染料7-COT。产率：40％。在USM中测量吸收(最大448nm)和荧光光谱(最大488nm)。

在含有10mM环辛四烯和0.25mM槲皮素的检测溶液(“COT混合物”)中测试ffC-sPA-染料5及其相应的含有COT部分的染料(ffC-sPA-染料5-COT)相对于对照检测溶液(USM)的光漂白速率。测量归一化的荧光强度(1μmol，在450nm处激发，PMT 600V)和蓝色LED光照射30分钟后剩余荧光强度的百分比，并且结果分别示于图4A和图4B中。图4A指示蓝色荧光强度通过共价键合的COT部分猝灭60％。然而，当在溶液中用蓝色LED光照射时，光稳定性显著改善。在照射30分钟后，ffC-sPA-染料5中仅留下10％的荧光信号，而ffC-sPA-染料5-COT中仅留下63％的信号(图4B)。

在四个不同强度(1倍、2倍、5倍或10倍)的蓝色/绿色光暴露下运行150个循环后，在

平台上运行的测序还显示出与ffC-sPA-染料5(图5A)相比，ffC-sPA-染料5-COT的信号衰减速率的显著改善(图5B)。结果表明，COT部分已减少或防止由光照射引起的DNA损伤。

如上所述，由化合物2制备另外的COT修饰的蓝色染料染料4-COT、染料6-COT和染料7-COT。对于每种COT修饰的染料，与完全官能化的核苷酸(ffN)的连接点是通过染料的羧基基团(-COOH)。图6A示出标准检测溶液(USM)中ffC-sPA-染料6-COT、ffC-sPA-染料7-COT和ffC-sPA-染料4-COT(染料浓度1μmol，在450nm处激发，PMT 600V)与不含COT的等效物相比的归一化荧光强度。图6A示出COT部分对染料的荧光以及猝灭效应的染料结构依赖性的影响。图6B示出测试为在蓝色LED光照射30分钟后染料的剩余荧光强度百分比的在所有三种测试的蓝色染料中观察到的COT部分的光保护作用。

此外，在

平台上使用蓝光照射观察到类似的猝灭和染料光稳定性。在图7中，散点图中x轴的黑云(右下象限)指示标记的C-核苷酸的荧光信号的强度。通过比较在1倍和10倍强度下在蓝光暴露下的强度变化来测量染料光漂白，并且结果总结在下表中。

如图8所示，在COT修饰的染料(ffC-sPA-染料4-COT和ffc-sPA-染料7-COT)中，信号衰减率(第150个测序循环与第一循环相比的信号强度％)也得到改善，这表明在测序期间COT部分对由蓝色LED/激光器诱导的DNA损伤的光保护作用。

总之，COT部分与蓝色染料的共价连接已经证明了对光漂白和DNA损伤两者的保护作用。

Claims

1.一种荧光化合物，所述荧光化合物包含光保护环辛四烯部分，所述光保护环辛四烯部分包含式(I)的结构：

其中：

R¹和R²中的每一者各自独立地选自由以下项组成的组：H、羟基、卤素、叠氮基、硫醇、硝基、氰基、任选地取代的氨基、羧基、-C(O)OR⁵、-C(O)NR⁶R⁷、任选地取代的C_1-6烷基、任选地取代的C_1-6烷氧基、任选地取代的C_1-6卤代烷基、任选地取代的C_1-6卤代烷氧基、任选地取代的C_2-6烯基、任选地取代的C_2-6炔基、任选地取代的C_6-10芳基、任选地取代的C_7-14芳烷基、任选地取代的C_3-7碳环基、任选地取代的5至10元杂芳基和任选地取代的3至10元杂环基；

在

m为介于0和10之间的整数；

前提条件是所述荧光化合物不是花青染料。

2.根据权利要求1所述的荧光化合物，其中Z不存在。

3.根据权利要求1所述的荧光化合物，其中Z为C_2-6亚烯基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的荧光化合物，其中X为-C(＝O)-或-C(＝O)NR⁴-。

5.根据权利要求4所述的荧光化合物，其中R⁴为H。

6.根据权利要求4所述的荧光化合物，其中R⁴为被氨基、羧基、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷取代的C_1-6烷基。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的荧光化合物，其中Y为-C(＝O)O-、-NR³-或–S(O)₂-。

8.根据权利要求7所述的荧光化合物，其中Y为-NR³-并且R³为H。

9.根据权利要求7所述的荧光化合物，其中Y为-NR³-并且R³为被氨基、羧基、-SO₃H、-SO₃ˉ、–O-SO₃ˉ、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷取代的C_1-6烷基。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的荧光化合物，其中所述光保护部分包含式(Ia)或(Id)的结构：

11.根据权利要求1至9中任一项所述的荧光化合物，其中所述光保护部分包含式(Ib)或(Ic)的结构：

12.根据权利要求1至11中任一项所述的荧光化合物，其中R¹和R²中的至少一者为氢。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的荧光化合物，其中R¹和R²均为氢。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的荧光化合物，其中R¹为H并且R²为氨基或羧基。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的荧光化合物，其中在

中R¹和R²所连接的至少一个碳原子被O、S或N取代。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的荧光化合物，其中m为1、2、3、4、5或6。

17.根据权利要求1至11中任一项所述的荧光化合物，其中m为2、3、4、5或6，并且R¹和R²中的每一者为氢。

18.根据权利要求1至11中任一项所述的荧光化合物，其中m为2、3、4、5或6，其中R¹和R²中的每一者在

中为氢；并且其中在其余的

中，R¹为H，并且R²为氨基、羧基、-C(O)OR⁵或-C(O)NR⁶R⁷。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的荧光化合物，其中R⁵为C_1-6烷基或任选地取代的苯基。

20.根据权利要求1至18中任一项所述的荧光化合物，其中R⁶和R⁷中的一者或两者为H。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的荧光化合物，其中R⁶和R⁷中的一者或两者为被羧基、氨基、-SO₃H或-SO₃ˉ取代的C_1-6烷基。

22.根据权利要求1所述的荧光化合物，其中所述光保护部分包含以下结构：

23.根据权利要求1至22中任一项所述的荧光化合物，其中所述荧光化合物能够由波长介于约350nm和约500nm之间或介于约420nm和约480nm之间的光源激发。

24.根据权利要求23所述的荧光化合物，其中所述荧光化合物能够由波长介于约450nm和约460nm之间的光源激发。

25.一种核苷或核苷酸，所述核苷或核苷酸用根据权利要求1至24中任一项所述的荧光化合物标记。

26.一种用于防止或减少荧光染料的光漂白的组合物，所述组合物包含环辛四烯或其任选地取代的衍生物，以及选自由以下项组成的组的一种或多种抗氧化剂：黄杉素、槲皮素、烯丙基硫脲、二甲基硫脲、水飞蓟素、trolox，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物包含环辛四烯和槲皮素，以及它们的任选地取代的衍生物和组合。

28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中所述荧光染料能够由波长介于约350nm和约500nm之间或介于约420nm和约480nm之间的光源激发。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述荧光染料能够由波长介于约450nm和约460nm之间的光源激发。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈水性溶液形式。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中环辛四烯或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.1mM至约100mM。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中环辛四烯或所述任选地取代的衍生物的浓度为约1mM至约20mM。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中环辛四烯或所述任选地取代的衍生物的浓度为约10mM。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的组合物，其中槲皮素或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.01mM至约10mM。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中槲皮素或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.05mM至约2mM。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中槲皮素或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.25mM。

37.根据权利要求26至36中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种荧光染料。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中荧光染料共价连接至核苷或核苷酸。

39.一种保护荧光染料免于光漂白的方法，所述方法包括将所述荧光染料共价连接至光保护环辛四烯部分，所述光保护环辛四烯部分包含根据权利要求1至24中任一项所述的式(I)的结构。

40.一种保护荧光染料免于光漂白的方法，所述方法包括使所述荧光染料与根据权利要求26至36中任一项所述的组合物接触。

41.一种保护核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，所述方法包括将所述核苷或核苷酸共价连接至根据权利要求1至24中任一项所述的荧光化合物。

42.一种保护标记的核苷或核苷酸免于光诱导降解的方法，所述方法包括使所述标记的核苷或核苷酸与根据权利要求26至36中任一项所述的组合物接触。

43.一种在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，所述方法包括：

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一缓冲液组合物包含环辛四烯和槲皮素，或它们的任选地取代的衍生物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中环辛四烯或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.1mM至约100mM、约1mM至约20mM、或约10mM。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中槲皮素或所述任选地取代的衍生物的浓度为约0.01mM至约10mM、约0.05mM至约2mM、或约0.25mM。

47.一种在核酸测序反应期间减少或防止核酸的光诱导降解的方法，所述方法包括：

(a)将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中，其中所述核苷酸包含3'封端基团并且用根据权利要求1至24中任一项所述的荧光化合物标记；

48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液包括所述第一缓冲溶液。

49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，所述方法还包括重复步骤(a)至(d)，直至确定所述模板多核苷酸链的所述部分的序列。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述步骤(a)至(d)重复至少50次。

51.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述第一缓冲液组合物的存在下用光源照射掺入所述核苷酸的所述复制多核苷酸链。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述光源具有约400nm至约500nm的波长。

53.根据权利要求43至52中任一项所述的方法，其中从掺入到所述复制多核苷酸链中的所述核苷酸中去除所述标记和所述3'封端基团包括使所述复制链与膦接触。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述膦为三(羟甲基)膦、三(2-羟乙基)膦或三(羟丙基)膦。

55.根据权利要求43至54中任一项所述的方法，其中所述核苷酸为核苷酸三磷酸。

56.根据权利要求43至55中任一项所述的方法，其中所述第一缓冲液组合物包含抗坏血酸或其盐。

57.根据权利要求43至54中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸链连接到固体载体。

58.根据权利要求55所述的方法，其中所述模板多核苷酸连接到流通池。

59.一种与测序设备一起使用的试剂盒，所述试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中所述多种组合物包含：

用于将3'封端的、标记的核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂；

包含根据权利要求26至36中任一项所述的组合物的缓冲液组合物；

用于从掺入到所述复制链中的所述封端的、标记的核苷酸中化学去除标记和封端部分的试剂；以及

洗涤溶液。

60.一种与测序设备一起使用的试剂盒，所述试剂盒包括含有多种组合物的多个腔室，其中每个腔室含有单一组合物，其中所述多种组合物包含：

用于将核苷酸掺入到与模板多核苷酸链的至少一部分互补的复制多核苷酸链中的试剂，其中所述核苷酸包含3'封端基团并且用根据权利要求1至24中任一项所述的荧光化合物标记；

包含至少一种抗氧化剂的缓冲液组合物；

洗涤溶液。