KR20230044364A - 치환된 쿠마린 염료 및 형광 표지로서의 용도 - Google Patents

치환된 쿠마린 염료 및 형광 표지로서의 용도 Download PDF

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니앨 하이네스
나타샤 크레이크
샤오린 우
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Abstract

본 출원은 치환된 쿠마린 유도체 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 이들 화합물은 핵산 서열분석 응용에서 뉴클레오티드를 위한 형광 표지로서 사용될 수 있다.

Description

치환된 쿠마린 염료 및 형광 표지로서의 용도
본 발명은 치환된 쿠마린 유도체 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 화합물은 핵산 서열분석 응용에서 뉴클레오티드를 위한 형광 표지로서 사용될 수 있다.
형광 표지를 갖는 핵산의 비방사성 검출은 분자 생물학에서 중요한 기술이다. 이전에 재조합 DNA 기술에 사용된 많은 절차는, 예를 들어 32P로 방사성 표지된 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 사용을 이용한다. 방사성 화합물은 핵산 및 다른 관심 분자의 민감한 검출을 가능하게 한다. 그러나, 방사성 동위원소의 사용에 있어서는 그들의 비용, 제한된 저장 수명, 불충분한 감도, 및 더 중요하게는 안전성 고려사항과 같은 심각한 제한이 있다. 방사성 표지에 대한 필요성을 없애게 되면, 안전 위험 및 예를 들어 시약 처분과 관련된 환경 영향 및 비용 모두를 감소시킨다. 비방사성 형광 검출에 적합한 방법은, 비제한적인 예로서, 자동화 DNA 서열분석, 혼성화 방법, 폴리머라제-연쇄-반응 산물의 실시간 검출 및 면역검정을 포함한다.
많은 응용의 경우, 복수의 공간적으로 중첩된 분석물의 독립적인 검출을 달성하기 위해 다수의 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 표지를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 멀티플렉스 방법에서는, 실험 프로토콜을 간소화하고 응용-특이적 시약 키트의 생성을 용이하게 하기 위해 반응 용기의 수를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 다색 자동화 DNA 서열분석 시스템에서, 멀티플렉스 형광 검출은 단일 전기영동 레인(lane)에서의 다수의 뉴클레오티드 염기의 분석을 가능하게 하며, 그럼으로써 단색 방법에 비해 처리량을 증가시키고, 레인간 전기영동 이동도 변동과 관련된 불확정성을 감소시킨다.
그러나, 멀티플렉스 형광 검출은 문제가 될 수 있으며, 적절한 형광 표지의 선택을 제한하는 다수의 중요한 인자가 있다. 첫째, 주어진 응용에서 실질적으로 해상되는(resolved) 흡수 및 방출 스펙트럼을 갖는 염료 화합물을 찾는 것이 어려울 수 있다. 게다가, 몇몇 형광 염료들이 함께 사용될 때, 동시 여기에 의해 구별가능한 스펙트럼 영역들에서 형광 신호들을 생성하는 것이 복잡할 수 있는데, 그 이유는, 염료들의 흡수 밴드들이 통상 폭넓게 떨어져 있으며, 이에 따라 심지어 2개의 염료에 대해서조차도 비견되는 형광 여기 효율을 달성하는 것이 어렵다. 많은 여기 방법이 레이저와 같은 고전력 광원을 사용하므로, 염료는 그러한 여기를 견디기 위해 충분한 광안정성을 가져야 한다. 분자 생물학 방법에 대해 특히 중요한 마지막 고려사항은 형광 염료가, 예를 들어 DNA 합성 용매 및 시약, 완충액, 폴리머라제 효소, 및 리가제 효소와 같은 시약 화학물질과 상용성이 있어야 한다는 것이다.
서열분석 기술이 진보함에 따라, 상기 제약 조건을 모두 충족시키고 특히 고상 서열분석 등과 같은 고처리량 분자 방법에 적합한 추가의 형광 염료 화합물, 이들의 핵산 접합체, 및 다중 염료 세트에 대한 필요성이 발전하였다.
적합한 형광 강도, 형상, 및 형광 밴드의 파장 최대치와 같은 개선된 형광 특성을 갖는 형광 염료 분자는 핵산 서열분석의 속도 및 정확도를 개선할 수 있다. 수계 생물학적 완충액 중에서 그리고 더 높은 온도에서 측정이 이루어질 때 강한 형광 신호가 특히 중요한데, 그 이유는 대부분의 염료의 형광 강도가 그러한 조건 하에서 상당히 더 낮기 때문이다. 더욱이, 염료가 부착된 염기의 성질이 또한 형광 최대치, 형광 강도, 및 다른 스펙트럼 염료 특성에 영향을 준다. 핵염기와 형광 염료 사이의 서열-특이적 상호작용은 형광 염료의 특수 설계에 의해 조정될 수 있다. 형광 염료의 구조의 최적화는 뉴클레오티드 도입의 효율을 개선하고, 서열분석 오류의 수준을 감소시키고, 핵산 서열분석에서의 시약의 사용을 감소시키고, 이에 따라 핵산 서열분석의 비용을 감소시킨다.
일부 광학적 및 기술적 개발은 이미 이미지 품질을 크게 개선해 왔지만, 궁극적으로 불량한 광학 해상도에 의해 제한되었다. 일반적으로, 광학 현미경법의 광학 해상도는 사용되는 광의 파장의 대략 절반에서 이격된 물체들로 제한된다. 그러면, 실제적인 관점에서, 단지 매우 멀리 떨어져서(적어도 200 내지 350 nm) 놓여 있는 물체들만이 광학 현미경법에 의해 해상될 수 있다. 이미지 해상도를 개선하고 표면적 단위당 해상가능한 물체들의 수를 증가시키는 한 가지 방법은 더 짧은 파장의 여기 광을 사용하는 것이다. 예를 들어, 동일한 광학계를 사용하여 광 파장이 Δλ가 약 100 nm만큼 단축되는 경우, 해상도는 더 우수할 것이고(약 Δ 50 nm/(약 15%)), 덜 왜곡된 이미지가 기록될 것이고, 인식가능한 영역 상의 물체들의 밀도는 약 35%로 증가될 것이다.
소정의 핵산 서열분석 방법은 레이저 광을 사용하여 염료-표지된 뉴클레오티드를 여기하고 검출한다. 이들 기기는, 660 nm에서 여기가능한 적절한 염료와 함께, 적색 레이저와 같은 더 긴 파장의 광을 사용한다. 유용한 해상도를 유지하면서 더 조밀하게 패킹된 핵산 서열분석 클러스터들을 검출하기 위하여, 더 짧은 파장의 청색 광원(450 내지 460 nm)이 사용될 수 있다. 이 경우에, 광학 해상도는 더 긴 파장의 적색 형광 염료의 방출 파장에 의해서가 아니라, 오히려, 그 다음으로 가장 긴 파장의 광원에 의해, 예를 들어 532 nm의 "녹색 레이저"에 의해 여기가능한 염료의 방출에 의해 제한될 것이다. 따라서, 서열분석 응용에서 형광 검출에 사용하기 위한 청색 염료 표지가 필요하다.
예를 들어, 청색-염료 화학 및 관련 레이저 기술이 DVD 및 블루-레이 디스크를 위한 염료를 생성하도록 개선되었지만, 이러한 화합물은 바이오-표지화에 적합하지 않고 바이오마커로서 사용될 수 없다. 또한, 소정 청색 염료는 수성 환경에서 장기간 동안 안정하지 않다. 예를 들어, 염기성 조건에서 이러한 염료는 친핵체에 의해 쉽게 공격 받을 수 있으므로, 염료의 교란 또는 열화를 초래할 수 있다.
불행하게도, 뉴클레오티드 표지화를 위한 강한 형광을 갖는 적절한 구매가능한 청색 염료는 여전히 매우 드물다. 청색 광 여기(예를 들어, 청색 LED 또는 레이저, 예를 들어, 약 450 nm 내지 약 460 nm) 하에서 강한 형광을 갖는 뉴클레오티드 표지화에 적합한 개선된 화학적 안정성을 갖는 형광 화합물이 본 명세서에 기재된다.
본 발명은 치환된 쿠마린 유도체에 관한 것이다. 이들 화합물은 형광 표지로서 유용하며, 특히 핵산 서열분석 응용에서 뉴클레오티드 표지화에 유용할 수 있다. 일부 태양에서, 이들 염료는 단파장 광, 최적으로는 450 내지 460 nm의 파장을 흡수하며, 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 파장 여기 광원이 사용되는 상황에서 특히 유리하다. 청색 파장 여기는 방출의 더 짧은 파장으로 인해 단위 면적당 더 높은 밀도의 특징부의 검출 및 해상도를 가능하게 한다. 그러한 염료들이 뉴클레오티드와 접합하여 사용될 때, 핵산 서열분석 방법 동안 획득된 서열분석 리드의 길이, 강도, 정확도, 및 품질에 있어서의 개선을 확인할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태는 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 또는 메소머 형태에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
(상기 식에서, R1은 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록시, 설포, 설포네이트, 설페이트, N-설폰아미도, 및 S-설폰아미도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 각각 선택적으로 치환된
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
이고;
R2는 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 또는 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 시아노, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, 선택적으로 치환된 아미노, 및 하이드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된 페닐이고;
각각의 R3, R4 및 R7은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
각각의 R5 및 R6은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬이거나, 또는 R5와 R6은 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
X는 O, S, 또는 NRa이고;
Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
Rd는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐임). 일부 실시 형태에서, R5 또는 R6 중 적어도 하나, 또는 R5와 R6 및 그들이 부착되어 있는 질소 원자로부터 형성된 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, R1은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함한다.
본 발명의 일부 추가적인 실시 형태는 하기 화학식 II 또는 화학식 II'의 화합물, 또는 이의 염 또는 메소머 형태에 관한 것이다:
[화학식 II]
Figure pct00004
[화학식 II']
Figure pct00005
(상기 식에서, X는 S, O, 또는 NRa이고;
Y는 O 또는 NH이고;
각각의 R1, R2, R3 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
R4는 -NRbRc, 할로, -ORd 또는 -OS(O)2Rd이고;
R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, N-설폰아미도, 설포닐, S-설폰아미도, 하이드록시, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 C3-C8 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이거나; 또는 화학식 II에서 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고;
Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
각각의 Rd는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐임). 일부 실시 형태에서, R4는 -NRbRc이고 화합물은 또한 하기 화학식 IIa 또는 화학식 IIa', 또는 이의 염 또는 메소머 형태로 표시된다:
[화학식 IIa]
Figure pct00006
[화학식 IIa']
Figure pct00007
.
화학식 II, 화학식 II', 화학식 IIa 또는 화학식 IIa'의 화합물의 일부 실시 형태에서, R6 및 R7 중 적어도 하나는 카르복실을 포함한다. 화학식 II 또는 화학식 IIa의 화합물의 일부 실시 형태에서, R6과 R7 및 이들이 부착되어 있는 원자는 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고, C5-C8 카르보사이클릴 또는 5원 내지 8원 헤테로사이클릴은 카르복실을 포함하거나 이로 치환된다. 화학식 IIa 또는 화학식 IIa'의 일부 실시 형태에서, Rb 및 Rc 중 적어도 하나는 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함한다.
일부 태양에서, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 리간드, 입자, 세포, 반고체 표면(예컨대, 겔), 또는 고체 표면과 같은 기질 모이어티(substrate moiety)에 표지되거나 접합된다. 표지화 또는 접합은 카르복실 기(-CO2H)를 통해 수행될 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 모이어티(예컨대 뉴클레오티드) 또는 그에 결합된 링커 상의 아미노 또는 하이드록실 기와 반응하여 아미드 또는 에스테를 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 다른 태양은, 예를 들어, 기질 모이어티에 대한 공유 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함하는 염료 화합물에 관한 것이다. 연결은 임의의 R 기를 포함하여, 염료의 임의의 위치에서 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 연결은 화학식 I의 R1을 통해 또는 R5 또는 R6을 통해 수행될 수 있다. 일부 다른 실시 형태에서, 연결은 화학식 II 또는 화학식 II'의 R6 또는 R7을 통해 또는 화학식 IIa 또는 화학식 IIa'의 Rb 또는 Rc를 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 추가의 태양은 하기 화학식에 의해 정의되는 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 화합물을 제공한다:
N-L-Dye
상기 식에서, N은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드이고;
L은 선택적인 링커 모이어티이고;
Dye는 본 발명에 따른 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 II'의 형광 화합물의 모이어티이다.
본 발명의 일부 추가 태양은 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 II'의 화합물로 표지된 모이어티, 특히 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 일부 추가 태양은 다양한 면역학적 검정, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 표지화, 또는 합성에 의한 DNA 서열분석에 사용될 수 있는 염료 화합물(유리되거나 표지된 형태)을 포함하는 키트에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 자동화 기기 플랫폼에서 합성에 의한 서열분석의 사이클에 특히 적합한 염료 "세트"를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 태양에서, 키트는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드이다.
본 발명의 추가의 태양은 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법이며, 이 방법은
(a) 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드(예컨대, A, G, C 및 T)와 접촉시키는 단계로서, 상기 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드이고, 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인, 상기 단계;
(b) 표지된 뉴클레오티드를 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계; 및
(c) 하나 이상의 형광 측정을 수행하여 도입된 뉴클레오티드의 정체(identity)를 결정하는 단계를 포함한다.
도 1은 37℃에서 완충액 용액에서 염료 I-1 또는 염료 I-2로 표지된 동일한 ffC와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 C 뉴클레오티드(ffC)의 형광 강도를 예시하는 선 차트이다.
도 2는 37℃에서 완충액 용액에서 염료 I-3 또는 염료 I-4로 표지된 동일한 ffC와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 C 뉴클레오티드(ffC)의 형광 강도를 예시하는 선 차트이다.
도 3a는 460 nm에서 여기될 때 완충액 용액에서 염료 II-1 또는 염료 II-8로 표지된 동일한 ffA와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 A 뉴클레오티드(ffA)의 방출 스펙트럼을 예시한다.
도 3b는 460 nm에서 여기될 때 완충액 용액에서 염료 II-1 및 염료 II-in으로 표지된 동일한 ffC와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 C 뉴클레오티드(ffC)의 방출 스펙트럼을 예시한다.
도 4a 내지 도 4c는 Miseq®에 사용된 표준 염료 세트로 표지된 ffN을 갖는 서열분석 메트릭(metric)과 비교하여, Illumina의 Miseq® 서열분석 플랫폼에 사용된 ffA 및 ffC가 염료 I-3a 또는 염료 I-4a로 표지되는 경우의 서열분석 메트릭(% 페이징, % 오류율, % 잔류 신호)을 예시한다.
도 5a 내지 도 5c는 Miseq®에 사용된 표준 염료 세트로 표지된 ffN을 갖는 서열분석 메트릭과 비교하여, Miseq® 서열분석 플랫폼에 사용된 ffC가 염료 II-1 또는 염료 II-8로 표지되는 경우의 서열분석 메트릭(% 페이징, % 오류율, % 잔류 신호)을 예시한다.
도 6a 및 도 6b는 염료 I-4a로 표지된 ffA 및 ffC의 유용성을 예시하는 산포도이며, 1 선량의 광 노출 후 ffC 및 ffT 뉴클레오티드로부터의 신호의 비(C/T @ 1X) 및 10 선량의 노출 후 적절한 신호의 비(C/T @ 10X/1X)가 제시된다.
도 6c 및 도 6d는 염료 I-3a로 표지된 ffA 및 ffC의 유용성을 예시하는 산포도이며, 1 선량의 광 노출 후 ffC 및 ffT 뉴클레오티드로부터의 신호의 비(C/T @ 1X) 및 10 선량의 노출 후 적절한 신호의 비(C/T @ 10X/1X)가 제시된다.
도 6e 및 도 6f는 염료 II-1로 표지된 ffA 및 ffC의 유용성을 예시하는 산포도이며, 1 선량의 광 노출 후 ffC 및 ffT 뉴클레오티드로부터의 신호의 비(C/T @ 1X) 및 10 선량의 노출 후 적절한 신호의 비(C/T @ 10X/1X)가 제시된다.
도 6g 및 도 6h는 염료 II-8로 표지된 ffA 및 ffC의 유용성을 예시하는 산포도이며, 1 선량의 광 노출 후 ffC 및 ffT 뉴클레오티드로부터의 신호의 비(C/T @ 1X) 및 10 선량의 노출 후 적절한 신호의 비(C/T @ 10X/1X)가 제시된다.
본 발명은 형광 검출 방법 및 서열분석 응용에 특히 적합한 치환된 쿠마린 화합물을 제공한다.
정의
본 명세서에 사용되는 섹션 제목은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며, 설명된 발명 요지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 명시적으로 그리고 명백하게 하나의 지시 대상으로 제한되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 교시의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에 기재된 다양한 실시 형태에 대해 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 실시 형태는 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에서 다른 수정 및 변경을 포함하는 것으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일반적인 유기적 약어는 하기와 같이 정의된다:
℃ 섭씨 온도
dATP 데옥시아데노신 트라이포스페이트
dCTP 데옥시시티딘 트라이포스페이트
dGTP 데옥시구아노신 트라이포스페이트
dTTP 데옥시티미딘 트라이포스페이트
ddNTP 다이데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트
ffN 완전히 작용화된 뉴클레오티드
h 시간
RT 실온
SBS 합성에 의한 서열분석
SM 출발 물질
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상이한 프로브 분자들은 상대적 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록, 하나 이상의 기재에 부착된 상이한 프로브 분자들의 집단을 지칭한다. 어레이는 기재 상의 상이한 어드레스가능한 위치에 각각 위치된 상이한 프로브 분자들을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이는, 각각 상이한 프로브 분자를 갖는 별개의 기재들을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 프로브 분자들은 기재들이 부착된 표면 상의 기재들의 위치에 따라 또는 액체 중에서의 기재들의 위치에 따라 확인될 수 있다. 별도의 기재가 표면 상에 위치하는 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어, 미국 특허 제6,355,431 B1호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0102578호 및 국제 특허 공개 WO 00/63437호에 기재된 바와 같이 웰 내에 비드를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류기(FACS)와 같은 미세유체 장치를 사용하여 액체 어레이에서 비드를 구별하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 포맷이 예를 들어 미국 특허 제6,524,793호에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 어레이의 추가의 예에는, 제한 없이, 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 국제 특허 공개 WO 93/17126호; WO 95/11995호; WO 95/35505호; 유럽 특허 EP 742 287호; 및 EP 799 897호에 기재된 것들이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공유적으로 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유적으로 부착된 중합체 코팅은, 다른 수단, 예를 들어 접착 또는 정전기 상호작용을 통한 표면에 대한 부착과 비교하여, 기재의 작용화된 표면과 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유적으로 부착된 중합체는 또한 공유 부착 이외의 수단을 통해 결합될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 원소 주기율표의 7열의 방사선-안정성(radio-stable) 원자, 예를 들어 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 중 임의의 하나를 의미하며, 불소 및 염소가 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Ca 내지 Cb"(여기서, "a" 및 "b"는 정수임)는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기 내의 탄소 원자의 개수, 또는 사이클로알킬 또는 아릴 기의 고리 원자의 개수를 지칭한다. 즉, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬의 고리, 및 아릴의 고리는 "a" 내지 "b"개(종점 포함)의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 예를 들어, "C1 내지 C4 알킬" 기는 1 내지 4개의 탄소를 갖는 모든 알킬 기, 즉 CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- 및 (CH3)3C-를 지칭하고; C3 내지 C4 사이클로알킬 기는 3개 또는 4개의 탄소 원자를 갖는 모든 사이클로알킬 기, 즉 사이클로프로필 및 사이클로부틸을 지칭한다. 유사하게, "4원 내지 6원 헤테로사이클릴" 기는 4 내지 6개의 총 고리 원자를 갖는 모든 헤테로사이클릴 기, 예를 들어 아제티딘, 옥세탄, 옥사졸린, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 등을 지칭한다. "a" 및 "b"가 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 기에 관하여 지정되어 있지 않다면, 이들 정의에 기재된 가장 넓은 범위가 가정되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "C1-C6"은 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6, 및 임의의 이들 2개의 숫자에 의해 정의되는 범위를 포함한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬, C2-C6 알킬, C1-C3 알킬 등을 포함한다. 유사하게, C2-C6 알케닐은 C2, C3, C4, C5 및 C6 알케닐, C2-C5 알케닐, C3-C4 알케닐 등을 포함하고; C2-C6 알키닐은 C2, C3, C4, C5 및 C6 알키닐, C2-C5 알키닐, C3-C4 알키닐 등을 포함한다. C3-C8 사이클로알킬은 각각 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 탄소 원자, 또는 임의의 이들 2개의 숫자에 의해 정의되는 범위의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 고리, 예컨대 C3-C7 사이클로알킬 또는 C5-C6 사이클로알킬을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전 포화된(즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는) 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(본 명세서에 나타날 때마다, "1 내지 20"과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭하며; 예를 들어, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 종점을 포함하여 최대 20개의 탄소 원자로 이루어질 수 있음을 의미하지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우도 포함한다). 알킬 기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알킬일 수 있다. 알킬 기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬" 또는 "C1-C6 알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함하지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알콕시"는 화학식 -OR (여기서, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬임), 예컨대 "C1-9 알콕시" 또는 "C1-C9 알콕시"이며, 이에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(아이소프로폭시), n-부톡시, 아이소-부톡시, sec-부톡시, 및 tert-부톡시 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알케닐"의 경우를 또한 포함한다. 알케닐 기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 단지 예로서, "C2-C6 알케닐" 또는 "C2-6 알케닐"은 알케닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 존재함을 나타내며, 즉, 알케닐 사슬은 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-다이에닐, 부타-1,2-다이에닐, 및 부타-1,2-다이엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐 기에는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 및 헥세닐 등이 포함되지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알키닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알키닐"의 경우를 또한 포함한다. 알키닐 기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알키닐일 수 있다. 알키닐 기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐일 수 있다. 단지 예로서, "C2-6 알키닐" 또는 "C2-C6 알케닐"은 알키닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알키닐 사슬은 에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일, 및 2-부티닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알키닐 기에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 및 헥시닐 등이 포함되지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로알킬"은 사슬 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 헤테로알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로알킬"의 경우를 또한 포함한다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 "C1-6 헤테로알킬", "C1-C6 헤테로알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로알킬 기는 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 단지 예로서, "C4-6헤테로알킬" 또는 "C4-C6 헤테로알킬"은 헤테로알킬 사슬 내에 4 내지 6개의 탄소 원자, 그리고 추가적으로 사슬의 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자가 존재함을 나타낸다.
용어 "방향족"은 컨쥬게이트된 파이 전자 시스템을 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하며, 카르보사이클릭 방향족 기(예를 들어, 페닐) 및 헤테로사이클릭 방향족 기(예를 들어, 피리딘) 둘 모두를 포함한다. 이 용어는, 전체 고리 시스템이 방향족이라면, 모노사이클릭 또는 융합-고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 원자쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격 내에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 아릴 기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "아릴"의 경우를 또한 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아릴 기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 기는 "C6-10 아릴", "C6 또는 C10 아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 아릴 기의 예에는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"아르알킬" 또는 "아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 아릴 기로서, 이는, 예를 들어 "C7-14 아르알킬" 등이며, 이에는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 나프틸알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기(즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 헤테로아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴 기는 5 내지 18개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 경우를 또한 포함한다. 일부 실시 형태에서, 헤테로아릴 기는 5 내지 10개의 고리 구성원 또는 5 내지 7개의 고리 구성원을 갖는다. 헤테로아릴 기는 "5원 내지 7원 헤테로아릴", "5원 내지 10원 헤테로아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예에는 푸릴, 티에닐, 프탈라지닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 아이소옥사졸릴, 아이소티아졸릴, 트라이아졸릴, 티아다이아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트라이아지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 및 벤조티에닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 헤테로아릴 기이다. 예에는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 아이소옥사졸릴알킬, 및 이미다졸릴알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기(즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "카르보사이클릴"은 고리 시스템 골격 내에 단지 탄소 원자만을 함유하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카르보사이클릴이 고리 시스템인 경우에는, 2개 이상의 고리가 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카르보사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카르보사이클릴에는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐이 포함된다. 카르보사이클릴 기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "카르보사이클릴"의 경우를 또한 포함한다. 카르보사이클릴 기는 또한 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 카르보사이클릴일 수 있다. 카르보사이클릴 기는 또한 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 카르보사이클릴일 수 있다. 카르보사이클릴 기는 "C3-6 카르보사이클릴", "C3-C6 카르보사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 카르보사이클릴 고리의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 2,3-다이하이드로-인덴, 바이사이클[2.2.2]옥타닐, 아다만틸, 및 스피로 [4.4]노나닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전 포화 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로원자(들)는 고리 시스템 내의 비방향족 또는 방향족 고리 중 어느 하나에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 3 내지 20개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로사이클릴"의 경우를 또한 포함한다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 10개의 고리 구성원을 갖는 중간 크기 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 6개의 고리 구성원을 갖는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 "3원 내지 6원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 바람직한 6원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중 1개 내지 최대 3개로부터 선택되며, 바람직한 5원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N, 또는 S로부터 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로사이클릴 고리의 예에는 아제피닐, 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 다이옥솔라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 옥시라닐, 옥세파닐, 티에파닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 다이옥소피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피롤리디오닐, 4-피페리도닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 1,3-다이옥시닐, 1,3-다이옥사닐, 1,4-다이옥시닐, 1,4-다이옥사닐, 1,3-옥사티아닐, 1,4-옥사티이닐, 1,4-옥사티아닐, 2H-1,2-옥사지닐, 트라이옥사닐, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아지닐, 1,3-다이옥솔릴, 1,3-다이옥솔라닐, 1,3-다이티올릴, 1,3-다이티올라닐, 아이소옥사졸리닐, 아이소옥사졸리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸리디노일, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 1,3-옥사티올라닐, 인돌리닐, 아이소인돌리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로-1,4-티아지닐, 티아모르폴리닐, 다이하이드로벤조푸라닐, 벤즈이미다졸리디닐, 및 테트라하이드로퀴놀린이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알콕시알킬" 또는 "(알콕시)알킬"은 알킬렌 기를 통해 연결된 알콕시 기, 예컨대 C2-C8 알콕시알킬, 또는 (C1-C6 알콕시)C1-C6 알킬, 예컨대, -(CH2)1-3-OCH3을 지칭한다.
"O-카르복시" 기는 "-OC(=O)R" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"C-카르복시" 기는 "-C(=O)OR" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 비제한적인 예에는 카르복실(즉, -C(=O)OH)이 포함된다.
"설포닐" 기는 "-SO2R" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"설피노" 기는 "-S(=O)OH" 기를 지칭한다.
"설포" 기는 "-S(=O)2OH" 또는 "-SO3H" 기를 지칭한다.
"설포네이트" 기는 "-SO3 -" 기를 지칭한다.
"설페이트" 기는 "-SO4 -" 기를 지칭한다.
"S-설폰아미도" 기는 "-SO2NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"N-설폰아미도" 기는 "-N(RA)SO2RB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"C-아미도" 기는 "-C(=O)NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"N-아미도" 기는 "-N(RA)C(=O)RB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"아미노" 기는 "-NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 비제한적인 예에는 유리 아미노(즉, -NH2)가 포함된다.
"아미노알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결된 아미노 기를 지칭한다.
"알콕시알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결된 알콕시 기, 예를 들어 "C2-C8 알콕시알킬" 등을 지칭한다.
기가 "선택적으로 치환된"으로 기재되는 경우, 이는 비치환되거나 치환될 수 있다. 마찬가지로, 기가 "치환된" 것으로 기재되는 경우, 치환체는 표시된 치환체들 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 치환된 기는 비치환된 모 기(parent group) 내의 하나 이상의 수소 원자를 다른 원자 또는 기로 교환한 것으로부터 유도된다. 달리 지시되지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주될 때, 이는 해당 기가 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카르보사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), C3-C7-카르보사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 할로, -CN, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬(즉, 에테르), 아릴옥시, 설피드릴(메르캅토), 할로(C1-C6)알킬(예컨대, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시(예컨대, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 니트로, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카르복시, O-카르복시, 아실, 시아나토, 아이소시아나토, 티오시아나토, 아이소티오시아나토, 설피닐, 설포닐, -SO3H, 설포네이트, 설페이트, 설피노, -OSO2C1-C4알킬, 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환됨을 의미한다. 기가 "선택적으로 치환된"으로 기재되어 있는 경우에는 언제든지, 그 기는 상기 치환체로 치환될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 기가 치환된 경우, 각각은 할로, -CN, -SO3 -, -OSO3 -, -SO3H, -SRA, -ORA, -NRBRC, 옥소, -CONRBRC, -SO2NRBRC, -COOH, 및 -COORB로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되며, 여기서, RA, RB 및 RC는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 화합물은 이온화된 형태, 예컨대, -CO2 -, -SO3 - 또는 -O-SO3 -으로 존재할 수 있다. 화합물이 양으로 또는 음으로 하전된 치환기, 예를 들어 SO3 -을 함유하는 경우, 그것은 또한, 화합물이 전체적으로 중성이 되게 하는 음으로 또는 양으로 하전된 반대이온을 함유할 수 있다. 다른 태양에서, 화합물은 염 형태로 존재할 수 있으며, 여기서는 반대이온이 짝산 또는 짝염기에 의해 제공된다.
소정의 라디칼 명명 규약은 문맥에 따라 모노-라디칼 또는 다이-라디칼 중 어느 하나를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환체가 분자의 나머지 부분에 대한 것으로 2개의 부착점을 필요로 하는 경우, 치환체는 다이-라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 부착점을 필요로 하는 알킬로 확인되는 치환체는 다이-라디칼, 예컨대 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등을 포함한다. 다른 라디칼 명명 규약은 라디칼이 "알킬렌" 또는 "알케닐렌"과 같은 다이-라디칼임을 명확하게 나타낸다.
2개의 "인접한" R 기가 "이들이 부착되어 있는 원자와 함께" 고리를 형성하는 것으로 언급되어 있을 때, 이는 원자들의 집합적 단위, 개재 결합, 및 2개의 R 기가 언급된 고리임을 의미한다. 예를 들어, 하기 하위구조가 존재하고:
Figure pct00008
R1 및 R2는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로 정의되거나, R1과 R2 는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 아릴 또는 카르보사이클릴을 형성하는 경우, 이는, R1 및 R2는 수소 또는 알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 대안적으로, 이 하위구조가 하기 구조를 가짐을 의미한다:
Figure pct00009
(상기 식에서, A는 표현된 이중 결합을 함유하는 아릴 고리 또는 카르보사이클릴임).
치환체가 다이-라디칼로서 표현된(즉, 분자의 나머지에 대해 2개의 부착점을 갖는) 경우는 어느 경우이든, 달리 지시되지 않는 한 치환체는 어떠한 방향 배치로도 부착될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, -AE- 또는
Figure pct00010
로 표현된 치환체는 A가 분자의 가장 왼쪽의 부착점에 부착되도록 치환체가 배향되는 것뿐만 아니라, A가 분자의 가장 오른쪽의 부착점에 부착되는 경우도 포함한다. 또한, 기 또는 치환체가
Figure pct00011
로 표현되고 L이 선택적으로 존재하는 링커 모이어티로 정의되는 경우; L이 존재하지 않으면(또는 부재하면), 이러한 기 또는 치환체는
Figure pct00012
와 동등하다.
본 명세서에 기재된 화합물은 몇몇 메소머 형태로 표시될 수 있다. 단일 구조가 그려져 있는 경우, 관련 메소머 형태들 중 임의의 것이 의도된다. 본 명세서에 기재된 쿠마린 화합물은 단일 구조로 표시되지만, 관련된 메소머 형태들 중 임의의 것으로 동일하게 표시될 수 있다. 예시적인 메소머 구조가 각각 화학식 I 및 화학식 Ia에 대해 하기에 나타나 있다:
Figure pct00013
본 명세서에 기재된 화합물의 단일 메소머 형태가 나타나 있는 각각의 경우에, 대안적인 메소머 형태가 동일하게 고려된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록실 기가 결여되어 있는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체, 예컨대 7-데아자 아데닌 또는 7-데아자 구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 누락되어 있다. 뉴클레오시드 유사체의 한 예는 표지가 염기에 연결되어 있고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다. 용어 "뉴클레오시드"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용된다. 예에는 리보스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 변형된 펜토스 모이어티는 산소 원자가 탄소로 치환되고/되거나 탄소가 황 또는 산소 원자로 치환된 펜토스 모이어티이다. "뉴클레오시드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다. 추가적으로, 뉴클레오시드는 더 큰 DNA 및/또는 RNA 중합체 및 올리고머 내로 도입될 수 있다.
용어 "퓨린 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 유사하게, 용어 "피리미딘 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 선택적으로 치환된 퓨린-염기의 비제한적인 목록은 퓨린, 아데닌, 구아닌, 7-데아자 아데닌, 7-데아자 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 잔틴, 알로잔틴, 7-알킬구아닌(예를 들어, 7-메틸구아닌), 테오브로민, 카페인, 요산 및 아이소구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기의 예에는 시토신, 티민, 우라실, 5,6-다이하이드로우라실 및 5-알킬시토신(예를 들어, 5-메틸시토신)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 "포함하는" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 유사하게, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 기재될 때, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 "내로 도입된" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 공유 결합은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 탄소 원자와 뉴클레오티드의 5' 탄소 원자 사이의 포스포다이에스테르 결합으로서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 하이드록시 기와 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기 사이에 형성된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "절단가능한 링커"는 전체 링커가 제거되어야 함을 암시하는 것으로 의도되지 않는다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 후 절단가능한 표지 및/또는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 모이어티에 부착된 채로 남아 있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체" 또는 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 의미한다. 그러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트 결합을 포함한 변형된 포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체", "유사체" 및 "변형된"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 본 명세서에 정의된 용어 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오시드"에 의해 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이의 통상적인 의미로 사용되고, 이의 양성자화 형태(예를 들어,
Figure pct00014
및
Figure pct00015
)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "모노포스페이트", "다이포스페이트", 및 "트라이포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 양성자화 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "페이징"은 3' 종결자 및 형광단의 불완전한 제거 및 주어진 서열분석 사이클에서 폴리머라제에 의한 클러스터 내로의 DNA 가닥의 일부분의 도입의 실패로 인해 야기되는 SBS에서의 현상을 지칭한다. 프리페이징은 효과적인 3' 종결자를 갖지 않는 뉴클레오티드의 도입에 의해 야기되는데, 여기서 이러한 도입 이벤트는 종결 실패로 인해 1 사이클 먼저 앞서 간다. 페이징 및 프리페이징은 특정 사이클에 대해 측정된 신호 강도가 현재 사이클로부터의 신호뿐만 아니라 선행 사이클 및 후행 사이클로부터의 잡음으로 이루어지게 한다. 사이클 수가 증가함에 따라, 페이징 및 프리페이징에 의해 영향을 받는 클러스터당 서열의 분율이 증가하여, 올바른 염기의 확인을 방해한다. 프리페이징은 합성에 의한 서열분석(SBS) 동안 미량의 보호되지 않거나 블록킹되지 않은 3'-OH 뉴클레오티드의 존재에 의해 야기될 수 있다. 보호되지 않은 3'-OH 뉴클레오티드는 제조 공정 동안 또는 가능하게는 저장 및 시약 취급 과정 동안 생성될 수 있다. 따라서, 프리페이징의 발생을 감소시키는 뉴클레오티드 유사체의 발견은 놀라우며, 기존의 뉴클레오티드 유사체에 비해 SBS 응용에서 큰 이점을 제공한다. 예를 들어, 제공된 뉴클레오티드 유사체는 더 빠른 SBS 사이클 시간, 더 낮은 페이징 및 프리페이징 값, 및 더 긴 서열분석 판독 길이를 초래할 수 있다.
화학식 I의 형광 화합물
본 발명의 일부 태양은 하기 화학식 I의 염료, 및 이의 염 및 메소머 형태에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00016
(상기 식에서, R1은 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록시, 설포, 설포네이트, 설페이트, N-설폰아미도, 및 S-설폰아미도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 각각 선택적으로 치환된
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
이고;
R2는 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 또는 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 시아노, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, 선택적으로 치환된 아미노, 및 하이드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된 페닐이고;
각각의 R3, R4 및 R7은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
각각의 R5 및 R6은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬이거나, 또는 R5와 R6은 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
X는 O, S, 또는 NRa이고;
Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
Rd는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐이되; 단, R5 또는 R6 중 적어도 하나, 또는 R5와 R6 및 그들이 부착되어 있는 질소 원자로부터 형성된 상기 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함하거나; 또는 R1은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함함).
화학식 I의 화합물의 일부 실시 형태에서, 일부 실시 형태에서, X는 O이다. 일부 다른 실시 형태에서, X는 S이다. 다른 실시 형태에서, X는 NH이다. 일부 추가의 실시 형태에서, R1은 각각 독립적으로 카르복실(-COOH), -C(O)NRbRc, 또는 -C(O)ORd로 치환된
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
이다.
일부 추가의 실시 형태에서, R1은 각각 카르복실로 치환된
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
또는
Figure pct00026
이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R1은
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R5 및 R6의 각각은 독립적으로 C1-C6 알킬이다. 일 실시 형태에서, R5 및 R6의 각각은 에틸이다. 다른 실시 형태에서, R5 및 R6 중 적어도 하나는 H이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R5는 H이고 R6은 치환된 C1-C6 알킬이다. 다른 실시 형태에서, R5 및 R6의 각각은 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 이러한 실시 형태에서, C1-C6 알킬은 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 또는 설페이트 (-O-SO3 -), 또는 선택적으로 치환된 아미노(예컨대 Boc 보호된 아미노 기)와 같은 하나 이상의 치환체로 치환된다.
화학식 I의 화합물의 일부 다른 실시 형태에서, R1은 각각 비치환되거나 설포(-SO3H)로 치환된
Figure pct00034
,
Figure pct00035
,
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R5는 H이고 R6은 카르복실로 치환된 C1-C6 알킬이다. 다른 실시 형태에서, R5 및 R6의 각각은 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 또는 설페이트(-O-SO3 -)로 치환된 C1-C6 알킬이고 R5 및 R6 중 하나는 카르복실로 치환된다. 다른 실시 형태에서, R5와 R6 및 그들이 부착되어 있는 질소 원자는 카르복실을 포함하거나 그로 치환된 4원, 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릴을 형성한다. 헤테로사이클릴 기는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 일 실시 형태에서, 헤테로사이클릴 기는 피페리딜이다. 다른 실시 형태에서, 헤테로사이클릴 기는 피페라지닐 또는 모르폴리닐이다. 헤테로사이클릴 기가 카르복실 기를 포함하는 경우, 이것은 C1-C6 알킬로 치환될 수 있고 C1-C6 알킬은 카르복실 기로 치환된다.
화학식 I의 화합물의 일부 실시 형태에서, R2는 H이다. 다른 실시 형태에서, R2는 C1-C6 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 아이소프로필, 또는 t-부틸이다. 일 실시 형태에서, R2는 메틸이다.
화학식 I의 화합물의 일부 실시 형태에서, R3, R4 및 R7 중 적어도 하나는 H이다. 일부 추가의 실시 형태에서, R3, R4 및 R7의 각각은 H이다.
화학식 I의 화합물의 임의의 실시 형태에서, 화합물은 -C(O)ORd로 치환되며, Rd는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 일 실시 형태에서, Rd는 에틸이다.
화학식 I의 화합물의 구체적인 실시 형태가 하기 표 1에 예시되어 있다:
[표 1]
Figure pct00038
화학식 II 또는 화학식 II'의 형광 화합물
본 발명의 일부 추가 태양은 하기 화학식 II 또는 화학식 II'의 염료, 및 이의 염 및 메소머 형태에 관한 것이다:
[화학식 II]
Figure pct00039
[화학식 II']
Figure pct00040
(상기 식에서, X는 S, O, 또는 NRa이고;
Y는 O 또는 NH이고;
각각의 R1, R2, R3 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
R4는 -NRbRc, 할로, -ORd 또는 -OS(O)2Rd이고;
R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, N-설폰아미도, 설포닐, S-설폰아미도, 하이드록시, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 C3-C8 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이거나; 또는 화학식 II에서 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고;
Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
각각의 Rd는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐이되; 단,
R6 및 R7 중 적어도 하나, 또는 R6과 R7 및 그들이 부착되어 있는 원자로부터 형성된 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴은 카르복실을 포함하거나 이로 치환되거나; 또는
R4는 -NRbRc이고 Rb 및 Rc 중 적어도 하나는 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함하는 치환된 C1-C6 알킬이거나 이로 치환됨).
화학식 II 또는 화학식 II'의 화합물의 일부 실시 형태에서, R4는 할로(예컨대, -F, -Cl 또는 -Br)이다. 일부 다른 실시 형태에서, R4는 -OS(O)2Rd이다. 일부 이러한 실시 형태에서, Rd는 C1-C6 알킬(예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 t-부틸) 또는 C1-C6 할로알킬(예컨대, 트라이플루오로메틸)이다. 일부 다른 실시 형태에서, R4는 -NRbRc이고 상기 화합물은 또한 하기 화학식 IIa 또는 화학식 IIa', 또는 이의 염 또는 메소머 형태로 표시된다:
[화학식 IIa]
Figure pct00041
[화학식 IIa']
Figure pct00042
일부 이러한 실시 형태에서, Rb 및 Rc의 각각은 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 일 실시 형태에서, Rb 및 Rc의 각각은 H이다. 일부 실시 형태에서, 치환된 C1-C6 알킬은 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 설페이트(-O-SO3 -) 또는 -SO2NReRf로 독립적으로 치환되고, Re 및 Rf의 각각은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다. 예를 들어, Rb는 H이고 Rc는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 이러한 일 실시 형태에서, Rb는 H이고 Rc는 에틸이다. 다른 실시 형태에서, Rb는 H이고 Rc는 카르복실, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -, -O-SO3 -or -SO2NH2로 치환된 C1-C6 알킬(예컨대 C3 또는 C5 알킬)이다. 다른 예에서, Rb 및 Rc의 각각은 독립적으로 각각 -CO2H, -C(O)ORd, -SO3H,
-SO3 -, -O-SO3 - 또는 -SO2NReRf로 치환될 수 있는 C1-C6 알킬이다. 일 실시 형태에서, Rb 및 Rc의 각각은 에틸이다. 추가적인 실시 형태에서, Rb는 -SO3H, -SO3 - 또는 -O-SO3 -으로 치환된 C3 또는 C5 알킬이고 Rc는 -CO2H 또는 -C(O)ORd로 치환된 C3 또는 C5 알킬이다. 일부 다른 실시 형태에서, Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 고리 구조에 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환된 4원, 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릴(예컨대
Figure pct00043
,
Figure pct00044
,
Figure pct00045
,
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
, 여기서, RN은 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬(예컨대 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 설페이트(-O-SO3 -) 또는 -SO2NReRf와 같은 하나 이상의 치환체로 각각 선택적으로 치환된, 메틸, C3 또는 C5 알킬), 또는 아미노 보호 기, 예컨대 Boc(-C(=O)OtBu)임)을 형성한다.
추가의 실시 형태에서, 이러한 4원, 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릴은 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬, -CO2H, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -, -O-SO3 - 또는 -SO2NReRf와 같은, 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
화학식 II, II', IIa 또는 IIa'의 화합물의 일부 실시 형태에서, Y는 O이다. 다른 실시 형태에서, Y는 S이다. 또 다른 실시 형태에서, Y는 NRa이며, Ra는 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 이러한 실시 형태에서, X는 O이다. 다른 실시 형태에서, X는 S이다.
화학식 II, II', IIa 또는 IIa'의 화합물의 일부 실시 형태에서, R1, R2, R3 및 R5의 각각은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬(예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 t-부틸)이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R1은 H 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R2는 H이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R3은 H 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이러한 실시 형태에서, R5는 H이다.
화학식 II, II', IIa 또는 IIa'의 화합물의 일부 실시 형태에서, R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 페닐, 카르복실 또는 -C(O)ORd이다. 예를 들어, R6 또는 R7 중 하나는 H 또는 C1-C6 알킬이고, R6 또는 R7 중 다른 하나는 카르복실, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 또는 카르복실, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -, 또는 -O-SO3 -으로 선택적으로 치환된 페닐이다. 일부 추가의 실시 형태에서, R6 또는 R7 중 하나는 H 또는 메틸이고, R6 또는 R7 중 다른 하나는 카르복실, -C(O)ORd, 메틸, 페닐, 카르복실 또는 -C(O)ORd로 치환된 페닐, 또는 카르복실 또는
-C(O)ORd로 치환된 C1-C6 알킬(예컨대, 메틸 또는 에틸)이다. 화학식 II 또는 IIa의 화합물의 다른 실시 형태에서, R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5, C6, C7 또는 C8 카르보사이클릴을 형성한다. 예를 들어, C5-C8 카르보사이클릴은 카르복실, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -,
-O-SO3 - 또는 치환된 C1-C6 알킬(예컨대, 카르복실 또는 -C(O)ORd로 치환됨)로 치환될 수 있다.
화학식 II, II', IIa 또는 IIa'의 화합물의 임의의 실시 형태에서, 화합물이 C(O)ORd를 포함하거나 그로 치환된 경우, Rd는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 일 실시 형태에서, Rd는 에틸이다.
화학식 IIa의 화합물의 구체적인 실시 형태가 하기 표 2A에 예시되어 있다.
[표 2A]
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
[표 2B]
Figure pct00053
화학식 IIa'의 화합물의 구체적인 실시 형태가 하기 표 2C에 예시되어 있다.
[표 2C]
Figure pct00054
화학식 IIa의 비제한적인 예시적인 화합물은 하기를 포함한다:
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
및
Figure pct00060
비제한적인 예는 상응하는 C1-C6 알킬 카르복실산 에스테르(예컨대 화합물의 카르복실산 기로부터 형성된 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 아이소프로필 에스테르, 및 t-부틸 에스테르); 상응하는 이민 유사체(여기서 화학식 IIa의 쿠마린 코어 Y 위치는 O 대신에 NH임); 상응하는 옥사졸 유사체(여기서 화학식 IIa의 X 위치는 S 대신에 O임); 이의 염 및 메소머 형태를 또한 포함한다.
화학식 II 또는 II'의 화합물의 추가적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00061
Figure pct00062
및
Figure pct00063
. 비제한적인 예는 상응하는 C1-C6 알킬 카르복실산 에스테르(예컨대 화합물의 카르복실산 기로부터 형성된 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 아이소프로필 에스테르, 및 t-부틸 에스테르); 상응하는 브로마이드 유사체(여기서 화학식 II 또는 II'의 R4는 -F 대신에 -Br임); 상응하는 이민 유사체(여기서 화학식 II 또는 II'의 쿠마린 코어 Y 위치는 O 대신에 NH임); 상응하는 옥사졸 유사체(여기서 화학식 II 또는 II'의 X 위치는 S 대신에 O임); 이의 염 및 메소머 형태를 또한 포함한다.
사이클로옥타테트라엔(COT) 광-보호 모이어티
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 형광 화합물(화학식 I, II 또는 Il')은 그에 공유 결합된 광-보호 모이어티를 도입시키도록 추가로 변형될 수 있으며, 예를 들어, 사이클로옥타테트라엔 모이어티는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00064
여기서,
R1A 및 R2A의 각각은 독립적으로 H, 하이드록실, 할로겐, 아지도, 티올, 니트로, 시아노, 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실, -C(O)OR5A, -C(O)NR5AR6A, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C1-6 알콕시, 선택적으로 치환된 C1-6 할로알킬, 선택적으로 치환된 C1-6 할로알콕시, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C7-14 아르알킬, 선택적으로 치환된 C3-7 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
X1 및 Y1은 각각 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NR3A-, -C(=O)-, -C(=O)-O-,
-C(=O)-NR4A-, -S(O)2-, -NR3A-C(=O)-NR4A, -NR3A-C(=S)-NR4A-, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌(적어도 하나의 탄소 원자는 O, S, 또는 N으로 대체됨)이고;
Z1은 부재하거나, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐렌, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐렌이고;
R3A 및 R4A의 각각은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 선택적으로 치환된 C6-10 아릴이고;
R5A 내지 R6A의 각각은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C7-14 아르알킬, 선택적으로 치환된 C3-7 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
Figure pct00065
에서 R1A 및 R2A가 부착되어 있는 탄소 원자는 O, S, 또는 N으로 선택적으로 대체되되, 단, 상기 탄소 원자가 O 또는 S로 대체되는 경우, R1A 및 R2A가 둘 모두 부재하고; 상기 탄소 원자가 N으로 대체되는 경우, R2A가 부재하고;
m은 0 내지 10의 정수이다.
본 명세서에 기재된 형광 화합물의 일부 실시 형태에서, X1은 -C(=O)- 또는 -C(=O)NR4A-이다. X1의 일부 이러한 실시 형태에서, R4A는 H이다. X1의 일부 다른 실시 형태에서, R4A는 C1-6 알킬(예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 tert-부틸)이다. 일부 실시 형태에서, Y1은 -C(=O)O-, -NR3A- 또는 -S(O)2-이다. Y1의 일부 이러한 실시 형태에서, R3A는 H, C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬(예컨대, -CO2H, -NH2, -SO3H, -SO3 - 또는 -O-SO3 -로 치환된 C1-6 알킬)이다. Y1의 일부 이러한 실시 형태에서, R3A는 H, C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬(예컨대, -CO2H, -NH2, -SO3H, -SO3 - 또는 -O-SO3 -로 치환된 C1-6 알킬)이다. 일부 실시 형태에서, X1 및 Y1은 둘 모두 결합일 수는 없으며, 예를 들어 X1이 결합일 때, Y1은 결합이 아니다. 일부 실시 형태에서, Z는 부재한다. 다른 실시 형태에서, Z는 C2-6 알케닐렌이다.
일부 실시 형태에서, 사이클로옥타테트라엔 모이어티는 구조:
Figure pct00066
,
Figure pct00067
,
Figure pct00068
또는
Figure pct00069
를 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, R1A 및 R2A 중 적어도 하나는 수소이다. 일부 추가의 실시 형태에서, R1A 및 R2A는 둘 모두 수소이다. 일부 다른 실시 형태에서, R1A는 H이고 R2A는 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실 또는 -C(O)NR5AR6A이다. 일부 실시 형태에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고, R1A 및 R2A의 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실, -C(O)NR5AR6A, 또는 이들의 조합이다. 일부 추가의 실시 형태에서, m이 2, 3, 4, 5, 또는 6인 경우, 하나의 R1A는 아미노, 카르복실, 또는 -C(O)NR5AR6A이고, 나머지 R1A 및 R2A는 수소이다. 일부 실시 형태에서,
Figure pct00070
에서 R1A 및 R2A가 부착되어 있는 적어도 하나의 탄소 원자는 O, S, 또는 N으로 대체된다. 일부 이러한 실시 형태에서,
Figure pct00071
에서 하나의 탄소 원자는 산소 원자로 대체되고, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R1A 및 R2A 둘 모두는 부재한다. 일부 다른 실시 형태에서,
Figure pct00072
에서 하나의 탄소 원자가 질소 원자로 대체되는 경우, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R2A는 부재하고, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R1A는 수소, 또는 C1-6 알킬이다. R1A 및 R2A의 임의의 실시 형태에서, R1A 또는 R2A가 -C(O)NR5AR6A인 경우, R5A 및 R6A는 독립적으로 H, C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬(예컨대, -CO2H, -NH2, -SO3H, 또는 -SO3 -으로 치환된 C1-6 알킬)일 수 있다.
일부 추가의 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 형광 화합물은 하기 구조의 사이클로옥타테트라엔 모이어티를 포함한다:
Figure pct00073
,
Figure pct00074
,
Figure pct00075
,
Figure pct00076
,
Figure pct00077
,
Figure pct00078
,
Figure pct00079
,
Figure pct00080
,
Figure pct00081
,
Figure pct00082
, 또는
Figure pct00083
. 본 명세서에 기재된 COT 모이어티는 아미드 결합(아미드 결합의 카르보닐 기는 나타나 있지 않음)을 형성하는, 본 명세서에 기재된 형광 염료의 작용기(예컨대, 카르복실 기)와 COT 유도체의 아미노 기 사이의 반응으로부터 생성될 수 있다.
화학식 I의 COT 보호된 화합물의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
[화학식 I-3a]
Figure pct00084
[화학식 I-4a]
Figure pct00085
, 및
[화학식 I-8a]
Figure pct00086
.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 명세서에 기재된 염료 화합물은 기질 모이어티에 대한 부착에 적합하며, 특히 기질 모이어티에 대한 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함한다. 기질 모이어티는 사실상 본 발명의 염료가 접합될 수 있는 임의의 분자 또는 물질일 수 있으며, 비제한적인 예로서, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 리간드, 입자, 고체 표면, 유기 및 무기 중합체, 염색체, 핵, 살아있는 세포, 및 이들의 조합 또는 집합체를 포함할 수 있다. 염료는 소수성 인력, 이온성 인력, 및 공유 부착을 포함하는 다양한 수단에 의해 선택적인 링커에 의해 접합될 수 있다. 일부 태양에서, 염료는 공유 부착에 의해 기질에 접합된다. 더 특히, 공유 부착은 링커 기에 의한 것이다. 일부 경우에, 그러한 표지된 뉴클레오티드는 "변형된 뉴클레오티드"로도 지칭된다.
본 발명의 일부 태양은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 I, II, II', IIa 또는 IIa'의 염료, 또는 본 명세서에 기재된 광-보호 모이어티를 함유하는 이의 유도체로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카르복실(-CO2H) 또는 알킬-카르복실 기를 통해 본 명세서에 개시된 염료 화합물에 부착되어 아미드 또는 알킬-아미드 결합을 형성할 수 있다. 일부 추가의 실시 형태에서, 카르복실 기는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 아미노 또는 하이드록실 기에 부착하기 위해 사용될 수 있는, 활성화된 형태의 카르복실 기, 예를 들어, 아미드 또는 에스테르의 형태일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "활성화된 에스테르"는 예를 들어, 온화한 조건에서 아미노 기를 함유하는 화합물과 반응할 수 있는 카르복실 기 유도체를 지칭한다. 활성화된 에스테르의 비제한적인 예에는 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 및 석신이미도 에스테르가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
예를 들어, 화학식 I의 염료 화합물은 화학식 I의 R1을 통해 또는 R5/R6 중 하나를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 일부 이러한 실시 형태에서, 화학식 I의 R1은 -CO2H 또는 -(CH2)1-6-CO2H를 포함하며 부착은 R1의 카르복실 작용기와 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 링커의 아미노 작용기 사이에 아미드 모이어티를 형성한다. 이와 같이, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 하기 구조의 염료 모이어티를 포함할 수 있다:
Figure pct00087
또는
Figure pct00088
. 다른 실시 형태에서, 화학식 I의 R5 또는 R6은 -CO2H 또는 -(CH2)1-6-CO2H를 포함하며 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다.
게다가, 화학식 II 또는 II'의 염료 화합물은 화학식 II/II'/IIa/IIa'의 R6 또는 R7; 또는 화학식 IIa/IIa'의 Rb 또는 Rc를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 일부 이러한 실시 형태에서, 화학식 II/II'/IIa/IIa'의 R6 또는 R7은 -CO2H 또는 -(CH2)1-6-CO2H를 포함하며 부착은 R6 또는 R7의 카르복실 작용기와 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 링커의 아미노 작용기 사이에 아미드 모이어티를 형성한다. 이와 같이, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 하기 구조의 염료 모이어티를 포함할 수 있다:
Figure pct00089
,
Figure pct00090
,
Figure pct00091
,
Figure pct00092
,
Figure pct00093
,
Figure pct00094
,
Figure pct00095
또는
Figure pct00096
. 다른 실시 형태에서, 화학식 IIa/IIa'의 Rb 또는 Rc는 -CO2H 또는 -(CH2)1-6-CO2H를 포함하며 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다.
일부 실시 형태에서, 염료 화합물은 뉴클레오티드 염기를 통해 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 이러한 실시 형태에서, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 선택적으로 링커 모이어티를 통해, 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 염료를 가질 수 있다. 예를 들어, 핵염기는 7-데아자 아데닌일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C7 위치에서 7-데아자 아데닌에 부착된다. 핵염기는 7-데아자 구아닌일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C7 위치에서 7-데아자 구아닌에 부착된다. 핵염기는 시토신일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C5 위치에서 시토신에 부착된다. 다른 예로서, 핵염기는 티민 또는 우라실일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C5 위치에서 티민 또는 우라실에 부착된다.
3'-OH 블록킹 기
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기를 가질 수 있다. 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다. 다양한 3' OH 블록킹 기가 국제 특허 공개 WO2004/018497호 및 WO2014/139596호에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티의 3' 산소 원자에 연결되는 아지도메틸(-CH2N3) 또는 치환된 아지도메틸(예를 들어, -CH(CHF2)N3 또는 CH(CH2F)N3), 또는 알릴일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블록킹 기는 아지도메틸로서, 이는 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소와 함께 3'-OCH2N3를 형성한다.
일부 다른 실시 형태에서, 3' 블록킹 기와 3' 산소 원자는 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소에 공유적으로 부착된 구조
Figure pct00097
의 아세탈 기를 형성하며, 여기서
각각의 R1a 및 R1b는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 시아노, 할로겐, 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 아르알킬이고;
각각의 R2a 및 R2b는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 시아노, 또는 할로겐이고;
대안적으로, R1a와 R2a는 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴 기를 형성하고;
RF는 H, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R3a)3이고;
각각의 R3a는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이다.
추가의 3' OH 블록킹 기는 미국 특허 출원 공개 제2020/0216891 A1호에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 참고로 포함된다. 아세탈 블록킹 기의 비제한적인 예에는
Figure pct00098
(AOM),
Figure pct00099
,
Figure pct00100
,
Figure pct00101
,
Figure pct00102
,
Figure pct00103
,
Figure pct00104
, 및
Figure pct00105
가 포함되며, 각각은 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소에 공유적으로 부착되어 있다.
링커
본 명세서에 개시된 바와 같은 염료 화합물은 기질 또는 다른 분자에 대한 이 화합물의 공유 부착을 위한 치환체 위치들 중 하나에 반응성 링커 기를 포함할 수 있다. 반응성 연결기는 결합(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합), 특히 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티이다. 특정 실시 형태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 용어 "절단가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 것이 요구되는 것을 내포하는 것으로 의미되지 않는다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 후 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 채로 남아 있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다. 절단가능한 링커는, 비제한적인 예로서, 친전자적으로 절단가능한 링커, 친핵적으로 절단가능한 링커, 광절단성 링커일 수 있으며, 이들은 환원성 조건(예를 들어, 다이설파이드 또는 아지드 함유 링커), 산화성 조건 하에서 절단가능하고, 안전성-캐치 링커(safety-catch linker)의 사용을 통해 절단가능하고, 제거 기전에 의해 절단가능하다. 염료 화합물을 기질 모이어티에 부착하기 위한 절단가능한 링커의 사용은 표지를, 필요하다면, 검출 후에 제거하여, 하류 단계들에서 어떠한 간섭 신호도 피할 수 있음을 보장한다.
유용한 링커 기를 국제 특허 출원 공개 WO2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있으며, 이의 예에는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매 또는 수용성 포스핀을 사용하여 절단될 수 있는 링커가 포함된다. 수용액 중에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 착물을 형성한다. 그러한 절단가능한 링커는 본 명세서에 기재된 염료와 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결하는 데 사용될 수 있다.
특정 링커는 국제 특허 출원 공개 WO2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure pct00106
Figure pct00107
상기 식에서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 C1-10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타낸다. 일부 태양에서, 링커는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 염료 화합물과 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결한다.
링커의 추가의 예에는 미국 특허 출원 공개 제2016/0040225호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들이 포함된다:
Figure pct00108
(상기 식에서, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타냄). 본 명세서에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드/뉴클레오시드와 표지 사이의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다. 본 명세서에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드/뉴클레오시드와 표지 사이의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다.
링커의 추가적인 예는 하기 화학식의 모이어티를 포함한다:
Figure pct00109
,
Figure pct00110
,
Figure pct00111
,
Figure pct00112
,
Figure pct00113
, 또는
Figure pct00114
, 여기서 B는 핵염기이고; Z는
-N3(아지도), -O-C1-C6 알킬, -O-C2-C6 알케닐, 또는 -O-C2-C6 알키닐이고; Fl은 염료 모이어티를 포함하며, 이는 추가의 링커 구조를 함유할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기재된 염료 화합물은 염료 화합물의 작용기(예를 들어, 카르복실)를 링커의 작용기(예를 들어, 아미노)와 반응시킴으로써 링커에 공유 결합됨을 이해한다. 일 실시 형태에서, 절단성 링커는
Figure pct00115
("AOL" 링커 모이어티) (여기서, Z는 -O-알릴임)를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 형광 염료(형광단)와 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 기를 도입함으로써 변경될 수 있으며, 그럼으로써 당업계에 알려진 다른 결합을 통해 구아닌 염기에 부착된 동일한 형광단과 비교하여 형광 강도를 증가시킬 수 있다. 예시적인 링커 및 그의 특성이 국제 특허 출원 공개 WO2007/020457호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 링커의 설계, 특히 그의 증가된 길이는, DNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 때, 구아노신 뉴클레오티드의 구아닌 염기에 부착된 형광단의 밝기의 개선을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 염료가 구아닌-함유 뉴클레오티드에 부착된 형광 염료 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 분석 방법에 사용하기 위한 것일 때, 국제 특허 공개 제2007/020457호에 기재된 바와 같이, 링커가 화학식 -((CH2)2O)n-(여기서, n은 2 내지 50의 정수임)의 스페이서 기를 포함하는 경우에 유리하다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기 상의 부위에 표지될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소성 염기(nitrogenous base), 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기로 이루어진다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록시 기가 결여되어 있는 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이고, 피리미딘은 시토신(C) 및 티민(T), 또는 RNA와 관련해서는, 우라실(U)이다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이며, 이때 에스테르화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록시 기 상에서 발생한다. 뉴클레오티드는 통상 모노, 다이 또는 트라이포스페이트이다.
"뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 누락되어 있다. 뉴클레오시드 유사체의 한 예는 표지가 염기에 연결되어 있고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다.
염기는 통상 퓨린 또는 피리미딘으로 지칭되지만, 당업자는 왓슨-크릭 염기쌍 형성(Watson-Crick base pairing)을 거치는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 능력을 변경시키지 않는 유도체 및 유사체가 이용가능하다는 것을 인식할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는, 코어 구조가 모 화합물의 코어 구조와 동일하거나 근접하게 유사하지만, 예를 들어 유도체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 다른 분자에 연결될 수 있게 하는 상이한 또는 추가적인 측기와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성을 거칠 수 있어야 한다. "유도체" 및 "유사체"는 또한, 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 포함한다. 그러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 결합 등을 포함한 변형된 포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다.
염료는, 예를 들어 링커를 통해 뉴클레오티드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 생성된 유사체에 대해 왓슨-크릭 염기쌍 형성이 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지화 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 전술된 바와 같이, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 염료를 공유적으로 부착하는 데 링커 기가 사용될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 효소적으로 도입가능하고 효소적으로 신장가능할 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는, 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오티드의 전체적인 결합 및 인식을 크게 방해하지 않도록 뉴클레오티드를 화합물에 연결하기에 충분한 길이를 가질 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오티드 염기를 이격시킨다.
본 명세서에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00116
상기 식에서, Dye는 (염료의 작용기와 링커 "L"의 작용기 사이의 공유 결합 후의) 본 명세서에 기재된 염료 화합물 (표지) 모이어티이고; B는 예를 들어 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 7-데아자 아데닌, 구아닌, 7-데아자 구아닌 등과 같은 핵염기이고; L은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 선택적인 링커이고; R'은 H일 수 있거나, -OR'이 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스테르 유사체, 반응성 인-함유 기에 부착된 -O-, 또는 블록킹 기에 의해 보호된 -O-이고; R''은 H 또는 OH이고; R'''은 H, 포스포르아미다이트, 또는 본 명세서에 기재된 3' OH 블록킹 기이다. R'''이 포스포르아미다이트인 경우, R'은 산-절단가능한 하이드록실 보호기이며, 이는 자동화 합성 조건 하에서 후속 단량체 커플링을 가능하게 한다. 일부 추가의 실시 형태에서, B는
Figure pct00117
,
Figure pct00118
,
Figure pct00119
,
Figure pct00120
,
Figure pct00121
,
Figure pct00122
또는
Figure pct00123
, 또는 이들의 선택적으로 치환된 유도체 및 유사체를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 표지된 핵염기는 구조
Figure pct00124
,
Figure pct00125
,
Figure pct00126
, 또는
Figure pct00127
를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 이러한 블록킹 기는 염료 화합물과 분리되어 있고 독립적이며, 즉 그것에 부착되어 있지 않다. 대안적으로, 염료는 3'-OH 블록킹 기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R'''은 염료 화합물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 3' OH 블록킹 기일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시 형태에서, 펜토스 당의 3' 탄소 상에는 블록킹 기가 없으며, 염기에 부착된 염료(또는 염료 및 링커 작제물)는, 예를 들어, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 블록은, 염료가 당의 3' 위치에 부착되어 있든 그렇지 않든 간에, 입체 장애로 인한 것일 수 있거나 크기, 전하 및 구조의 조합으로 인한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시 형태에서, 블록킹 기는 펜토스 당의 2' 또는 4' 탄소 상에 존재하며, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다.
블록킹 기의 사용은 중합이 제어될 수 있게 하는데, 이는, 예를 들어 표지된 뉴클레오티드가 도입될 때 신장을 정지시킴으로써 이루어진다. 블록킹 효과가, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 화학적 조건을 변화시킴으로써 또는 화학적 블록의 제거에 의해 가역적인 경우, 신장이 소정의 지점에서는 정지되고, 이어서 계속되게 할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 링커(염료와 뉴클레오티드 사이에 존재함) 및 블록킹 기 둘 모두가 존재하며, 별개의 모이어티이다. 특정 실시 형태에서, 링커 및 블록킹 기는 둘 모두 실질적으로 유사한 조건 하에서 절단가능하다. 따라서, 염료 화합물 및 블록킹 기 둘 모두를 제거하는 데 단지 단일 처리만이 요구될 것이기 때문에 탈보호 및 탈블록킹 공정이 더 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 실시 형태에서 링커 및 블록킹 기는 유사한 조건 하에서 절단가능할 필요가 없으며, 대신에 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단가능하다.
본 발명은 또한 염료 화합물을 도입시킨 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 포스포다이에스테르 결합으로 연결된 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들로 각각 구성된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 변형된(예를 들어, 염료 화합물로 표지된) 뉴클레오티드와 조합된, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드 이외의 천연 발생 뉴클레오티드, 천연 비발생(또는 변형된) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 비천연 골격 결합 및/또는 비-뉴클레오티드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 구성된 키메라 구조가 또한 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비제한적인 예시적인 표지된 뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
Figure pct00128
Figure pct00129
상기 식에서, L은 링커를 나타내고, R은 전술된 바와 같은 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티, 또는 5' 위치가 모노-, 다이- 또는 트라이-포스페이트로 치환된 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티를 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 비제한적인 예시적인 형광 염료 접합체가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00130
,
Figure pct00131
,
Figure pct00132
,
Figure pct00133
,
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
,
Figure pct00137
,
Figure pct00138
상기 식에서, PG는 본 명세서에 기재된 3' OH 블록킹 기를 나타내고; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 정수이고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 일 실시 형태에서, -O-PG는 AOM이다. 다른 실시 형태에서, -O-PG는 -O-아지도메틸이다. 일 실시 형태에서, n은 5이다.
Figure pct00139
는 링커 모이어티의 아미노 기와 Dye의 카르복실 기 사이의 반응의 결과로서 Dye와 절단성 링커의 연결점을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드의 임의의 실시 형태에서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트라이포스페이트이다.
본 발명의 추가의 태양은 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 혼성화된다. 일부 실시 형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체 상에 고정화된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 고체 지지체는 복수의 고정화된 표적 폴리뉴클레오티드들의 어레이를 포함한다.
키트
본 명세서에는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물로 표지된 뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 키트는 제2 유형의 뉴클레오티드를 포함하며, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드와는 상이한 화합물로 표지된다. 일부 실시 형태에서, 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드 및 제2 유형의 표지된 뉴클레오티드는 단일 레이저 파장을 사용하여 여기가능하다. 키트는 2개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 2개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 이들 표지 중 2개 이상이 단일 여기 공급원(이는 레이저일 수 있음)을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 여기 밴드들은 적어도 부분적으로 중첩될 수 있어서, 스펙트럼의 중첩 영역에서의 여기는 두 표지 모두가 형광을 방출하도록 한다. 특정 실시 형태에서, 표지 중 적어도 하나의 존재가 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있도록, 2개 이상의 표지로부터의 방출은 스펙트럼의 상이한 영역에서 일어날 것이다. 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 경우, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오티드의 각각은 상이한 화합물로 표지되고, 각각의 표지는 다른 표지와 구별가능한 별도의 최대 흡광도를 갖는다.
일부 태양에서, 키트는 4가지 유형의 표지된 뉴클레오티드(A, C, G 및 T 또는 U, 예를 들어, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP)를 포함할 수 있으며, 4개의 뉴클레오티드 중 제1 유형은 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물로 표지된다. 그러한 키트에서, 4가지 유형 뉴클레오티드의 각각은 나머지 다른 3개의 뉴클레오티드 상의 표지와 동일하거나 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 대안적으로, 제1 유형의 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드이고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 표지로 표지되고, 제4 유형의 뉴클레오티드는 비표지된다(암색이다). 다른 예로서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드이고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 2가지 표지(즉, 본 명세서에 개시된 화합물, 및 제2 표지)의 조합으로 표지되고, 제4 유형의 뉴클레오티드는 비표지된다(암색이다). 하나의 유형의 뉴클레오티드가 2가지 표지의 조합으로 표지되는 경우, 그러한 유형의 뉴클레오티드의 일부는 하나의 표지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 화합물)로 표지될 수 있고, 이러한 유형의 뉴클레오티드의 다른 부분은 제2 표지로 표지될 수 있다. 따라서, 표지 화합물들 중 하나 이상은 그러한 화합물(들)이 다른 화합물과 구별될 수 있도록 하는 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있으며, 이로써 이들 화합물 각각은 나머지 다른 3개의 화합물과 구별가능하게 된다. 최대치 이외에 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있으며, 이들 차이는 이들 화합물을 구별하는 데 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 키트는 이들 화합물 중 2개 이상이 별개의 흡광도 최대치를 갖도록 할 수 있다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 500 nm 미만의 영역에서 광을 흡수한다.
본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오티드, 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 프로세스 또는 성분을 포함함)을 검출, 측정, 또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트를 사용할 수 있는 예시적인 기법에는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)이 포함된다. 이러한 사용은 자동화 서열분석 기기와 같은 특정 기법을 수행하기 위한 자동화 기기 상에서 행해질 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드(들)는 비표지된 또는 본래의 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합과 조합되어 공급될 수 있다. 뉴클레오티드들의 조합은 별개의 개별 성분들(예를 들어, 용기 또는 튜브당 하나의 뉴클레오티드 유형)로서 또는 뉴클레오티드 혼합물(예를 들어, 동일한 용기 또는 튜브 내에서 혼합된 2개 이상의 뉴클레오티드)로서 제공될 수 있다.
키트가 복수의, 특히 2개, 또는 3개, 또는 더 구체적으로 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오티드들은 상이한 염료 화합물들로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물을 함유하지 않아서 암색일 수 있다. 상이한 뉴클레오티드들이 상이한 염료 화합물들로 표지되는 경우, 이러한 염료 화합물들은 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료라는 것이 상기 키트의 특징이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료"는 2개 이상의 그러한 염료가 하나의 샘플 내에 존재할 때 형광 검출 장비(예를 들어, 시판 모세관-기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물로 표지된 2개의 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료들이, 예를 들어 동일한 레이저에 의해 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 실시 형태의 특징이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4개의 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료들 중 2개는 모두 하나의 파장에서 여기될 수 있고, 나머지 2개의 스펙트럼적으로 구별가능한 염료는 모두 다른 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 실시 형태의 특징이다. 염료에 대한 특정 여기 파장은 450 내지 460 nm, 488 nm, 또는 532 nm이다.
일 실시 형태에서, 키트는 본 발명의 화합물로 표지된 제1 뉴클레오티드 및 제2 염료로 표지된 제2 뉴클레오티드를 포함하며, 염료들은 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm의 흡광도 최대치의 차이를 갖는다. 더 구체적으로, 이들 2개의 염료 화합물은 15 내지 40 nm의 스토크스 이동(Stokes shift)을 가지며, 여기서 "스토크스 이동"은 피크 흡수 파장과 피크 방출 파장 사이의 거리이다.
추가의 실시 형태에서, 키트는 형광 염료로 표지된 2개의 다른 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 염료는 532 nm에서 동일한 레이저에 의해 여기된다. 이들 염료는 흡광도 최대치의 차이가 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm일 수 있다. 더 구체적으로, 이들 2개의 염료 화합물은 20 내지 40 nm의 스토크스 이동을 가질 수 있다. 본 발명의 염료와 스펙트럼적으로 구별가능하고 상기 기준을 충족하는 특정 염료는 미국 특허 제5,268,486호(실시예 Cy3) 또는 국제 특허 공개 WO 0226891호(Alexa 532; Molecular Probes A20106)에 기재된 바와 같은 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 바와 같은 비대칭 폴리메틴이다(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨). 대안적인 염료는 로다민 유사체, 예를 들어 테트라메틸 로다민 및 이의 유사체를 포함한다.
대안적인 실시 형태에서, 본 발명의 키트는 동일한 염기가 2개의 상이한 화합물로 표지된 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오티드는 스펙트럼적으로 구별되는 화합물, 예를 들어 600 nm 미만에서 흡수하는 '녹색' 염료로 표지될 수 있다. 제3 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물 및 스펙트럼적으로 구별되는 화합물의 혼합물로 표지될 수 있고, 제4 뉴클레오티드는 '암색'이고 표지를 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 간단히 말하면, 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 4는 '청색', '녹색', '청색/녹색', 및 암색으로 표지될 수 있다. 계측을 더 단순화하기 위하여, 4개의 뉴클레오티드가 단일 레이저로 여기되는 2개의 염료로 표지될 수 있으며, 이에 따라 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 4의 표지화는 '청색 1', '청색 2', '청색 1/청색 2', 및 암색일 수 있다.
뉴클레오티드들은 본 발명의 2개의 염료를 함유할 수 있다. 키트는 본 발명의 염료들로 표지된 2개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드는 520 nm 내지 560 nm의 영역에서 흡수하는 염료로 표지된다. 키트는 비표지된 뉴클레오티드를 추가로 수용할 수 있다.
키트가 상이한 염료 화합물들로 표지된 상이한 뉴클레오티드들을 갖는 구성들에 관하여 본 명세서에서 예시되어 있지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오티드들을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
표지된 뉴클레오티드 외에도, 키트는 적어도 하나의 추가 성분을 함께 포함할 수 있다. 추가의 성분(들)은 본 명세서에 기재된 방법에서 또는 하기 실시예 섹션에서 확인된 성분들 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 키트 내로 조합될 수 있는 성분들의 일부 비제한적인 예가 하기에 기재된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 DNA 폴리머라제(예컨대 돌연변이 DNA 폴리머라제) 및 하나 이상의 완충액 조성물을 추가로 포함한다. 하나의 완충액 조성물은 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 아스코르베이트를 포함할 수 있으며, 이는 검출 동안 광손상으로부터 염료 화합물을 보호하는데 사용될 수 있다. 추가적인 완충액 조성물은 3' 블록킹 기 및/또는 절단가능한 링커를 절단하는 데 사용될 수 있는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수용성 포스핀 또는 수용성 전이 금속 촉매는 팔라듐 착물과 같은, 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성하였다. 키트의 다양한 성분은 사용 전에 희석될 농축된 형태로 제공될 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 적합한 희석 완충액이 또한 포함될 수 있다. 역시, 본 명세서에 기재된 방법에서 확인된 성분들 중 하나 이상이 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.
제조 방법
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 발명에 따른 염료는 다양한 각종 적합한 출발 물질로부터 합성될 수 있다. 예를 들어, 화학식 IIa의 화합물은 하기 화학식 III의 화합물을 화학식 NHRbRc의 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다:
[화학식 III]
Figure pct00140
(상기 식에서, X는 S, O, 또는 NRa이고;
Y는 O 또는 NH이고;
각각의 R1, R2, R3 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, N-설폰아미도, 설포닐, S-설폰아미도, 하이드록시, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 C3-C8 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이거나; 또는 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록시, 또는 선택적으로 치환된 페닐이거나; 또는 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴을 형성하고;
Rx는 할로, -ORd 또는 -OS(O)2Rd이고;
Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
각각의 Rd는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐임).
반응은 주위 온도 또는 승온에서 유기 용매 중에서 수행될 수 있다. 유사하게, 화학식 IIa'의 화합물은 화학식 III의 화합물을 화학식 NHRbRc의 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기서 구조의 변수는 본 명세서에 정의되어 있다.
Figure pct00141
서열분석 방법
본 발명에 따른 염료 화합물을 포함하는 뉴클레오티드는, 그 자체로든 또는 더 큰 분자 구조 또는 접합체 내로 도입되거나 그와 회합되든 간에, 이러한 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법과 같은 임의의 분석 방법에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "폴리뉴클레오티드 내로 도입된"은 5' 포스페이트가 그 자체로 더 긴 폴리뉴클레오티드 사슬의 일부를 형성할 수 있는 제2 뉴클레오티드의 3' 하이드록실 기에 포스포다이에스테르 결합으로 연결됨을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드의 3' 말단은 추가의 뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 포스포다이에스테르 결합으로 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 일 비제한적인 실시 형태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 표지된 뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명의 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계, 및 (b) 상기 뉴클레오티드(들)에 부착된 염료 화합물로부터의 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 뉴클레오티드(들)의 정체를 결정하는 단계를 포함한다.
이 방법은, 본 발명에 따른 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 합성 단계 (a) 및 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드(들)를 그의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출하는 검출 단계 (b)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일부 실시 형태는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (a) 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드(예컨대 뉴클레오시드 트라이포스페이트 A, G, C 및 T)와 접촉시키는 단계로서, 상기 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드이고, 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인, 상기 단계; (b) 표지된 뉴클레오티드를 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계; 및 (c) 하나 이상의 형광 측정을 수행하여 도입된 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시 형태에서, 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인 단일 가닥 프라이머 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 형성된다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 (d) 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 뉴클레오티드로부터 표지 모이어티 및 3' 하이드록실 블록킹 기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, (e) 제거된 표지 모이어티 및 3' 블록킹 기를 프라이머 폴리뉴클레오티드 가닥으로부터 세척하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a) 내지 단계 (d) 또는 단계 (a) 내지 단계 (e)는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 적어도 일부분의 서열이 결정될 때까지 반복된다. 일부 경우에, 단계 (a) 내지 (d) 또는 단계 (a) 내지 (e)는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200회 반복된다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 도입된 뉴클레오티드로부터의 표지 모이어티 및 3' 블록킹 기는 단일 화학 반응에서 제거된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 본 방법은 자동화 서열분석 기기에서 수행되고, 자동화 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 광원을 포함한다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 폴리머라제 효소의 작용에 의한 합성 단계에서 폴리뉴클레오티드(예컨대 본 명세서에 기재된 단일 가닥 프라이머 폴리뉴클레오티드) 내로 도입된다. 그러나, 예를 들어 화학적 올리고뉴클레오티드 합성 또는 비표지된 올리고뉴클레오티드에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드의 라이게이션과 같은, 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 연결하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "도입시키는"은 화학적 방법뿐만 아니라 효소적 방법에 의한 폴리뉴클레오티드 합성을 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 합성 단계가 수행되며, 선택적으로 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 본 발명의 형광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한, 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 유리 3' 하이드록실 기와 뉴클레오티드 상의 5' 포스페이트 기 사이의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형/표적 가닥에 대한 뉴클레오티드의 상보적 염기쌍 형성에 의해 유도된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
상기 방법의 모든 실시 형태에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오티드가 도입된 폴리뉴클레오티드 가닥이 주형/표적 가닥에 어닐링되는 동안에, 또는 2개의 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오티드(들)를 도입시킨 폴리뉴클레오티드 가닥은 단리되거나 정제되고, 이어서 추가로 처리되거나 후속 분석에 사용될 수 있다. 예로서, 합성 단계에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드(들)를 도입시키는 폴리뉴클레오티드 가닥은 표지된 프로브 또는 프라이머로서 후속적으로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 단계의 산물은 추가의 반응 단계를 거칠 수 있으며, 필요하다면, 이들 후속 단계의 산물은 정제되거나 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기법에 익숙한 자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 실시 형태에서, 합성 단계는 적합한 폴리머라제 효소의 존재 하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오티드 전구체를 사용하여 주형/표적 가닥에 상보적인 신장된 폴리뉴클레오티드 가닥(프라이머 폴리뉴클레오티드 가닥)을 형성하는 표준 프라이머 신장 반응과 유사할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 합성 단계는 그 자체로서, 프라이머 폴리뉴클레오티드 가닥 및 주형 폴리뉴클레오티드 가닥의 카피로부터 유도되는 어닐링된 상보적 가닥들로 구성된 표지된 이중-가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 닉 번역(nick translation), 가닥 치환 중합, 랜덤 프라이밍된 DNA 표지화 등을 포함한다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드의 도입을 촉매할 수 있는 것이다. 다양한 천연 발생 또는 돌연변이/변형된 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리머라제가 열사이클링 조건을 사용하여 수행되는 합성 반응에는 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라제는 등온 프라이머 신장 반응에 있어서는 요구되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 표지된 뉴클레오티드를 도입시킬 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라제는 국제 특허 공개 WO 2005/024010호 또는 WO06120433호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 37℃와 같은 더 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라제일 필요는 없으며, 이에 따라 폴리머라제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥-치환 활성 등과 같은 다수의 인자에 좌우될 것이다.
구체적인 비제한적인 실시 형태에서, 본 발명은 핵산 서열분석 방법, 재서열분석 방법, 전체 게놈 서열분석 방법, 단일 뉴클레오티드 다형 점수화 방법, 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 때 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 수반하는 임의의 다른 응용을 포함한다.
특정 실시 형태에서 본 발명은 합성에 의한 폴리뉴클레오티드 서열분석 반응에 있어서의 본 발명에 따른 염료 모이어티를 포함하는 표지된 뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 일반적으로, 서열분석하고자 하는 주형/표적 핵산에 상보적인 신장된 폴리뉴클레오티드 사슬을 형성하기 위하여 폴리머라제 또는 리가제를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 순차적으로 부가하는 것을 수반한다. 부가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 정체는 검출 또는 "이미징" 단계에서 결정될 수 있다. 부가된 염기의 정체는 각각의 뉴클레오티드 도입 단계 후에 결정될 수 있다. 이어서, 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성 규칙을 사용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 정체의 결정을 위한 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오티드의 사용은, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형의 점수화에 유용할 수 있으며, 그러한 단일 염기 신장 반응은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열분석하고자 하는 주형/표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생(nascent) 가닥 내로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입을, 그러한 도입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오티드의 서열분석은 적합한 프라이머를 사용하여 프라이밍될 수 있고(또는 헤어핀의 일부로서 프라이머를 함유할 헤어핀 작제물로서 제조될 수 있고), 신생 사슬은 폴리머라제-촉매 반응에서 프라이머의 3' 말단에 대한 뉴클레오티드의 부가에 의해 단계적으로 신장된다.
특정 실시 형태에서, 상이한 뉴클레오티드 트라이포스페이트들(A, T, G 및 C) 각각은 특유의 형광단으로 표지될 수 있으며, 또한 제어되지 않은 중합을 방지하기 위해 3' 위치에 블록킹 기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 비표지될 수 있다(암색). 폴리머라제 효소는 주형/표지 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 사슬 내로 뉴클레오티드를 도입시키며, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 추가 도입을 방지한다. 임의의 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척될 수 있고, 각각의 도입된 뉴클레오티드로부터의 형광 신호는 적합한 방출 필터 및 레이저 여기를 사용하는 전하 결합 장치와 같은 적합한 수단에 의해 광학적으로 "판독"(read) 될 수 있다. 이어서, 3'-블록킹 기 및 형광 염료 화합물을 (동시에 또는 순차적으로) 제거하여(탈보호하여) 추가의 뉴클레오티드 도입을 위해 신생 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 도입된 뉴클레오티드의 정체는 각각의 도입 단계 후에 결정되겠지만, 이는 엄격히 필수적인 것은 아니다. 유사하게, 미국 특허 제5,302,509호(본 명세서에 참고로 포함됨)는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기에 예시된 바와 같이, 이 방법은 DNA 폴리머라제의 존재 하에서, 고정화된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장 가닥 내로의 형광 표지된 3'-블록킹된 뉴클레오티드 A, G, C, 및 T의 도입을 이용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기를 도입시키지만, 3'-블록킹 기에 의해 추가의 부가로부터 방지된다. 이어서, 도입된 뉴클레오티드의 표지를 결정할 수 있으며, 블록킹 기를 화학적 절단에 의해 제거하여 추가의 중합이 일어날 수 있게 할 수 있다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석하고자 하는 핵산 주형은 서열분석이 요구되는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오티드의 부가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서의 역할을 하는 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 이중-가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 영역은 상보적 가닥 상의 이러한 유리 3' 하이드록실 기를 오버행(overhang)할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 오버행 영역은 단일-가닥일 수 있지만, 서열분석하고자 하는 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에 "닉이 존재하여" 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH 기를 제공한다면 이중-가닥일 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 서열분석은 가닥 치환에 의해 진행될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 프라이머가 서열분석하고자 하는 주형의 단일-가닥 영역에 혼성화되는 별개의 성분(예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석하고자 하는 주형 가닥은 각각, 예를 들어 헤어핀 루프 구조와 같은 분자내 이중체를 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드 및 이들이 고체 지지체에 부착될 수 있는 방법이 국제 특허 공개 WO0157248호 및 WO2005/047301호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 뉴클레오티드를 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가할 수 있으며, 그 결과 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오티드 사슬이 합성될 수 있다. 첨가된 염기의 성질은 각각의 뉴클레오티드 첨가 후에 - 특히 그러나 반드시 그러한 것은 아님 - 결정되며, 이로써 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오티드) 내로의 뉴클레오티드의 도입이, 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기와의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실 기에 뉴클레오티드를 연결함으로써 행해진다.
서열분석하고자 하는 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드로 구성된 하이브리드 분자일 수 있다. 핵산 주형은, 서열분석 반응에서 주형의 카피를 방해하지 않는 한, 천연 발생 및/또는 천연 비발생 뉴클레오티드 및 천연 또는 비천연 골격 결합을 포함할 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 서열분석하고자 하는 핵산 주형은 당업계에 알려진 임의의 적합한 결합 방법을 통해, 예를 들어 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체(예를 들어, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 실시 형태에서, 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오티드의 직접 공유 부착을 가능하게 하거나, 그 자체가 고체 지지체에 비공유적으로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 다가전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오티드를 고정화하도록 하는 어떠한 방식으로 개질될 수 있다.
국제 특허 공개 WO00/06770호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들과 같이, 폴리뉴클레오티드가 지지체(예를 들어, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착된 어레이에서, 폴리뉴클레오티드는 유리 상의 펜던트 에폭사이드 기와 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노 기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정화된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 국제 특허 공개 WO2005/047301호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 황-기반 친핵체와 고체 지지체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어 각각 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO00/31148호, WO01/01143호, WO02/12566호, WO03/014392호, 미국 특허 제6,465,178호, 및 국제 특허 공개 WO00/53812호에 기재된 바와 같이, 고체-지지된 주형 폴리뉴클레오티드의 또 다른 추가의 예는 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착되어 있는 경우이다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정화될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기에 인용된 참고문헌에 그리고 국제 특허 공개 WO2005/065814호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 구체적인 하이드로겔은 국제 특허 공개 WO2005/065814호 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0079923호에 기재된 것들을 포함한다. 일 실시 형태에서, 하이드로겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어 미국 특허 제6,172,218호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 응용에 유용할 수 있다. 비드 라이브러리가 제조될 수 있으며, 여기서는 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유한다. 그들의 생성을 위한 예시적인 라이브러리 및 방법은 문헌[Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드를 사용하는 그러한 비드들의 어레이의 서열분석은 본 발명의 범주 내에 있다.
서열분석하고자 하는 주형(들)은 고체 지지체 상의 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터링된 어레이, 및 비드 어레이를 포함한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용가능하다. 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는, 고체 지지체 상에의 핵산 분자의 고정화에 의해 형성된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본질적으로 임의의 유형의 어레이 상의 주형을 서열분석하는 데 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는 클러스터링된 어레이의 서열분석과 관련하여 특히 유리하다. 클러스터링된 어레이에서, 어레이 상의 별개의 영역(종종 부위 또는 특징부로 지칭됨)들은 다수의 폴리뉴클레오티드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 이러한 다수의 폴리뉴클레오티드 분자는 광학적 수단에 의해 개별적으로 해상가능하지 않고 대신에 앙상블(ensemble)로서 검출된다. 어레이가 어떻게 형성되는지에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별 폴리뉴클레오티드 분자의 다수의 카피(예를 들어, 그 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산 종에 대해 균질함) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자들의 다수의 카피(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 카피)를 포함할 수 있다. 핵산 분자들의 클러스터링된 어레이는 당업계에서 일반적으로 알려진 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 국제 특허 공개 WO 98/44151호 및 WO00/18957호(각각 본 명세서에 참고로 포함됨)는 핵산의 증폭 방법을 기재하는데, 여기서는 고정화된 핵산 분자들의 클러스터들 또는 "콜로니"들로 구성된 어레이를 형성하기 위하여, 주형 및 증폭 산물이 고체 지지체 상에 고정화된 채로 남아 있다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이 상에 존재하는 핵산 분자들은 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 서열분석하기에 적합한 주형이다.
본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는 또한 단일 분자 어레이 상의 주형의 서열분석에 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분포된(또는 배열된) 폴리뉴클레오티드 분자들의 집단을 지칭하며, 여기서 집단의 모든 다른 것들로부터 임의의 개별 폴리뉴클레오티드의 간격은 개별 폴리뉴클레오티드 분자들을 개별적으로 해상하는 것이 가능하도록 하는 것이다. 따라서, 고체 지지체의 표면 상에 고정화된 표적 핵산 분자는 일부 실시 형태에서 광학적 수단에 의해 해상될 수 있다. 이는, 각각의 신호가 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호가, 사용되는 특정 이미징 장치의 해상가능한 영역 내에서 발생할 것임을 의미한다.
어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오티드 분자들 사이의 간격이 적어도 100 nm, 더 특히 적어도 250 nm, 훨씬 더 특히 적어도 300 nm, 더욱 더 특히 적어도 350 nm인 단일 분자 검출이 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 해상가능하고 단일 분자 형광점으로서 검출가능하고, 상기 단일 분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광표백을 나타낸다.
용어 "개별적으로 해상된" 및 "개별 해상도"는, 시각화될 때, 어레이 상의 하나의 분자를 그의 이웃하는 분자와 구별하는 것이 가능함을 명시하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들 사이의 분리는 개별 분자들을 해상하는 데 사용되는 특정 기법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 국제 특허 공개 WO 00/06770호 및 WO 01/57248호를 참조함으로써 이해될 것이며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 표지된 뉴클레오티드의 한 가지 용도는 합성에 의한 서열분석 반응에서의 것이지만, 그러한 뉴클레오티드의 유용성은 그러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는 자동화 형광 서열분석 프로토콜, 특히 Sanger 및 그 동료들의 사슬 종결 서열분석 방법에 기초한 형광 염료-종결자 사이클 서열분석에 사용될 수 있다. 그러한 방법은 일반적으로 효소, 및 프라이머 신장 서열분석 반응에서 형광 표지된 다이데옥시뉴클레오티드를 도입시키는 사이클 서열분석을 사용한다. 이른바 Sanger 서열분석 방법, 및 관련 프로토콜(Sanger-유형)은 표지된 다이데옥시뉴클레오티드를 갖는 랜덤화된 사슬 종결을 이용한다.
따라서, 본 발명은 또한 3' 및 2' 위치 둘 모두에서 하이드록실 기가 결여된 다이데옥시뉴클레오티드인 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 그러한 변형된 다이데옥시뉴클레오티드는 Sanger 유형 서열분석 방법 등에 사용하기에 적합하다.
3' 블록킹 기를 도입시킨 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드 - 이것은 인식될 것임 - 가 또한 Sanger 방법 및 관련 프로토콜에 이용될 수 있는데, 그 이유는, 다이데옥시 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성되는 것과 동일한 효과가 3' OH 블록킹 기를 갖는 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성될 수 있기 때문이다: 둘 모두는 후속 뉴클레오티드의 도입을 방지한다. 본 발명에 따르고 3' 블록킹 기를 갖는 뉴클레오티드가 Sanger-유형 서열분석 방법에서 사용되는 경우, 뉴클레오티드에 부착된 염료 화합물 또는 검출가능한 표지는 절단가능한 링커를 통해 연결될 필요가 없음이 이해될 것인데, 그 이유는, 본 발명의 표지된 뉴클레오티드가 도입되는 각각의 경우에, 뉴클레오티드는 후속으로 도입될 필요가 없으며, 이에 따라 표지는 뉴클레오티드로부터 제거될 필요가 없기 때문이다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 서열분석 방법은 비표지된 뉴클레오티드 및 본 명세서에 기재된 형광 염료를 함유하는 친화성 시약을 사용하여 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 (a)의 도입 혼합물 내의 4개의 상이한 유형의 뉴클레오티드(예컨대, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP) 중 1개, 2개, 3개 또는 각각은 비표지될 수 있다. 4개의 유형의 뉴클레오티드의 각각(예컨대, dNTP)은 3' 하이드록시 블록킹 기를 가져서, 단일 염기만 폴리머라제에 의해 프라이머 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 첨가될 수 있도록 보장한다. 단계 (b)에서 비표지된 뉴클레오티드의 도입 후에, 나머지 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척된다. 이어서, 도입된 dNTP를 포함하는 표지된 신장 생성물을 제공하기 위해 도입된 dNTP를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 친화성 시약이 도입된다. 합성에 의한 서열분석에서 비표지된 뉴클레오티드 및 친화성 시약의 용도는 국제 특허 공개 WO 2018/129214호 및 WO 2020/097607호에 개시되어 있다. 비표지된 뉴클레오티드를 사용하는 본 발명의 변형된 서열분석 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다:
(a') 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 하나 이상의 비표지된 뉴클레오티드(예컨대, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 또는 dUTP)와 접촉시키는 단계로서, 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인, 상기 단계;
(b') 뉴클레오티드를 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입시켜 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계;
(c') 도입된 비표지된 뉴클레오티드에 하나의 친화성 시약이 특이적으로 결합하는 조건 하에서, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 친화성 시약의 세트와 접촉시켜 표지된 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 제공하는 단계;
(d') 도입된 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위해 표지된 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체의 하나 이상의 형광 측정을 수행하는 단계.
본 명세서에 기재된 변형된 서열분석 방법의 일부 실시 형태에서, 도입 혼합물 내의 비표지된 뉴클레오티드의 각각은 3' 하이드록시 블록킹 기를 함유한다. 추가의 실시 형태에서, 도입된 뉴클레오티드의 3' 하이드록시 블록킹 기는 다음 도입 사이클 전에 제거된다. 더 추가의 실시 형태에서, 본 방법은 도입된 뉴클레오티드로부터 친화성 시약을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 더 추가의 실시 형태에서, 3' 하이드록시 블록킹 기 및 친화성 시약은 동일한 반응에서 제거된다. 일부 실시 형태에서, 친화성 시약의 세트는 제1 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 제2 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약, 및 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 포함할 수 있다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제1 친화성 시약, 제2 친화성 시약, 및 제3 친화성 시약의 각각은 스펙트럼적으로 구별가능한 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 시약은 단백질 태그, 항체(항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체 등의 결합 단편을 포함하지만 이로 한정되지 않음), 압타머(aptamer), 노틴(knottin), 아피머(affimer), 또는 도입된 뉴클레오티드에 적합한 특이성 및 친화성으로 결합하는 임의의 다른 공지된 제제를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 친화성 시약은 항체 또는 단백질 태그이다. 다른 실시 형태에서, 제1 유형, 제2 유형 및 제3 유형의 친화성 시약 중 적어도 하나는 하나 이상의 검출가능한 표지(예를 들어, 동일한 검출가능한 표지의 다수의 카피)를 포함하는 항체 또는 단백질 태그이며, 여기서 검출가능한 표지는 본 명세서에 기재된 비스-보론 염료 모이어티이거나 이를 포함한다.
실시예
추가의 실시 형태가 하기의 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되지 않는다.
실시예 1. 화학식 I의 화합물의 합성
출발 물질 SM1의 합성:
Figure pct00142
(벤조피난-2-일)아세트산(0.75 g)을 다이클로로메탄(20 mL) 중 4-플루오로-2-하이드록시벤즈알데하이드(1.04 g)와 혼합하였다. N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보다이이미드 하이드로클로라이드(1.1 g), 4-(다이메틸아미노)피리딘(980 mg) 및 다이아이소프로필에틸아민(1.38 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후에, 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 중에 현탁시키고, 진공 여과에 의해 침전물을 수집하고, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시켜 생성물을 황색 고체로서 얻었다. 수율 780 mg (52%). 19F NMR (376 ㎒, DMSO) δ -105.29.
출발 물질 SM2의 합성:
Figure pct00143
다이클로로메텐(20 mL) 중 (티오펜-2-일)아세트산(0.84 g, 5.9 mmol), 4-플루오로-2-하이드록시벤즈알데하이드(0.75 g, 5.35 mmol), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드(1.23 g, 6.4 mmol), 4-(다이메틸아미노)피리딘(981 mg, 8 mmol) 및 에틸다이아이소프로필아민(1.38 g, 11 mmol)의 혼합물을 50℃에서 교반하면서 가열하였다. 약 5분 만에 황색 침전물이 형성되었다. UV 하에서 강한 형광을 발하였다. 1시간 후에, 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 중에 현탁시키고, 진공 여과에 의해 침전물을 수집하고, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시켰다. 수율 1.1 g (77%).
일반 합성 절차 (스즈키(Suzuki) 가교결합)
다이메틸포름아미드와 물의 혼합물 중 적절한 3-할로-쿠마린(1 eq) 및 아릴/헤테로아릴 보론산 또는 에스테르(1.1 eq)를 염기(탄산나트륨)의 존재 하에 촉매량의 PdCl2(PPh3)2로 처리하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 가열하고 후속하여 실온으로 냉각시켰다. 생성물 단리를 위해, 이 반응 혼합물을 물로 희석하고, HCl(1M)로 산성화하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 분획을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 일반적으로 반고체 잔류물인 조 물질을 유기 용매(예를 들어 DCM)로 배산(triturate)시키고, 생성물을 여과에 의해 단리하였다.
화합물: I-2: 2-(7-(다이에틸아미노)-4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-3-일)푸란-4-카르복실산
Figure pct00144
다이메틸포름아미드(1.6 mL) 및 물(0.4 mL) 중 3-브로모-7-다이에틸아미노-4-메틸-쿠마린(50 mg, 0.22 mmol) 및 2-보라노푸란-4-카르복실산(51 mg, 0.22 mmol)을 다이클로로메탄과의 착물인 1,1′-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐 (II)(PdCl2(dppf).DCM, 2.6 mg, 3.2 μmol, 1.5 mol %) 및 Na2CO3(59 mg, 0.56 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 6시간 동안 가열하고 후속하여 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 H2O로 희석하고, HCl (1M)로 산성화하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기물을 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 분취용 HPLC로 정제하였다. 수율 7%. LC-MS (-): m/z 340 (M-1)-; (+): 342 (M+1)+, 683 (2M+1)+. EtOH 395 nm에서 최대 흡수. EtOH 485 nm에서 최대 방출(400 nm에서 여기).
화합물 I-3: 5-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)푸란-2-카르복실산
Figure pct00145
상기에 기재된 일반 커플링 절차에 따라 화합물 I-3을 제조하였다. 수율 46%. LC-MS (-) m/z 326 (M-1)-. 2-보로노푸란-4-카르복실산을 대신 사용하여 화합물 I-3과 유사한 절차에 따라 화합물 I-1을 제조하였다.
화합물 I-4: 2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-6-카르복실산
Figure pct00146
다이메틸포름아미드(10 mL) 및 물(5 mL) 중 3-브로모-7-다이에틸아미노 쿠마린(135 mg, 0.40 mmol) 및 2-보로노벤조푸란-6-카르복실산(113 mg, 0.55 mmol)을 PdCl2(PPh3)2(11 mg, 16 μmol, 5 mol%) 및 Na2CO3(68 mg, 0.64 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 가열하고 후속하여 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 H2O로 희석하고, HCl (1M)로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기물을 염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 다이클로로메탄 중에 배산시키고 진공 하에서 여과하여 생성물을 단리하였다. 수율 76 mg (50%). LC-MS (-) m/z 376 (M-1)-.
화합물 I-5: 2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-5-카르복실산
Figure pct00147
상기에 기재된 일반 커플링 절차에 따라 화합물 I-5를 제조하였다. 수율 (36%). LC-MS (-): m/z 376 (M-1)-; (+): 378 (M+1) +, 755 (2M+1)+.
화합물 I-6: 2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티오펜-5-카르복실산
Figure pct00148
상기에 기재된 일반 커플링 절차에 따라 화합물 I-6을 제조하였다. 수율 78%. LC-MS (-): m/z 342 (M-1)-; (+): 344 (M+1) +, 687 (2M+1)+. EtOH 432 nm에서 최대 흡수. EtOH 506 nm에서 최대 방출(450 nm에서 여기).
화합물 I-7: 2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-1-메틸-1H-인돌-5-카르복실산
Figure pct00149
상기에 기재된 일반 커플링 절차에 따라 화합물 I-7을 제조하였다. 수율 80%. LC-MS (-): m/z 389 (M-1)-; (+): 391 (M+1) +. EtOH 407 nm에서 최대 흡수.
화합물 I-8a: 3-(N-(3-(사이클로옥타-1,3,5,7-테트라엔-1-카르복사미도)프로필)-2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-6-카르복사미도)프로판-1-설폰산
Figure pct00150
다이메틸포름아미드-물 혼합물(2:1) 중 3-브로모-7-플루오로-쿠마린 및 2-보로노벤조푸란-6-카르복실산으로부터 일반 커플링 절차에 따라 2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-6-카르복실산을 제조하였다. 용매 증발 후에, 조 잔류물을 다이아이소프로필에테르로 배산시키고, 여과에 의해 생성물을 단리하였다. 수율 57%. LC-MS (-) m/z 323 (M-1)-.
Figure pct00151
다이메틸아세트아미드(5 mL) 중 2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-6-카르복실산(100 mg, 0.31 mmol)을 벤조트라이아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, 193 mg, 0.37 mmol) 및 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 1 mL)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 다이메틸아세트아미드(3 mL) 중 3-((3-(사이클로옥타-1,3,5,7-테트라엔-1-카르복사미도)프로필)아미노)프로판-1-설폰산(COT-S, 110 mg, 0.37 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 교반하고, 2 M HCl로 산성화하였다. 생성된 침전물을 여과에 의해 단리하고 아세토니트릴로 세척한 다음 분취용 HPLC로 정제하여 2-(N-(2-(사이클로옥타-1,3,5,7-테트라엔-1-카르복사미도)에틸)-2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)벤조푸란-6-카르복사미도)에탄-1-설폰산(화합물 I-8b)을 수득하였다. 수율: 33 mg (18%). LC-MS (-) m/z 603 (M-1)-.
Figure pct00152
DMSO(3 mL) 중 화합물 I-8b(33 mg, 55 μmol), 트라이에틸아민(15 μL, 110 μmol) 및 4-아미노부탄산(11 mg, 110 μmol)을 80℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 추가량의 4-아미노부탄산(1 eq) 및 트라이에틸아민(2 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 110℃에서 24시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 아세토니트릴 및 TEAB(0.1M)로 희석하였다. 최종 생성물을 단리하고, 분취용 HPLC로 정제하였다. 수율 42%. LC-MS (-) m/z 686 (M-1)-, 343(M-1)2-. EtOH 426 nm에서 최대 흡수. EtOH 482 nm에서 최대 방출(430 nm에서 여기).
화합물 I-9:1-(3-(벤조푸란-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일)피페리딘-4-카르복실산
Figure pct00153
3-(벤조푸란-2-일)-7-플루오로-2H-크로멘-2-온(280 mg), 다이아이소프로필에틸아민(0.1 mL) 및 아이소니페코트산(129 mg)을 DMSO(2 mL) 중에서 120℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 아세토니트릴(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석하였다. 고체 침전물을 여과하고, 물로 세척하였다. 수율 170 mg (약 44%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 8.49 (s, 1H), 7.74 - 7.68 (m, 2H), 7.60 (dd, J = 8.1, 1.0 ㎐, 1H), 7.50 (d, J = 1.0 ㎐, 1H), 7.34 (ddd, J = 8.3, 7.2, 1.4 ㎐, 1H), 7.27 (td, J = 7.5, 1.1 ㎐, 1H), 7.06 (dd, J = 9.0, 2.5 ㎐, 1H), 6.91 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 4.02 - 3.88 (m, 2H), 3.07 (td, J = 13.4, 12.7, 3.1 ㎐, 2H), 1.95 - 1.84 (m, 2H), 1.67 - 1.54 (m, 2H).
화합물 I-10: 1-[2-옥소-3-(티오펜-2-일)-2H-크로멘-7-일)피페리딘-4-카르복실산
Figure pct00154
3-(티오펜-2-일)-7-플루오로-2H-크로멘-2-온(280 mg), 다이아이소프로필에틸아민(0.1 mL) 및 아이소니페코트산(147 mg)을 DMSO(2 mL) 중에서 110℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 아세토니트릴(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석하였다. 고체 침전물을 여과하고, 물로 세척하였다. 수율 135 mg (약 33%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 12.26 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 3.7, 1.2 ㎐, 1H), 7.58 (d, J = 0.9 ㎐, 1H), 7.58 - 7.55 (m, 1H), 7.15 (dd, J = 5.1, 3.7 ㎐, 1H), 7.04 (dd, J = 8.9, 2.5 ㎐, 1H), 6.90 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 3.97 - 3.87 (m, 2H), 3.04 (ddd, J = 14.0, 11.6, 3.0 ㎐, 2H), 1.90 (dd, J = 13.8, 3.4 ㎐, 2H), 1.68 - 1.52 (m, 3H).
화합물 I-11: N-[2-옥소-3-(티오펜-2-일)-2H-크로멘-7-일]-N-(2-설포에틸)글리신
Figure pct00155
3-(티오펜-2-일)-7-플루오로-2H-크로멘-2-온 및 N-(2-설포에틸)글리신으로부터 본 명세서에 기재된 유사한 절차에 따라 화합물 I-11을 제조하였다. 수율 28%.
화합물 I-12: 1-[3-(3-설포-벤조푸란-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일]피페리딘-4-카르복실산
Figure pct00156
화합물 I-9 (390 mg)를 냉각된 황산(1 g)에 첨가하고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 무수 다이에틸 에테르로 배산시켰다. 결정질 생성물을 여과에 의해 수집하고 에탄올 및 에테르 혼합물(1:1, 5 mL)로 세척하였다. 수율 290 mg (62%). LC-MS m/z (-) 468 (M-1)-.
화합물 I-13: 1-[3-(5-설포-티오펜-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일]피페리딘-4-카르복실산
Figure pct00157
화합물 I-10(710 mg)을 냉각된 황산(1 g)에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하고 추가로 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 무수 다이에틸 에테르 및 아세토니트릴과 배산시켰다. 생성물을 여과에 의해 수집하고 에탄올 및 에테르 혼합물(1:1, 2 x 5 mL)로 세척하였다. 수율 720 mg (83%). LC-MS m/z (-) 434 (M-1)-.
화합물 I-14: 1-(3-(벤조푸란-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일)피페리딘-2-카르복실산
Figure pct00158
3-(벤조푸란-2-일)-7-플루오로-2H-크로멘-2-온(실시예 I-1, 280 mg), 다이아이소프로필 에틸아민(0.1 mL) 및 피페리딘-2-카르복실산(155 mg)을 DMSO(2 mL) 중에서 110℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 아세토니트릴(3 mL) 및 물(2 mL)로 희석하였다. 고체 침전물을 여과하고, 물로 세척하였다. 수율 125 mg (32%).
실시예 2. 화학식 I의 염료의 화학적 안정성의 비교
염료 I-1, 염료 I-2 및 참조 염료 A로 표지된 3개의 ffC를 암실에서 37℃에서 도입 완충액 중에 각각 유지하였다. 이어서, 형광 신호 강도를 48시간 동안 검사하였고, 정규화된 것이 도 1에 나타나 있다. 결과는 화학식 I의 새로운 염료로 표지된 ffC가 참조 염료 A로 표지된 ffC보다 화학적으로 더 안정하다는 것을 입증한다.
또 다른 실험에서, 염료 I-3a, 염료 I-4a 및 참조 염료 A로 표지된 3개의 ffC를 37℃에서 8일 동안 글리신 완충액 중에 유지하였다. 이어서, 잔류 형광 신호 강도를 검사하였고, 도 2에 나타내었다. 글리신 완충액에서 가열한 후 시간 경과에 따라 형광 강도가 감소하는 것으로 관찰되었다. 염료 I-3a 및 염료 I-4a는 모두 염료 A보다 개선된 화학적 안정성을 나타내었다.
또한, 염료 I-8a로 표지된 ffC의 스펙트럼 특성을 실온에서 스캔 믹스에서 측정하였다(460 nm에서 여기). 여기/방출 스펙트럼(Ex/Em)은 434/494 nm이다.
화학식 I의 화합물 및 참조 염료 A로 표지된 ffC의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
실시예 3. 화학식 II 또는 화학식 II'의 화합물의 합성
일반 합성 도식
화학식 II의 화합물은 하기 일반 반응 도식(여기서 Y는 O 또는 NH임)에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00164
또는
Figure pct00165
화합물 II-51a: 에틸 2-(2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트
Figure pct00166
절차 A: 에탄올(100 mL) 중 2-시아노티오아세트아미드(5 g, 50 mmol, 1 eq), 4-플루오로살리실산 알데하이드(7.7 g, 55 mmol, 1.1 eq), 에틸 4-클로로-아세토아세테이트(9.9 g, 60 mmol, 1.2 eq)를 약 70℃에서 2시간 동안 가열하였다. 테트라부틸암모늄 브로마이드(NBu4Br, 0.5 g)를 첨가하고 반응 혼합물을 90℃에서 1.5시간 동안 가열하고 실온에서 밤새 교반되게 두었다. 이어서 침전물을 여과하고, 에탄올(약 5 mL) 및 물(2x15 mL)로 세척하였다. EtOH로부터의 결정화. 수율 11 g (약 67%).
Figure pct00167
절차 B: 에탄올(5 mL) 중 4-플루오로-2-하이드록시벤즈알데하이드(1.5 g, 1.1 eq), 에틸 3-아미노-3-티옥소프로파노에이트(1.5 g, 1.0 eq) 및 에틸 4-브로모아세토아세테이트(2.3 g, 1.1 eq)를 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, 소량의 에탄올로 세척하고, 물(약 15 mL) 및 중탄산나트륨(1.1 eq) 중에 현탁시키고, 혼합물을 10분 동안 교반하고, 침전물을 여과하였다. 물로 세척하였다. 표적 화합물을 오프 화이트 고체로서 단리하였다.
Figure pct00168
4-플루오로-2-하이드록시벤즈알데하이드(5 g, 1 eq) 및 에틸 3-아미노-3-티옥소프로파노에이트(5.8 g, 1.1 eq)를 EtOH (50 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반되게 두었다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, 소량의 에탄올로 세척하였다. 수율 6.6 g (83%).
에탄올(5 mL) 중 7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-카르보티오아미드(2 g, 1.0 eq) 및 에틸 4-브로모아세토아세테이트(1.87 g, 1 eq)를 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, 소량의 에탄올로 세척하고, 물(약 15 mL) 및 중탄산나트륨(1 g) 중에 현탁시키고, 혼합물을 10분 동안 교반하고, 침전물을 여과하였다. 물로 세척하였다. 표적 화합물을 오프 화이트 고체로서 단리하였다.
화합물 II-51a의 제조에서 상기에 기재된 유사한 절차에 따라 화합물 II-51d(에틸 2-(2-(7-브로모-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트)를 제조하였다. 수율: 약 80%.
화합물 II-60a: 에틸 2-(2-(6-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트
Figure pct00169
화합물 II-51a의 제조에 기재된 절차 A와 유사하게 화합물 II-60a를 제조하였다. 수율: 약 50%.
화합물 II-54a: 에틸 2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4-메틸티아졸-5-카르복실레이트
Figure pct00170
다이메틸포름아미드(3 mL) 중 7-플루오로-3-티오카르바모일쿠마린(450 mg, 1 eq)과 에틸 2-클로로아세토아세테이트(365 mg, 1.1 eq)의 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하고 실온에 밤새 두었다. 이어서 반응 혼합물을 물(5 mL)로 희석하고 중탄산나트륨으로 중화시켰다. 침전물을 여과하고 에탄올로부터 결정화하였다. 수율 약 81%.
화합물 II-51: (2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세트산
Figure pct00171
7-플루오로-3-[(4-에톡시카르보닐메틸)-2-티아졸릴]-2H-벤조피라논-2(1 g, 3 mmol, 1 eq)를 물(5 mL) 중에 현탁시키고, 에탄올(0.5 mL) 및 수산화리튬(0.36 g, 15 mmol, 5 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 35℃에서 약 3시간 동안 교반하였다. 거의 투명한 용액을 여과하고, 여과액을 아세트산(1.5 mL)으로 산성화하고, 실온에 밤새 두었다. 이어서, 생성물을 여과하고, 냉수(2x1 0.5 mL)로 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 수율 0.76 g (83%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ 8.97 (s, 1H), 8.14 (dd, J = 8.8, 6.4 ㎐, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.53 (dd, J = 9.7, 2.5 ㎐, 1H), 7.35 (td, J = 8.8, 2.5 ㎐, 1H), 3.83 (s, 2H). 19F NMR (376 ㎒, DMSO) δ -104.37.
화합물 II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 화합물 II-51d로부터 2-(2-(7-브로모-2-옥소-2H-크로멘-3-일) 티아졸-4-일)아세트산(화합물 II-51c)을 제조하였다. 수율 약 75%.
화합물 II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 화합물 II-60a로부터 (2-(6-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세트산(화합물 II-60)을 제조하였다. 수율 약 83%.
50℃에서 물-DMSO 혼합물 중에서 화합물 II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 화합물 II-54a로부터 (2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4-메틸티아졸-5-카르복실산(화합물 II-54)을 제조하였다. 수율 약 80%.
화합물 II-52: (2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-카르복실산
Figure pct00172
이 화합물을 약 80℃에서 1시간 동안 에탄올 중에서 II-51의 제조에서 상기에 기재된 유사한 절차에 따라 제조하였다. 침전물을 여과하였다. 이어서 이미노 유도체를 물과 함께 1시간 동안 교반하여 가수분해하였다. 여과 후 아세트산을 사용한 NaHCO3 또는 Na2CO3 용액으로부터의 재침전에 의해 제거될 수 있는 부산물로서 에틸 에스테르를 함유할 수 있다. 수율 약 74%. LC-MS: (+) m/z 292(M+1); (-) m/z 290 (M-1)-, 581 (2M-1)-.
화합물 II-1: 2-(2-(2-옥소-7-((3-설포프로필)아미노)-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세트산
Figure pct00173
DMSO 중 화합물 II-51(1.0 eq) 및 3-아미노프로판설폰산(2.0 eq)을 DIPEA(2.0 eq)로 처리하고 110℃에서 18시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시키고, 0.1M TEAB/MeCN으로 희석하고, 분취용 HPLC로 정제하였다. 합한 HPLC 분획을 진공에서 건조시켰다. 수율 약 10%. 최대 흡수 431 nm (EtOH). LC-MS: (+) m/z 425(M+1).
DMSO 중에서 화합물 II-51a(1.0 eq) 및 3-아미노프로판설폰산(2.0 eq)을 반응시켜 3-[(3-(4-(2-에톡시카르보닐메틸)티아졸-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일)아미노]프로판-1-설폰산(화합물 II-1a)을 제조하고 DIPEA(2.0 eq)로 처리하고 100oC에서 12시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시키고, 0.1M TEAB/MeCN으로 희석하고, 분취용 HPLC로 정제하였다. 수율 약 14%.
화합물 II-2a: 에틸 2-[2-(다이에틸아미노-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4-티아졸릴]아세테이트
Figure pct00174
7-다이에틸아미노-3-티오카르바모일-2H-벤조피론-2(276 mg, 1 eq)와 에틸 4-클로로아세토아세테이트(180 mg, 1.1 eq)의 혼합물을 0.5시간 동안 DMF(2.5 mL) 중에서 100oC에서 교반하고 실온에 밤새 두었다. 이어서, 반응 혼합물을 물(2.5 mL)로 희석하고, 중탄산나트륨 첨가하고, 황색 침전물을 여과하였다. 에탄올로부터 결정화될 수 있다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ 8.74 (s, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.81 (dd, J = 9.1, 2.4 ㎐, 1H), 6.65 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 4.12 (q, J = 7.1 ㎐, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.49 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 1.21 (t, J = 7.1 ㎐, 3H), 1.15 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화합물 II-51의 제조에 기재된 일반적인 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 II-2a를 LiOH와 반응시켜 [2-(7-다이에틸아미노-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세트산(화합물 II-2)을 제조하였다. 수율 약 93%. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ 12.43 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 7.46 (d, J = 0.7 ㎐, 1H), 6.81 (dd, J = 9.0, 2.5 ㎐, 1H), 6.65 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 3.78 (d, J = 0.8 ㎐, 2H), 3.49 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 1.15 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화합물 II-2b: 에틸 2-(2-(7-다이에틸아미노-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트
Figure pct00175
EtOH (50 mL) 중 2-시아노티오아세트아미드(2 g, 1 eq), p-다이에틸아미노살리실산 알데하이드(3.86 g, 1 eq), 에틸 4-브로모아세토아세테이트(3.45 mL, 1 eq)를 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 트라이에틸아민(0.25 g)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 다시 1.5시간 동안 교반하고 침전된 생성물을 여과하였다. 수율 약 45.5%. LC-MS: (+) 386 (M+1)+.
화합물 II-5b: p-[2-(7-(다이에틸아미노)-2-이미노-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]벤조산
Figure pct00176
EtOH(50 mL) 중 2-시아노티오아세트아미드(0.41 g, 1 eq), p-다이에틸아미노살리실산 알데하이드(0.8 g, 1 eq), 4-(2-브로모아세틸)벤조산(1 g, 1 eq)을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 트라이에틸아민(0.25 g)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 다시 1.5시간 동안 교반하고 침전된 생성물을 여과하였다. 수율 약 89%. LC-MS: (+) 420 (M+1)+.
EtOH-물-HCl의 혼합물 중에서 화합물 II-5b를 가수분해하여 p-[2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]벤조산(화합물 II-5)을 제조하였다. 생성물을 여과하고 EtOH로 세척하였다. 수율 95%. 1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 12.99 (s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.28 - 8.17 (m, 2H), 8.10 - 7.95 (m, 2H), 7.78 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 6.86 (dd, J = 9.0, 2.4 ㎐, 1H), 6.68 (d, J = 2.3 ㎐, 1H), 3.51 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 1.16 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화합물 II-7: 2-[2-옥소-7-((3-설포프로필)아미노)-2H-크로멘-3-일]티아졸-5-카르복실산
Figure pct00177
10 mL 1구 둥근 바닥 플라스크에 7-플루오로 쿠마린(89 mg, 300 μmol), 3-아미노-1-프로판설폰산(125 mg, 900 μmol) 및 DMSO(2 mL)를 첨가하였다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 261μl, 1500μmol)을 플라스크에 첨가하고 80℃로의 가열을 시작하였다. 가열 시, 반응 혼합물은 담황색에서 주황색/적색으로 색이 변하였다. 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(3 mL)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 20 μm 나일론 필터를 통해 반응 혼합물을 여과하였다. 분취용 HPLC(Axia 컬럼, 구배 6-20)를 통해 조 재료를 정제하였다. 수율: 28.6 μmol (9.5%).
화합물 II-8: 4-메틸-2-[2-옥소-7-((3-설포프로필)아미노)-2H-크로멘-3-일]티아졸-5-카르복실산
Figure pct00178
10 mL 1구 둥근 바닥 플라스크에 화합물 II-54(110 mg, 360 μmol), 3-아미노-1-프로판설폰산(150 mg, 1080 μmol) 및 DMSO(2mL)를 첨가하였다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 313 μL, 1800 μmol)을 플라스크에 첨가하였다. 반응물을 100℃에서 5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(3 mL)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 20 μm 나일론 필터를 통해 반응 혼합물을 여과하였다. 분취용 HPLC(Axia 컬럼, 구배 10-22)에 의해 조 재료를 정제하였다. 수율: 74.5 μmol, 21%. 439 nm에서의 흡수 (10mM TRIS pH =8 중).
화합물 II-11a: 에틸 2-(2-(7-에틸아미노-2-옥소-6-메틸-2H-크로멘-3-일)-4-티아졸릴)아세테이트
Figure pct00179
무수 아세토니트릴 중 3-(에틸아미노)-p-크레졸(1 eq), 무수 이염화마그네슘(1.5 eq) 및 무수 트라이에틸아민(3.5 eq)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 파라포름알데하이드(6.5 eq)를 첨가하고 4시간 동안 환류하면서 교반을 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수성 HCl(10%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기층을 물로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압 하에서 농축하고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 수율:15 내지 20%.
Figure pct00180
EtOH(3 mL) 중 2-에톡시카르보닐티오아세트아미드(300 mg, 1 eq), 3-에틸아미노-4-메틸살리실산 알데하이드(402 mg, 1.1 eq), 에틸 3-클로로-2-옥소부타노에이트(403 mg, 1.2 eq)를 약 70oC에서 2시간 동안 가열하고, 이어서 90oC에서 0.5시간 동안 가열하고, 실온에서 밤새 교반되게 두었다. 이어서 침전물을 여과하고, EtOH(약 0.5 mL) 및 물(2x0.5 mL)로 세척하였다. 수율 330 mg (약 43%).
화합물 II-11b: 2-[2-(7-(부틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세트산
Figure pct00181
DMSO (0.5 mL) 및 DIPEA (23 μl, 132 μmol) 중에서 화합물 II-51(20 mg, 66 μmol), 부틸아민(10 mg, 133 μmol)을 반응시켜 화합물 II-11b를 제조하였다. 110oC에서 5시간 동안 가열한 후에, 반응 혼합물을 물(2 mL)로 희석하였다. 주황색 고체를 여과하고 건조시켰다. 수율 6 mg (25%). LC-MS (+): 359 (M+1).
화합물 II-12a: 에틸 2-(2-(7-플루오로-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4-메틸-티아졸-5-일)아세테이트
Figure pct00182
EtOH(100 mL) 중 2-에톡시카르보닐티오아세트아미드(5 g, 50 mmol, 1 eq), p-다이에틸아미노살리실산 알데하이드(7.7 g, 55 mmol, 1.1 eq), 에틸 3-클로로-2-옥소부타노에이트(6.7 g, 41 mmol, 1.2 eq)를 약 70oC에서 2시간 동안 가열하였다. 테트라부틸암모늄 브로마이드(0.5 g)를 첨가하고 반응 혼합물을 90℃에서 0.5시간 동안 가열하고 실온에서 밤새 교반되게 두었다. 이어서 침전물을 여과하고, EtOH(약 5 mL) 및 물(2x15 mL)로 세척하였다. EtOH로부터의 결정화. 수율 11.2 g (약 85%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ 8.87 (s, 1H), 7.77 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 6.85 (dd, J = 9.1, 2.5 ㎐, 1H), 6.67 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 4.28 (q, J = 7.1 ㎐, 2H), 3.51 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 2.68 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.1 ㎐, 3H), 1.16 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화합물 II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 화합물 II-12a를 LiOH와 반응시켜 [2-(7-다이에틸아미노-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4-메틸-티아졸-5-일)카르복실산(화합물 II-12)을 제조하였다. 표적 화합물을 에탄올로부터의 결정화에 의해 단리하였다. 수율 58%. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ 8.86 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.1 ㎐, 1H), 6.84 (dd, J = 9.1, 2.5 ㎐, 1H), 6.66 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 3.51 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 2.67 (s, 3H), 1.16 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화합물 II-12b: 에틸 2-(2-(7-플루오로-2-이미노-2H-크로멘-3-일)-4-메틸-티아졸-5-일)아세테이트
Figure pct00183
EtOH(80 mL) 중 2-시아노티오아세트아미드(5 g, 50 mmol, 1 eq), p-다이에틸아미노살리실산 알데하이드(10.6 g, 55 mmol, 1.1 eq), 3-브로모-2-옥소부타노에이트(12.52 g, 60 mmol, 1.2 eq)를 실온에서 3시간 동안 가열하였다. 침전물을 여과하고, EtOH(약 5 mL)로 세척하였다. 수율 9 g (47%). 이 화합물을 묽은 염산 중에서 화합물 II-12a로 가수분해하였다.
화합물 II-33a: 2-[2-(7-(3-(tert-부톡시카르보닐)아제티딘-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세트산
Figure pct00184
DMSO(0.5 mL) 및 DIPEA(35 μL, 200 μmol) 중 화합물 II-51(31 mg, 100 μmol), 3-(tert-부톡시카르보닐)아제티딘 하이드로클로라이드(39 mg, 200 μmol)를 90oC에서 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 생성물을 분취용 HPLC로 단리하였다. 수율: 25%.
II-33a의 제조에서의 유사한 절차에 따라 DMSO(1mL) 및 DIPEA(35 μl, 200 μmol) 중 화합물 II-51(31 mg, 100 μmol), 아제티딘(13.5 μL, 200 μmol)을 반응시켜 2-[2-(7-(아제티딘-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세트산(화합물 II-33)을 제조하였다. 수율: 49 μmol (49%). LC-MS (+): 343 (M+1).
화합물 II-43c: 에틸 2-(7-(에틸아미노)-6-메틸-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-6-카르복실레이트
Figure pct00185
2-브로모-4-에톡시카르보닐사이클로헥사논(400 mg, 1.8 mmol), 2-하이드록시-4-에틸아미노-5-메틸 벤즈알데하이드(293mg, 1.64 mmol), 에틸-3-아미노-3-티옥소프로포네이트(265 mg, 1.8 mmol)를 에탄올(10mL)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 교반하고 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이 시간이 끝날 때까지 출발 물질이 소모된다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 진공에서 제거하고, 이어서 고체 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 용액을 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 건조시켰다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 진공에서 건조시켜 황색 분말을 수득하였다. 수율 75 mg (11%). 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 7.32 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.19 (qd, J = 7.1, 1.0 ㎐, 2H), 3.30 (dd, J = 7.6, 3.9 ㎐, 2H), 3.17 - 3.01 (m, 2H), 3.01 - 2.76 (m, 2H), 2.36 - 2.25 (m, 1H), 2.21 - 2.14 (m, 3H), 2.10 - 1.97 (m, 1H), 1.48 (d, J = 31.1 ㎐, 2H), 1.37 (td, J = 7.1, 1.7 ㎐, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 ㎐, 3H).
화합물 II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 II-43c를 LiOH와 반응시켜 2-(7-(에틸아미노)-6-메틸-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-6-카르복실산(화합물 II-43b)을 제조하였다. 수율: 54%. UV-Vis: 50% EtOH/H2O 중에서 Abs 441nm. 형광: 50% EtOH/H2O 중에서 498 nm.
화합물 II-43e: 에틸 2-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)-4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00186
4-다이에틸아미노-살리실알데하이드(0.35g, 1.82 mmol), 에틸 3-브로모-2-옥소사이클로헥산-1-카르복실레이트(0.5 g, 2.00 mmol) 및 에틸-3-아미노-3-티옥소프로포네이트(0.29 g, 2.00 mmol)를 에탄올(20 mL)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 교반하고 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이 시간이 끝날 때까지 출발 물질이 소모된다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 진공에서 제거하고, 이어서 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 용액을 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 건조시켰다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 진공에서 건조시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율 300 mg (38%).
화합물 II-47a: 에틸 2-[2-(7-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세테이트
Figure pct00187
DMSO(6 mL) 중 4-플루오로살리실알데하이드(5 g, 1 eq), 1-메틸-피페라진(3.93 g)의 혼합물을 100℃에서 10시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 용매의 일부 및 여분의 N-메틸 피페라진을 75oC에서 진공에서 증류시켜 제거하였다. 이 살리실산 알데하이드 유도체는 다음 단계를 위해 충분히 순수하지만, 장기간 저장을 위해 염으로 전환될 수 있다. 예를 들어, 염화수소 염을 제조할 수 있다. 여기에 무수 다이에틸에테르 중 HCl의 점성 잔류물 용액(100 ml, 1M)을 첨가하였다. 에테르를 디캔팅하고 생성물을 에탄올로 배산시켰다. 1시간 후에, 생성물을 여과하였다.
무수 에탄올(5 mL) 및 에틸 4-브로모아세토아세테이트 중에서 함께 혼합된 에틸 3-아미노-3-티옥소프로파노에이트(0.6 g, 1 eq, 4.08 mmol) 및 4-(4-메틸-피페라진-1-일)-2-하이드록시벤즈알데하이드 하이드로클로라이드(1.05 g, 1 eq, 4.08 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 약 1시간 동안 교반한 다음, 4시간 동안 80oC으로 유지하였다. 새로운 황색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 생성물을 여과하고, EtOH로 세척하고, 무수 에탄올로부터 하이드로클로라이드 염으로서 결정화하였다. 물에 용해시키고 중탄산나트륨을 사용하여 염기로 전환시켰다. 수율 1.39 g (82.5%).
EtOH(0.25 mL) 및 물(2 mL) 중에서 상응하는 에틸 에스테르(화합물 II-47a, 207 mg, 1 eq)를 LiOH(60 mg, 5 eq)와 반응시켜 2-(2-(7-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세트산(화합물 II-47)을 제조하였다. 반응 혼합물을 30 내지 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 거의 투명한 용액을 여과하고, 아세트산으로 산성화하고, 실온에 밤새 두었다. 이어서, 생성물을 여과하고, 냉수(2x1 0.5 mL)로 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 수율 0.15 g (78.8%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 8.77 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.9 ㎐, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.05 (dd, J = 9.0, 2.4 ㎐, 1H), 6.92 (d, J = 2.3 ㎐, 1H), 3.79 (s, 2H), 3.44 (t, J = 5.2 ㎐, 4H), 2.45 (t, J = 5.1 ㎐, 5H), 2.23 (s, 3H).
II-48: 2-[2-(7-(4-메틸-4-(3-설포나토프로필)피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세트산
Figure pct00188
건조 DMF(0.5 mL) 중 2-(2-(7-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세트산(화합물 II-47, 38 mg, 1 eq)과 1,3-프로판설톤(12.2 mg, 1 eq)의 혼합물을 100oC에서 3시간 동안 가열하였다. 생성물을 건조 다이에틸 에테르로 침전시키고, 여과하고, 아세톤으로 세척하고 건조시켰다. 수율 54 mg (83%).
화합물 II-49a: 에틸 2-[2-(7-(4-메틸-4-(5-카르복실라토펜틸)피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일]아세테이트
Figure pct00189
건조 아세토니트릴(5 mL) 중 에틸 2-(2-(7-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트(화합물 II-47a, 413 mg, 1 eq)와 6-브로모헥산산(195 mg, 1 eq)의 혼합물을 90oC에서 12시간 동안 가열하였다. 다음날 침전된 생성물을 여과하고, 아세톤으로 세척하고 건조시켰다. 수율 321 mg (약 60%).
화합물 II-49c: 3-(4-(3-(4-(에톡시카르보닐메틸)티아졸-2-일)-2-옥소-2H-크로멘-7-일)-1-메틸피페라진-1-윰-1-일)프로필설포네이트
Figure pct00190
건조 아세토니트릴(1 mL) 중 에틸 2-(2-(7-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트(실시예 II-6, 100 mg, 1 eq)와 1,3-다이옥사-2-티안-2,2-다이옥사이드(50 mg, 1 eq)의 혼합물을 80oC에서 1시간 동안 가열하였다. 이어서 침전된 생성물을 여과하고, 아세톤으로 세척하고 건조시켰다. 수율 110 mg (82%). 1H NMR (400 ㎒, TFA-d) δ 8.90 (s, 1H), 7.87 (d, J = 9.1 ㎐, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.24 (dd, J = 9.2, 2.4 ㎐, 1H), 7.06 (d, J = 2.3 ㎐, 1H), 4.58 (t, J = 5.3 ㎐, 2H), 4.46 (q, J = 7.2 ㎐, 2H), 4.31 (s, 2H), 4.26 - 3.88 (m, 8H), 3.80 (t, J = 9.3 ㎐, 2H), 3.40 (s, 3H), 2.47 (d, J = 6.4 ㎐, 2H), 1.45 (t, J = 7.2 ㎐, 3H).
화합물 II-50a: 에틸 2-(2-(7-(4-t-부톡시카르보닐피페라진-1-일)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-4-일)아세테이트
Figure pct00191
4-플루오로살리실알데하이드(2.80 g, 20 mmol, 1 eq), 1-Boc-피페라진(4.09 g, 22 mmol) 및 Hunig Base in DMSO(6 mL)의 혼합물을 80℃에서 10시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 결정화된 반응 덩어리를 소량의 아세토니트릴로 희석하고 생성물을 여과하고, 물로 세척하였다.
Figure pct00192
(4-t-부톡시카르보닐피페라진-1-일)살리실산 알데하이드 (1.5 g, 1 eq), 2-에톡시카르보닐-티오아세트아미드 및 에틸 4-클로로아세토아세테이트의 혼합물을 EtOH(25 mL) 중에서 80 내지 85oC에서 1시간 교반하고 실온에 밤새 두었다. 이어서, 반응 혼합물을 물(25 mL)로 희석하고, 중탄산나트륨 첨가하고, 황색 침전물을 여과하였다. 에탄올로부터 결정화될 수 있다. 수율 78%.
1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 8.80 (s, 1H), 7.83 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.07 (ddd, J = 9.0, 4.5, 2.4 ㎐, 1H), 6.95 (d, J = 2.3 ㎐, 1H), 4.14 (q, J = 7.1 ㎐, 2H), 3.89 (d, J = 1.4 ㎐, 2H), 3.48 (s, 7H), 3.41 - 3.35 (m, 1H), 2.82 (t, J = 5.2 ㎐, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.23 (t, J = 7.1 ㎐, 3H).
화합물 II-1a': 에틸 2-(4-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-2-일)아세테이트
Figure pct00193
무수 EtOH(70 mL) 중 p-다이에틸아미노-살리실산 알데하이드(5.50 g) 및 에틸 아세토아세테이트(3.89 g)를 실온에서 10분 교반하였다. 피페리딘(3 방울)을 첨가하고 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 결정질 생성물을 황색 고체 침전물로서 여과하고, EtOH로 세척하였다.
다이클로로메탄(100 mL) 중 3-아세틸- 7-다이에틸아미노-2H-크로멘-2-온(5.18 g, 20 mmol) 및 tetra-n-부틸 암모늄 트라이브로마이드(19.3 g, 40 mmol)의 용액을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하여 황색 각기둥(수율 약 80%)을 얻었다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
Figure pct00194
이전 단계로부터의 3-(2-브로모아세틸)-7-다이에틸아미노-2H-크로멘-2-온(700 mg, 1 egv) 및 에틸 3-아미노-3-티옥소프로파노에이트(380 mg, 1.25 eq)를 에탄올 (5 mL)과 혼합하고 반응 혼합물을 80oC에서 2시간 유지하였다. 반응 혼합물을 실온에 밤새 두었다. 무색 침전물을 여과하고, 에탄올로 세척하고, 물(15 mL)이 담긴 비커로 옮기고, 중탄산나트륨으로 중화시켰다. 1시간 후, 생성물을 여과하고 물로 세척하였다. 수율 780 mg (94%). 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 8.64 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.7 ㎐, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 4.28 (q, J = 7.1 ㎐, 2H), 4.14 (s, 2H), 3.47 (q, J = 7.1 ㎐, 4H), 1.34 (td, J = 7.1, 0.6 ㎐, 3H), 1.26 (t, J = 7.1 ㎐, 6H).
II-51의 제조에 기재된 유사한 절차에 따라, 상응하는 에틸 에스테르 II-1a'를 LiOH와 반응시켜 2-(4-(7-(다이에틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-3-일)티아졸-2-일)아세트산(화합물 II-1')을 제조하였다. 수율 0.275 g (약 74%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 8.61 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.65 (d, J = 9.0 ㎐, 1H), 6.75 (dd, J = 8.9, 2.5 ㎐, 1H), 6.59 (d, J = 2.4 ㎐, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.46 (q, J = 7.0 ㎐, 4H), 1.14 (t, J = 7.0 ㎐, 6H).
화학식 I, II 또는 II'의 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 제조하기 위한 일반적인 절차
다이메틸아세트아미드(DMA) 중 적절한 염료(1.0 eq)를 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 10 eq) 및 2-(엔도-5-노르보르넨-2.3-다이카르복실이미드)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TNTU)(1.2 eq)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 관련 아미노-치환된 뉴클레오티드 유도체(아미노 작용기를 함유하는 링커 모이어티를 갖는 뉴클레오티드, 1.2 eq)를 첨가한 후에, 트라이에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 커플링 완료 후에, 용매를 진공에서 증류시켜 제거하고, 잔류물을 이온 교환 컬럼(Sephadex, 구배 0.1 M에서 1.0 M까지 용리액 TEAB)으로 사전 정제하고 역상 HPLC를 사용하여 추가로 정제하였다. 생성물의 조성을 LC-MS 및 HRMS에 의해 확인하였다.
[표 3]
Figure pct00195
표 3에서 일부 예시적인 ffC 및 ffa의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00196
Figure pct00197
도 3a는 460 nm에서 여기될 때 완충액 용액에서 염료 II-1 또는 염료 II-8로 표지된 동일한 ffA와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 A 뉴클레오티드(ffA)의 방출 스펙트럼을 예시한다.
도 3b는 460 nm에서 여기될 때 완충 용액에서 염료 II-1 및 염료 II-8로 표지된 동일한 ffC와 비교하여 참조 염료 A로 표지된 완전히 작용화된 C 뉴클레오티드(ffC)의 방출 스펙트럼을 예시한다.
염료 II-1 및 II-8은 참조 염료 A와 비교하여 청색 레이저 파장(약 460 nm)에 의한 여기에서 충분한 흡수를 갖고 "청색-방출" 검출 영역(약 470 내지 520 nm)에서 더 강한 형광 신호를 제공한 것으로 관찰되었다. 결과는 예를 들어 핵산 서열분석 응용에서 형광 바이오마커로서의 이들 염료의 유용성을 입증한다.
실시예 4. 2-채널 서열분석 응용
서열분석 응용에서 본 명세서에 기재된 새로운 염료 (염료 I-4a 및 I-3a; 염료 II-1 및 II-8)로 표지된 완전히 작용화된 뉴클레오티드의 유효성을 Illumina's Miseq® 플랫폼에서 2-채널 검출 방법으로 입증하였다. 본 명세서에 기재된 2-채널 방법과 관련하여, 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여 핵산이 서열분석될 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 청색 노출(채널 1) 500 ms, 녹색 노출(채널 2) 1000 ms; 공칭 1X 노출은 청색 450ms이고, 녹색 노출은 약 3.5 J/㎠에 해당하는 540ms이다. 염료 I-4a, 염료 I-3a, 염료 II-1 또는 염료 II-8로 표지된 ffA/ffC의 성능을 Miseq®에서 사용된 표준 염료 세트로 표지된 ffN으로부터 생성된 서열분석 데이터와 비교하였다. 이들 데이터는 도 4a 내지 도 4c 및 도 5a 내지 도 5c에 도시되어 있다. 데이터는 염료 I-4a, I-3a, II-1 및 II-8에 기초한 ffN이 참조 염료 A에 비견되는 화학적 안정성을 가지며 서열분석에 적합하다는 것을 명확하게 입증하였다. 각각의 서열분석 실행을 5가지 상이한 광 선량(1X, 3X, 5X, 7.5X 및 10X)에서 151 사이클 동안 수행하였다.
2-채널 검출에서는, 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 유형, 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 유형, 제1 채널 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 유형, 및 어느 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는, 표지가 결여되어 있는 제4 뉴클레오티드 유형을 제공함으로써 핵산이 서열분석될 수 있다. 실험의 RTA2.0.93 분석에 의해 산포도를 생성하였다. 산포도가 도 6a 내지 도 6h에 예시되어 있다.
도 4a 내지 도 4c는 상이한 광 선량(1X, 3X, 5X, 7.5X 및 10X)을 사용할 때, 표준 염료 세트로 표지된 ffN과 비교하여, Miseq® 서열분석 플랫폼에 사용된 ffA 및 ffC가 염료 I-4a(ffC= 1.25uM; ffA=1.5uM) 또는 염료 I-3a(ffC=1.5 uM; ffA= 1.6uM)로 표지된 경우의 서열분석 메트릭을 예시한다. 표준 염료 세트로 표지된 ffN의 경우, ffC-sPA-참조 염료 A 및 ffA-BL-참조 염료 A를 사용하였다. 90 ug/ml의 최종 농도의 ffN의 도입을 위해 DNA 중합효소 Pol 1901을 사용하였다. 염료 I-3a 및 I-4a로 표지된 ffA/ffC는 1X 및 3X 광 선량에서 참조 염료 A로 표지된 것들에 비견되는 서열분석 결과를 제공하는 것으로 관찰되었다.
도 5a 내지 도 5c는 상이한 광 선량(1X, 3X, 5X, 7.5X 및 10X)을 사용할 때, 표준 염료 세트로 표지된 ffN과 비교하여, Miseq® 서열분석 플랫폼에 사용된 ffA 및 ffC가 염료 II-1 또는 염료 II-8로 표지되는 경우의 서열분석 메트릭을 예시한다. 특히, 하기 ffN을 사용하였다: ffA-sPA-BL-염료 II-1(1.65uM) + ffA-sPA-BL-NR550S0(0.35uM); ffC-sPA-염료 II-1 (1.5uM) + ffC-LN3-SO7181 (0.5uM); ffA-BL-염료 II-8 (1.8uM) + ffA-sPA-BL-NR550S0 (0.2uM); ffC-sPA-염료 II-8 (1.5uM) + ffC-LN3-SO7181 (0.5uM). ffT는 1uM로 사용된 ffT-LN3-AF550POPOS0이고, G는 비표지된다. 표준 염료 세트로 표지된 ffN의 경우, ffC-sPA-참조 염료 A 및 ffA-BL-참조 염료 A를 사용하였다. 90 ug/ml의 최종 농도의 ffN의 도입을 위해 DNA 중합효소 Pol 1901을 사용하였다. 염료 II-1 및 II-8로 표지된 ffA/ffC는 1X 및 3X 광 선량에서 참조 염료 A로 표지된 것들에 비견되는 서열분석 결과를 제공하는 것으로 관찰되었다.
도 6a 내지 도 6h는 1X 및 10X 광 선량에서 각각 상기에 기재된 바와 같은 염료 I-4a, I-3a, I-1 및 I-8로 표지된 ffA/ffC의 산포도이다. ffT는 1uM로 사용된 ffT-LN3-AF550POPOS0이고, G는 비표지되었다(암색 G). Pol 1901을 90 ug/ml의 최종 농도로 도입 완충액에 사용하였다. 청색 노출(채널 1) 500 ms, 녹색 노출(채널 2) 1000 ms; 스캐닝 믹스 중에서 스캐닝됨. 각각의 도 6a 내지 도 6h에서, "G" 뉴클레오티드는 좌측 하단 구름("암색 G")으로서 나타나 있다. 본 명세서에 기재된 새로운 청색 염료 및 녹색 염료(NR550S0)로 표지된 "A" 뉴클레오티드의 혼합물로부터의 신호는 우측 상단 구름으로서 나타나 있다. 염료 AF550POPOS0으로 표지된 "T" 뉴클레오티드로부터의 신호는 좌측 상단 구름으로 나타나 있고, 본 명세서에 기재된 새로운 청색 염료 및 다른 염료 SO7181에 의해 표지된 "C" 뉴클레오티드의 혼합물로부터의 신호는 우측 하단 구름으로 나타나 있다. X-축은 하나의(청색) 채널에 대한 신호 강도를 나타내고, Y-축은 다른(녹색) 채널에 대한 신호 강도를 나타낸다. AF550POPOS0, 및 NR550S0의 화학 구조는 국제 특허 공개 WO2018060482A1호, WO2017051201A1호, 및 WO2014135221A1호에 각각 개시되어 있으며, 이들 모두는 참고로 포함된다.
도 6a 내지 도 6h는 새로운 청색 염료(염료 I-4a, I-3a, 염료 II-1 또는 염료 II-8)로 표지된 ffA 및 ffC의 유용성을 예시하며, 1 선량의 광 노출(C/T @ 1X) 후 ffC 및 ffT 뉴클레오티드로부터의 신호의 비 및 10 선량의 노출(C/T @ 10X/1X) 후 적절한 신호의 비가 제시되어 있다. 이 파라미터는 더 높은 선량의 광에서 ffT의 형광 강도와 관련하여 ffC 형광 강도가 얼마나 많이 이동하는지를 측정하며, 이는 광표백을 나타낸다. 도 6a 내지 도 6h는 각각 본 명세서에 기재된 새로운 염료로 표지된 ffC 접합체가 충분한 신호 강도 및 큰 구름 분리를 제공함을 보여준다.

Claims (66)

  1. 하기 화학식 II 또는 화학식 II'의 화합물, 또는 이의 염 또는 메소머 형태:
    [화학식 II]
    Figure pct00198

    [화학식 II']
    Figure pct00199

    (상기 식에서, X는 S, O, 또는 NRa이고;
    Y는 O 또는 NH이고;
    각각의 R1, R2, R3 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
    R4는 -NRbRc, 할로, -ORd 또는 -OS(O)2Rd이고;
    R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, N-설폰아미도, 설포닐, S-설폰아미도, 하이드록시, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 C3-C8 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이거나; 또는 화학식 II에서 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    각각의 Rd는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐이되; 단,
    R6 및 R7 중 적어도 하나, 또는 R6과 R7 및 그들이 부착되어 있는 원자로부터 형성된 상기 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴은 카르복실을 포함하거나; 또는
    R4는 -NRbRc이고 Rb 및 Rc 중 적어도 하나는 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함함).
  2. 제1항에 있어서, R4는 할로인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R4는 -OS(O)2Rd이고, Rd는 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 할로알킬인, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, Rd는 트라이플루오로메틸인, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R4는 -NRbRc이고 상기 화합물은 또한 하기 화학식 IIa 또는 화학식 IIa', 또는 이의 염 또는 메소머 형태로 표시되는, 화합물:
    [화학식 IIa]
    Figure pct00200

    [화학식 IIa']
    Figure pct00201
    .
  6. 제5항에 있어서, Rb 및 Rc의 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, Rb 및 Rc의 각각은 독립적으로 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나, 또는 Rb는 H이고 Rc는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 치환된 C1-C6 알킬은 독립적으로 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), -O-SO3 - 또는 -SO2NReRf로 치환되고, Re 및 Rf의 각각은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬인, 화합물.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, Rb 및 Rc의 각각은 에틸인, 화합물.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Rb 및 Rc의 각각은 독립적으로 카르복실, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -, 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Rb는 H이고 Rc는 C1-C6 알킬, 또는 카르복실, -C(O)ORd, -SO3H, -SO3 -, -O-SO3 - 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  12. 제5항에 있어서, Rb 및 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원, 5원 또는 6원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 O인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X는 S 또는 O인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 H 또는 C1-C6 알킬인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 H 또는 C1-C6 알킬인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 H인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 페닐, 카르복실 또는 -C(O)ORd인, 화합물.
  20. 제19항에 있어서, R6 또는 R7 중 하나는 H 또는 C1-C6 알킬이고, R6 또는 R7 중 다른 하나는 카르복실, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 또는 카르복실, -C(O)ORd 또는 설포로 선택적으로 치환된 페닐인, 화합물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, R6 또는 R7 중 하나는 H 또는 메틸이고, R6 또는 R7 중 다른 하나는 카르복실, -C(O)ORd, 메틸, 페닐, 카르복실 또는 -C(O)ORd로 치환된 페닐, 또는 카르복실 또는 C(O)ORd로 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께 C5-C6 카르보사이클릴을 형성하는, 화합물.
  23. 제14항에 있어서,
    Figure pct00202

    Figure pct00203

    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206
    및
    Figure pct00207
    , 및 C1-C6 알킬 카르복실산 에스테르, 이의 염 및 메소머 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  24. 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염 또는 메소머 형태:
    [화학식 I]
    Figure pct00208

    (상기 식에서, R1은 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록시, 설포, 설포네이트, 설페이트, N-설폰아미도, 및 S-설폰아미도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 각각 선택적으로 치환된
    Figure pct00209
    ,
    Figure pct00210
    ,
    Figure pct00211
    또는
    Figure pct00212
    이고;
    R2는 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 또는 카르복실,
    -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 할로, 시아노, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, 선택적으로 치환된 아미노, 및 하이드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된 페닐이고;
    각각의 R3, R4 및 R7은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
    각각의 R5 및 R6은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬이거나, 또는 R5와 R6은 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    X는 O, S, 또는 NRa이고;
    Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    Rd는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐이되; 단,
    R5 또는 R6 중 적어도 하나, 또는 R5와 R6 및 그들이 부착되어 있는 질소 원자로부터 형성된 상기 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함하거나; 또는
    R1은 카르복실 또는 -C(O)ORd를 포함함).
  25. 제24항에 있어서, R1은 카르복실로 각각 치환된
    Figure pct00213
    ,
    Figure pct00214
    ,
    Figure pct00215
    또는
    Figure pct00216
    인, 화합물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, R1은
    Figure pct00217
    ,
    Figure pct00218
    ,
    Figure pct00219
    ,
    Figure pct00220
    ,
    Figure pct00221
    또는
    Figure pct00222
    인, 화합물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R6의 각각은 C1-C6 알킬인, 화합물.
  28. 제27항에 있어서, R5 및 R6의 각각은 에틸인, 화합물.
  29. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 H이고 R6은 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  30. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R6의 각각은 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 C1-C6 알킬은 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 설페이트(-O-SO3 -) 또는 선택적으로 치환된 아미노로 치환되는, 화합물.
  32. 제24항에 있어서, R1은 각각 비치환되거나 설포(-SO3H)로 치환된
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    ,
    Figure pct00225
    또는
    Figure pct00226
    인, 화합물.
  33. 제32항에 있어서, R5는 H이고 R6은 카르복실로 치환된 C1-C6 알킬인, 화합물.
  34. 제32항에 있어서, R5 및 R6의 각각은 카르복실, -C(O)ORd, 설포(-SO3H), 설포네이트(-SO3 -), 또는 설페이트(-O-SO3 -)로 치환된 C1-C6 알킬이고 R5 및 R6 중 하나는 카르복실로 치환되는, 화합물.
  35. 제32항에 있어서, R5와 R6 및 그들이 부착되어 있는 질소 원자는 카르복실로 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H인, 화합물.
  37. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 C1-C6 알킬인, 화합물.
  38. 제37항에 있어서, R2는 메틸인, 화합물.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 및 R7의 각각은 H인, 화합물.
  40. 제24항에 있어서,
    Figure pct00227
    ,
    Figure pct00228
    ,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    ,
    Figure pct00231
    ,
    Figure pct00232
    ,
    Figure pct00233
    ,
    Figure pct00234
    ,
    Figure pct00235
    ,
    Figure pct00236
    ,
    Figure pct00237
    ,
    Figure pct00238
    ,
    Figure pct00239
    ,
    Figure pct00240
    , 및 이의 염 및 메소머 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  41. 제5항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  42. 제41항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 I의 R1의 카르복실 기를 통해 상기 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  43. 제41항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 II 또는 화학식 II'의 R6 또는 R7의 카르복실 기를 통해 상기 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 3' OH 블록킹 기를 추가로 포함하는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  46. 제41항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 혼성화된 올리고뉴클레오티드인, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체 상에 고정화되는, 올리고뉴클레오티드.
  48. 제47항에 있어서, 상기 고체 지지체는 복수의 고정화된 표적 폴리뉴클레오티드의 어레이를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  49. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  50. 제49항에 있어서, 제2 유형의 표지된 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 제2 유형의 표지된 뉴클레오티드는 상기 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드와는 상이한 화합물로 표지되는, 키트.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드 및 제2 유형의 표지된 뉴클레오티드는 단일 레이저 파장을 사용하여 여기가능한, 키트.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오티드 및 제4 유형의 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드, 제3 유형의 뉴클레오티드 및 제4 유형의 뉴클레오티드의 각각은 상이한 화합물로 표지되고, 각각의 표지는 다른 표지와 구별가능한 별개의 흡광도 최대치를 갖는, 키트.
  53. 제49항에 있어서, 상기 키트는 4가지 유형의 뉴클레오티드를 포함하며, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 표지로 표지되고, 제4 유형의 뉴클레오티드는 비표지되는(암색(dark)인), 키트.
  54. 제49항에 있어서, 상기 키트는 4가지 유형의 뉴클레오티드를 포함하며, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 2가지 표지의 조합으로 표지되고, 제4 유형의 뉴클레오티드는 비표지되는(암색인), 키트.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 완충액 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
  56. 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 또는 단백질 결합 검정에서의 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 화합물, 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항의 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
  57. 제56항에 있어서, 자동화 서열분석 기기에서의 용도로서, 상기 자동화 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함하는, 용도.
  58. 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드이고, 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인, 상기 단계;
    (b) 표지된 뉴클레오티드를 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 형광 측정을 수행하여 도입된 뉴클레오티드의 정체(identity)를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분에 상보적인 단일 가닥 프라이머 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 형성되는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, (d) 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 상기 뉴클레오티드로부터 표지 및 3' 블록킹 기를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, (e) 제거된 표지 및 3' 블록킹 기를 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드로부터 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드 가닥의 적어도 일부분의 서열이 결정될 때까지 단계 (a) 내지 단계 (e)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 단계 (e)는 적어도 50회 반복되는, 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 상기 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3' 블록킹 기는 단일 화학 반응에서 제거되는, 방법.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자동화 서열분석 기기에서 수행되고, 상기 자동화 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 광원을 포함하는, 방법.
  66. 하기 화학식 IIa 또는 화학식 IIa'의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 III 또는 화학식 III'의 화합물을 각각 화학식 NHRbRc의 아민과 반응시키는 단계를 포함하는, 방법:
    [화학식 IIa]
    Figure pct00241

    [화학식 IIa']
    Figure pct00242

    [화학식 III]
    Figure pct00243

    [화학식 III']
    Figure pct00244

    (상기 식에서, X는 S, O, 또는 NRa이고;
    Y는 O 또는 NH이고;
    각각의 R1, R2, R3 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, C1-C6 하이드록시알킬, (C1-C6 알콕시)(C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 아미노, 할로, 시아노, 하이드록시, 니트로, 설포닐, 설피노, 설포, 설포네이트, S-설폰아미도, N-설폰아미도, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
    R6 및 R7의 각각은 독립적으로 H, 카르복실, -C(O)NRbRc, -C(O)ORd, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 할로, 선택적으로 치환된 아미노, N-설폰아미도, 설포닐, S-설폰아미도, 하이드록시, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 C3-C8 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이거나; 또는 화학식 III에서 R6과 R7은 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 C5-C8 카르보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    Rx는 할로, -ORd 또는 -OS(O)2Rd이고;
    Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    각각의 Rb 및 Rc는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 Rb와 Rc는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4원 내지 10원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    각각의 Rd는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐임).
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