KR20210134209A - 엑소사이클릭 아민 치환된 쿠마린 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 - Google Patents

엑소사이클릭 아민 치환된 쿠마린 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 Download PDF

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캐롤 아나스타시
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Abstract

본 출원은 엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 유도체 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 이들 화합물은 핵산 서열분석 적용에서 뉴클레오티드에 대한 형광 표지로서 사용될 수 있다.

Description

엑소사이클릭 아민 치환된 쿠마린 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
우선권 출원에 대한 참조의 원용
본 출원은 2019년 3월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/812,837호에 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참고로 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 유도체 및 형광 마커로서의 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 화합물은 핵산 서열분석 적용에서 뉴클레오티드에 대한 형광 표지로서 사용될 수 있다.
여러 간행물 및 특허 문헌이 본 개시내용이 속하는 최신 기술을 보다 완전히 설명하기 위해 본 출원에서 참고된다. 이들 간행물 및 문헌 각각의 개시내용은 본원에 참고로 원용된다.
형광 표지를 갖는 핵산의 비-방사성 검출은 분자 생물학에서 중요한 기술이다. 이전에 재조합 DNA 기술에 이용된 많은 절차는 예를 들어, 32P로 방사성 표지된 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 의존하였다. 방사성 화합물은 핵산 및 기타 관심 분자의 민감한 검출을 허용한다. 그러나, 방사성 동위원소의 사용에는 심각한 한계, 예컨대, 이들의 비용, 제한된 저장 수명, 불충분한 민감도, 및 보다 중요하게는, 안전성 고려사항이 있다. 방사성 표지에 대한 필요성을 없애는 것은 안전성 위험 및 예를 들어, 시약 폐기와 연관된 환경 영향 및 비용 둘 모두를 저하시킨다. 비-방사성 형광 검출을 처리할 수 있는 방법은 비-제한적인 예로서, 자동화된 DNA 서열분석(sequencing), 하이브리드화(hybridization) 방법, 폴리머라제-연쇄-반응 생성물의 실시간 검출 및 면역검정을 포함한다.
많은 적용에서, 복수의 공간적으로-중첩되는 분석물의 독립적인 검출을 달성하기 위해 다중(multiple) 스펙트럼적으로-구별가능한 형광 표지를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 멀티플렉스(multiplex) 방법에서, 반응 용기의 수를 저하시켜, 실험 프로토콜을 단순화하고 적용-특이적 시약 키트의 생산을 용이하게 할 수 있다. 다중-색상 자동화된 DNA 서열분석 시스템에서 예를 들어, 멀티플렉스 형광 검출은 단일 전기영동 레인에서 다중 뉴클레오티드 염기의 분석을 가능하게 하여, 단일-색상 방법에 비해 처리량을 증가시키고 레인-간 전기영동 이동성 변이와 연관된 불확실성을 저하시킨다.
그러나, 멀티플렉스 형광 검출은 문제가 될 수 있으며 적절한 형광 표지의 선택을 제한하는 다수의 중요한 인자가 있다. 첫째, 주어진 적용에서 적합하게-분해되는 흡수 및 방출 스펙트럼을 갖는 염료 화합물을 찾기가 어려울 수 있다. 또한, 여러 개의 형광 염료가 함께 사용되는 경우, 동시 여기(excitation)에 의해 구별가능한 스펙트럼 영역에서 형광 신호를 생성하는 것은 복잡할 수 있는데, 그 이유는 염료의 흡수 대역(band)이 일반적으로 넓게 분리되어, 심지어 2 개의 염료에 대해서도 비슷한 형광 여기 효율을 달성하기가 어렵기 때문이다. 많은 여기 방법은 레이저와 같은 고출력 광원을 사용하므로, 염료는 이러한 여기를 견딜 수 있는 충분한 광-안정성을 가져야 한다. 분자 생물학 방법에서 특히 중요한 최종 고려사항은 형광 염료가 시약 화학, 예컨대, 예를 들어, DNA 합성 용매 및 시약, 완충액, 폴리머라제 효소 및 리가제 효소와 호환이 되어야 하는 정도이다.
서열분석 기술이 발전함에 따라, 상기 모든 제약을 만족시키고 특히 고 처리량 분자 방법, 예컨대, 고체상 서열분석 등을 처리할 수 있는 추가 형광 염료 화합물, 핵산 컨쥬게이트(conjugate) 및 다중 염료 세트에 대한 필요성이 발전하였다.
개선된 형광 특성, 예컨대, 적합한 형광 세기, 형상 및 최대 형광 파장을 갖는 형광 염료 분자는 핵산 서열분석의 속도 및 정확도를 개선시킬 수 있다. 강한 형광 신호는 대부분의 염료의 형광 세기가 물-기반의 생물학적 완충액 및 더 높은 온도 하에서 측정이 이루어지는 경우 유의하게 낮기 때문에 이러한 조건에서 특히 중요하다. 게다가, 염료가 부착되는 염기의 성질은 또한 최대 형광, 형광 세기 및 기타 스펙트럼 염료 특성에 영향을 준다. 핵염기 및 형광 염료 사이의 서열-특이적 상호작용은 형광 염료의 특이적 설계에 의해 조정될 수 있다. 형광 염료의 구조의 최적화는 뉴클레오티드 혼입(incorporation)의 효율을 개선하고, 서열분석 오류 수준을 저하시키며, 핵산 서열분석에서 시약의 사용을 감소시켜, 핵산 서열분석의 비용을 감소시킬 수 있다.
일부 광학 및 기술 개발은 이미 이미지 품질을 크게 개선시켰지만 궁극적으로 불량한 광학 분해능에 의해 제한되었다. 일반적으로, 광 현미경의 광학 분해능은 사용된 광의 파장의 대략 절반에서 이격된 물체로 제한된다. 실제적인 관점에서, 그 때는, 아주 멀리 떨어져 있는 (200 이상 내지 350 nm) 물체만이 광 현미경에 의해 분해될 수 있었다. 이미지 분해능을 개선시키고 표면적 유닛(unit)당 분해가능한 물체의 수를 증가시키는 하나의 방법은 더 짧은 파장의 여기 광을 사용하는 것이다. 예를 들어, 광 파장을 동일한 광학장치를 이용하여 Δλ~100 nm로 단축시키면, 분해능이 더 우수할 것이고 (약 Δ50 nm/(약 15 %)), 덜-왜곡된 이미지가 기록될 것이며, 인지가능한 영역 상의 물체의 밀도가 약 35 % 증가할 것이다.
특정 핵산 서열분석 방법은 염료-표지된 뉴클레오티드를 여기시키고 검출하기 위해 레이저 광을 이용한다. 이들 기기는 660 nm에서 여기가능한 적절한 염료와 함께, 더 긴 파장의 광, 예컨대, 적색 레이저를 사용한다. 유용한 분해능을 유지하면서 보다 조밀하게 패킹된(packed) 핵산 서열분석 클러스터를 검출하기 위해, 더 짧은 파장의 청색 광원 (450-460 nm)이 사용될 수 있다. 이 경우, 광학 분해능은 더 긴 파장 적색 형광 염료의 방출 파장에 의해 제한되는 것이 아니라, 다음으로 가장 긴 파장 광원, 예를 들어, 532 nm에서 "녹색 레이저"에 의해 여기가능한 염료의 방출에 의해 제한될 것이다. 따라서, 서열분석 적용에서 형광 검출에 사용하기 위한 청색 염료 표지의 필요성이 있다.
비록 청색-염료 화학 및 연관된 레이저 기술이 예를 들어, DVD 및 Blu-ray 디스크를 위한 염료를 생산하기 위해 개선되었지만, 이러한 화합물은 바이오-표지화에 적절하지 않으며 바이오마커로서 사용될 수 없다.
불행하게도, 뉴클레오티드 표지화에 적합한 강한 형광을 가진 상업적으로 이용가능한 청색 염료는 여전히 매우 드물다. 본원에 청색광 여기 하에서 강한 형광을 갖는 뉴클레오티드 표지화에 적합한 새로운 형광 화합물을 기재한다.
요약
본 개시내용은 엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 유도체에 관한 것이다. 화합물은 특히 핵산 서열분석 적용에서 뉴클레오티드 표지화를 위한 형광 표지로서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 염료는 짧은-파장에서, 최적으로 450-460 nm의 파장에서 광을 흡수하고, 450-460 nm의 파장을 갖는 청색 파장 여기원이 사용되는 상황에서 특히 유리하다. 청색 파장 여기는 짧은 파장의 형광 방출로 인해 유닛 면적당 특징의 더 높은 밀도의 검출 및 분해능을 허용한다. 이러한 염료가 뉴클레오티드와의 컨쥬게이트에 사용되는 경우, 핵산 서열분석 방법 동안에 수득된 서열분석 판독의 길이, 세기, 정확도 및 품질에서 개선이 나타날 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00001
여기서 X는 O, S, Se 또는 NRn이고, 여기서 Rn은 H, C1-6 알킬 또는 C6-10 아릴이고;
고리 A는 3 내지 10 원 헤테로사이클릴이고;
R, R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
각각의 R3은 독립적으로 할로, -CN, -CO2H, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나, 2 개의 R3은 옥소(=O)를 형성하고; 여기서 p 및 q는 각각 1, 2, 3 또는 4이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2Rf, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 Rc, Rd, Re 및 Rf는 독립적으로 H, 임의로 치환된 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
m은 0, 1, 2, 3 또는 4이며; n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 양태에서, m 또는 n 중 하나 이상은 0이 아니다. 일부 추가 양태에서, 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H인 경우이면, m 또는 n 중 하나 이상은 0이 아니다. 예를 들어, 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H이고, m이 0인 경우이면, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H이고, n이 0인 경우이면, m은 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 양태에서, m이 1이고; R5는 -CO2H이고; 각각의 R, R1, R2, R4는 H이고; 고리 A는
Figure pct00002
인 경우이면; X는 O, Se 또는 NRn이다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물은 기질 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 리간드, 입자, 세포, 반-고체 표면 (예컨대, 겔) 또는 고체 표면과 컨쥬게이션된다. 컨쥬게이션은 카복실 기 (-CO2H)를 통해 수행될 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 모이어티 (예컨대, 뉴클레오티드) 상의 아미노 또는 하이드록실 기 또는 이에 결합된(bound) 링커와 반응시켜, 아미드 또는 에스테르를 형성할 수 있다.
본 개시내용의 일부 다른 양태는 예를 들어, 기질 모이어티에 대한 공유 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함하는 염료 화합물에 관한 것이다. 연결(linking)은 R 기 중 임의의 것을 포함하여 염료의 임의의 위치에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결은 화학식 (I)의 R3 또는 R5를 통해 수행될 수 있다.
본 개시내용의 일부 추가 양태는 하기 화학식으로 정의된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 화합물을 제공한다:
Figure pct00003
여기서 N은 뉴클레오티드이고;
L은 선택적 링커 모이어티이며;
염료는 본 개시내용에 따른 형광 화합물이다.
본원에 기재된 일부 추가 실시양태는 화학식 (I)의 화합물로 표지된 모이어티, 특히 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 관련된다.
일부 추가 개시내용은 본 개시내용의 염료 화합물을 사용한 서열분석 방법을 제공한다.
추가 양태에 따르면, 개시내용은 또한 다양한 면역학적 검정, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 표지화에 사용될 수 있거나 합성에 의한 DNA 서열분석에 사용될 수 있는 염료 화합물 (유리 또는 컨쥬게이트 형태)을 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 자동화된 기기 플랫폼에서 합성에 의한 서열분석 사이클에 특히 적합한 염료 "세트"를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 키트가 있으며, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드는 본원에 기재된 표지된 뉴클레오티드이다.
개시내용의 추가 양태는 엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 염료 및 이러한 염료로 표지된 모이어티, 예컨대, 뉴클레오티드를 포함하는 개시내용의 화합물의 화학적 제조이다.
추가 양태에는, 서열분석 검정에서 폴리뉴클레오티드에 본원에 기재된 표지된 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계 및 혼입되고 표지된 뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함하는 서열분석 방법이 있다.
도 1은 2-채널 서열분석 분석에서 본원에 기재된 염료 I-4로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시하는 산점도이다.
도 2는 2-채널 서열분석 분석에서 본원에 기재된 염료 I-5로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시하는 산점도이다.
도 3은 2-채널 서열분석 분석에서 본원에 기재된 염료 I-6으로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시하는 산점도이다.
본 개시내용은 형광 검출 및 합성에 의한 서열분석 방법에 특히 적합한 엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 화합물을 제공한다. 본원에 기재된 실시양태는 화학식 (I)의 구조의 염료 및 이의 유도체, 이의 염 및 메소머 형태에 관한 것이다.
Figure pct00004
일부 양태에서, X는 O이다. 일부 양태에서, X는 S이다. 일부 양태에서, X는 Se이다. 일부 양태에서, X는 NRn이며, 여기서 Rn은 H, C1-6 알킬 또는 C6-10 아릴이고, 일 양태에서 Rn은 H이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 1이고; R5가 -CO2H이고; 각각의 R, R1, R2, R4가 H이며; 고리 A가
Figure pct00005
인 경우이면; X는 O, Se 또는 NRn이다. 일부 추가 실시양태에서, n이 0이고; 고리 A가
Figure pct00006
또는
Figure pct00007
이고; 각각의 R, R1, R2, R4가 H이며; X가 O인 경우이면; m은 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 양태에서, n이 0인 경우이면, m은 1, 2, 3 또는 4이고 하나 이상의 R5는 -CO2H이다. 일부 다른 양태에서, n이 1이고 R3이 -CO2H인 경우이면, m은 0이거나 R5는 -CO2H가 아니다.
일부 양태에서, R은 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이다. 일 양태에서, R은 H이다. 다른 양태에서, R은 할로이다. 일부 양태에서, R은 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 양태에서, R은 -CO2H이다. 일부 양태에서, R은 -SO3H이다. 일부 양태에서, R은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 양태에서, R은 -SO2NH2이다. 일부 양태에서, R은 -CN이 아니다.
일부 양태에서, R1은 H이다. 일부 양태에서, R1은 할로이다. 일부 양태에서, R1은 -CN이다. 일부 양태에서, R1은 C1-6 알킬이다. 일부 양태에서, R1은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 양태에서, R1은 -SO2NH2이다. 일부 양태에서, R1은 -CN이 아니다.
일부 양태에서, R2는 H이다. 일부 양태에서, R2는 할로이다. 일부 양태에서, R2는 -SO3H이다. 일부 양태에서, R2는 임의로 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, R2는 -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 양태에서, R4는 H이다. 일부 양태에서, R4는 -SO3H이다. 일부 양태에서, R4는 임의로 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, R4는 -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 양태에서, 고리 A는 3 내지 7 원 단일 헤테로사이클릭 고리이다. 일부 추가 실시양태에서, 3 내지 7 원 단일 헤테로사이클릭 고리는 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다. 일부 추가 실시양태에서, 3 내지 7 원 단일 헤테로사이클릭 고리는 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 양태에서, 고리 A는
Figure pct00008
이다. 이러한 일 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00009
이다. 일부 양태에서, 고리 A는
Figure pct00010
이다. 이러한 일 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00011
이다. 일부 양태에서, 고리 A는
Figure pct00012
이다. 이러한 일 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00013
이다. 본원에 기재된 고리 A의 일부 양태에서, n은 0이다. 본원에 기재된 고리 A의 일부 양태에서, n은 1이다. 본원에 기재된 고리 A의 일부 양태에서, n은 2 또는 3이다. 일부 양태에서, 각각의 R3은 독립적으로 -CO2H, -SO3H, -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬, -(CH2)p-CO2Rc, 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 양태에서, R3은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 다른 양태에서, R3은 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 양태에서, R3은 -CO2H 또는 -SO3H로 치환된 C1-4 알킬 또는 C2-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, n은 1이고 R3은 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이다. 일부 추가 실시양태에서, Rc는 H 또는 C1-4 알킬이다.
화학식 (I)의
Figure pct00014
모이어티의 벤젠 고리는 임의의 1, 2, 3 또는 4 개 위치에서 R5로서 도시된 치환기에 의해 임의로 치환된다. m이 0인 경우, 벤젠 고리는 비치환된다. m이 1보다 큰 경우, 각각의 R5는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 양태에서, m은 0이다. 다른 양태에서, m은 1이다. 다른 양태에서, m은 2이다. 일부 양태에서, m은 1, 2 또는 3이고, 각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2Rf, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, R5는 -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 -CO2H, -SO3H 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, R5는 -(CH2)xCOOH이고, 여기서 x는 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시양태에서, 각각의 R, R1, R2, R4가 H이고; n이 0이며; m이 1인 경우이면;
Figure pct00015
는 다음 위치에서 치환된다:
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
. 일 실시양태에서, R5는 -CO2H이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이며; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 0인 경우이면, n은 1이고; 또는 n이 0인 경우이면, m은 1이다. 일 실시양태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 1인 경우,
Figure pct00020
는 다음 위치에서 치환된다:
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
. 일 실시양태에서, R5는 -CO2H이다. 다른 실시양태에서, R5는 할로, 예컨대, 클로로, 또는 -SO3H이다. 또 다른 실시양태에서, R5는 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이며; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 0인 경우이면, n은 1이고; 또는 n이 0인 경우이면, m은 1이다. 일 실시양태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 1인 경우,
Figure pct00025
는 다음 위치에서 치환된다:
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
. 일 실시양태에서, R5는 -CO2H이다. 다른 실시양태에서, R5는 할로, 예컨대, 클로로, 또는 -SO3H이다. 또 다른 실시양태에서, R5는 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2, 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00028
또는
Figure pct00029
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이며; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 0인 경우이면, n은 1이고; 또는 n이 0인 경우이면, m은 1이다. 일 실시양태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다. 일부 추가 실시양태에서, m이 1인 경우,
Figure pct00030
는 다음 위치에서 치환된다:
Figure pct00031
또는
Figure pct00032
. 일 실시양태에서, R5는 -CO2H이다. 다른 실시양태에서, R5는 할로, 예컨대, 클로로, 또는 -SO3H이다. 또 다른 실시양태에서, R5는 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 이상 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다.
엑소사이클릭 아민-치환된 쿠마린 염료의 구체적인 예는 다음, 및 이의 염 및 메소머 형태를 포함한다:
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
.
특히 유용한 화합물은 본원에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카복시 또는 알킬-카복시 기를 통해 본원에 개시된 염료 화합물에 부착되어 아미드 또는 알킬-아미드를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 염료 화합물은 화학식 (I)의 R3 또는 R5를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 R3은 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2H이며 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 R5는 -CO2H이며 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 표지를 가질 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 부착된 차단 기를 가질 수 있다. 차단 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 차단 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
본원은 2 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드가 본 개시내용의 화합물로 표지된, 키트를 제공한다. 키트는 2 개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 2 개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 레이저일 수 있는 단일 여기원을 사용하여 표지 중 2 개 이상을 여기시킬 수 있다. 예를 들어, 2 개 이상의 표지에 대한 여기 대역은 스펙트럼의 중첩 영역에서의 여기로 인해 표지 둘 모두가 형광을 방출하도록 적어도 부분적으로 중첩될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2 개 이상의 표지로부터의 방출은 표지 중 하나 이상의 존재가 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있도록 스펙트럼의 상이한 영역에서 발생할 것이다.
키트는 4 개의 표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 여기서 4 개의 뉴클레오티드 중 제1의 것은 본원에 개시된 화합물로 표지된다. 이러한 키트에서, 각각의 4 개의 뉴클레오티드는 다른 3 개의 뉴클레오티드에 있는 표지와 동일하거나 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 따라서, 화합물 중 하나 이상은 화합물(들)이 다른 화합물과 구별가능하도록 별개의 최대 흡광도 및/또는 최대 방출을 가질 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 각각의 화합물이 다른 3 개의 화합물과 구별가능하도록 별개의 최대 흡광도 및/또는 최대 방출을 가질 수 있다. 최대치 이외의 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있으며 이러한 상이함을 이용하여 화합물을 구별할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 키트는 화합물 중 2 개 이상이 별개의 최대 흡광도를 갖도록 할 수 있다. 발명의 화합물은 전형적으로 500 nm 미만의 영역에서 광을 흡수한다.
본원에 제시된 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트는 생물학적 시스템 (예를 들어, 이의 공정 또는 구성요소 포함)을 검출, 측정 또는 식별하는 데 사용될 수 있다. 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트를 이용할 수 있는 예시적인 기술은 서열분석, 발현 분석, 하이브리드화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정 (예컨대, 세포 결합(binding) 또는 세포 기능 분석) 또는 단백질 검정 (예컨대, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)을 포함한다. 특정 기술을 수행하기 위한 자동화 기기, 예컨대, 자동화된 서열분석 기기에서 사용할 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2 개의 레이저를 함유할 수 있다.
본원은 개시내용의 화합물을 합성하는 방법을 개시한다. 본 개시내용에 따른 염료는 다양한 상이한 적합한 출발 재료로부터 합성될 수 있다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)의 화합물을 하기 화학식 (III)의 임의로 치환된 사이클릭 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00036
여기서 각각의 변수인 X, R, R1, R2, R3, R4, R5, 고리 A, m 및 n은 본원에 정의된다. 반응은 주위 온도 또는 상승된 온도에서 유기 용매에서 수행될 수 있다.
정의
본원에 사용된 섹션 표제는 구성 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "단수형"은 명시적으로 및 명백하게 하나의 지시 대상으로 제한되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 다양한 변형 및 변이가 본 교시의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고 본원에 기재된 다양한 실시양태에 대해 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 실시양태는 첨부된 청구 범위 및 이들의 등가물의 범주 내에서 다른 변형 및 변이를 포함하도록 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는(including)"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"의 사용은 제한되지 않는다. 용어 "갖는(having)"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "가지다(have)", "가지다(has)", "가졌다(had)"의 사용은 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 전환 어구이든 또는 청구 범위의 본문이든 간에, 용어 "포함하다(comprise(s))" 및 "포함하는(comprising)"은 개방된 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는(having at leat)" 또는 "적어도 포함하는(including at least)"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정의 맥락에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는(comprising)"은 공정이 적어도 언급된 단계를 포함하나 추가 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는(comprising)"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징 또는 구성요소를 포함하나 추가 특징 또는 구성요소도 또한 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자간에 전자 쌍의 공유를 특징으로 하는 화학적 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅은 다른 수단, 예를 들어, 접착 또는 정전기적 상호작용을 통한 표면에 대한 부착과 비교하여, 기질의 기능화된 표면과 화학적 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유 부착된 중합체는 또한 공유 부착 이외의 수단을 통해 결합될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 원소 주기율표의 7 열의 방사-안정 원자 중 임의의 하나, 예컨대, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미하고, 불소 및 염소가 선호된다.
본원에 사용된 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된 (즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않은) 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭한다. 알킬 기는 1 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있다 (본원에 표시될 때마다, 수치 범위, 예컨대, "1 내지 20"은 주어진 범위의 각각의 정수를 지칭한다; 예컨대, "1 내지 20 개의 탄소 원자"는 알킬 기가 1 개의 탄소 원자, 2 개의 탄소 원자, 3 개의 탄소 원자 등으로 이루어지며, 최대 20 개의 탄소 원자를 포함하지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 발생을 포함한다). 알킬 기는 또한 1 내지 9 개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알킬일 수 있다. 알킬 기는 또한 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 알킬 기는 "C1-4 알킬" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬"은 알킬 쇄에 1 내지 6 개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알킬 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3 차 부틸, 펜틸 및 헥실 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "알콕시"는 R이 상기 정의된 알킬인 화학식 -OR을 지칭하고, 예컨대, "C1-9 알콕시"이며, 비제한적으로 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시 (이소프로폭시), n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭한다. 알케닐 기는 2 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알케닐"의 발생을 포함한다. 알케닐 기는 또한 2 내지 9 개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 또한 2 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 "C2-6 알케닐" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6 알케닐"은 알케닐 쇄에 2 내지 6 개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알케닐 쇄는 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-디에닐, 부타-1,2,-디에닐 및 부타-1,2-디엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐 기는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐 및 헥세닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭한다. 알키닐 기는 2 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알키닐"의 발생을 포함한다. 알키닐 기는 또한 2 내지 9 개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알키닐일 수 있다. 알키닐 기는 또한 2 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐일 수 있다. 알키닐 기는 "C2-6 알키닐" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6 알키닐"은 알키닐 쇄에 2 내지 6 개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알키닐 쇄가 에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일 및 2-부티닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알키닐 기는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐 및 헥시닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 비제한적으로 질소, 산소 및 황을 포함하는 탄소 이외의 원소를 쇄 백본(backbone)에 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭한다. 헤테로알킬 기는 1 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로알킬"의 발생을 포함한다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 9 개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 저급 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 "C1-6 헤테로알킬" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 헤테로알킬 기는 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 단지 예로서, "C4-6 헤테로알킬"은 헤테로알킬 쇄에 4 내지 6 개의 탄소 원자가 있고 쇄의 백본에 하나 이상의 헤테로원자가 추가로 있음을 나타낸다.
용어 "방향족"은 컨쥬게이션된 파이 전자 시스템을 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하고 카보사이클릭 방향족 기 (예컨대, 페닐) 및 헤테로사이클릭 방향족 기 (예컨대, 피리딘) 둘 모두를 포함한다. 이 용어는 전체 고리 시스템이 방향족인 경우 모노사이클릭 또는 융합된-고리 폴리사이클릭 (즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아릴"은 고리 백본에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템 (즉, 2 개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2 개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 아릴 기는 6 내지 18 개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "아릴"의 발생을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아릴 기는 6 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 기는 "C6-10 아릴", "C6 또는 C10 아릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 아줄레닐 및 안트라세닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"아랄킬" 또는 "아릴알킬"은, 치환기로서, 알킬렌 기를 통해 연결되는 아릴 기이며, 예컨대, "C7-14 아랄킬" 등이며, 비제한적으로 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필 및 나프틸알킬을 포함한다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기 (즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 비제한적으로 질소, 산소 및 황을 포함하는 탄소 이외의 원소를 고리 백본에 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템 (즉, 2 개의 인접한 원자를 공유하는 2 개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 헤테로아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴 기는 5-18 개의 고리 구성원 (즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하여 고리 백본을 이루는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 발생을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 5 내지 10 개의 고리 구성원 또는 5 내지 7 개의 고리 구성원을 갖는다. 헤테로아릴 기는 "5-7 원 헤테로아릴", "5-10 원 헤테로아릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예는 푸릴, 티에닐, 프탈라지닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴 및 벤조티에닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"헤테로아랄킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은, 치환기로서, 알킬렌 기를 통해 연결되는 헤테로아릴 기이다. 예는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 이소옥사졸릴알킬 및 이미다졸릴알킬을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기 (즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "카보사이클릴"은 고리 시스템 백본에 탄소 원자만을 함유하는 비-방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카보사이클릴이 고리 시스템인 경우, 2 개 이상의 고리는 융합된, 브릿지된(bridged) 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 접합(join)될 수 있다. 카보사이클릴은 고리 시스템에서 하나 이상의 고리가 방향족이 아닌 경우 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카보사이클릴은 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐을 포함한다. 카보사이클릴 기는 3 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "카보사이클릴"의 발생을 포함한다. 카보사이클릴 기는 또한 3 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴 기는 또한 3 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴 기는 "C3-6 카보사이클릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 카보사이클릴 고리의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 2,3-디하이드로-인덴, 바이사이클[2.2.2]옥타닐, 아다만틸 및 스피로[4.4]노나닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전히 포화된 카보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 백본에 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 비-방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합된, 브릿지된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 접합될 수 있다. 헤테로사이클릴은 고리 시스템에서 하나 이상의 고리가 방향족이 아닌 경우 임의의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로원자(들)는 고리 시스템에서 비-방향족 또는 방향족 고리에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 3 내지 20 개의 고리 구성원 (즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하여 고리 백본을 이루는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로사이클릴"의 발생을 포함한다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 10 개의 고리 구성원을 갖는 중간 크기의 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 6 개의 고리 구성원을 갖는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 "3-6 원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 바람직한 6 원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중 하나 내지 최대 3 개로부터 선택되며, 바람직한 5 원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S로부터 선택된 하나 또는 2 개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로사이클릴 고리의 예는 아제피닐, 아크리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 디옥솔라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 옥시라닐, 옥세파닐, 티에파닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 디옥소피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피롤리디오닐, 4-피페리도닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 1,3-디옥시닐, 1,3-디옥사닐, 1,4-디옥시닐, 1,4-디옥사닐, 1,3-옥사티아닐, 1,4-옥사티이닐, 1,4-옥사티아닐, 2H-1,2-옥사지닐, 트리옥사닐, 헥사하이드로-1,3,5-트리아지닐, 1,3-디옥솔릴, 1,3-디옥솔라닐, 1,3-디티올릴, 1,3-디티올라닐, 이소옥사졸리닐, 이소옥사졸리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸리디노닐, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 1,3-옥사티올라닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로-1,4-티아지닐, 티아모르폴리닐, 디하이드로벤조푸라닐, 벤즈이미다졸리디닐 및 테트라하이드로퀴놀린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"O-카복시" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-OC(=O)R" 기를 지칭한다.
"C-카복시" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 "-C(=O)OR" 기를 지칭한다. 비-제한적인 예는 카복실 (즉, -C(=O)OH)을 포함한다.
"설포닐" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-SO2R" 기를 지칭한다.
"설피노" 기는 "-S(=O)OH" 기를 지칭한다.
"S-설폰아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-SO2NRARB" 기를 지칭한다.
"N-설폰아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-N(RA)SO2RB" 기를 지칭한다.
"C-아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-C(=O)NRARB" 기를 지칭한다.
"N-아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-N(RA)C(=O)RB" 기를 지칭한다.
"아미노" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴 및 3-10 원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-NRARB" 기를 지칭한다. 비-제한적인 예는 유리 아미노(즉, -NH2)를 포함한다.
"아미노알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결되는 아미노 기를 지칭한다.
"알콕시알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결되는 알콕시 기를 지칭하며, 예컨대, "C2-8 알콕시알킬" 등이다.
본원에 사용된 바와 같이, 치환된 기는 하나 이상의 수소 원자가 다른 원자 또는 기로 교환된 비치환된 모(parent) 기로부터 유래된다. 달리 지시되지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주되는 경우, 이는 기가 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카보사이클릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), C3-C7-카보사이클릴-C1-C6-알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3-10 원 헤테로사이클릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3-10 원 헤테로사이클릴-C1-C6-알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5-10 원 헤테로아릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5-10 원 헤테로아릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 할로, -CN, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬 (즉, 에테르), 아릴옥시, 설프하이드릴 (머캅토), 할로(C1-C6)알킬 (예컨대, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시 (예컨대, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 니트로, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, O-카복시, 아실, 시아나토, 이소시아나토, 티오시아나토, 이소티오시아나토, 설피닐, 설포닐, -SO3H, 설피노, -OSO2C1-4 알킬 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다. 기가 "임의로 치환된" 것으로서 기재되는 경우, 그 기는 상기 치환기들로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기는 할로, -CN, SO3 -, -SO3H, -SRA, -ORA, -NRBRC, 옥소, -CONRBRC, -SO2NRBRC, -COOH 및 -COORB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되며, 여기서 RA, RB 및 RC는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
본원에 기재된 화합물은 여러 메소머 형태로서 표현될 수 있다. 단일 구조가 그려지는 경우, 관련 메소머 형태 중 임의의 것이 의도된다. 본원에 기재된 쿠마린 화합물은 단일 구조로 표현되지만 관련된 메소머 형태 중 임의의 것으로서 동일하게 제시될 수 있다. 화학식 (I)에 대한 예시적인 메소머 구조가 아래에 제시되어 있다:
Figure pct00037
본원에 기재된 화합물의 단일 메소머 형태가 제시되는 각각의 경우에, 대안적인 메소머 형태가 동일하게 고려된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 기재된 화합물은 이온화된 형태, 예컨대, -CO2 - 또는 -SO3 -로 존재할 수 있다. 화합물이 양으로 또는 음으로 하전된 치환기 기, 예를 들어, SO3 -를 함유하는 경우, 화합물 전체가 중성이 되도록 음으로 또는 양으로 하전된 반대이온을 또한 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 화합물은 염 형태로 존재할 수 있으며, 여기서 반대이온은 컨쥬게이트 산 또는 염기에 의해 제공된다.
특정 라디칼 명명 규칙은 문맥에 따라 모노-라디칼 또는 디-라디칼을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환기가 분자의 나머지에 대해 2 개의 부착점을 필요로 하는 경우, 치환기는 디-라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2 개의 부착점을 필요로 하는 알킬로서 식별된 치환기는 디-라디칼, 예컨대, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등을 포함한다. 다른 라디칼 명명 규칙은 라디칼이 디-라디칼, 예컨대, "알킬렌" 또는 "알케닐렌"임을 분명히 나타낸다.
2 개의 "인접한" R 기가 "이들이 부착된 원자와 함께" 고리를 형성한다고 하는 경우, 이는 원자의 집합 유닛, 개재(intervening) 결합 및 2 개의 R 기가 언급된 고리임을 의미한다. 예를 들어, 다음 하위구조가 존재하고:
Figure pct00038
R1 및 R2가 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로서 정의되거나, R1 및 R2가 이들이 부착된 원자와 함께 아릴 또는 카보사이클릴을 형성하는 경우, 이는 R1 및 R2가 수소 또는 알킬로부터 선택될 수 있거나, 대안적으로, 하위구조가 하기 구조를 갖는 것을 의미하며:
Figure pct00039
여기서 A는 묘사된 이중 결합을 함유하는 아릴 고리 또는 카보사이클릴이다.
표지된 뉴클레오티드
개시내용의 양태에 따르면, 기질 모이어티에 대한 부착에 적합한 염료 화합물, 특히 기질 모이어티에 대한 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함하는 염료 화합물을 제공한다. 기질 모이어티는 사실상 개시내용의 염료가 컨쥬게이션될 수 있는 임의의 분자 또는 물질일 수 있고, 비-제한적인 예로서 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 리간드, 입자, 고체 표면, 유기 및 무기 중합체, 염색체, 핵, 살아 있는 세포, 및 이들의 조합물 또는 조립체(assemblage)를 포함할 수 있다. 염료는 소수성 인력, 이온성 인력, 및 공유 부착을 포함하여 다양한 수단에 의해 선택적 링커에 의해 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 양태에서, 염료는 공유 부착에 의해 기질에 컨쥬게이션된다. 보다 특히, 공유 부착은 링커 기에 의해 이루어진다. 일부 경우에, 이러한 표지된 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로서 지칭된다.
본 개시내용은 본원에 제시된 염료 중 하나 이상으로 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (변형된 뉴클레오티드)의 컨쥬게이트를 추가로 제공한다. 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 예컨대, 비-제한적인 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고체상 증폭, 폴리뉴클레오티드 서열분석 (예컨대, 고체상 서열분석), 닉(nick) 번역 반응 등에서 효소적 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오티드를 표지화하는데 유용하다.
생체분자에 대한 부착은 화학식 (I)의 화합물의 R, R1, R2, R3, R4, R5 또는 X 위치를 통해 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 연결은 화학식 (I)의 R3 또는 R5 기를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 치환기 기는 카복실 또는 치환된 알킬, 예를 들어, -CO2H로 치환된 알킬 또는 카복실 기의 활성화된 형태, 예를 들어, 아미드 또는 에스테르이며, 이는 생체분자의 아미노 또는 하이드록실 기에 대한 부착에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "활성화된 에스테르"는 온화한 조건에서, 예를 들어, 아미노 기를 함유하는 화합물과 반응할 수 있는 카복실 기 유도체를 지칭한다. 활성화된 에스테르의 비-제한적인 예는 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 및 석신이미도 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 염료 화합물은 뉴클레오티드 염기를 통해 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 공유 부착될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는 표지를 가질 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 부착된 3'-OH 차단 기를 가질 수 있다.
본원에 기재된 새로운 형광 염료의 특히 유용한 적용은 생체분자, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 표지하기 위한 것이다. 본 출원의 일부 실시양태는 본원에 기재된 새로운 형광 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
링커
본원에 기재된 염료 화합물은 기질 또는 다른 분자에 대한 화합물의 공유 부착을 위해 치환기 위치 중 하나에서 반응성 링커 기를 포함할 수 있다. 반응성 연결 기는 결합(예컨대, 공유 또는 비-공유 결합), 특히 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 용어 "절단가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거되어야 한다는 것을 암시하는 것은 아니다. 절단 부위는 절단 후 링커의 일부가 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 채로 유지되도록 보장하는 링커 상의 위치에 있을 수 있다. 절단가능한 링커는, 비-제한적인 예로서, 친전자적으로 절단가능한 링커, 친핵적으로 절단가능한 링커, 광절단가능한 링커, 환원성 조건 하에서 절단가능한 링커 (예를 들어, 디설파이드 또는 아지드 함유 링커), 산화성 조건 하에서 절단가능한 링커, 안전성-포착 링커의 사용을 통해 절단가능한 링커, 및 제거 메커니즘에 의해 절단가능한 링커일 수 있다. 염료 화합물을 기질 모이어티에 부착하기 위한 절단가능한 링커의 사용은, 하류(downstream) 단계에서 임의의 간섭 신호를 피하면서, 필요한 경우, 검출 후 표지가 제거될 수 있도록 보장한다.
유용한 링커 기는 PCT 공개공보 WO2004/018493호 (본원에 참고로 원용됨)에서 찾아볼 수 있으며, 이의 예는 수용성 포스핀 또는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성 리간드로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매를 사용하여 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 수용액에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성 전이 금속 착물을 형성한다. 이러한 절단가능한 링커는 표지, 예컨대, 본원에 제시된 염료에 뉴클레오티드의 염기를 연결시키는데 사용될 수 있다.
특정 링커는 PCT 공개공보 WO2004/018493호 (본원에 참고로 원용됨)에 개시된 것들, 예컨대, 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure pct00040
(여기서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 Q는 C1-10 치환된 또는 비치환된 알킬 기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환된 또는 비치환된 알킬 기이며, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지에 연결되는 위치를 나타낸다). 일부 양태에서, 링커는 표지, 예컨대, 예를 들어, 본원에 기재된 염료 화합물에 뉴클레오티드의 염기를 연결시킨다.
링커의 추가 예는 미국 공개공보 제2016/0040225호 및 제2019/0017111호 (본원에 참고로 원용됨)에 개시된 것들, 예컨대, 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure pct00041
.
본원에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 및 표지 사이의 전체의 또는 부분적인 링커 구조를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 형광 염료 (형광단) 및 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 기를 도입함으로써 변경될 수 있고, 이에 의해 당업계에 알려진 다른 링키지(linkage)를 통해 구아닌 염기에 부착된 동일한 형관단에 비해 형광 세기를 증가시킬 수 있다. 예시적인 링커 및 이들의 특성은 PCT 공개공보 WO2007020457호 (본원에 참고로 원용됨)에 제시되어 있다. 링커의 설계, 및 특히 이들의 증가된 길이는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA에 혼입되는 경우 구아노신 뉴클레오티드의 구아닌 염기에 부착되는 형광단의 밝기의 개선을 허용할 수 있다. 따라서, 염료가 구아닌-함유 뉴클레오티드에 부착되는 형광 염료 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 분석 방법에 사용되는 경우, WO 2007/020457호에 기재된 바와 같이, 링커는 n이 2 내지 50의 정수인 화학식 -((CH2)2O)n-의 스페이서 기를 포함하는 것이 유리하다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기 상의 부위에서 표지될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소성 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기로 이루어진다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실 기가 결여된 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린계는 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)이고, 피리미딘계는 시토신 (C) 및 티민 (T)이거나, RNA의 맥락에서, 우라실 (U)이다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이며, 에스테르화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록실 기 상에서 발생한다. 뉴클레오티드는 일반적으로 모노, 디- 또는 트리포스페이트이다.
"뉴클레오시드"는 구조적으로 뉴클레오티드와 유사하지만 포스페이트 모이어티가 빠져 있다. 뉴클레오시드 유사체의 예는 표지가 염기에 연결되고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다.
비록 염기가 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘으로서 지칭되지만, 당업자는 왓슨-크릭 염기 페어링(Watson-Crick base pairing)을 겪는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 능력을 변경하지 않는 유도체 및 유사체가 이용가능하다는 것을 이해할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모 화합물의 것과 동일하거나 거의 유사하지만, 화학적 또는 물리적 변형, 예컨대, 예를 들어, 상이하거나 추가의 측 기를 가져, 유도체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 다른 분자에 연관되도록 하는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 실시양태에서, 유도체는 왓슨-크릭 페어링을 겪을 수 있어야 한다. "유도체" 및 "유사체"는 또한 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 포함한다. 이러한 유도체 및 유사체는 예를 들어, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포라닐리데이트, 및 포스포라미데이트 링키지 등을 포함하는 변형된 포스포디에스테르 링키지를 포함할 수 있다.
염료는 예를 들어, 링커를 통해 뉴클레오티드 염기의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 왓슨-크릭 염기 페어링은 생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지화 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이 링커 기를 사용하여 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 염료를 공유 부착시킬 수 있다.
특정 실시양태에서 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 효소적으로 혼입가능하고 효소적으로 연장가능할 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오티드의 전체 결합 및 인지를 유의하게 방해하지 않도록 화합물에 뉴클레오티드를 연결하기에 충분한 길이일 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 스페이서는 예를 들어, 뉴클레오티드 염기가 절단 부위 또는 표지로부터 거리를 두게 한다.
본원에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00042
여기서 염료는 염료 화합물이고; B는 핵염기, 예컨대, 예를 들어, 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 구아닌 등이고; L은 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 선택적 링커 기이고; R'은 H, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스테르 유사체, 반응성 인(phosphorous) 함유 기에 부착된 -O-, 또는 차단 기에 의해 보호된 -O-일 수 있고; R"은 H, OH, 포스포르아미다이트 또는 3'-OH 차단 기일 수 있으며, R"'은 H 또는 OH이다. R"이 포스포르아미다이트인 경우, R'은 자동화된 합성 조건 하에서 후속 모노머 커플링을 가능하게 하는 산-절단가능한 하이드록실 보호 기이다.
특정 실시양태에서, 차단 기는 염료 화합물과 별도이고 무관하며, 즉, 이것에 부착되지 않는다. 대안적으로, 염료는 3'-OH 차단 기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R"은 염료 화합물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 3'-OH 차단 기일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시양태에서, 펜토스 당의 3' 탄소 상에는 차단 기가 없고, 염기에 부착된 염료 (또는 염료 및 링커 작제물)는 예를 들어, 추가 뉴클레오티드의 혼입에 대한 차단물로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다. 따라서, 차단은 염료가 당의 3' 위치에 부착되는지 여부에 관계없이, 입체 장애로 인한 것일 수 있거나, 크기, 전하 및 구조의 조합으로 인한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시양태에서, 차단 기는 펜토스 당의 2' 또는 4' 탄소 상에 존재하고, 추가 뉴클레오티드의 혼입에 대한 차단물로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다.
차단 기의 사용은 변형된 뉴클레오티드가 혼입되는 경우, 예컨대, 연장을 중단시킴으로써, 중합화가 제어되도록 한다. 차단 효과가 예를 들어, 비-제한적인 예로서 화학적 조건을 변화시킴으로써 또는 화학적 차단물의 제거에 의해 가역적인 경우, 연장을 특정 위치에서 중단한 다음, 이후 계속할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 3'-OH 차단 기는 본원에 참고로 원용되는 WO2004/018497호 및 WO2014/139596호에 개시된 모이어티를 포함할 것이다. 예를 들어, 차단 기는 아지도메틸 (-CH2N3) 또는 치환된 아지도메틸 (예컨대, -CH(CHF2)N3 또는 CH(CH2F)N3), 또는 알릴일 수 있다.
특정 실시양태에서, (염료 및 뉴클레오티드 사이의) 링커 및 차단 기는 둘 모두가 존재하며 별도의 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 링커 및 차단 기는 둘 모두가 실질적으로 유사한 조건 하에서 절단가능하다. 따라서, 탈보호 및 탈차단 공정은 염료 화합물 및 차단 기 둘 모두를 제거하는데 단일 처리만이 필요할 것이므로 보다 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서 링커 및 차단 기는 유사한 조건 하에서 절단될 필요가 없고, 대신 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단될 수 있다.
개시내용은 또한 염료 화합물을 혼입하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 링키지로 접합된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 각각 포함하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 제시된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 (예컨대, 염료 화합물로 표지됨)와 조합하여, 자연 발생 뉴클레오티드, 본원에 기재된 표지된 뉴클레오티드 이외의 비-자연 발생 (또는 변형된) 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 비-자연적인 백본 링키지 및/또는 비-뉴클레오티드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 키메라 구조가 또한 고려된다.
본원에 기재된 비-제한적인 예시적인 표지된 뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
Figure pct00043
Figure pct00044
여기서 L은 링커를 나타내고 R은 상기 기재된 당 잔기를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 비-제한적인 예시적인 형광 염료 컨쥬게이트는 아래에 제시된다:
Figure pct00045
키트
본 개시내용은 또한 염료로 표지된 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 하나 이상의 추가 구성요소와 함께 본원에 제시된 염료로 표지된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 것이다. 추가 구성요소(들)는 본원에 제시된 방법 또는 하기 실시예 섹션에서 식별된 구성요소 중 하나 이상일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 조합될 수 있는 구성요소의 일부 비-제한적인 예는 하기에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 함께 본원에 제시된 염료로 표지된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 표지되지 않은 또는 천연 뉴클레오티드, 및/또는 형광 표지된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 공급될 수 있다. 따라서, 키트는 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 다른 것, 예를 들어, 종래 기술의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 조합은 별도의 개별 구성요소 (예컨대, 용기 또는 튜브당 하나의 뉴클레오티드 타입) 또는 뉴클레오티드 혼합물 (예컨대, 동일한 용기 또는 튜브에서 혼합된 2 개 이상의 뉴클레오티드)로서 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된 복수의, 특히 2 개, 또는 3 개, 또는 보다 특히 4 개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오티드는 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물이 없는 다크(dark)일 수 있다. 상이한 뉴클레오티드가 상이한 염료 화합물로 표지되는 경우, 염료 화합물이 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료인 것이 키트의 특징이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료"는 2 개 이상의 이러한 염료가 하나의 샘플에 존재하는 경우 형광 검출 장비 (예를 들어, 상업적인 모세관-기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장의 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물로 표지된 2 개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급되는 경우, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료는 예컨대, 예를 들어, 동일한 레이저에 의해 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 실시양태의 특징이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4 개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급되는 경우, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료 중 2 개는 둘 모두 하나의 파장에서 여기될 수 있고 다른 2 개의 스펙트럼적으로 구별가능한 염료는 둘 모두 다른 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 실시양태의 특징이다. 특정 여기 파장은 488 nm 및 532 nm이다.
일 실시양태에서, 키트는 본 개시내용의 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 제2 염료로 표지된 제2 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 염료는 10 nm 이상, 특히 20 nm 내지 50 nm의 최대 흡광도에서의 상이함을 갖는다. 보다 특히, 2 개의 염료 화합물은 15-40 nm 사이의 스톡스 이동(Stokes shifts)을 가지며, "스톡스 이동"은 피크 흡수 및 피크 방출 파장 사이의 거리이다.
추가 실시양태에서, 키트는 형광 염료로 표지된 2 개의 다른 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 염료는 동일한 레이저에 의해 532 nm에서 여기된다. 염료는 10 nm 이상, 특히 20 nm 내지 50 nm의 최대 흡광도에서의 상이함을 가질 수 있다. 보다 특히, 2 개의 염료 화합물은 20-40 nm 사이의 스톡스 이동을 가질 수 있다. 본 개시내용의 염료와 스펙트럼적으로 구별가능하고 상기 기준을 충족시키는 특정 염료는 미국 특허 제5,268,486호 (예를 들어, Cy3) 또는 WO 0226891호 (Alexa 532; Molecular Probes A20106)에 기재된 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 비대칭 폴리메틴이며, 이들 각각이 본원에 참고로 원용된다. 대안적인 염료는 로다민 유사체, 예를 들어, 테트라메틸 로다민 및 이의 유사체를 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 개시내용의 키트는 동일한 염기가 2 개의 상이한 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오티드는 개시내용의 화합물로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오티드는 스펙트럼적으로 별개인 화합물, 예를 들어, 600 nm 미만에서 흡수하는 '녹색' 염료로 표지될 수 있다. 제3 뉴클레오티드는 개시내용의 화합물 및 스펙트럼적으로 별개인 화합물의 혼합물로서 표지될 수 있으며, 제4 뉴클레오티드는 '다크'일 수 있고 표지를 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 간단히 말해, 뉴클레오티드 1-4는 '청색', '녹색', '청색/녹색'으로 표지되고, 다크일 수 있다. 계측을 더 단순화하기 위해, 4 개의 뉴클레오티드는 단일 레이저로 여기되는 2 개의 염료로 표지될 수 있고, 따라서, 뉴클레오티드 1-4의 표지화는 '청색 1', '청색 2', '청색 1/청색 2', 및 다크일 수 있다.
뉴클레오티드는 본 개시내용의 2 개의 염료를 함유할 수 있다. 키트는 개시내용의 염료로 표지된 2 개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 추가 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 여기서 뉴클레오티드는 520 nm 내지 560 nm의 영역에서 흡수하는 염료로 표지된다. 키트는 표지되지 않은 뉴클레오티드를 추가로 함유할 수 있다.
비록 키트가 상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오티드를 갖는 구성과 관련하여 본원에 예시되지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2, 3, 4 개 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오티드를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, 키트는 변형된 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드로의 혼입을 촉매화할 수 있는 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 이러한 키트에 포함될 다른 구성요소는 완충액 등을 포함할 수 있다. 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드, 및 상이한 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 다른 임의의 뉴클레오티드 구성요소는 농축된 형태로 키트에 제공되어 사용 전에 희석될 수 있다. 이러한 실시양태에서 적합한 희석 완충액이 또한 포함될 수 있다. 또한, 본원에 제시된 방법에서 식별된 구성요소 중 하나 이상이 본 개시내용의 키트에 포함될 수 있다.
서열분석 방법
본 개시내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오시드)는 단독으로든 또는 더 큰 분자 구조 또는 컨쥬게이트에 혼입 또는 회합(association)되든지 간에, 임의의 분석 방법, 예컨대, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이 문맥에서 용어 "폴리뉴클레오티드에 혼입된"은 5' 포스페이트가 제2 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 3' 하이드록실 기에 포스포디에스테르 링키지로 접합되는 것을 의미할 수 있으며, 이는 그 자체로 더 긴 폴리뉴클레오티드 쇄의 일부를 형성할 수 있다. 본원에 제시된 변형된 뉴클레오티드 세트의 3' 말단은 추가의 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 포스포디에스테르 링키지로 접합되거나 접합되지 않을 수 있다. 따라서, 비-제한적인 일 실시양태에서, 개시내용은 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 변형된 뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다: (a) 개시내용의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 혼입하는 단계 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오티드(들)에 부착된 염료 화합물로부터의 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오티드에 혼입된 변형된 뉴클레오티드(들)를 검출하는 단계.
이러한 방법은 다음을 포함할 수 있다: 개시내용에 따른 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 합성 단계 (a) 및 폴리뉴클레오티드에 혼입된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(들)가 이들의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출되는 검출 단계 (b).
본 출원의 일부 실시양태는 다음을 포함하는 서열분석 방법에 관한 것이다: (a) 본원에 기재된 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 단계; 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오티드(들)에 부착된 새로운 형광 염료로부터의 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오티드에 혼입된 표지된 뉴클레오티드(들)를 검출하는 단계.
일 실시양태에서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 폴리머라제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오티드에 혼입된다. 그러나, 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 접합하는 다른 방법, 예컨대, 예를 들어, 화학적 올리고뉴클레오티드 합성, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드의 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드에 대한 결찰(ligation)이 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "혼입하는"은 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 효소적 방법뿐만 아니라 화학적 방법에 의한 폴리뉴클레오티드 합성을 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 합성 단계가 수행되고 임의로 개시내용의 형광 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한 주형 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링된(annealed) 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 유리 3' 하이드록실 기 및 변형된 뉴클레오티드 상의 5' 포스페이트 기 사이에 포스포디에스테르 링키지의 형성을 허용하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 대한 뉴클레오티드의 상보적인 염기-페어링에 의해 지시되는 폴리뉴클레오티드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
방법의 모든 실시양태에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오티드가 혼입된 폴리뉴클레오티드 가닥이 주형 가닥에 어닐링되는 동안, 또는 두 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가 단계, 예를 들어, 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오티드(들)를 혼입하는 표적 가닥은 단리되거나 정제된 다음, 추가로 처리되거나 후속 분석에서 사용될 수 있다. 예로서, 합성 단계에서 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드(들)로 표지된 표적 폴리뉴클레오티드는 이후 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제시된 합성 단계의 생성물은 추가 반응 단계를 거칠 수 있고, 원하는 경우, 이러한 후속 단계의 생성물은 정제되거나 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기술에 익숙한 사람들에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 실시양태에서, 합성 단계는 적합한 폴리머라제 효소의 존재 하에서 주형 가닥에 상보적인 연장된 표적 가닥을 형성하기 위해, 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 전구체를 사용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 다른 실시양태에서, 합성 단계는 그 자체로 표적 및 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 복사하는 것으로부터 유래된 어닐링된 상보적 가닥을 포함하는 표지된 이중 가닥 증폭 생성물을 생산하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 닉 번역, 가닥 변위(displacement) 중합화, 무작위 프라이밍된(primed) DNA 표지화 등을 포함한다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본원에 제시된 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 촉매화할 수 있는 것이다. 다양한 자연 발생 또는 변형된 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리머라제는 열순환 조건을 사용하여 수행되는 합성 반응에 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라제는 등온 프라이머 연장 반응에 바람직하지 않을 수 있다. 개시내용에 따른 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라제는 이들 각각이 본원에 참고로 원용되는 WO 2005/024010호 또는 WO06120433호에 기재된 것들을 포함한다. 더 낮은 온도, 예컨대, 37 ℃에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소가 반드시 열안정성 폴리머라제일 필요는 없으므로, 폴리머라제의 선택은 다수의 인자, 예컨대, 반응 온도, pH, 가닥-변위 활성 등에 따라 달라질 것이다.
구체적인 비-제한적 실시양태에서, 개시내용은 핵산 서열분석, 재-서열분석, 전체 게놈 서열분석, 단일 뉴클레오티드 다형성 스코어링, 폴리뉴클레오티드에 혼입되는 경우 본원에 제시된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 수반하는 임의의 다른 적용을 포함한다. 형광 염료를 포함하는 변형된 뉴클레오티드로 표지된 폴리뉴클레오티드의 사용이 유리한 다양한 다른 적용 중 임의의 것은 본원에 제시된 염료를 갖는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서 개시내용은 폴리뉴클레오티드 합성에-의한-서열분석(sequencing-by-synthesis) 반응에서 개시내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 사용을 제공한다. 합성에-의한-서열분석은 일반적으로 서열분석될 주형 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오티드 쇄를 형성하기 위해 폴리머라제 또는 리가제를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드 쇄에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 순차적인 첨가를 포함한다. 첨가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 정체성은 검출 또는 "이미징" 단계에서 결정될 수 있다. 첨가된 염기의 정체성은 각각의 뉴클레오티드 혼입 단계 후에 결정될 수 있다. 이어서, 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기-페어링 규칙을 사용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 정체성의 결정을 위한 본원에 제시된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드의 사용은, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성의 스코어링에 유용할 수 있으며, 이러한 단일 염기 연장 반응은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
본 개시내용의 일 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 서열은 혼입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 서열분석될 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 초기 가닥으로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 혼입을 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오티드의 서열분석은 적합한 프라이머로 프라이밍될 수 있고 (또는 헤어핀(hairpin)의 일부로서 프라이머를 함유할 헤어핀 작제물로서 제조될 수 있음), 초기 쇄는 폴리머라제-촉매화 반응에서 프라이머의 3' 말단에 대한 뉴클레오티드의 첨가에 의한 단계적 방식으로 연장된다.
특정 실시양태에서, 각각의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 (A, T, G 및 C)는 고유의 형광단으로 표지될 수 있고, 또한 제어되지 않은 중합화를 방지하기 위해 3' 위치에 차단 기를 포함한다. 대안적으로, 4 개의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않을 수 있다 (다크). 폴리머라제 효소는 뉴클레오티드를 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 초기 쇄에 혼입시키고, 차단 기는 뉴클레오티드의 추가 혼입을 방지한다. 임의의 혼입되지 않은 뉴클레오티드는 세척 제거될 수 있고, 각각의 혼입된 뉴클레오티드로부터의 형광 신호는 적합한 수단, 예컨대, 레이저 여기 및 적합한 방출 필터를 사용하는 전하-커플링된 장치에 의해 광학적으로 "판독"될 수 있다. 이어서, 3'-차단 기 및 형광 염료 화합물을 (동시에 또는 순차적으로) 제거 (탈보호)하여 추가 뉴클레오티드 혼입을 위한 초기 쇄를 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 혼입된 뉴클레오티드의 정체성은 각각의 혼입 단계 후에 결정될 것이지만, 이것이 엄밀히 필수적인 것은 아니다. 유사하게, 미국 특허 제5,302,509호 (이는 본원에 참고로 원용됨)는 고체 지지체 상에 고정된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기 예시된 바와 같이, 방법은 DNA 폴리머라제의 존재 하에서 고정된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장하는 가닥으로의 형광 표지된 3'-차단된 뉴클레오티드 A, G, C 및 T의 혼입을 활용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기를 혼입시키지만 3'-차단 기에 의해 추가 첨가는 방지된다. 이어서, 혼입된 뉴클레오티드의 표지를 결정할 수 있고, 차단 기는 추가 중합화가 일어날 수 있도록 화학적 절단에 의해 제거된다. 합성에-의한-서열분석 반응에서 서열분석될 핵산 주형은 서열분석이 요구되는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가 뉴클레오티드의 첨가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서 역할을 하는 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석될 주형의 영역은 상보적 가닥 상에 이러한 유리 3' 하이드록실 기를 돌출시킬(overhang) 것이다. 서열분석될 주형의 돌출 영역은 단일 가닥일 수 있지만, 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH 기를 제공하기 위해 서열분석될 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에 "닉이 존재" 하는 경우, 이중-가닥일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 서열분석은 가닥 변위에 의해 진행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 프라이머는 서열분석될 주형의 단일-가닥 영역에 하이브리드화되는 별도의 구성요소 (예컨대, 짧은 올리고뉴클레오티드)로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석될 주형 가닥은 각각 분자-내 듀플렉스(duplex), 예컨대, 예를 들어, 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있는 부분적으로 자기-상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드, 및 이들을 고체 지지체에 부착시킬 수 있는 방법은 이들 각각이 본원에 참고로 원용되는 PCT 공개공보 WO0157248호 및 WO2005/047301호에 개시되어 있다. 뉴클레오티드는 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가되어, 5'에서 3' 방향으로의 폴리뉴클레오티드 쇄의 합성을 초래할 수 있다. 첨가된 염기의 성질은 특히 각각의 뉴클레오티드 첨가 후에 결정될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니므로, 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공한다. 따라서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기와의 포스포디에스테르 링키지의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실 기에 뉴클레오티드를 접합시킴으로써 핵산 가닥 (또는 폴리뉴클레오티드)에 혼입된다.
서열분석될 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 하이브리드(hybrid) 분자일 수 있다. 핵산 주형은 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 및 자연적인 또는 비-자연적인 백본 링키지가 서열분석 반응에서 주형의 복사를 방해하지 않는 한, 이들을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 서열분석될 핵산 주형은 당업계에 알려진 임의의 적합한 링키지 방법, 예를 들어, 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서 주형 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체 (예컨대, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 개시내용의 다른 실시양태에서 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오티드의 직접 공유 부착을 허용하거나, 그 자체가 고체 지지체에 비-공유 부착할 수 있는 하이드로겔 또는 중합전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오티드를 고정시키기 위해 일부 방식으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 지지체에 직접 부착된 어레이는 예를 들어, WO00006770호 (본원에 참고로 원용됨)에 개시된 것들이며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 유리(glass) 상의 펜던트 에폭시드 기와 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노 기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, WO2005/047301호 (본원에 참고로 원용됨)에 기재된 바와 같이, 황-기반 친핵체와 고체 지지체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체-지지된 주형 폴리뉴클레오티드의 또 다른 추가 예는, 예를 들어, 이들 각각이 본원에 참고로 원용되는 W000/31148호, W001/01143호, W002/12566호, W003/014392호, 미국 특허 제6,465,178호 및 W000/53812호에 기재된 바와 같이, 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착된 것이다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기 인용된 참고문헌 및 본원에 참고로 원용되는 WO2005/065814호에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 구체적인 하이드로겔은 WO 2005/065814호 및 미국 공개공보 제2014/0079923호에 기재된 것들을 포함한다. 일 실시양태에서, 하이드로 겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는 예를 들어, 미국 특허 제6,172,218호 (이는 본원에 참고로 원용됨)에 기재된 바와 같이, 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 적용에 유용할 수 있다. 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 비드 라이브러리가 제조될 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이들의 생성을 위한 방법은 이들 각각이 본원에 참고로 원용되는 Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)에 기재되어 있다. 본원에 제시된 뉴클레오티드를 사용하는 이러한 비드의 어레이에 대한 서열분석은 개시내용의 범주 내에 있다.
서열분석될 주형(들)은 고체 지지체 상에 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 개시내용의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터형 어레이 및 비드 어레이를 포함하는 모든 타입의 고-밀도 어레이에 적용가능하다. 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 비제한적으로 고체 지지체 상의 핵산 분자의 고정에 의해 형성된 것들을 포함하는 본질적으로 임의의 타입의 어레이에서 주형을 서열분석하기 위해 사용될 수 있다.
그러나, 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 클러스터형 어레이의 서열분석의 맥락에서 특히 유리하다. 클러스터형 어레이에서, 어레이 상의 별개의 영역 (종종 부위, 또는 특징으로서 지칭됨)은 다중 폴리뉴클레오티드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 다중 폴리뉴클레오티드 분자는 광학 수단에 의해 개별적으로 분해될 수 없으며 대신에 앙상블(ensemble)로서 검출된다. 어레이가 형성되는 방법에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별적인 폴리뉴클레오티드 분자의 다중 복사체 (예컨대, 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산 종에 대해 동질이다) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자의 다중 복사체 (예컨대, 2 개의 상이한 핵산 종의 다중 복사체)를 포함할 수 있다. 핵산 분자의 클러스터형 어레이는 당업계에 일반적으로 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예로서, 이들 각각이 본원에 원용되는 WO 98/44151호 및 WO00/18957호는 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"를 포함하는 어레이를 형성하기 위해 주형 및 증폭 생성물 둘 모두가 고체 지지체 상에 고정된 채로 유지되는 핵산의 증폭 방법을 기재하고 있다. 이러한 방법에 따라 제조된 클러스터형 어레이 상에 존재하는 핵산 분자는 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 사용한 서열분석에 적합한 주형이다.
본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 또한 단일 분자 어레이 상의 주형의 서열분석에 유용하다. 본원에 사용된 용어 "단일 분자 어레이(single molecule array)" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분포된 (또는 어레이된) 폴리뉴클레오티드 분자의 집단을 지칭하며, 여기서 집단의 모든 다른 것들로부터 임의의 개별적인 폴리뉴클레오티드의 간격은 개별적인 폴리뉴클레오티드 분자를 개별적으로 분해할 수 있게 한다. 따라서, 고체 지지체의 표면에 고정된 표적 핵산 분자는 일부 실시양태에서 광학 수단에 의해 분해될 수 있다. 이는 각각 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호가 사용된 특정 이미징 장치의 분해가능한 영역 내에서 발생할 것임을 의미한다.
단일 분자 검출은 어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오티드 분자 사이의 간격이 100 nm 이상, 보다 특히 250 nm 이상, 보다 더 특히 300 nm 이상, 심지어 보다 특히 350 nm 이상인 경우에 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 분해가능하고 단일 분자 형광점으로서 검출가능하고, 상기 단일 분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광표백(photobleaching)을 나타낸다.
용어 "개별적으로 분해된" 및 "개별 분해능"은 가시화되는 경우 어레이 상의 하나의 분자를 이의 이웃하는 분자와 구별할 수 있음을 명시하기 위해 본원에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들 사이의 분리는 개별 분자를 분해하기 위해 사용되는 특정 기술에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 각각이 본원에 참고로 원용되는 공개 출원 WO00/06770호 및 WO 01/57248호를 참고하여 이해될 것이다. 개시내용의 변형된 뉴클레오티드의 일 사용은 합성에-의한-서열분석 반응에서의 사용이지만, 변형된 뉴클레오티드의 유용성은 이러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법론에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 자동화된 형광 서열분석 프로토콜, 특히 생거(Sanger) 및 동료의 쇄 종결 서열분석 방법에 기반한 형광 염료-종결자 사이클 서열분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 프라이머 연장 서열분석 반응에서 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 혼입하기 위해 효소 및 사이클 서열분석을 사용한다. 소위 생거 서열분석 방법 및 관련된 프로토콜 (생거-타입)은 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 이용한 무작위화 쇄 종결을 활용한다.
따라서, 본 개시내용은 또한 3' 및 2' 위치 둘 모두에서 하이드록실 기가 결여된 디데옥시뉴클레오티드인 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 변형된 디데옥시뉴클레오티드는 생거 타입 서열분석 방법 등에 사용하기에 적합하다.
3' 차단 기를 혼입하는 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 인식될 것이며, 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성된 동일한 효과가 3'-OH 차단 기를 갖는 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성될 수 있기 때문에 생거 방법 및 관련된 프로토콜에서 또한 유용할 수 있다: 둘 모두는 후속 뉴클레오티드의 혼입을 방지한다. 본 개시내용에 따른 뉴클레오티드 및 3' 차단 기를 갖는 뉴클레오티드가 생거-타입 서열분석 방법에서 사용되는 경우, 뉴클레오티드에 부착된 염료 화합물 또는 검출가능한 표지가 절단가능한 링커를 통해 연결될 필요가 없음이 이해될 것이며, 개시내용의 표지된 뉴클레오티드가 혼입되는 각각의 경우; 뉴클레오티드를 이후에 혼입할 필요가 없으므로 표지를 뉴클레오티드로부터 제거할 필요가 없다.
실시예
추가 실시양태는 임의의 방식으로 청구 범위의 범주를 제한하도록 의도되지 않은 다음 실시예에서 추가로 상세하게 개시된다.
실시예 1: 화합물 I-1: 7-(3-카복시아제티디닐-1)-3-(5-클로로-벤즈옥사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00046
3-(5-클로로-벤즈옥사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.32 g, 1 mmol) 및 3-카복시아제티딘 (0.2 g, 2 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120 ℃에서 7 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 혼합물을 물 (15 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.25 g (63 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 396.05. 실측치 m/z: (+) 397 (M+1)+; (-) 395 (M-1)-.
실시예 2. 화합물 I-2: 7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(벤즈옥사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00047
3-(벤즈옥사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.56 g, 2 mmol) 및 3-카복시아제 티딘 (0.3 g, 3 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 125 ℃에서 9 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.41 g (56 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 362.09. 실측치 m/z: (+) 363 (M+1)+.
실시예 3. 화합물 I-3: 7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(벤즈이미다졸-2-일)쿠마린
Figure pct00048
3-(벤즈이미다졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (FC-2, 0.56 g, 2 mmol, 1 당량) 및 3-카복시아제티딘 (AC-C4, 0.3 g, 3 mmol, 1.5 당량)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 120 ℃에서 9 시간 동안 교반하였다. 3-카복시아제티딘 (0.3 g, 3 mmol) 및 DIPEA (0.26 g, 2 mmol)의 추가 부분을 첨가하였다. 추가 3 시간 동안 120 ℃에서 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.26 g (36 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 361.11. 실측치 m/z: (+) 362 (M+1)+; (-) 360 (M-1)- .
실시예 4. 화합물 I-4: 7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00049
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.30 g, 1 mmol) 및 3-카복시아제티딘 (0.2 g, 2 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120 ℃에서 8 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.28 g (75 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 378.07. 실측치 m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
실시예 5. 화합물 I-5: 7-(3-카복시피롤리딘-일-1)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00050
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.30 g, 1 mmol) 및 3-카복시피롤리딘 (0.23 g, 2 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120 ℃에서 6 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.31 g (80 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 392.08. 실측치 m/z: (+) 393 (M+1)+; (-) 391 (M-1)-.
실시예 6. 화합물 I-6: 7-(4-카복시피페리딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00051
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.30 g, 1 mmol) 및 이소니페코트산 (0.26 g, 2 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120 ℃에서 6 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.34 g (83 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 406.10 실측치 m/z: (+) 407 (M+1)+; (-) 405 (M-1)-.
실시예 7. 화합물 I-7: 7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(6-설포-벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00052
7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린 (0.38 g, 1 mmol)을 약 -5 ℃에서 20 % 발연 황산 (0.5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 몇 시간 동안 냉각하면서 교반한 다음, 3 시간 동안 실온에서 교반하였다. 80 ℃에서 1 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 무수 디에틸 에테르 (10 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 생성물을 HPLC에 의해 정제하였다. 수율 0.1 g (22 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 458.02. 실측치 m/z: (+) 459 (M+1)+.
실시예 8. 화합물 I-8 : 7-(3-카복시아제티딘-1-일)-3-(6-설파미도-벤즈옥사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00053
3-(6-설파미도-벤즈옥사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 (0.36 g, 1 mmol) 및 3-카복시아제티딘 (0.3 g, 3 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 몇 분 동안 교반한 다음, DIPEA (0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 125 ℃에서 9 시간 동안 교반하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 후, 반응 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 밤새 교반하였다. 생성된 침전물을 흡입 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.26 g (60 %). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 441.06. 실측치 m/z: (+) 442 (M+1)+.
실시예 9. 형광 세기의 비교
(최대 여기 파장 450 nm에서의) 예시적인 염료 용액의 형광 세기를 동일한 스펙트럼 영역에 대한 표준 염료와 비교하였다. 결과를 표 1에 나타내며 형광 기반 분석 적용을 위한 예시적인 염료의 유의한 이점을 입증한다.
표 1. 실시예에 개시된 새로운 형광 염료의 스펙트럼 특성.
Figure pct00054
실시예 10. 완전히 기능적인 뉴클레오티드 컨쥬게이트의 합성을 위한 일반 절차
본원에 개시된 쿠마린 형광 염료를 하기 적절한 아미노-치환된 아데닌 (A) 및 시토신 (C) 뉴클레오티드 유도체 A-LN3-NH2 또는 C-LN3-NH2와 커플링시켰다:
Figure pct00055
다음의 예시적인 아데닌 반응식에 따라 적절한 시약을 이용한 염료의 카복실 기의 활성화 후:
Figure pct00056
아데닌 커플링에 대한 일반적인 생성물은 하기에 도시된 바와 같다:
Figure pct00057
ffA-LN3-염료는 LN3 링커를 포함하고 본원에 개시된 쿠마린 염료로 표지된 완전히 기능화된 A 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조에서 R 기는 컨쥬게이션 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
염료 (10 μmol)를 5 mL 둥근-바닥 플라스크에 넣어 건조시키고 무수 디메틸포름아미드 (DMF, 1 mL)에 용해시킨 다음, 용매를 진공에서 증류 제거하였다. 이 절차를 2 회 반복하였다. 건조된 염료를 실온에서 무수 N,N-디메틸아세트아미드 (DMA, 0.2 mL)에 용해시켰다. N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트 (TSTU, 1.5 당량, 15 μmol, 4.5 mg)를 염료 용액에 첨가한 다음, DIPEA (3 당량, 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 마이크로피펫을 통해 이 용액에 첨가하였다. 반응 플라스크를 질소 가스 하에서 밀봉하였다. 반응 진행을 TLC (용리액 아세토니트릴-물 1:9) 및 HPLC에 의해 모니터링하였다. 한편, 적절한 아미노-치환된 뉴클레오티드 유도체 (A-LN3-NH2, 20 mM, 1.5 당량, 15 μmol, 0.75 mL)의 용액을 진공에서 농축시킨 다음, 물 (20 μL)에 재-용해시켰다. DMA 중 활성화된 염료의 용액을 N-LN3-NH2의 용액을 함유하는 플라스크로 옮겼다. DIPEA (3 당량, 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 트리에틸아민(1 μL)과 함께 더 첨가하였다. 커플링 진척을 TLC, HPLC, 및 LCMS에 의해 매시간 모니터링하였다. 반응이 완료되면, 트리에틸아민 바이카보네이트 완충액 (TEAB, 0.05 M ~ 3 mL)를 피펫을 통해 반응 혼합물에 첨가하였다. 완전히 기능화된 뉴클레오티드의 처음의 정제는 DEAE-세파덱스(Sephadex)® 컬럼을 통과하여 켄칭된 반응 혼합물을 실행시킴으로써 수행하여, 잔류하는 반응되지 않은 염료의 대부분을 제거하였다. 예를 들어, 세파덱스를 빈 25 g 바이오타지(Biotage) 카트리지, 용매 시스템 TEAB/MeCN에 붓는다. 세파덱스 컬럼으로부터의 용액을 진공에서 농축시켰다. 나머지 재료를 20 μm 나일론 필터를 통해 여과하기 전에 최소량의 물 및 아세토니트릴에 재용해시켰다. 여과된 용액을 분취용-HPLC에 의해 정제하였다. 제조된 화합물의 조성을 LCMS에 의해 확인하였다.
사이토신 커플링을 위한 일반적인 생성물은 상기 기재된 유사한 절차에 따라 하기에 도시된 바와 같다:
Figure pct00058
ffC-LN3-염료는 LN3 링커를 포함하고 본원에 개시된 쿠마린 염료로 표지된 완전히 기능화된 C 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조에서 R 기는 컨쥬게이션 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
실시예 11. 화학식 (I)의 화합물의 아미드 유도체의 제조
본원에 기재된 일부 추가 실시양태는 화학식 (I)의 화합물의 아미드 유도체 및 그의 제조 방법에 관한 것이며, 방법은 카복실산 활성화를 통해 화학식 (Ia)의 화합물을 화학식 (Ia')의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00059
및 화학식 (Ia')의 화합물을 화학식 (Am)의 일차 또는 이차 아민과 반응시켜 화학식 (Ib)의 아미드 유도체에 도달하는 단계를 포함하며:
Figure pct00060
여기서 변수 X, R, R1, R2, R3, R4 및 n은 본원에 정의되며; R'은 카복실 활성화제의 잔류 모이어티 (예컨대, N-하이드록시석신이미드, 니트로페놀, 펜타플루오로페놀, HOBt, BOP, PyBOP, DCC 등)이며; 각각의 RA 및 RB는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10 원 헤테로아릴, 3-10 원 헤테로사이클릴, 아랄킬, 헤테로아랄킬 또는 (헤테로사이클릴)알킬이다.
화학식 (Ib)의 화합물의 제조를 위한 일반적인 절차
화학식 (Ia)의 적절한 염료 (0.001 mol)를 적합한 무수 유기 용매 (DMF, 1.5 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 카복실 활성화 시약, 예컨대, TSTU, BOP 또는 PyBOP를 첨가하였다. 반응 혼합물을 약 20 분 동안 실온에서 교반한 다음, 적절한 아민 유도체를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 여과하고 과량의 활성화 시약을 물 중 0.1 M TEAB 용액으로 켄칭시켰다. 용매를 진공에서 증발시키고 잔류물을 TEAB 용액에 재-용해시키고 HPLC에 의해 정제하였다.
실시예 12. 2-채널 서열분석 적용
서열분석 적용에서 본원에 기재된 새로운 염료로 표지된 A 뉴클레오티드의 효율을 2-채널 검출 방법에서 입증하였다. 본원에 기재된 2-채널 방법과 관련하여, 핵산은, 그 개시내용이 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 출원 제2013/0079232호에 기재된 방법 및 시스템을 활용하여 서열분석될 수 있다.
2-채널 검출에서, 핵산은 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 타입, 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 타입, 제1 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 타입 및 어느 한 채널에서 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는 표지가 결여된 제4 뉴클레오티드 타입을 제공함으로써 서열분석될 수 있다. 산점도를 실험의 RTA2.0.93 분석에 의해 생성하였다. 도 1에서 도 3까지 예시된 산점도는 각각의 26 번의 사이클 실행의 5 번 사이클에 있었다.
도 1은 다음을 함유하는 완전히 기능화된 뉴클레오티드 (ffN) 혼합물의 산점도를 예시한다: Pol812를 포함하는 혼입 완충액 중 A-I-4 (0.5 μM), A-NR550S0 (1.5 μM), C-NR440 (2 μM), 다크 G (2 μM) 및 T-AF550POPOS0 (2 μM). 청색 노출 (채널 1) 500 ms, 녹색 노출 (채널 2) 1000 ms; Scanning mix에서 스캔됨.
도 2는 다음을 함유하는 완전히 기능화된 뉴클레오티드 (ffN) 혼합물의 산점도를 예시한다: Pol812를 포함하는 혼입 완충액 중 A-I-5 (1 μM), A-NR550S0 (1 μM), C-NR440 (2 μM), 다크 G (2 μM) 및 T-AF550POPOS0 (2 μM). 청색 노출 (채널 1) 500 ms, 녹색 노출 (채널 2) 1000 ms; Scanning mix에서 스캔됨.
도 3은 다음을 함유하는 완전히 기능화된 뉴클레오티드 (ffN) 혼합물의 산점도를 예시한다: Pol812를 포함하는 혼입 완충액 중 A-I-6 (1 μM), A-NR550S0 (1 μM), C-NR440 (2 μM), 다크 G (2 μM) 및 T-AF550POPOS0 (2 μM). 청색 노출 (채널 1) 500 ms, 녹색 노출 (채널 2) 1000 ms; Scanning mix에서 스캔됨.
각각의 도 1-3에서, "G" 뉴클레오티드는 표지되지 않고 좌측 하단 클라우드(cloud) ("다크 G")로서 도시된다. 본원에 기재된 새로운 염료 및 녹색 염료 (NR550S0)에 의해 표지된 "A" 뉴클레오티드의 혼합물로부터의 신호는 각각 도 1-3에서 우측 상단 클라우드로서 도시된다. 염료 AF550POPOS0으로 표지된 "T" 뉴클레오티드로부터의 신호는 좌측 상단 클라우드로 표시되고, 염료 NR440에 의해 표지된 "C" 뉴클레오티드로부터의 신호는 우측 하단 클라우드로 표시된다. X-축은 일 (청색) 채널의 신호 세기를 나타내고 Y-축은 다른 (녹색) 채널의 신호 세기를 나타낸다. NR440, AF550POPOS0, 및 NR550S0의 화학적 구조는 각각 PCT 공개공보 WO2018060482A1호, WO2017051201A1호, 및 WO2014135221A1호에 개시되며, 이들 모두가 참고로 원용된다.
도 1-3은 각각 본원에 기재된 새로운 염료로 표지된 완전히 기능적인 A-뉴클레오티드 컨쥬게이트가 충분한 신호 세기 및 뛰어난 클라우드 분리를 제공함을 도시한다.

Claims (41)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물, 이의 염 또는 메소머 형태:
    Figure pct00061

    여기서:
    X는 O, S, Se 또는 NRn이고, 여기서 Rn은 H, C1-6 알킬 또는 C6-10 아릴이고;
    고리 A는 3 내지 10 원 헤테로사이클릴이고;
    R, R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
    각각의 R3은 독립적으로 할로, -CN, -CO2H, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나, 2 개의 R3은 옥소(=O)를 형성하고;
    여기서 p 및 q는 각각 1, 2, 3 또는 4이고;
    각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2Rf, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
    각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
    각각의 Rc, Rd, Re 및 Rf는 독립적으로 H, 임의로 치환된 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
    m은 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
    n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
  2. 제1항에 있어서, X가 O 또는 S인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, X가 NRn인, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R이 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 아미노알킬, 임의로 치환된 카보사이클릴, 임의로 치환된 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R이 H, 할로 또는 C1-6 알킬인, 화합물.
  6. 제5항에 있어서, R이 H인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H, 할로 또는 C1-6 알킬인, 화합물.
  8. 제7항에 있어서, R1이 H인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 H, -SO3H, 임의로 치환된 알킬, 또는 -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬인, 화합물.
  10. 제9항에 있어서, R2가 H 또는 -SO3H인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 H, -SO3H, 임의로 치환된 알킬, 또는 -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬인, 화합물.
  12. 제11항에 있어서, R4가 H 또는 -SO3H인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 A가 하나의 질소 원자를 함유하는 3 내지 7 원 단일 헤테로사이클릭 고리인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 A가
    Figure pct00062
    또는
    Figure pct00063
    인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1, 2 또는 3이고, 각각의 R3이 독립적으로 -CO2H, -SO3H, -CO2H 또는 -SO3H로 임의로 치환된 C1-4 알킬, -(CH2)p-CO2Rc, 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬인, 화합물.
  16. 제15항에 있어서, n이 1인, 화합물.
  17. 제16항에 있어서, R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R5가 할로, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NRaRb 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬인, 화합물.
  19. 제18항에 있어서, R5가 -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 -CO2H, -SO3H 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-6 알킬인, 화합물.
  20. 제1항에 있어서, X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2 및 R4가 H이고; 고리 A가
    Figure pct00064
    또는
    Figure pct00065
    이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; m이 0 또는 1이며; R5가 할로, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 -SO3H 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-6 알킬인, 화합물.
  21. 제1항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물, 및 이들의 염 및 메소머 형태:
    Figure pct00066

    Figure pct00067

    Figure pct00068
    .
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는, 화합물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (I)의 R3을 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 화학식 (I)의 R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2H이며, 상기 부착이 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성하는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  26. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (I)의 R5를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  27. 제26항에 있어서, 화학식 (I)의 R5가 -CO2H이며, 상기 부착이 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성하는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 부착된 3' OH 차단 기를 추가로 포함하는, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 제1 표지된 뉴클레오티드 및 제2 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 표지된 뉴클레오티드가 제1 표지된 뉴클레오티드와 상이한 화합물로 표지되는, 키트.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제1 및 제2 표지된 뉴클레오티드가 단일 레이저 파장을 사용하여 여기가능한, 키트.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 제2, 제3 및 제4 뉴클레오티드가 상이한 화합물로 표지되고, 각각의 표지가 다른 표지와 구별가능한 별개의 최대 흡광도를 갖는, 키트.
  34. 제30항에 있어서, 상기 키트가 4 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 4 개의 뉴클레오티드 중 제1의 것이 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 4 개의 뉴클레오티드 중 제2의 것이 제2 표지를 갖고, 제3 뉴클레오티드가 제3 표지를 갖고, 제4 뉴클레오티드가 표지되지 않은 (다크인) 것인, 키트.
  35. 제30항에 있어서, 상기 키트가 4 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 4 개의 뉴클레오티드 중 제1의 것이 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드이고, 4 개의 뉴클레오티드 중 제2의 것이 제2 표지를 갖고, 제3 뉴클레오티드가 2 개의 표지의 혼합물을 갖고, 제4 뉴클레오티드가 표지되지 않은 (다크인) 것인, 키트.
  36. 서열분석, 발현 분석, 하이브리드화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 또는 단백질 결합 검정에서 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
  37. 제36항에 있어서, 자동화된 서열분석 기기가 상이한 파장에서 작동하는 2 개의 레이저를 포함하는, 상기 자동화된 서열분석 기기에 대한, 용도.
  38. 서열분석 검정에서 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계를 포함하는 서열분석 방법.
  39. 제38항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 서열분석 검정이 자동화된 서열분석 기기에서 수행되고, 상기 자동화된 서열분석 기기가 상이한 파장에서 작동하는 2 개의 광원을 포함하는 것인, 방법.
  41. 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물을 합성하는 방법.
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