BR112020026528A2

BR112020026528A2 - Composto de cumarina substituída com amina exocíclicos, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, kit, uso dos mesmos, método de sequenciamento e método para sintetizar um composto

Info

Publication number: BR112020026528A2
Application number: BR112020026528-4A
Authority: BR
Inventors: Nikolai Romanov; Carole Anastasi; Patrick McCauley
Original assignee: Illumina Cambridge Limited
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2021-09-08
Also published as: BR112020026528B1; JP2022522553A; US11884825B2; CN112654681A; AU2020230955A1; WO2020178162A1; KR20210134209A; WO2020178162A8; CA3103900A1; US11390753B2; ZA202007842B; CN112654681B; IL279674A; US20200277529A1; EP3931263A1; SG11202012555UA; US20230022437A1; MX2020013384A

Abstract

compostos de cumarina substituída com amina exocíclicos e seus usos como marcadores fluorescentes. o presente pedido se refere a derivados de cumarina substituída com amina exocíclicos e seus usos como marcadores fluorescentes. esses compostos podem ser usados como marcadores fluorescentes para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento de ácido nucleico.

Description

COMPOSTOS DE CUMARINA SUBSTITUÍDA COM AMINA EXOCÍCLICOS E SEUS USOS COMO MARCADORES FLUORESCENTES INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA AO PEDIDO DE PRIORIDADE

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório U.S. No. 62/812,837, depositado em 1º de março de 2019, que é incorporado por referência na íntegra. Campo

[002] A presente invenção refere-se a derivados de cumarina substituídos por amina exocíclicos e seus usos como marcadores fluorescentes. Em particular, os compostos podem ser usados como marcadores fluorescentes para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento de ácido nucleico.

ANTECEDENTES

[003] Várias publicações e documentos de patente são referenciados nesse pedido para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual essa invenção pertence. A invenção de cada uma dessas publicações e documentos é incorporada por referência na presente invenção.

[004] Detecção não radioativa de ácidos nucleicos contendo marcadores fluorescentes é uma tecnologia importante em biologia molecular. Muitos procedimentos empregados em tecnologia de DNA recombinante se baseavam anteriormente no uso de nucleotídeos ou polinucleotídeos radioativamente 32 marcados com, por exemplo, P. Compostos radioativos permitem detecção sensível de ácidos nucleicos e outras moléculas de interesse. Entretanto, há várias limitações no uso de isótopos radioativos tais como seu gasto, vida útil limitada, sensibilidade insuficiente, e mais importante, considerações de segurança. A eliminação da necessidade de marcadores radioativos reduz tanto os riscos de segurança como o impacto ambiental e custos associados, por exemplo, ao descarte de reagente. Métodos favoráveis à detecção fluorescente não radioativa incluem, como exemplos não limitantes, sequenciamento de DNA automatizado, métodos de hibridização, detecção em tempo real de produtos de reação de cadeia de polimerase e imunoensaios.

[005] Para muitas aplicações, é desejável empregar múltiplos marcadores fluorescentes distinguíveis de modo espectral para obter detecção independente de uma pluralidade de analisados de sobreposição espacial. Em tais métodos multiplex, o número de vasos de reação pode ser reduzido, simplificando protocolos experimentais e facilitando a produção de kits de reagente específicos de aplicação. Em sistemas de sequenciamento de DNA automatizados de multicores, por exemplo, a detecção de fluorescência por multiplex permite a análise de múltiplas bases de nucleotídeo em uma única faixa de eletroforese, aumentando, desse modo, o rendimento em relação a métodos de cor única e reduzindo as incertezas associadas a variações de mobilidade eletroforética entre as faixas.

[006] Entretanto, a detecção de fluorescência por multiplex pode ser problemática e há diversos fatores importantes que limitam a seleção de marcadores fluorescentes apropriados. Primeiramente, pode ser difícil encontrar compostos corantes com espectros de emissão e absorção resolvidos adequadamente em uma dada aplicação. Além disso, quando vários corantes fluorescentes são usados juntos, a geração de sinais de fluorescência em regiões espectrais distinguíveis por excitação simultânea pode ser complicada porque faixas de absorção dos corantes são normalmente amplamente separadas, assim é difícil obter eficiências de excitação de fluorescência comparáveis mesmo para dois corantes. Muitos métodos de excitação usam fontes de luz de potência alta como lasers e, portanto, o corante deve ter fotoestabilidade suficiente para resistir a tal excitação. Uma consideração final de importância específica para métodos de biologia molécula é a extensão na qual os corantes fluorescentes devem ser compatíveis com químicas de reagente como, por exemplo, solventes e reagentes de síntese de DNA, tampões, enzimas polimerase e enzimas ligase.

[007] À medida que a tecnologia de sequenciamento avança, surgiu uma necessidade por compostos corantes fluorescentes adicionais, seus conjugados de ácido nucleico e conjuntos de corantes múltiplos que atendam a todas as limitações acima e que sejam favoráveis particularmente a métodos molecular com alto rendimento como sequenciamento de fase sólida e similares.

[008] Moléculas de corante fluorescente com propriedades de fluorescência aperfeiçoadas como intensidade de fluorescência adequada, formato, e máximo de comprimento de onda de fluorescência podem melhorar a velocidade e precisão de sequenciamento de ácido nucleico. Sinais de fluorescência fortes são especialmente importantes quando medições são feitas em tampões biológicos à base de água e em temperaturas mais altas visto que as intensidades de fluorescência da maioria dos corantes são significativamente mais baixas em tais condições. Além disso, a natureza da base à qual um corante é ligado também afeta o máximo de fluorescência, intensidade de fluorescência e outras propriedades espectrais de corante. As interações específicas de sequência entre as nucleobases e os corantes fluorescentes podem ser moldadas por desenho específico dos corantes fluorescentes. A otimização da estrutura dos corantes fluorescentes pode melhorar a eficiência de incorporação de nucleotídeo, reduzir o nível de erros de sequenciamento, e diminuir o uso de reagentes e, portanto, os custos de sequenciamento de ácido nucleico.

[009] Alguns desenvolvimentos óticos e técnicos já levaram à qualidade de imagem muito melhorada, porém foram finalmente limitados por resolução ótica ruim. Em geral, a resolução ótica de microscopia de luz é limitada a objetos espaçados em aproximadamente metade do comprimento de onda da luz usada. Em termos práticos, então, somente objetos que estão colocados bem separados (pelo menos 200 a 350 nm) poderiam ser resolvidos por microscopia de luz. Um modo para melhorar a resolução de imagem e aumentar o número de objetos resolvíveis por unidade de área superficial é usar luz de excitação de um comprimento de onda mais curto. Por exemplo, se o comprimento de onda de luz for encurtado por Δλ~100 nm com a mesma ótica, a resolução será melhor (cerca de Δ50 nm/(cerca de 15%)), imagens menos distorcidas serão registradas, e a densidade de objetos na área reconhecível será aumentada em cerca de 35%.

[010] Certos métodos de sequenciamento de ácido nucleico empregam luz laser para excitar e detectar nucleotídeos marcados com corante. Esses instrumentos usam luz de comprimento de onda mais longo, como lasers vermelhos, juntamente com corantes apropriados que são excitáveis a 660 nm. Para detectar agrupamentos de sequenciamento de ácido nucleico densamente empacotados enquanto mantém resolução útil, uma fonte de luz azul de comprimento de onda mais curto (450-460 nm) pode ser usada. Nesse caso, a resolução ótica será limitada não pelo comprimento de onda de emissão dos corantes fluorescentes vermelhos de comprimento de onda mais longo, porém ao invés pela emissão de corantes excitáveis pela próxima fonte de luz de comprimento de onda mais longo, por exemplo, por “laser verde” a 532 nm. Desse modo, há necessidade de marcadores de corante azul para uso em detecção de fluorescência em aplicações de sequenciamento.

[011] Embora química de corante azul e tecnologias laser associadas tenham melhorado, por exemplo, para fornecer corantes para discos de DVD e Blu-ray, esses compostos não são apropriados para biomarcação e não podem ser usados como biomarcadores.

[012] Infelizmente, corantes azuis comercialmente disponíveis com fluorescência forte adequados para marcação de nucleotídeo são ainda bem raros. São descritos na presente invenção novos compostos fluorescentes adequados para marcação de nucleotídeo com fluorescência forte sob excitação de luz azul.

SUMÁRIO

[013] A presente invenção refere-se a derivados de cumarina substituídos por amina exocíclicos. Os compostos podem ser úteis como marcadores fluorescentes, particularmente para marcação de nucleotídeo em aplicações de sequenciamento de ácido nucleico. Em alguns aspectos, os corantes absorvem luz em luz de comprimento de onda curto, de modo ideal em um comprimento de onda de 450- 460 nm e são particularmente vantajosos em situações em que fontes de excitação de comprimento de onda azuis tendo um comprimento de onda de 450-460 nm são usadas. A excitação de comprimento de onda azul permite detecção e resolução de uma densidade mais alta de características por área unitária devido ao comprimento de onda mais curto de emissão de fluorescência. Quando tais corantes são usados em conjugados com nucleotídeos, aperfeiçoamentos podem ser vistos no comprimento, intensidade, precisão e qualidade de leituras de sequenciamento obtidas durante métodos de sequenciamento de ácido nucleico.

[014] Algumas modalidades da presente invenção se referem a um composto da fórmula (I), ou um sal do mesmo:

(I) em que X é O, S, Se, ou NRn, em que Rn é H, C1-6 alquila ou C6-10 arila; o anel A é uma heterociclila com 3 a 10 membros; R, R1, R2, e R4 são cada um independentemente H, halo, -CN, -CO2H, amino, - OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; cada R3 é independentemente halo, -CN, -CO2H, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q- C(O)NRdRe, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 alquenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída, ou dois R3 formam oxo (=O); em que p e q são cada 1, 2, 3 ou 4; cada R5 é independentemente halo, -CN, -CO2Rf, amino, -OH, C-amido, N- amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída;

cada Ra e Rb é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada Rc, Rd, Re e Rf é independentemente H, C1-6 alquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; m é 0, 1, 2, 3, ou 4; e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5.

[015] Em alguns aspectos, pelo menos um entre m ou n não é 0. Em alguns aspectos adicionais, quando cada um de R, R1, R2, e R4 é H, então pelo menos um de m ou n não é 0. Por exemplo, quando cada um de R, R1, R2, e R4 é H, m é 0, então n é 1, 2, 3, 4, ou 5. quando cada um de R, R1, R2, e R4 é H, n é 0, então m é 1, 2, 3, ou 4. Em alguns aspectos, quando m é 1; R5 é –CO2H; cada um de R, R1, R2, R4 é H; anel A é ; então X é O, Se, ou NRn.

[016] Em algumas outras modalidades, um composto da presente invenção é conjugado com uma porção de substrato tal como, por exemplo, um nucleosídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, polipeptídio, carboidrato, ligante, partícula, célula, superfície semissólida (por exemplo, gel) ou superfície sólida. A conjugação pode ser realizada através de um grupo carboxila (-CO2H), que pode ser reagido usando métodos conhecidos na técnica com um grupo amino ou hidroxila em uma porção (tal como um nucleotídeo) ou um ligante ligado à mesma, para formar uma amida ou éster.

[017] Alguns outros aspectos da presente invenção se referem a compostos de corante compreendendo grupos ligantes para permitir, por exemplo, ligação covalente a uma porção de substrato. A ligação pode ser realizada em qualquer posição do corante, incluindo em quaisquer dos grupos R. Em algumas modalidades, a ligação pode ser realizada através de R3 ou através de R5 da Fórmula (I).

[018] Alguns aspectos adicionais da presente invenção fornecem um composto de nucleosídeo ou nucleotídeo definido pela fórmula: N-L-corante em que N é um nucleotídeo; L é uma porção de ligante opcional; e corante é um composto fluorescente de acordo com a presente invenção.

[019] Algumas modalidades adicionais descritas na presente invenção são relacionadas a uma porção, em particular nucleotídeo ou oligonucleotídeo, marcado com um composto da Fórmula (I).

[020] Alguma invenção adicional fornece métodos de sequenciamento usando os compostos de corante da presente invenção.

[021] De acordo com um aspecto adicional a invenção também fornece um kit compreendendo um composto de corante (livre ou em forma conjugada) que pode ser usado em vários ensaios imunológicos, marcação de ácido nucleico ou oligonucleotídeo, ou para sequenciamento de DNA por síntese. Ainda em outro aspecto, a invenção fornece kits compreendendo “conjuntos” de corante particularmente adequados para ciclos de sequenciamento por síntese em uma plataforma de instrumentos automatizada. Em alguns aspectos há kits contendo um ou mais nucleotídeos onde pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado descrito na presente invenção.

[022] Um aspecto adicional da invenção é a preparação química de compostos da invenção, incluindo corantes de cumarina substituída por amina exocíclica e porções como nucleotídeos marcados com tais corantes.

[023] Em aspectos adicionais são métodos de sequenciamento incluindo incorporar um nucleotídeo marcado descrito na presente invenção em um polinucleotídeo em um ensaio de sequenciamento e detectar o nucleotídeo marcado, incorporado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[024] A FIG. 1 é um gráfico de dispersão ilustrando a capacidade de uso de um nucleotídeo totalmente funcionalizado A marcado com corante I-4 descrito na presente invenção em uma análise de sequenciamento de dois canais.

[025] A FIG. 2 é um gráfico de dispersão ilustrando a capacidade de uso de um nucleotídeo totalmente funcionalizado A marcado com corante I-5 descrito na presente invenção em uma análise de sequenciamento de dois canais.

[026] A FIG. 3 é um gráfico de dispersão ilustrando a capacidade de uso de um nucleotídeo totalmente funcionalizado A marcado com corante I-6 descrito na presente invenção em uma análise de sequenciamento de dois canais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[027] A presente invenção fornece compostos de cumarina substituída por amina exocíclicos particularmente adequados para métodos de detecção de fluorescência e sequenciamento por síntese. As modalidades descritas na presente invenção se referem a corantes e seus derivados da estrutura da fórmula (I), sais e formas mesoméricas da mesma.

(I)

[028] Em alguns aspectos, X é O. Em alguns aspectos, X é S. Em alguns aspectos, X é Se. Em alguns aspectos, X é NRn, em que Rn é H, C1-6 alquila, ou C6-10 arila, e em um aspecto, Rn é H. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 1; R5 é –CO2H; cada um de R, R1, R2, R4 é H; anel A é ; então X é O, Se, ou NRn. Em algumas modalidades, quando n é 0; o anel A é , , ou ; cada um de R, R1, R2, R4 é H; X é O; então m é 1, 2, 3, ou 4. Em alguns aspectos, quando n é 0, então m é 1, 2, 3 ou 4 e pelo menos um R5 é -CO2H. Em alguns outros aspectos, quando n é 1 e R3 é -CO2H, então m é 0 ou R5 não é -CO2H.

[029] Em alguns aspectos, R é H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída. Em um aspecto, R é H. Em um outro aspecto, R é halo. Em alguns aspectos, R é alquila C1-6 opcionalmente substituída. Em alguns aspectos, R é -CO2H. Em alguns aspectos R é -SO3H. Em alguns aspectos, R é -SO2NRaRb, em que Ra e Rb é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em um aspecto, R é -SO2NH2. Em alguns aspectos, R não é -CN.

[030] Em alguns aspectos, R1 é H. Em alguns aspectos, R1 é halo. Em alguns aspectos, R1 é -CN. Em alguns aspectos, R1 é C1-6 alquila. Em alguns aspectos, R1 é - SO2NRaRb, em que Ra e Rb é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em um aspecto, R1 é -SO2NH2. Em alguns aspectos, R1 não é -CN.

[031] Em alguns aspectos, R2 é H. Em alguns aspectos, R2 é halo. Em alguns aspectos, R2 é –SO3H. Em alguns aspectos, R2 é alquila opcionalmente substituída,

por exemplo C1-6 alquila. Em algumas modalidades adicionais, R2 é C1-4 alquila opcionalmente substituída com -CO2H ou -SO3H.

[032] Em alguns aspectos, R4 é H. Em alguns aspectos, R4 é -SO3H. Em alguns aspectos, R4 é alquila opcionalmente substituída, por exemplo C1-6 alquila. Em algumas modalidades adicionais, R4 é C1-4 alquila opcionalmente substituída com - CO2H ou -SO3H.

[033] Em alguns aspectos, o anel A é um anel heterocíclico único com 3 a 7 membros. Em algumas modalidades adicionais, o anel heterocíclico único com 3 a 7 membros contém um ou mais heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades adicionais, o anel heterocíclico único com 3 a 7 membros contém um átomo de nitrogênio. Em alguns aspectos, o anel A é . Em uma tal modalidade, o anel A é . Em alguns aspectos, o anel A é . Em uma tal modalidade, o anel A é . Em alguns aspectos, o anel A é . Em uma tal modalidade, o anel A é . Em alguns aspectos do anel A descrito na presente invenção, n é 0. Em alguns aspectos do anel A descrito na presente invenção, n é 1. Em alguns aspectos do anel A descrito na presente invenção, n é 2 ou 3. Em alguns aspectos, cada R3 é independentemente -CO2H, -SO3H, C1-4 alquila opcionalmente substituída com -CO2H ou -SO3H, -(CH2)p-CO2Rc, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em alguns aspectos, R3 é metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila ou hexila. Em outros aspectos, R3 é C1-4 alquila substituída. Em alguns aspectos, R3 é C1-4 alquila ou C2-6 alquila substituída com -CO2H ou –SO3H. Em algumas modalidades adicionais, n é 1 e R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc. Em algumas modalidades adicionais, Rc é H ou C1-4 alquila.

[034] O anel benzeno da porção da fórmula (I) é opcionalmente substituído em qualquer uma, duas, três ou quatro posições por um substituinte mostrado como R5. Onde m é zero, o anel benzeno é não substituído. Onde m é maior que 1, cada R5 pode ser igual ou diferente. Em alguns aspectos, m é 0. Em outros aspectos, m é 1. Em outros aspectos, m é 2. Em alguns aspectos, m é 1, 2 ou 3, e cada R5 é independentemente halo, -CN, -CO2Rf, amino, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb ou C1-6 alquila opcionalmente substituída, onde Rf é H ou C1-4 alquila. Em algumas modalidades adicionais, R5 é -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, ou C1-6 alquila substituída com -CO2H, -SO3H, ou -SO2NH2. Em algumas modalidades adicionais, R5 é -(CH2)xCOOH onde x é 2, 3, 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, quando cada um de R, R1, R2, R4 é H; n é 0; m é 1; então é substituído na seguinte posição: ou . Em uma modalidade, R5 é –CO2H.

[035] Os exemplos particulares de um composto da fórmula (I) incluem onde X é O, S ou NH; cada R, R1, R2, e R4 é H; anel A é ou ; n é 0 ou 1; R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc; p é 1, 2, 3, ou 4; Rc é H ou C1-6 alquila; m é 0 ou 1; e R5 é halo, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, ou C1-6 alquila substituída com -SO3H ou -SO2NRaRb. Em algumas modalidades, pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila. Em algumas modalidades adicionais, Rf é H ou C1-4 alquila. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 0, então n é 1; ou quando n é 0, então m é 1. Em uma modalidade, tanto m como n são 1. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 1, é substituído na seguinte posição: ou . Em uma modalidade, R5 é –CO2H. Em outra modalidade, R5 é halo, tal como cloro, ou –SO3H. Ainda em outra modalidade, R5 é -SO2NRaRb onde pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila.

[036] Exemplos particulares de um composto da fórmula (I) incluem onde X é O, S ou NH; cada R, R1, R2, e R4 é H; anel A é ou ; n é 0 ou 1; R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc; p é 1, 2, 3, ou 4; Rc é H ou C1-6 alquila; m é 0 ou 1; e R5 é halo, -CO2Rf, - SO3H, -SO2NRaRb, ou C1-6 alquila substituída com -SO3H ou -SO2NRaRb. Em algumas modalidades, pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila. Em algumas modalidades adicionais, Rf é H ou C1-4 alquila. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 0, então n é 1; ou quando n é 0, então m é 1. Em uma modalidade, tanto m como n são 1. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 1, é substituído na seguinte posição: ou . Em uma modalidade, R5 é –CO2H. Em outra modalidade, R5 é halo, tal como cloro, ou – SO3H. Ainda em outra modalidade, R5 é -SO2NRaRb onde pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila.

[037] Exemplos particulares de um composto da fórmula (I) incluem onde X é O, S ou NH; cada R, R1, R2, e R4 é H; anel A é ou ; n é 0 ou 1;

R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc; p é 1, 2, 3, ou 4; Rc é H ou C1-6 alquila; m é 0 ou 1; e R5 é halo, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, ou C1-6 alquila substituída com -SO3H ou -SO2NRaRb. Em algumas modalidades, pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila. Em algumas modalidades adicionais, Rf é H ou C1-4 alquila. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 0, então n é 1; ou quando n é 0, então m é 1. Em uma modalidade, tanto m como n são 1. Em algumas modalidades adicionais, quando m é 1, é substituído na seguinte posição: ou . Em uma modalidade, R5 é –CO2H. Em outra modalidade, R5 é halo, tal como cloro, ou –SO3H. Ainda em outra modalidade, R5 é -SO2NRaRb onde pelo menos um ou ambos de Ra e Rb é H ou C1-6 alquila.

[038] Exemplos específicos de corantes de cumarina substituída por amina exocíclicos incluem: , , , , , ,

, , , , , , , e sais e formas mesoméricas dos mesmos.

[039] Um composto particularmente útil é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado com um corante como descrito na presente invenção. O oligonucleotídeo ou nucleotídeo marcado pode ser ligado ao composto de corante revelado na presente invenção através de um carboxi ou um grupo alquil-carboxi para formar uma amida ou alquil-amida. Por exemplo, o composto de corante revelado na presente invenção é ligado ao nucleotídeo ou oligonucleotídeo através de R3 ou R5 da fórmula (I). Em algumas modalidades, R3 da Fórmula (I) é -CO2H ou - (CH2)p-CO2H e a ligação forma uma amida usando o grupo –CO2H. Em algumas modalidades, R5 da Fórmula (I) é -CO2H e a ligação forma uma amida usando o grupo –CO2H. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode ter o marcador ligado à posição C5 de uma base de pirimidina ou a posição C7 de uma base 7-deaza purina através de uma porção de ligante.

[040] O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode ter também um grupo de bloqueio covalentemente ligado a açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo. O grupo de bloqueio pode ser ligado em qualquer posição no açúcar ribose ou desoxirribose. Em modalidades específicas, o grupo de bloqueio está na posição 3’ OH do açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.

[041] São fornecidos na presente invenção kits incluindo dois ou mais nucleotídeos em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado com um composto da presente invenção. O kit pode incluir dois ou mais nucleotídeos marcados. os nucleotídeos podem ser marcados com dois ou mais marcadores fluorescentes. Dois ou mais dos marcadores podem ser excitados usando uma fonte de excitação única, que pode ser um laser. Por exemplo, as faixas de excitação para os dois ou mais marcadores podem estar pelo menos parcialmente em sobreposição de modo que a excitação na região de sobreposição do espectro faça com que os dois marcadores emitam fluorescência. Em modalidades específicas, a emissão a partir de dois ou mais marcadores ocorrerá em regiões diferentes do espectro de modo que a presença de pelo menos um dos marcadores possa ser determinada por distinguir oticamente a emissão.

[042] O kit pode conter quatro nucleotídeos marcados, onde o primeiro de quatro nucleotídeos é marcado com um composto como revelado na presente invenção. Em tal kit, cada um dos quatro nucleotídeos pode ser marcado com um composto que é igual ou diferente ao marcador nos três outros nucleotídeos. Desse modo, um ou mais dos compostos podem ter um máximo de absorbância e/ou máximo de emissão distintos de modo que o(s) composto(s) é(são) distinguível(is) dos outros compostos. Por exemplo, cada composto pode ter um máximo de absorbância e/ou máximo de emissão distintos de modo que cada um dos compostos seja distinguível dos três outros compostos. Será entendido que partes do espectro de absorbância e/ou espectro de emissão diferente dos máximos podem diferir e essas diferenças podem ser exploradas para distinguir os compostos. Os kits podem ser tais de dois ou mais dos compostos têm um máximo de absorbância distinto. Os compostos da invenção absorvem tipicamente luz na região abaixo de 500 nm.

[043] Os compostos, nucleotídeos ou kits que são expostos na presente invenção podem ser usados para detectar, medir ou identificar um sistema biológico (incluindo, por exemplo, processos ou componentes dos mesmos). Técnicas exemplificadoras que podem empregar os compostos, nucleotídeos ou kits incluem sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridização, análise genética, análise de RNA, ensaio celular (por exemplo, análise de ligação de célula ou função celular) ou ensaio de proteína (por exemplo, ensaio de ligação de proteína ou ensaio de atividade de proteína). O uso pode ser em um instrumento automatizado para realizar uma técnica específica, tal como um instrumento de sequenciamento automatizado. O instrumento de sequenciamento pode conter dois lasers operando em diferentes comprimentos de onda.

[044] São revelados na presente invenção métodos de sintetizar compostos da invenção. Corantes de acordo com a presente invenção podem ser sintetizados de uma variedade de materiais de partida adequados diferentes. Por exemplo, os compostos da fórmula (I) podem ser preparados por reagir um composto da fórmula (II) com uma amina cíclica opcionalmente substituída da fórmula (III):

, onde cada uma das variáveis X, R, R1, R2, R3, R4, R5, anel A, m e n são definidas na presente invenção. A reação pode ser conduzida em solventes orgânicos em temperatura ambiente ou elevada. Definições

[045] Os títulos de seção usados na presente invenção são para fins de organização apenas e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita.

[046] Observa-se que, como usado nesse relatório descritivo e nas reivindicações apensas, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem referentes no plural a menos que expressamente e não equivocamente limitadas a um referente. Será evidente para técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas em várias modalidades descritas na presente invenção sem se afastar do espírito ou escopo dos presentes ensinamentos. Desse modo, pretende-se que as várias modalidades descritas na presente invenção cubram outras modificações e variações compreendidas no escopo das reivindicações apensas e seus equivalentes.

[047] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto. O uso do termo “incluindo” bem como outras formas, como “incluem”, “inclui” e “incluído” não é limitante. O uso do termo “tendo” bem como outras formas, tais como “têm,” “tem” e “tinha”, não é limitante. Como usado nesse relatório descritivo, se em uma frase de transição ou no corpo da reivindicação, os termos “compreende(m)” e “compreendendo” devem ser interpretados como tendo um significado ilimitado. Isto é, os termos acima devem ser interpretados de modo sinônimo com as frases “tendo pelo menos” ou “incluindo pelo menos”. Por exemplo, quando usado no contexto de um processo, o termo “compreendendo” significa que o processo inclui pelo menos as etapas citadas, porém pode incluir etapas adicionais. Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo “compreendendo” significa que o composto, composição ou dispositivo inclui pelo menos as características ou componentes citados, porém também pode incluir características ou componentes adicionais.

[048] Como usado na presente invenção, o termo “covalentemente ligado” ou “covalentemente unido” se refere à formação de uma ligação química que é caracterizada pela partilha de pares de elétrons entre átomos. Por exemplo, um revestimento de polímero covalentemente ligado se refere a um revestimento de polímero que forma ligações químicas com uma superfície funcionalizada de um substrato, em comparação com ligação na superfície através de outros meios, por exemplo, adesão ou interação eletrostática. Será reconhecido que polímeros que são ligados covalentemente a uma superfície também podem ser ligados através de meio além de ligação covalente.

[049] O termo “halogênio” ou “halo” como usado na presente invenção, significa qualquer um dos átomos radio-estáveis da coluna 7 da Tabela Periódica dos Elementos, por exemplo, flúor, cloro, bromo, ou iodo, com flúor e cloro sendo preferidos.

[050] Como usado na presente invenção, “alquila” se refere a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que é totalmente saturada (isto é, não contém ligações duplas ou triplas). O grupo alquila pode ter 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aparecer aqui, uma faixa numérica como “1 a 20” se refere a cada inteiro na faixa dada; por exemplo, “1 a 20 átomos de carbono” significa que o grupo alquila consiste em 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono etc. até e incluindo 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquila” onde nenhuma faixa numérica é designada). O grupo alquila também pode ser uma alquila de tamanho médio tendo 1 a 9 átomos de carbono. O grupo alquila pode ser também uma alquila inferior tendo 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila pode ser designado como “C1- 4alquila” ou designações similares. Apenas como exemplo, “C1-6alquila” indica que há um a seis átomos de carbono na cadeia de alquila, isto é, a cadeia de alquila é selecionada a partir do grupo que consiste em metila, etila, propila, isopropila, n- butila, isobutila, sec-butila e t-butila. Grupos de alquila típicos incluem, porém não são de modo algum limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciária, pentila, hexila e similares.

[051] Como usado na presente invenção, “alcoxi” se refere à fórmula -OR em que R é uma alquila como definido acima, como “C1-9 alcoxi ”, incluindo, porém não limitado a metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metil etpxi (isopropoxi), n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi e terc-butoxi e similares.

[052] Como usado na presente invenção, “alquenila” se refere à cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas. O grupo alquenila pode ter 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquenila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo alquenila também pode ser uma alquenila de tamanho médio tendo 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquenila pode ser também uma alquenila inferior tendo 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquenila pode ser designado como “C2-6alquenila” ou designações similares. Apenas como exemplo, “C2-6alquenila” indica que há dois a seis átomos de carbono na cadeia de alquenila, isto é, a cadeia de alquenila é selecionada a partir do grupo que consiste em etenila, propen-1-ila, propen-2-ila, propen-3-ila, buten-1-ila, buten-2-ila, buten-3-ila, buten-4-ila, 1- metil-propen-1-ila, 2-metil-propen-1-ila, 1-etil-eten-1-ila, 2-metil-propen-3-ila, buta-1,3-dienila, buta-1,2,-dienila, e buta-1,2-dien-4-ila. Grupos de alquenila típicos incluem, porém não são limitados de modo algum a, etenila, propenila, butenila, pentenila e hexenila e similar.

[053] Como usado na presente invenção, “alquinila” se refere à cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas. O grupo alquinila pode ter 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquinila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo alquinila também pode ser uma alquinila tamanho médio tendo 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquinila também pode ser uma alquinila inferior tendo 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquinila pode ser designado como “C2- 6alquinila” ou designações similares. Apenas como exemplo, “C2-6alquinila” indica que há dois a seis átomos de carbono na cadeia de alquinila, isto é, a cadeia de alquinila é selecionada a partir do grupo que consiste em etinila, propin-1-ila, propin-2-ila, butin-1-ila, butin-3-ila, butin-4-ila e 2-butinila. Grupos de alquinila típicos incluem, porém não são de modo algum limitados a etinila, propinila, butinila, pentinila e hexinila e similares.

[054] Como usado na presente invenção, “heteroalquila” se refere a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo um ou mais heteroátomos,

isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo, porém não limitado a, nitrogênio, oxigênio e enxofre, na cadeia principal. O grupo heteroalquila pode ter 1 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heteroalquila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo heteroalquila também pode ser uma heteroalquila de tamanho médio tendo 1 a 9 átomos de carbono. O grupo heteroalquila pode ser também uma heteroalquila inferior tendo 1 a 6 átomos de carbono. O grupo heteroalquila pode ser designado como “C1-6 heteroalquila” ou designações similares. o grupo heteroalquila pode conter um ou mais heteroátomos. Apenas como exemplo, “C4-6heteroalquila” indica que há quatro a seis átomos de carbono na cadeia heteroalquila e adicionalmente um ou mais heteroátomos na cadeia principal.

[055] O termo “aromático” se refere a um anel ou sistema de anel tendo um sistema de elétron pi conjugado e inclui tanto grupos aromáticos carbocíclicos (por exemplo, fenila) como aromáticos heterocíclicos (por exemplo, piridina). O termo inclui grupos monocíclicos ou policíclicos de anel fundido (isto é, anéis que partilham pares adjacentes de átomos) com a condição de que o sistema de anel inteiro seja aromático.

[056] Como usado na presente invenção, “arila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (isto é, dois ou mais anéis fundidos que partilham dois átomos de carbono adjacentes) contendo apenas carbono no anel principal. Quando a arila é um sistema de anel, todo anel no sistema é aromático. O grupo arila pode ter 6 a 18 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “arila” onde nenhuma faixa numérica é designada. Em algumas modalidades, o grupo arila tem 6 a 10 átomos de carbono. O grupo arila pode ser designado como “C6-10 arila,” “C6 ou C10 arila,” ou designações similares. Os exemplos de grupos arila incluem, porém não são limitados a fenila, naftila, azulenila e antracenila.

[057] Uma “aralquila” ou “arilalquila” é um grupo arila ligado como um substituinte, através de um grupo etileno, como “C7-14 aralquila” e similar, incluindo, porém, não limitado a 2-feniletil, 3-fenilpropila, e naftil alquila Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (isto é, um grupo C1-6 alquileno).

[058] Como usado na presente invenção, “heteroarila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (isto é, dois ou mais anéis fundidos que partilham dois átomos adjacentes) que contém(contêm) um ou mais heteroátomos, isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo porém não limitado a nitrogênio, oxigênio e enxofre no anel principal. Quando a heteroarila é um sistema de anel, todo anel no sistema é aromático. O grupo heteroarila pode ter 5-18 membros de anel (isto é, o número de átomos compondo o anel principal, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heteroarila” onde nenhuma faixa numérica é designada. Em algumas modalidades, o grupo heteroarila tem 5 a 10 membros de anel ou 5 a 7 membros de anel. O grupo heteroarila pode ser designado como “heteroarila de 5-7 membros,” “heteroarila de 5-10 membros” ou designações similares. Os exemplos de anéis de heteroarila incluem, porém não são limitados a, furila, tienila, fttalazinila, pirrolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, isoxazolila, isotiazolila, triazolila, tiadiazolila, piridinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, triazinila, quinolinila, isoquinlinila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzotiazolila, indolila, isoindolila e benzotienila.

[059] Uma “heteroaralquila” ou “heteroaril alquila” é um grupo de heteroarila ligado, como substituinte, através de um grupo alquileno. Os exemplos incluem, porém não são limitados a 2-tienilmetil, 3-tienilmetil, furilmetil, tieniletil,

pirrolilalquila, piridilalquila, isoxazolilalquila, e imidazolilalquila. Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (isto é, um grupo alquileno C1-6).

[060] Como usado na presente invenção, “carbociclila” significa um anel cíclico não aromático ou sistema de anel contendo apenas átomos de carbono no sistema de anel principal. Quando a carbociclila é um sistema de anel, dois ou mais anéis podem ser unidos em um modo fundido, ligado em ponte ou espiro. Carbociclilas podem ter qualquer grau de saturação com a condição de que pelo menos um anel em um sistema de anel não seja aromático. Desse modo, carbociclilas incluem cicloalquilas, cicloalquenilas e cicloalquinilas. O grupo carbociclila pode ter 3 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “carbociclila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo carbociclila pode ser também uma carbociclila de tamanho médio tendo 3 a 10 átomos de carbono. O grupo carbociclila pode ser também uma carbociclila tendo 3 a 6 átomos de carbono. O grupo carbociclila pode ser designado como “C3-6 carbociclila” ou designações similares. Os exemplos de anéis carbociclila incluem, porém não são limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclohexenila, 2,3-diidro-indeno, biciclo[2.2.2]octanila, adamantila, e espiro[4.4]nonanila.

[061] Como usado na presente invenção, “cicloalquila” significa um anel ou sistema de anel de carbociclila totalmente saturado. Os exemplos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila.

[062] Como usado na presente invenção, “heterociclila” significa um anel ou sistema de anel cíclico não aromático contendo pelo menos um heteroátomo no anel principal. Heterociclilas podem ser unidos em um modo fundido, ligado em ponte ou espiro. Heterociclilas podem ter qualquer grau de saturação com a condição de que pelo menos um anel no sistema de anel não seja aromático.

O(s) heteroátomo(s) podem estar presentes em um anel não aromático ou aromático no sistema de anel.

O grupo heterociclila pode ter 3 a 20 membros de anel (isto é, o número de átomos compondo o anel principal, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heterociclila” onde nenhuma faixa numérica é designada.

O grupo heterociclila pode ser também uma heterociclila de tamanho médio tendo 3 a 10 membros de anel.

O grupo heterociclila pode ser também uma heterociclila tendo 3 a 6 membros de anel.

O grupo heterociclila pode ser designado como “heterociclila de 3-6 membros” ou designações similares.

Em heterociclilas monociclilas de seis membros preferidas, o(s) heteroátomo(s) é(são) selecionado(s) a partir de um até três de O, N ou S e em heterociclilas monocíclicas de cinco membros preferidas, o(s) heteroátomo(s) é(são) selecionado(s) a partir de um ou dois heteroátomos selecionados a partir de O, N ou S.

Os exemplos de anéis de heterociclila incluem, porém não são limitados a, azepinila, acridinila, carbazolila, cinolinila, dioxolanila, imidazolinila, imidazolidinila, morfolinila, oxiranila, oxepanila, tiepanila, piperidinila, piperazinila dioxopiperazinila, pirrolidinila, pirrolidonila, pirrolidionila, 4-piperidonila, pirazolinila, pirazolidinila, 1,3-dioxinila, 1,3-dioxanila, 1,4-dioxinila, 1,4-dioxanila, 1,3-oxatianila, 1,4-oxatiinila, 1,4-oxatianila, 2H-1,2-oxazinila, trioxanila, hexaidro-1,3,5-triazinila, 1,3-dioxolila, 1,3-dioxolanila, 1,3-ditiolila, 1,3- ditiolanila, isoxazolinila, isoxazolidinila, oxazolinila, oxazolidinila, oxazolidinonila, tiazolinila, tiazolidinila, 1,3-oxatiolanila, indolinila, isoindolinila, tetrahidrofuranila, tetrahidropiranila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, tetrahidro-1,4- tiazinila, tiamorfolinila, diidrobenzofuranila, benzimidazolidinila, e tetrahidroquinolina.

[063] Um grupo “O-carboxi” se refere a um grupo “-OC(=O)R” no qual R é selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[064] Um grupo “C-carboxi” se refere a um grupo “-C(=O)OR” no qual R é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção. Um exemplo não limitante inclui carboxila (isto é, -C(=O)OH).

[065] Um grupo “sulfonila” se refere a um grupo “-SO2R” no qual R é selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[066] Um grupo “sulfino” se refere a um grupo “-S(=O)OH”.

[067] Um grupo “S-sulfonamido” se refere a um grupo “-SO2NRARB” no qual RA e RB são cada um independentemente selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[068] Um grupo “N-sulfonamido” se refere a um grupo “-N(RA)SO2RB” no qual RA e RB são cada um independentemente selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[069] Um grupo “C-amido” se refere a um grupo “-C(=O)NRARB” no qual RA e RB são cada um independentemente selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[070] Um grupo “N-amido” se refere a um grupo “-N(RA)C(=O)RB” no qual RA e RB são cada um independentemente selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção.

[071] Um grupo “amino” se refere a um grupo “-NRARB” no qual RA e RB são cada um independentemente selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, e heterociclila com 3-10 membros, como definido na presente invenção. Um exemplo não limitante inclui amino livre (isto é, -NH2).

[072] Um grupo “aminoalquila” se refere a um grupo amino ligado através de um grupo alquileno.

[073] Um grupo “alcoxialquila” se refere a um grupo alcoxi ligado através de um grupo alquileno, como “C2-8 alcoxi alquila” e similar.

[074] Como usado na presente invenção, um grupo substituído é derivado do grupo principal não substituído no qual houve uma troca de um ou mais átomos de hidrogênio por outro átomo ou grupo. A menos que de outro modo indicado, quando um grupo é considerado como sendo “substituído,” quer se dizer que o grupo é substituído com um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir de C1-C6 alquila, C1-C6 alquenila, C1-C6 alquinila, C1-C6 heteroalquila, C3-C7 carbociclila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), C3-C7-carbociclila-C1-C6-alquila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heterociclila com 3-10 membros (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heterociclila com 3-10 membros-C1-C6-alquila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), arila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), arila(C1-C6)alquila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi , C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heteroarila com 5-10 membros (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi , C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heteroarila com 5-10 membros(C1-C6)alquila (opcionalmente substituída com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), halo, -CN, hidroxi, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi (C1-C6)alquila (isto é, éter), ariloxi, sulfidrila (mercapto), halo(C1-C6)alquila (por exemplo, –CF3), halo(C1-C6)alcoxi (por exemplo, –OCF3), C1-C6 alquilatio, arilatio, amino, amino(C1-C6)alquila, nitro, O- carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, N-tiocarbamila, C-amido, N-amido, S- sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acila, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinila, sulfonila, -SO3H, sulfino, -OSO2C1-4alquila, e oxo (=O). Sempre que um grupo for descrito como “opcionalmente substituído” aquele grupo pode ser substituído com os substituintes acima.

[075] Em algumas modalidades, grupos de alquila, alquenila ou alquinila substituída são substituídos com um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halo, -CN, SO3-, -SO3H, -SRA, -ORA, -NRBRC, oxo, -CONRBRC, - SO2NRBRC, -COOH, e -COORB, onde RA, RB e RC são individualmente independentemente selecionados a partir de H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila e arila substituída.

[076] Os compostos descritos na presente invenção podem ser representados como várias formas mesoméricas. Onde uma estrutura única é traçada, quaisquer das formas mesoméricas relevantes são pretendidas. Os compostos de cumarina descritos na presente invenção são representados por uma estrutura única, porém podem ser igualmente mostrados como quaisquer das formas mesoméricas relacionadas. Estruturas mesoméricas exemplificadoras são mostradas abaixo para a Fórmula (I):

[077] Em cada exemplo onde uma única forma mesomérica de um composto descrito na presente invenção é mostrada, as formas mesoméricas alternativas são igualmente contempladas.

[078] Como entendido por um técnico no assunto, um composto descrito na presente invenção pode existir em forma ionizada, por exemplo, -CO2- ou -SO3-. Se um composto contiver um grupo substituinte positiva ou negativamente carregado, por exemplo, -SO3- pode conter também um contraíon negativa ou positivamente carregado de modo que o composto como um todo seja neutro. Em outros aspectos, o composto pode existir em uma forma de sal, onde o contraíon é provido por uma base ou ácido conjugado.

[079] Deve ser entendido que certas convenções de nomeação de radical podem incluir um mono-radical ou um di-radical, dependendo do contexto. Por exemplo, onde um substituinte requer dois pontos de ligação no resto da molécula, entende-se que o substituinte é um di-radical. Por exemplo, um substituinte identificado como alquila que requer dois pontos de ligação inclui di-radicais como –CH2–, –CH2CH2–, –CH2CH(CH3)CH2–, e similares. Outras convenções de nomeação de radicais indicam claramente que o radical é um di-radical tal como “alquileno” ou “alquenileno”.

[080] Quando se diz que dois grupos R “adjacentes” formam um anel “juntamente com o átomo ao qual são ligados,” quer se dizer que a unidade coletiva dos átomos, ligações intermediárias e os dois grupos R são o anel citado. Por exemplo, quando a seguinte subestrutura está presente: e R1 e R2 são definidos como selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e alquila, ou R1 e R2 juntamente com os átomos aos quais são ligados formam uma arila ou carbociclila, quer se dizer que R1 e R2 podem ser selecionados a partir de hidrogênio ou alquila ou alternativamente, a subestrutura tem a estrutura: onde A é um anel de arila ou uma carbociclila contendo a ligação dupla mostrada. Nucleotídeos marcados

[081] De acordo com um aspecto da invenção, são fornecidos compostos corantes adequados para ligação em porções de substrato, particularmente compreendendo grupos ligantes para permitir a ligação em porções de substrato. Porções de substrato podem ser virtualmente qualquer molécula ou substância com a qual os corantes da invenção podem ser conjugados e por meio de exemplo não limitante, podem incluir nucleosídeos, nucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos, ligantes, partículas, superfícies sólidas, polímeros orgânicos e inorgânicos, cromossomos, núcleos, células vivas e combinações ou montagens dos mesmos. Os corantes podem ser conjugados por um ligante opcional por uma variedade de meios incluindo atração hidrofóbica, atração iônica e ligação covalente. Em alguns aspectos, os corantes são conjugados com o substrato por ligação covalente. Mais particularmente, a ligação covalente é por meio de um grupo ligante. Em alguns exemplos, tais nucleotídeos marcados são também mencionados como “nucleotídeos modificados.”

[082] A presente invenção fornece ainda conjugados de nucleosídeos e nucleotídeos marcados com um ou mais dos corantes expostos na presente invenção (nucleotídeos modificados). Nucleosídeos e nucleotídeos marcados são úteis para marcar polinucleotídeos formados por síntese enzimática, tal como, por meio de exemplo não limitante, em amplificação PCR, amplificação isotérmica, amplificação de fase sólida, sequenciamento de polinucleotídeo (por exemplo, sequenciamento de fase sólida), reações de tradução de nick e similares.

[083] A ligação das biomoléculas pode ser através de R, R1, R2, R3, R4, R5, ou posição X do composto da fórmula (I). Em alguns aspectos, a ligação é através do grupo R3 ou R5 da fórmula (I). Em algumas modalidades, o grupo substituinte é uma carboxila ou alquila substituída, por exemplo, alquila substituída com -CO2H ou uma forma ativada de grupo carboxila, por exemplo, uma amida ou éster, que pode ser usada para ligação ao grupo de amino ou hidroxila das biomoléculas. O termo “éster ativado” como usado na presente invenção, se refere a um derivado de grupo carboxila que é capaz de reagir em condições brandas, por exemplo, com um composto contendo um grupo amino. Exemplos não limitantes de ésteres ativados incluem, porém não limitados a p-nitrofenil, pentafluorofenil e ésteres de succinimido.

[084] Em algumas modalidades, os compostos corantes podem ser covalentemente ligados em oligonucleotídeos ou nucleotídeos através da base de nucleotídeo. Por exemplo, o nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode ter o marcador ligado à posição C5 de uma base pirimidina ou à posição C7 de uma base 7-deaza purina através de uma porção de ligante. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado também pode ter um grupo de bloqueio 3’-OH covalentemente ligado no açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.

[085] Uma aplicação útil particular dos novos corantes fluorescentes como descrito na presente invenção é para marcar biomoléculas, por exemplo, nucleotídeos ou oligonucleotídeos. Algumas modalidades do presente pedido são dirigidas a um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado com os novos compostos fluorescentes como descrito na presente invenção. Ligantes

[086] Os compostos corantes como revelados na presente invenção podem incluir um grupo ligante reativo em uma das posições substituintes para ligação covalente do composto a um substrato ou outra molécula. Grupos de ligação reativos são porções capazes de formar uma ligação (por exemplo, uma ligação covalente ou não covalente), em particular uma ligação covalente. Em uma modalidade específica o ligante pode ser um ligante clivável. O uso do termo “ligante clivável” não pretende sugerir que é necessário que o ligante inteiro seja removido. O sítio de clivagem pode ser localizado em uma posição no ligante que assegure que parte do ligante permaneça ligada ao corante e/ou porção de substrato após clivagem. Ligantes cliváveis podem ser, por meio de exemplo não limitante, ligantes eletrofilicamente cliváveis, ligantes nucleofilicamente cliváveis, ligantes fotocliváveis, cliváveis sob condições redutivas (por exemplo, ligantes contendo azida ou dissulfeto), condições oxidativas, cliváveis através do uso de ligantes de trava de segurança e cliváveis por mecanismos de eliminação. O uso de um ligante clivável para ligar o composto corante em uma porção de substrato assegura que o marcador pode, se necessário, ser removido após detecção, evitando qualquer sinal interferente em etapas a jusante.

[087] Grupos de ligante úteis podem ser encontrados na Publicação PCT nº WO2004/018493 (aqui incorporada por referência), cujos exemplos incluem ligantes que podem ser clivados usando fosfinas solúveis em água ou catalisadores de metal de transição solúveis em água formados de um metal de transição e pelo menos ligantes parcialmente solúveis em água. Em solução aquosa os últimos formam complexos de metal de transição pelo menos parcialmente solúveis em água. Tais ligantes cliváveis podem ser usados para ligar bases de nucleotídeos a marcadores tais como os corantes expostos na presente invenção.

[088] Ligantes particulares incluem aqueles revelados na Publicação PCT nº WO2004/018493 (aqui incorporada por referência) tais como aqueles que incluem porções das fórmulas:

(em que X é selecionado a partir do grupo que compreende O, S, NH e NQ em que Q é um grupo alquila substituída ou não substituída C1-10, Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, NH e N(alila), T é hidrogênio ou um grupo C1- C10 alquila substituída ou não substituída e * indica onde a porção é ligada ao restante do nucleotídeo ou nucleosídeo). Em alguns aspectos, os ligantes ligam as bases de nucleotídeos a marcadores como, por exemplo, os compostos corantes descritos na presente invenção.

[089] Exemplos adicionais de ligantes incluem aqueles revelados nas publicações US nos 2016/0040225 e 2019/0017111 (aqui incorporadas por referência), como aquelas que incluem porções das fórmulas: , .

[090] As porções de ligante ilustradas na presente invenção podem compreender a estrutura de ligante total ou parcial entre os nucleotídeos/nucleosídeos e os marcadores.

[091] Em modalidades particulares, o comprimento do ligante entre um corante fluorescente (fluoróforo) e uma base de guanina pode ser alterado, por exemplo, por introduzir um grupo espaçador de polietileno glicol, desse modo aumentando a intensidade de fluorescência em comparação com o mesmo fluoróforo ligado à base de guanina através de outras ligações conhecidas na técnica. Ligantes exemplificadores e suas propriedades são expostos na publicação PCT nº WO2007020457 (aqui incorporado por referência). O desenho de ligantes, especialmente seu comprimento aumentado, pode permitir aperfeiçoamentos no brilho de fluoróforos ligados ás bases de guanina de nucleotídeos de guanosina quando incorporados em polinucleotídeos tais como DNA. Desse modo, quando o corante é para uso em qualquer método de análise que requeira detecção de um marcador de corante fluorescente ligado em um nucleotídeo contendo guanina, é vantajoso se o ligante compreender um grupo espaçador da fórmula –((CH2)2O)n–, em que n é um número inteiro entre 2 e 50, como descrito em WO 2007/020457.

[092] Nucleosídeos e nucleotídeos podem ser marcados em sítios no açúcar ou nucleobase. Como conhecido na técnica, um “nucleotídeo” consiste em uma base nitrogenada, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. Em RNA, o açúcar é ribose e em DNA é uma desoxirribose, isto é, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na ribose. A base nitrogenada é um derivado de purina ou pirimidina. As purinas são adenina (A) e guanina (G) e as pirimidinas são citosina (C) e timina (T) ou no contexto de RNA, uracila (U). O átomo C-1 de desoxirribose é ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um nucleotídeo também é um éster de fosfato de um nucleosídeo, com esterificação ocorrendo no grupo hidroxila ligado ao C-3 ou C-5 do açúcar. Nucleotídeos são normalmente mono- di ou trifosfatos.

[093] Um “nucleosídeo” é estruturalmente similar a um nucleotídeo, porém não tem as porções de fosfato. Um exemplo de um análogo de nucleosídeo seria um no qual o marcador é ligado à base e não há grupo de fosfato ligado à molécula de açúcar.

[094] Embora a base seja normalmente mencionada como uma purina ou pirimidina, o técnico no assunto reconhecerá que derivados e análogos são disponíveis que não alteram a capacidade do nucleotídeo ou nucleosídeo ser submetido a emparelhamento de base Watson-Crick. “Derivado” ou “análogo” significa um composto ou molécula cuja estrutura de núcleo é igual a, ou estreitamente lembra aquela de um composto principal, porém que tem uma modificação química ou física, como, por exemplo, um grupo lateral diferente ou adicional, que permite que o nucleotídeo ou nucleosídeo derivado seja ligado a outra molécula. Por exemplo, a base pode ser uma deazapurina. Em modalidades específicas, os derivados devem ser capazes de serem submetidos a emparelhamento Watson-Crick. “Derivado” e “análogo” também incluem, por exemplo, um derivado de nucleosídeo ou nucleotídeo sintético tendo porções de base modificadas e/ou porções de açúcar modificadas. Tais derivados e análogos são discutidos, por exemplo, em Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Análogos de nucleotídeo podem compreender também ligações de fosfodiéster modificado incluindo ligações de fosfotiorato, fosfoditiorato, alquila-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato e similares.

[095] Um corante pode ser ligado em qualquer posição na base de nucleotídeo, por exemplo, através de um ligante. Em modalidades específicas, emparelhamento de base Watson-Crick pode ainda ser realizado para o análogo resultante. Sítios de marcação de nucleobase específicos incluem a posição C5 de uma base de pirimidina ou a posição C7 de uma base 7-deaza purina. Como descrito acima um grupo ligante pode ser usado para ligar covalentemente um corante ao nucleosídeo ou nucleotídeo.

[096] Em modalidades específicas o nucleotídeo ou nucleosídeo marcado pode ser enzimaticamente incorporável e enzimaticamente extensível. Por conseguinte, uma porção de ligante pode ser de comprimento suficiente para ligar o nucleotídeo ao composto de modo que o composto não interfira significativamente na ligação geral e reconhecimento do nucleotídeo por uma enzima de replicação de ácido nucleico. Desse modo, o ligante pode compreender também uma unidade espaçadora. O espaçador distancia, por exemplo, a base de nucleotídeo a partir de um marcador ou sítio de clivagem.

[097] Nucleosídeos ou nucleotídeos marcados com os corantes descritos na presente invenção podem ter a fórmula: onde corante é um composto corante; B é uma nucleobase, tal como, por exemplo, uracila timina, citosina, adenina, guanina e similar; L é um grupo ligante opcional que pode ou não estar presente; R’ pode ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, um análogo de éster de fosfato, -O- ligado a um grupo contendo fósforo reativo, ou -O- protegido por um grupo de bloqueio; R” pode ser H, OH, uma fosforamidita, ou um grupo de bloqueio 3’-OH, e R’” é H ou OH. Onde R” é fosforamidita, R’ é um grupo de proteção de hidroxila clivável por ácido que permite acoplamento de monômero subsequente sob condições de síntese automatizada.

[098] Em uma modalidade particular, o grupo de bloqueio é separado e independente do composto de corante, isto é, não ligado ao mesmo. Alternativamente, o corante pode compreender todo ou parte do grupo de bloqueio 3’-OH. Desse modo, R” pode ser um grupo de bloqueio 3’-OH que pode ou não compreender o composto de corante.

[099] Ainda em outra modalidade alternativa, não há grupo de bloqueio no carbono 3’ do açúcar pentose e o corante (ou corante e construção de ligante) ligado à base, por exemplo, pode ser de um tamanho ou estrutura suficiente para atuar como um bloqueio para a incorporação de um nucleotídeo adicional. Desse modo, o bloqueio pode ser devido a impedimento estérico ou pode ser devido a uma combinação de tamanho, carga e estrutura, quer o corante seja ligado ou não à posição 3’ do açúcar.

[0100] Ainda em outra modalidade alternativa, o grupo de bloqueio está presente no carbono 2’ ou 4’ do açúcar pentose e pode ser de um tamanho ou estrutura suficiente para atuar como um bloqueio para a incorporação de um nucleotídeo adicional.

[0101] O uso de um grupo de bloqueio permite que polimerização seja controlada, tal como por parar a extensão quando um nucleotídeo modificado é incorporado. Se o efeito de bloqueio for reversível, por exemplo, por meio de exemplo não limitante por alterar condições químicas ou por remoção de um bloqueio químico, a extensão pode ser parada em certos pontos e então permitida continuar.

[0102] Em outra modalidade específica, um grupo de bloqueio 3’-OH compreenderá uma porção revelada em WO2004/018497 e WO2014/139596, que são pela presente invenção incorporadas por referências. Por exemplo, o grupo de bloqueio pode ser azidometil (-CH2N3) ou substituído azidometil (por exemplo, -CH(CHF2)N3 ou CH(CH2F)N3), ou alila.

[0103] Em uma modalidade particular, o ligante (entre corante e nucleotídeo) e grupo de bloqueio estão ambos presentes e são porções separadas. Em modalidades específicas, o ligante e grupo de bloqueio são ambos cliváveis sob condições substancialmente similares. Desse modo, os processos de desproteção e desbloqueio podem ser mais eficientes porque somente um único tratamento será necessário para remover tanto o composto corante como o grupo de bloqueio. Entretanto, em algumas modalidades, um ligante e grupo de bloqueio não necessitam ser cliváveis sob condições similares, ao invés sendo individualmente cliváveis em condições distintas.

[0104] A invenção também abrange polinucleotídeos incorporando compostos corantes. Tais polinucleotídeos podem ser DNA ou RNA compreendido respectivamente de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos unidos em ligação de fosfodiéster. Polinucleotídeos podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos de ocorrência não natural (ou modificados) diferentes dos nucleotídeos marcados descritos na presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, em combinação com pelo menos um nucleotídeo modificado (por exemplo, marcado com um composto corante) como exposto na presente invenção. Polinucleotídeos de acordo com a invenção podem incluir também ligações principais não naturais e/ou modificações químicas não nucleotídeo. Estruturas quiméricas compreendidas de misturas de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos compreendendo pelo menos um nucleotídeo marcado são também consideradas.

[0105] Nucleotídeos marcados exemplares não limitantes como descrito na presente invenção incluem: em que L representa um ligante e R representa um resíduo de açúcar como descrito acima.

[0106] Em algumas modalidades, conjugados de corante fluorescente exemplificadores não limitantes são mostrados abaixo: . Kits

[0107] A presente invenção também fornece kits incluindo nucleosídeos e/ou nucleotídeos modificados marcados com corantes. Tais kits incluirão em geral pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com um corante exposto na presente invenção juntamente com pelo menos um componente adicional. O(s) componente(s) adicional(is) pode(m) ser um ou mais dos componentes identificados em um método exposto na presente invenção na seção de Exemplos abaixo. Alguns exemplos de componentes não limitantes que podem ser combinados em um kit da presente invenção são expostos abaixo.

[0108] Em uma modalidade particular, um kit pode incluir pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com um corante exposto na presente invenção juntamente com nucleotídeos ou nucleosídeos modificados ou não modificados. Por exemplo, nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a invenção podem ser fornecidos em combinação com nucleotídeos nativos ou não marcados e/ou com nucleotídeos marcados de modo fluorescente ou qualquer combinação dos mesmos. Por conseguinte, os kits podem compreender nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a invenção e nucleotídeos modificados marcados com outros, por exemplo, compostos de corante do estado da técnica. Combinações de nucleotídeos podem ser fornecidas como componentes individuais separados (por exemplo, um tipo de nucleotídeo por vaso ou tubo) ou como misturas de nucleotídeo (por exemplo, dois ou mais nucleotídeos misturados no mesmo vaso ou tubo).

[0109] Onde kits compreendem uma pluralidade, particularmente dois, ou três, ou mais particularmente quatro nucleotídeos modificados marcados com um composto corante, os nucleotídeos diferentes podem ser marcados com compostos corantes diferentes, ou um pode ser escuro, sem compostos corantes. Onde os nucleotídeos diferentes são marcados com compostos corantes diferentes, é uma característica dos kits que os compostos corantes sejam corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis. Como usado na presente invenção, o termo “corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis” se refere a corantes fluorescentes que emitem energia fluorescente em comprimentos de onda que podem ser distinguidos por equipamento de detecção fluorescente (por exemplo, uma plataforma de sequenciamento de DNA baseado em capilar comercial) quando dois ou mais tais corantes estão presentes em uma amostra. Quando dois nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes fluorescentes são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas modalidades que os corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ser excitados no mesmo comprimento de onda, tal como, por exemplo, pelo mesmo laser. Quando quatro nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes fluorescentes são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas modalidades que dois dos corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ambos ser excitados em um comprimento de onda e os dois outros corantes espectralmente distinguíveis possam ser ambos excitados em outro comprimento de onda. Comprimentos de onda de excitação paticulares são 488 nm e 532 nm.

[0110] Em uma modalidade, um kit inclui um nucleotídeo modificado marcado com um composto da presente invenção e um segundo nucleotídeo modificado marcado com um segundo corante em que os corantes têm uma diferença em máximo de absorbância de pelo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos corantes têm deslocamentos Stokes entre 15-40 nm onde “deslocamento Stokes” é a distância entre a absorção de pico e comprimentos de onda de emissão de pico.

[0111] Em uma modalidade adicional, um kit pode incluir ainda dois outros nucleotídeos modificados marcados com corantes fluorescentes em que os corante são excitados pelo mesmo laser a 532 nm. Os corantes podem ter uma diferença em máximo de absorbância de pelo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos corantes podem ter deslocamentos Stokes entre 20-40 nm. Corantes específicos que são espectralmente distinguíveis de corantes da presente invenção e que atendem aos critérios acima são análogos de polimetina como descrito na patente US 5,268,486 (por exemplo, Cy3) ou WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) ou polimetinas não simétricas como revelado na patente US 6,924,372, cada uma das quais é incorporada à presente invenção por referência. Corantes alternativos incluem análogos de rodamina, por exemplo, tetrametil rodamina e análogos dos mesmos.

[0112] Em uma modalidade alternativa, os kits da invenção podem conter nucleotídeos onde a mesma base é marcada com dois compostos diferentes. Um primeiro nucleotídeo pode ser marcado com um composto da invenção. Um segundo nucleotídeo pode ser marcado com um composto espectralmente distinto, por exemplo, um corante ‘verde’ absorvendo em menos de 600 nm. Um terceiro nucleotídeo pode ser marcado como uma mistura do composto da invenção e o composto espectralmente distinto e o quarto nucleotídeo pode ser ‘escuro’ e não conter marcador. Em termos simples, portanto, os nucleotídeos 1-4 podem ser marcados ‘azul’, ‘verde’, ‘azul/verde’ e escuro. Para simplificar ainda mais a instrumentação, quatro nucleotídeos podem ser marcados com dois corantes excitados com um laser único, e desse modo a marcação de nucleotídeos 1-4 pode ser ‘azul 1’, ‘azul 2’, ‘azul 1/azul 2’ e escuro.

[0113] Nucleotídeos podem conter dois corantes da presente invenção. Um kit pode conter dois ou mais nucleotídeos marcados com corantes da invenção. Kits podem conter um nucleotídeo adicional onde o nucleotídeo é marcado com um corante que absorve na região de 520 nm a 560 nm. Kits podem conter ainda um nucleotídeo não marcado.

[0114] Embora kits sejam exemplificados na presente invenção em relação a configurações tendo nucleotídeos diferentes que são marcados com compostos corantes diferentes, será entendido que kits podem incluir 2, 3, 4 ou mais nucleotídeos diferentes que têm o mesmo composto corante.

[0115] Em modalidades particulares, um kit pode incluir uma enzima polimerase capaz de catalisar a incorporação dos nucleotídeos modificados em um polinucleotídeo. Outros componentes a serem incluídos em tais kits podem incluir tampões e similares. Os nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a invenção e quaisquer outros componentes de nucleotídeo incluindo misturas de nucleotídeos diferentes, podem ser fornecidos no kit em uma forma concentrada para ser diluída antes do uso. Em tais modalidades um tampão de diluição adequado pode ser também incluído. Novamente, um ou mais dos componentes identificados em um método exposto na presente invenção pode ser incluído em um kit da presente invenção. Métodos de sequenciamento

[0116] Nucleotídeos modificados (ou nucleosídeos) compreendendo um composto corante de acordo com a presente invenção podem ser usados em qualquer método de análise como método que inclui detecção de um marcador fluorescente ligado em um nucleotídeo ou nucleosídeo, quer sozinho ou incorporado em ou associado a um conjugado ou estrutura molecular maior. Nesse contexto o termo “incorporado em um polinucleotídeo” pode significar que o 5’ fosfato é unido em ligação de fosfodiéster ao grupo 3’ hidroxila de um segundo nucleotídeo (modificado ou não modificado), que pode ele próprio fazer parte de uma cadeia de polinucleotídeo mais longa. A extremidade 3’ de um nucleotídeo modificado exposto na presente invenção pode ou não ser unida em ligação de fosfodiéster ao 5’ fosfato de um nucleotídeo adicional (modificado ou não modificado). Desse modo, em uma modalidade não limitante, a invenção fornece um método de detectar um nucleotídeo modificado incorporado em um polinucleotídeo, que compreende: (a) incorporar pelo menos um nucleotídeo modificado da invenção em um polinucleotídeo e (b) detectar o(s) nucleotídeo(s) modificado(s) incorporado(s) no polinucleotídeo por detectar o sinal fluorescente a partir do composto corante ligado ao(s) nucleotídeo(s) modificado(s).

[0117] Esse método pode incluir: uma etapa sintética (a) na qual um ou mais nucleotídeos modificados de acordo com a invenção são incorporados em um polinucleotídeo e uma etapa de detecção (b) na qual um ou mais nucleotídeo(s) modificado(s) incorporado(s) no polinucleotídeo são detectados por detectar ou medir quantitativamente sua fluorescência.

[0118] Algumas modalidades do presente pedido são dirigidas a métodos de sequenciamento incluindo: (a) incorporar pelo menos um nucleotídeo marcado como descrito na presente invenção em um polinucleotídeo; e (b) detectar o(s) nucleotídeo(s) marcado(s) incorporado(s) no polinucleotídeo por detectar o sinal fluorescente a partir do corante fluorescente novo ligado ao(s) nucleotídeo(s) modificado(s).

[0119] Em uma modalidade, pelo menos um nucleotídeo modificado é incorporado em um polinucleotídeo na etapa sintética pela ação de uma enzima polimerase. Entretanto, outros métodos de unir nucleotídeos modificados a polinucleotídeos, tais como, por exemplo, síntese de oligonucleotídeo químico ou ligação de oligonucleotídeos marcados a oligonucleotídeos não marcados, podem ser usados. Portanto, o termo “incorporar” quando usado em referência a um nucleotídeo e polinucleotídeo, pode abranger síntese de polinucleotídeo por métodos químicos bem como métodos enzimáticos.

[0120] Em uma modalidade específica, uma etapa sintética é realizada e pode compreender opcionalmente incubar uma fita de molde de polinucleotídeo com uma mistura de reação compreendendo nucleotídeos modificados marcados de modo fluorescente da invenção. Uma polimerase pode ser também fornecida em condições que permitam a formação de uma ligação de fosfodiéster entre um grupo de hidroxila 3’ livre em uma fita de polinucleotídeo anelada à fita de molde de polinucleotídeo e um grupo de fosfato 5’ no nucleotídeo modificado. Desse modo, uma etapa sintética pode incluir a formação de uma fita de polinucleotídeo como dirigida por emparelhamento base complementar de nucleotídeos a um molde de fita.

[0121] Em todas as modalidades dos métodos, a etapa de detecção pode ser realizada enquanto a fita de polinucleotídeo na qual os nucleotídeos marcados são incorporados é anelada a um molde de fita, ou após uma etapa de desnaturação na qual as duas fitas são separadas. Etapas adicionais, por exemplo, etapas de reação química ou enzimática ou etapas de purificação, podem ser incluídas entre a etapa sintética e a etapa de detecção. em particular, a fita alvo incorporando o(s) nucleotídeo(s) marcado(s) pode ser isolada ou purificada e então processada adicionalmente ou usada em uma análise subsequente. Como exemplo, polinucleotídeos alvo marcados com nucleotídeo(s) modificado(s) como descrito na presente invenção em uma etapa sintética podem ser subsequentemente usados como sondas ou iniciadores marcados. Em outras modalidades, o produto da etapa sintética exposta na presente invenção pode ser sujeito a etapas de reação adicionais e se desejado, o produto dessas etapas subsequentes purificadas ou isoladas.

[0122] Condições adequadas para a etapa sintética serão bem conhecidas por aqueles familiarizados com técnicas de biologia molecular padrão. Em uma modalidade uma etapa sintética pode ser análoga a uma reação de extensão de iniciador padrão usando precursores de nucleotídeo, incluindo nucleotídeos modificados como descrito na presente invenção, para formar uma fita alvo estendida complementar ao molde de fita na presença de uma enzima polimerase adequada. Em outras modalidades, a etapa sintética pode ela própria fazer parte de uma reação de amplificação produzindo um produto de amplificação de fita dupla marcada compreendida de fitas complementares aneladas derivadas da cópia das fitas de molde de polinucleotídeo e alvo. Outras etapas sintéticas exemplificadoras incluem tradução de nick, polimerização de deslocamento de fita, marcação de DNA sensibilizado aleatório etc. Uma enzima polimerase particularmente útil para uma etapa sintética é uma que é capaz de catalisar a incorporação de nucleotídeos modificados como exposto na presente invenção. Uma variedade de polimerases de ocorrência natural ou modificadas pode ser usada. Como exemplo, uma polimerase termoestável pode ser usada para uma reação sintética que é realizada usando condições de termociclagem, ao passo que uma polimerase termoestável não pode ser desejada para reações de extensão de iniciador isotérmico. Polimerases termoestáveis adequadas que são capazes de incorporar os nucleotídeos modificados de acordo com a invenção incluem aquelas descritas em WO 2005/024010 ou WO06120433, cada uma das quais é incorporada à presente invenção por referência. Em reações sintéticas que são realizadas em temperaturas mais baixas como 37 °C, enzimas polimerase não precisam necessariamente ser polimerases termoestáveis, portanto, a escolha de polimerase dependerá de diversos fatores como temperatura de reação, pH, atividade de deslocamento de fita e similar.

[0123] Em modalidades não limitante específicas, a invenção abrange métodos de sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento, re-

sequenciamento, sequenciamento de genoma inteiro, classificação de polimorfismo de nucleotídeo único, qualquer outra aplicação envolvendo a detecção do nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com corantes expostos na presente invenção quando incorporados em um polinucleotídeo. Qualquer de uma variedade de outras aplicações se beneficiando do uso de polinucleotídeos marcados com os nucleotídeos modificados compreendendo corantes fluorescentes pode usar nucleotídeos ou nucleosídeos modificados, com corantes expostos na presente invenção.

[0124] Em uma modalidade particular, a invenção fornece uso de nucleotídeos modificados compreendendo compostos corantes de acordo com a invenção e uma reação de sequenciamento por síntese, de polinucleotídeo. Sequenciamento por síntese envolve em geral a adição sequencial de um ou mais nucleotídeos ou oligonucleotídeos a uma cadeia de polinucleotídeo em crescimento na direção 5’ a 3’ usando uma polimerase ou ligase a fim de formar uma cadeia de polinucleotídeo estendido complementar ao molde de ácido nucleico a ser sequenciado. A identidade da base presente em um ou mais do(s) nucleotídeo(s) adicionado(s) pode ser determinada em uma etapa de detecção ou “imageamento”. A identidade da base adicionada pode ser determinada após cada etapa de incorporação de nucleotídeo. A sequência do molde pode ser então inferida usando regras de emparelhamento de base Watson-Crick convencionais. O uso dos nucleotídeos modificados marcados com corantes, expostos na presente invenção para determinação da identidade de uma base única pode ser útil, por exemplo, na classificação de polimorfismos de nucleotídeo único e tais reações de extensão de base única estão compreendidas no escopo dessa invenção.

[0125] Em uma modalidade da presente invenção, a sequência de um molde de polinucleotídeo é determinada por detectar a incorporação de um ou mais nucleotídeos em uma fita nascente complementar ao molde de polinucleotídeo a ser sequenciado através da detecção de marcador(s) fluorescente(s) ligado(s) ao(s) nucleotídeo(s) incorporado(s). O sequenciamento do molde de polinucleotídeo pode ser iniciado com um iniciador adequado (ou preparado como um constructo grampo que conterá o iniciador como parte do grampo) e a cadeia nascente é estendida em um modo escalonado pela adição de nucleotídeos à extremidade 3’ do iniciador em uma reação catalisada por polimerase.

[0126] Em modalidades particulares, cada um dos trifosfatos de nucleotídeo diferentes (A, T, G e C) pode ser marcado com um fluoróforo exclusivo e também compreende um grupo de bloqueio na posição 3’ para evitar polimerização descontrolada. Alternativamente, um dos quatro nucleotídeos pode ser não marcado (escuro). A enzima polimerase incorpora um nucleotídeo na cadeia nascente complementar ao molde de polinucleotídeo, e o grupo de bloqueio evita adicionalmente a incorporação de nucleotídeos. Quaisquer nucleotídeos não incorporados podem ser lavados e o sinal fluorescente de cada nucleotídeo incorporado pode ser “lido” oticamente por meio adequado, como um dispositivo de carga acoplada usando excitação a laser e filtros de emissão adequados. O grupo de bloqueio em 3’ e compostos corantes fluorescentes podem ser então removidos (desprotegidos) (simultânea ou sequencialmente) para expor a cadeia nascente para incorporação adicional de nucleotídeo. Tipicamente, a identidade do nucleotídeo incorporado será determinada após cada etapa de incorporação, porém isso não é estritamente essencial. Similarmente, a patente US nº 5,302,509 (que é incorporada à presente invenção por referência) revela um método para sequenciar polinucleotídeos imobilizados sobre um suporte sólido.

[0127] O método, como exemplificado acima, utiliza a incorporação de nucleotídeos bloqueados em 3’ A, G, C e T, marcados de modo fluorescente em uma fita em crescimento complementar ao polinucleotídeo imobilizado, na presença de polimerase de DNA.

A polimerase incorpora uma base complementar ao polinucleotídeo alvo, porém é impedida de adição adicional pelo grupo de bloqueio em 3’. O marcador do nucleotídeo incorporado pode ser então determinado e o grupo de bloqueio removido por clivagens químicas para permitir que ocorra polimerização adicional.

O molde de ácido nucleico a ser sequenciado em uma reação de sequenciamento por síntese pode ser qualquer polinucleotídeo que se deseja sequenciar.

O molde de ácido nucleico para uma reação de sequenciamento compreenderá tipicamente uma região de fita dupla tendo um grupo hidroxila 3’ livre que serve como um iniciador ou ponto de iniciação para a adição de nucleotídeos adicionais na reação de sequenciamento.

A região do molde a ser sequenciado penderá sobre esse grupo hidroxila 3’ livre sobre a fita complementar.

A região de saliência do molde a ser sequenciada pode ser de fita simples, porém pode ser de fita dupla, com a condição de que um “entalhe esteja presente” na fita complementar ao molde de fita a ser sequenciada para prover um grupo OH 3’ livre para iniciação da reação de sequenciamento.

Em tal modalidade, sequenciamento pode prosseguir por deslocamento de fita.

Em certas modalidades, um iniciador contendo o grupo hidroxila 3’ livre pode ser adicionado como um componente separado (por exemplo, um oligonucleotídeo curto) que hibridiza com uma região de fita simples do molde a ser sequenciado.

Alternativamente, o iniciador e o molde de fita a ser sequenciada podem cada fazer parte de uma fita de ácido nucleico parcialmente auto-complemetnar capaz de formar um duplex intramolecular, como por exemplo, uma estrutura de laço de grampo.

Polinucleotídeos de grampo e métodos pelos quais podem ser ligados a suportes sólidos são revelados nas publicações PCT nos WO0157248 e WO2005/047301 cada uma das quais é incorporada à presente invenção por referência. Nucleotídeos podem ser adicionados sucessivamente a um iniciador em crescimento, resultando em síntese de uma cadeia de polinucleotídeo na direção 5’ a 3’. A natureza da base que foi adicionada pode ser determinada, particularmente, porém não necessariamente após cada adição de nucleotídeo, desse modo provendo informações de sequência para o molde de ácido nucleico. Desse modo, um nucleotídeo é incorporado em uma fita de ácido nucleico (ou polinucleotídeo) por união do nucleotídeo ao grupo hidroxila 3’ livre da fita de ácido nucleico através da formação de uma ligação de fosfodiéster com o grupo de fosfato 5‘ do nucleotídeo.

[0128] O molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser DNA ou RNA, ou mesmo uma molécula híbrida compreendida de desoxinucleotídeos e ribonucleotídeos. O molde de ácido nucleico pode compreender nucleotídeos de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural e ligações principais naturais ou não naturais, com a condição de que esses não evitam a cópia do molde na reação de sequenciamento.

[0129] Em certas modalidades, o molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser ligado a um suporte sólido através de qualquer método de ligação adequado conhecido na técnica, por exemplo, através de ligação covalente. Em certas modalidades, moldes de polinucleotídeos podem ser ligados diretamente a um suporte sólido (por exemplo, um suporte a base de sílica). Entretanto, em outras modalidades da invenção a superfície do suporte sólido pode ser modificada em algum modo para permitir ligação covalente direta de moldes de polinucleotídeos, ou imobilizar os moldes de polinucleotídeos através de um hidrogel ou multicamada de polieletrólito, que pode ele próprio ser não covalentemente ligado ao suporte sólido.

[0130] Arranjos nos quais polinucleotídeos foram diretamente ligados a suportes a base de sílica são aquelas, por exemplo, reveladas em WO00006770 (incorporada à presente invenção por referência), em que polinucleotídeos são imobilizados em um suporte de vidro por reação entre um grupo epóxido pendente sobre o vidro com um grupo amino interno sobre o polinucleotídeo. Além disso, polinucleotídeos podem ser ligados a um suporte sólido por reação de um nucleófilo baseado em enxofre com o suporte sólido, por exemplo, como descrito em W02005/047301 (incorporado à presente invenção por referência). Um exemplo ainda adicional de moldes de polinucleotídeos sustentados em sólido é onde os moldes de polinucleotídeos são ligados a hidrogel sustentado sobre suportes a base de sílica ou outros suportes sólidos, por exemplo, como descrito em W000/31148, W001/01143, W002/12566, W003/014392, patente US No. 6,465,178 e W000/53812, cada uma das quais é incorporada à presente invenção por referência.

[0131] Uma superfície particular na qual moldes de polinucleotídeos podem ser imobilizados é um hidrogel de poliacrilamida. Hidrogeis de poliacrilamida são descritos nas referências citadas acima e em WO2005/065814, que é incorporado à presente invenção por referência. Hidrogeis específicos que podem ser usados incluem aqueles descritos em WO 2005/065814 e U.S. Pub. nº 2014/0079923. Em uma modalidade o hidrogel é PAZAM (poli(N-(5-azidoacetamidil pentila) acrilamida- co-acrilamida)).

[0132] Moléculas de molde de DNA podem ser ligadas a microesferas ou micropartículas, por exemplo, como descrito na patente US 6,172,218 (que é incorporada à presente invenção por referência). A ligação a microesferas ou micropartículas pode ser útil para aplicações de sequenciamento. Bibliotecas de microesfera podem ser preparadas onde cada microesfera contém sequências de DNA diferentes. Bibliotecas exemplares e métodos para sua criação são descritos em Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), cada um dos quais é incorporado à presente invenção por referência. O sequenciamento de arranjos de tais microesferas usando nucleotídeos expostos na presente invenção está compreendido no escopo da invenção.

[0133] Molde(s) que deve(m) ser sequenciados podem fazer parte de um “arranjo” em um suporte sólido, em cujo caso o arranjo pode assumir qualquer forma conveniente. Desse modo, o método da invenção é aplicável a todos os tipos de arranjos de alta densidade, incluindo arranjos de molécula única, arranjos agrupados e arranjos de microesfera. Nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente invenção podem ser usados para sequenciar moldes essencialmente em qualquer tipo de arranjo, incluindo, porém não limitado àqueles formados por imobilização de moléculas de ácido nucleico sobre um suporte sólido.

[0134] Entretanto, os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da invenção são particularmente vantajosos no contexto de sequenciamento dos arranjos agrupados. Em arranjos agrupados, regiões distintas no arranjo (frequentemente mencionadas como sítios, ou características) compreendem múltiplas moléculas de molde de polinucleotídeo. Em geral, as múltiplas moléculas de polinucleotídeo não são individualmente resolvíveis por meio ótico e são ao invés detectadas como um conjunto. Dependendo de como o arranjo é formado, cada sítio no arranjo pode compreender múltiplas cópias de uma molécula de polinucleotídeo individual (por exemplo, o sítio é homogêneo para uma espécie de ácido nucleico de fita simples ou dupla específica) ou mesmo múltiplas cópias de um número pequeno de moléculas de polinucleotídeo diferentes (por exemplo, múltiplas cópias de duas espécies de ácido nucleico diferentes). Arranjos agrupados de moléculas de ácido nucleico podem ser produzidos usando técnicas em geral conhecidas na arte. Como exemplo, WO 98/44151 e WO00/18957, cada uma das quais é incorporada na presente invenção, descrevem métodos de amplificação de ácidos nucleicos em que os produtos tanto molde como amplificação permanecem imobilizados sobre um suporte sólido a fim de formar arranjos compreendidas de agrupamentos ou “colônias” de moléculas de ácido nucleico imobilizadas. As moléculas de ácido nucleico presentes nos arranjos agrupados preparados de acordo com esses métodos são moldes adequados para sequenciamento usando os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da invenção.

[0135] Os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente invenção são também úteis em sequenciamento de moldes em arranjos de molécula única. O termo “arranjo de molécula única” ou “SMA” como usado na presente invenção se refere a uma população de moléculas de polinucleotídeo, distribuídas (ou dispostas) sobre um suporte sólido em que o espaçamento de qualquer polinucleotídeo individual a partir de todos os outros da população é tal que é possível resolver individualmente as moléculas de polinucleotídeo individuais. As moléculas de ácido nucleico alvo imobilizadas sobre a superfície de suporte sólido podem ser desse modo capazes de serem resolvidas por meios óticos em algumas modalidades. Isso significa que um ou mais sinais distintos, cada representando um polinucleotídeo, ocorrerá na área resolvível do dispositivo de imageamento específico usado.

[0136] A detecção de molécula única pode ser obtida em que o espaçamento entre moléculas de polinucleotídeo adjacentes em um arranjo é pelo menos 100 nm, mais particularmente pelo menos 250 nm, ainda mais particularmente pelo menos 300 nm, mesmo mais particularmente pelo menos 350 nm. Desse modo, cada molécula é individualmente resolvível e detectável como um ponto fluorescente de molécula única e fluorescência a partir do referido ponto fluorescente de molécula única também exibe fotobranqueamento de etapa única.

[0137] Os termos “individualmente resolvido” e “resolução individual” são usados na presente invenção para especificar que quando visualizado, é possível distinguir uma molécula no arranjo a partir de suas moléculas vizinhas. A separação entre moléculas individuais no arranjo será determinada, em parte, pela técnica específica usada para resolver as moléculas individuais. As características gerais de arranjos de molécula única serão entendidas por referência a pedidos publicados WO00/06770 e WO 01/57248, cada um dos quais é incorporado na presente invenção por referência. Embora um uso dos nucleotídeos modificados da invenção seja em reações de sequenciamento por síntese, a utilidade dos nucleotídeos modificados não é limitada a tais métodos. De fato, os nucleotídeos podem ser usados vantajosamente em qualquer metodologia de sequenciamento que requer detecção de marcadores fluorescentes ligados a nucleotídeos incorporados em um polinucleotídeo.

[0138] Em particular, os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da invenção podem ser usados em protocolos de sequenciamento fluorescente automatizados, particularmente sequenciamento de ciclo de terminador-corante fluorescente baseado no método de sequenciamento de terminação de cadeia de Sanger e colaboradores. Tais métodos usam em geral enzimas e sequenciamento de ciclo para incorporar didesoxinucleotídeos marcados de modo fluorescente em uma reação de sequenciamento de extensão de iniciador. Os denominados métodos de sequenciamento Sanger, e protocolos relacionados (tipo Sanger), utilizam terminação de cadeia randomizada com didesoxinucleotídeos marcados.

[0139] Desse modo, a presente invenção também abrange nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes que são didesoxinucleotídeos sem grupos hidroxila em ambas as posições 3’ e 2’, tais didesoxinucleotídeos modificados sendo adequados para uso em métodos de sequenciamento tipo Sanger e similares.

[0140] Nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente invenção incorporando grupos de bloqueio 3’, serão reconhecidos, também podem ser utilidade em métodos Sanger, e protocolos relacionados uma vez que o mesmo efeito obtido pelo uso de didesoxinucleotídeos modificados pode ser obtido usando nucleotídeos modificados tendo grupos de bloqueio 3’-OH: ambos evitam incorporação de nucleotídeos subsequentes. Onde nucleotídeos de acordo com a presente invenção e tendo um grupo de bloqueio 3’ devem ser usados em métodos de sequenciamento do tipo Sanger será reconhecido que os compostos corantes ou marcadores detectáveis ligados aos nucleotídeos não necessitam ser ligados através de ligantes cliváveis, uma vez que em cada exemplo onde um nucleotídeo marcado da invenção é incorporado; nenhum nucleotídeo necessita ser subsequentemente incorporado e desse modo o marcador não precisa ser removido do nucleotídeo.

EXEMPLOS

[0141] Modalidades adicionais são reveladas em detalhe adicional nos exemplos que se seguem, que não pretendem de modo algum limitar o escopo das reivindicações. Exemplo 1 Composto I-1: 7-(3-Carboxiazetidinil-1)-3-(5-cloro-benzoxazol-2- ila)cumarina

[0142] 3-(5-Cloro-benzoxazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,32 g, 1 mmol) e 3- carboxiazetidina (0,2 g, 2 mmol) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitar durante 7 h a 120 °C, e ficar em repouso em temperatura ambiente durante 1 h, a mistura foi diluída com água (15 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,25 (63%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 396,05. Encontrado m/z: (+) 397 (M+1)+; (-) 395 (M-1)-. Exemplo 2. Composto I-2: 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(benzoxazol-2- ila)cumarina

[0143] 3-(Benzoxazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,56 g, 2 mmol) e 3- carboxiazetidina (0,3 g, 3 mmol) é adicionado a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitação durante 9 h a 125 °C e repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (10 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,41 g (56%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 362,09. Encontrado m/z: (+) 363 (M+1)+. Exemplo 3. Composto I-3: 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(benzimidazol-2- ila)cumarina

[0144] 3-(Benzimidazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (FC-2, 0,56 g, 2 mmol, 1 eq.) e 3-carboxiazetidina (AC-C4, 0,3 g, 3 mmol, 1,5 eq) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. A mistura é agitada durante 9 h a 120 °C. Porções adicionais de 3-carboxiazetidina (0,3 g, 3 mmol) e DIPEA (0,26 g, 2 mmol) foram adicionados. Após agitar a 120 °C por outro período de 3 h, e ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (10 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,26 g (36%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 361,11. Encontrado m/z: (+) 362 (M+1)+; (-) 360 (M-1)-. Exemplo 4. Composto I-4: 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(benzotiazol-2- ila)cumarina

[0145] 3-(Benzotiazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,30 g, 1 mmol) e 3- carboxiazetidina (0,2 g, 2 mmol) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitar por 8 h a 120 °C e ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (10 mL) e foi agitada durante a noite. O precipitado resultante é coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,28 g (75%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC,

NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 378,07. Encontrado m/z: (+) 379 (M+1)+; (- ) 377 (M-1)-. Exemplo 5. Composto I-5: 7-(3-Carboxipirrolidin-ila-1)-3-(benzotiazol-2- ila)cumarina

[0146] 3-(Benzotiazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,30 g, 1 mmol) e 3- carboxipirrolidina (0,23 g, 2 mmol) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitar por 6 h a 120 °C e ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (20 mL) e foi agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,31 g (80%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 392,08. Encontrado m/z: (+) 393 (M+1)+; (- ) 391 (M-1)-. Exemplo 6. Composto I-6: 7-(4-Carboxipiperidin-1-ila)-3-(benzotiazol-2- ila)cumarina

[0147] 3-(Benzotiazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,30 g, 1 mmol) e ácido isonipecótico (0,26 g, 2 mmol) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitar por 6 h a 120 °C e ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (20 mL) e foi agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,34 g (83%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 406,10 encontrado m/z: (+) 407 (M+1)+; (-) 405 (M-1)-. Exemplo 7. Composto I-7: 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(6-sulfo-benzotiazol-2- ila)cumarina

[0148] 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(benzotiazol-2-ila)cumarina (0.38 g, 1 mmol) foi adicionado a aproximadamente -5 °C a 20% de ácido sulfúrico fumegante

(0,5 mL). A mistura foi agitada com resfriamento por algumas horas e então em temperatura ambiente por 3 h. Após agitação por 1 h a 80 °C e repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com éter dietílico anidro (10 mL) e foi agitada durante a noite. O precipitado resultante é coletado por filtração por sucção. O produto foi purificado por HPLC. Rendimento 0,1 g (22%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 458,02. Encontrado m/z: (+) 459 (M+1)+. Exemplo 8. Composto I-8: 7-(3-Carboxiazetidin-1-ila)-3-(6-sulfamido- benzoxazol-2-ila)cumarina

[0149] 3-(6-Sulfamido-benzoxazol-2-ila)-7-fluoro-cumarina (0,36 g, 1 mmol) e 3-carboxiazetidina (0,3 g, 3 mmol) é adicionado a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em frasco de fundo redondo. A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambiente e então DIPEA (0,52 g, 4 mmol) foi adicionado. Após agitação durante 9 h a 125 °C e repouso em temperatura ambiente por 1 h, a mistura de reação foi diluída com água (10 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração por sucção. Rendimento 0,26 g (60%). Pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, NMR e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 441,06. Encontrado m/z: (+) 442 (M+1)+. Exemplo 9. Comparação de intensidades de fluorescência

[0150] Intensidades de fluorescência de soluções de corante exemplares (em comprimento de onda de excitação máxima 450 nm) foram comparadas com um corante padrão para a mesma região espectral.

Os resultados são mostrados na Tabela 1 e demonstram vantagens significativas dos corantse exemplares para aplicações analíticas baseadas em fluorescência.

Tabela 1. Propriedades espectrais dos novos corantes fluorescentes revelados nos exemplos.

Propriedades espectrais em EtOH-água 1:1 Número Estrutura Max. de Intensidade de Max.

Abs. fluorescência fluorescência (nm) (nm) relativa (%)

I-1 451 499 90

I-2 446 496 70

I-3 443 496 75

I-4 449 497 94

I-5 473 512 138

I-6 463 514 98 Exemplo 10. Procedimento geral para a síntese de conjugados de nucleotídeo totalmente funcionais

[0151] Corantes fluorescentes de cumarina revelados na presente invenção foram acoplados com derivados de nucleotídeo de adenina (A) e de citosina (C) substituídos por amino apropriados A-LN3-NH2 ou C-LN3-NH2:

[0152] Após ativação do grupo carboxílico de um corante com reagentes apropriados de acordo com o seguinte esquema exemplificador de adenina:

[0153] O produto geral para o acoplamento de adenina é como mostrado abaixo:

[0154] ffA-LN3-Corante se refere a um nucleotídeo totalmente funcionalizado com um ligante LN3 e marcado com um corante de cumarina revelado na presente invenção. O grupo R em cada das estruturas se refere à porção de corante de cumarina após conjugação.

[0155] O corante (10 μmol) é seco por colocar em um frasco de fundo redondo de 5 mL e é dissolvido em dimetilformamida anidra (DMF, 1 mL), a seguir o solvente é destilado a vácuo. Esse procedimento é repetido duas vezes. O corante seco é dissolvido em N,N-dimetilacetamida anidra (DMA, 0,2 mL) em temperatura ambiente. Tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (TSTU, 1,5 eq., 15 μmol, 4,5 mg) é adicionado à solução de corante, a seguir DIPEA (3 eq., 30 μmol, 3,8 mg, 5,2 μL é adicionado através de micropipeta a esse solução. O frasco de reação é selado sob gás nitrogênio. O progresso da reação é monitorado por TLC (eluente acetonitrila-água 1:9) e HPLC. Enquanto isso, uma solução do derivado de nucleotídeo substituído por amino apropriado (A-LN3-NH2, 20 mM, 1,5eq, 15 μmol, 0,75 mL) é concentrada a vácuo, a seguir dissolvida novamente em água (20 μL). Uma solução do corante ativado em DMA é transferida para o frasco contendo a solução de N-LN3-NH2. Mais DIPEA (3 eq. 30 μmol, 3,8mg, 5,2 μL) é adicionado juntamente com trietilamina (1 μL). O progresso do acoplamento é monitorado de hora em hora por TLC, HPLC e LCMS. Quando a reação é concluída, tampão de bicarbonato de trietilamina (TEAB, 0,05 ~3 mL) é adicionado à mistura de reação via pipeta. A purificação inicial do nucleotídeo totalmente funcionalizado é realizada por passar a mistura de reação resfriada bruscamente através de uma coluna DEAE-Sephadex® para remover a maior parte de corante não reagido restante. Por exemplo, Sephadex é derramado em um cartucho Biotage de 25 g vazio, sistema de solvente TEAB/MeCN. A solução a partir da coluna de Sephadex é concentrada a vácuo. O material restante é dissolvido novamente no volume mínimo de água e acetonitrila, antes de filtração através de um filtro de Nylon de 20 μm. A solução filtrada é purificada por HPLC preparativo. A composição de compostos preparados é confirmada por LCMS.

[0156] O produto geral para o acoplamento de citosina é mostrado abaixo, seguindo procedimento similar descrito acima.

[0157] ffC-LN3-Corante se refere a um nucleotídeo totalmente funcionalizado com um ligante LN3 e marcado com um corante de cumarina revelado na presente invenção. O grupo R em cada das estruturas se refere à porção de corante de cumarina após conjugação. Exemplo 11. Preparação de derivados de amida dos compostos da fórmula (I)

[0158] Algumas modalidades adicionais descritas na presente invenção são relacionadas a derivados de amida dos compostos da fórmula (I) e métodos de preparar os mesmos, os métodos incluem converter um composto da fórmula (Ia) em um composto da fórmula (Ia’) através de ativação de ácido carboxílico: e reagir o composto da fórmula (Ia’) com uma amina primária ou secundária da fórmula (Am) para chegar no derivado de amida da fórmula (Ib): onde as variáveis X, R, R1, R2, R3, R4, e n são definidas na presente inveção; Rʹ é a porção residual de um agente de ativação de carboxila (tal como N- hidroxisuccinimida, nitrofenol, pentafluorofenol, HOBt, BOP, PyBOP, DCC etc.); cada um de RA e RB é independentemente hidrogênio, C1-6 alquila, C2-6 alquenila, C2- 6 alquinila, C3-7 carbociclila, C6-10 arila, heteroarila com 5-10 membros, heterociclila com 3-10 membros, aralquila, heteroaralquila, ou (heterociclil)alquila. Procedimento geral para a preparação dos compostos da fórmula (Ib)

[0159] Um corante apropriado da fórmula (Ia) (0,001 mol) é dissolvido em solvente orgânico anidro adequado (DMF, 1,5 mL). A essa solução um reagente de ativação de carboxila como TSTU, BOP ou PyBOP é adicionado. Essa mistura de reação é agitada em temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min. e então derivados de amina apropriados são adicionados. A mistura de reação é agitada durante a noite, filtrada e excesso do reagente de ativação é resfriado bruscamente com 0,1M solução de TEAB em água. Solventes são evaporados a vácuo e o resíduo é dissolvido novamente em solução de TEAB e purificado por HPLC. Exemplo 12. Aplicações de sequenciamento de dois canais

[0160] A eficiência dos nucleotídeos A marcados com os corantes novos descritos na presente invenção em aplicação de sequenciamento foi demonstrada no método de detecção de dois canais. Com relação aos métodos de dois canais descritos na presente invenção, ácidos nucleicos podem ser sequenciados utilizando métodos e sistemas descritos no pedido de patente US nº 2013/0079232, cuja invenção é incorporada à presente invenção por referência na íntegra.

[0161] Na detecção de dois canais, um ácido nucleico pode ser sequenciado por prover um primeiro tipo de nucleotídeo que é detectado em um primeiro canal, um segundo tipo de nucleotídeo que é detectado em um segundo canal, um terceiro tipo de nucleotídeo que é detectado em ambos - o primeiro e o segundo canal e um quarto tipo de nucleotídeo que não tem um marcador que não é, ou é minimamente, detectado em qualquer canal. Os gráficos de dispersão foram gerados por análise RTA2.0.93 de um experimento. Os gráficos de dispersão ilustrados na FIG. 1 até a FIG. 3 estavam no ciclo 5 de cada um dos 26 cursos de ciclo.

[0162] A FIG. 1 ilustra o gráfico de dispersão de uma mistura de nucleotídeos totalmente funcionalizada (ffN) contendo: A-I-4 (0,5 μM), A-NR550S0 (1,5 μM), C- NR440 (2 μM), escuro G (2 μM) e T-AF550POPOS0 (2 μM) em tampão de incorporação com Pol812. Exposição azul (Canal 1) 500 ms, exposição verde (Canal 2) 1000 ms; varridos em mistura de Varredura).

[0163] A FIG. 2 ilustra o gráfico de dispersão de uma mistura de nucleotídeos totalmente funcionalizada (ffN) contendo: A-I-5 (1 μM), A-NR550S0 (1 μM), C- NR440 (2 μM), dark G (2 μM) e T-AF550POPOS0 (2 μM) em tampão de incorporação com Pol812. Exposição azul (Canal 1) 500 ms, exposição verde (Canal 2) 1000 ms; varridos em mistura de Varredura).

[0164] A FIG. 3 ilustra o gráfico de dispersão de uma mistura de nucleotídeos totalmente funcionalizada (ffN) contendo: A-I-6 (1 μM), A-NR550S0 (1 μM), C- NR440 (2 μM), dark G (2 μM) e T-AF550POPOS0 (2 μM) em tampão de incorporação com Pol812. Exposição azul (Canal 1) 500 ms, exposição verde (Canal 2) 1000 ms; varridos em mistura de Varredura).

[0165] Em cada uma das FIGs. 1-3 Nucleotídeo “G” é não marcado e mostrado como a nuvem esquerda inferior (“G escuro”). O sinal a partir de uma mistura de nucleotídeo “A” marcado pelos corantes novos descritos na presente invenção e um corante verde (NR550S0) é mostrado como a nuvem direita superior na figura 1-3 respectivamente. O sinal a partir do nucleotídeo “T” marcado com o corante AF550POPOS0 é indicado pela nuvem esquerda superior e o sinal a partir do nucleotídeo “C” marcado pelo corante NR440 é indicado pela nuvem direita inferior. O eixo X mostra a intensidade de sinal para um canal (azul) e o eixo Y mostra a intensidade de sinal para o outro canal (Verde). As estruturas químicas de NR440, AF550POPOS0, e NR550S0 são reveladas nas Publicações PCT WO2018060482A1, WO2017051201A1, e WO2014135221A1 respectivamente, todas as quais são incorporadas por referências.

[0166] Cada uma das FIGs. 1-3 mostram, que os conjugados de nucleotídeos A totalmente funcionais marcados com o corante novo descrito na presente invenção fornecem intensidades de sinal suficientes e grande separação de nuvem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um composto de Fórmula (I), um sal ou uma forma mesomérica do mesmo: (I) em que: X é O, S, Se, ou NRn, em que Rn é H, C1-6 alquila, ou C6-10 arila; o anel A é uma heterociclila com 3 a 10 membros; R, R1, R2, e R4 são cada um independentemente H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; cada R3 é independentemente halo, -CN, -CO2H, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q- C(O)NRdRe, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 alquenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída, ou dois R3 formam oxo (=O); em que p e q são cada um 1, 2, 3 ou 4; cada R5 é independentemente halo, -CN, -CO2Rf, amino, -OH, C-amido, N- amido, -NO2, -SO3H, -SO2NRaRb, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; cada Ra e Rb é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada Rc, Rd, Re e Rf é independentemente H, C1-6 alquila opcionalmente substituída substituído, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; m é 0, 1, 2, 3 ou 4; e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5.

2. O composto da reivindicação 1, em que X é O ou S.

3. O composto da reivindicação 1, em que X é NRn.

4. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que R é H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, carbociclila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída.

5. O composto da reivindicação 4, em que R é H, halo ou C1-6alquila.

6. O composto da reivindicação 5, em que R é H.

7. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que R1 é H, halo, ou C1-6alquila.

8. O composto da reivindicação 7, em que R1 é H.

9. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que R2 é H, - SO3H, alquila opcionalmente substituída, ou C1-4 alquila opcionalmente substituída com -CO2H ou -SO3H.

10. O composto da reivindicação 9, em que R2 é H ou -SO3H.

11. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que R4 é H, -SO3H, alquila opcionalmente substituída, ou C1-4 alquila opcionalmente substituída com -CO2H ou -SO3H.

12. O composto da reivindicação 11, em que R4 é H ou -SO3H.

13. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o anel A é um anel heterocíclico único de 3 a 7 membros contendo um átomo de nitrogênio.

14. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o anel Aé , , ou .

15. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que n é 1, 2 ou 3, e em que cada R3 é independentemente -CO2H, -SO3H, C1-4 alquila opcionalmente substituída com -CO2H ou -SO3H, -(CH2)p-CO2Rc, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída.

16. O composto da reivindicação 15, em que n é 1.

17. O composto da reivindicação 16, em que R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc.

18. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que cada R5 é halo, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NRaRb, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída.

19. O composto da reivindicação 18, em que R5 é -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, ou C1-6 alquila substituída com -CO2H, -SO3H, ou -SO2NH2.

20. O composto da reivindicação 1, em que X é O, S ou NH; cada R, R1, R2, e R4 é H; anel A é , , ou ; n é 0 ou 1; R3 é -CO2H ou -(CH2)p-CO2Rc; m é 0 ou 1; e R5 é halo, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, ou C1-6 alquila substituída com -SO3H ou -SO2NH2.

21. O composto da reivindicação 1, selecionado a partir do grupo que consiste em: , , , , , , , , , , , ,

, e sais e formas mesoméricas dos mesmos.

22. O composto de acordo com as reivindicações 1 a 21, em que o composto é ligado a um nucleotídeo ou oligonucleotídeo.

23. Um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado com um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

24. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado de acordo com a reivindicação 23, em que o composto é ligado ao nucleotídeo ou oligonucleotídeo através de R3 da Fórmula (I).

25. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado da reivindicação 24, em que R3 da Fórmula (I) é -CO2H ou -(CH2)p-CO2H e a ligação forma uma amida usando o grupo –CO2H.

26. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado de acordo com a reivindicação 23, em que o composto é ligado ao nucleotídeo ou oligonucleotídeo através de R5 da Fórmula (I).

27. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado da reivindicação 26, em que R5 da Fórmula (I) é -CO2H e a ligação forma uma amida usando o grupo – CO2H.

28. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado de qualquer uma das reivindicações 23 a 27, em que o composto é ligado à posição C5 de uma base de pirimidina ou à posição C7 de uma base 7-deaza purina através de uma porção ligante.

29. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, compreendendo adicionalmente um grupo de bloqueio 3’ OH covalentemente ligado ao açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.

30. Um kit compreendendo um primeiro nucleotídeo marcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29 e um segundo nucleotídeo marcado.

31. O kit da reivindicação 30, em que o segundo nucleotídeo marcado é marcado com um composto diferente do primeiro nucleotídeo marcado.

32. O kit da reivindicação 31, em que o primeiro e o segundo nucleotídeos marcados são excitáveis usando um único comprimento de onda de laser.

33. O kit da reivindicação 31 ou 32, compreendendo adicionalmente um terceiro nucleotídeo e um quarto nucleotídeo, em que cada um do segundo, terceiro e quarto nucleotídeos é marcado com um composto diferente, em que cada marcador tem um máximo de absorbância distinto que é distinguível dos outros marcadores.

34. O kit da reivindicação 30, em que o kit compreende quatro nucleotídeos, em que um primeiro dos quatro nucleotídeos é um nucleotídeo marcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, um segundo dos quatro nucleotídeos carreia um segundo marcador, um terceiro nucleotídeo carreia um terceiro marcador e um quarto nucleotídeo é não marcado (escuro).

35. O kit da reivindicação 30, em que o kit compreende quatro nucleotídeos, em que um primeiro dos quatro nucleotídeos é um nucleotídeo marcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, um segundo dos quatro nucleotídeos carreia um segundo marcador, um terceiro nucleotídeo carreia uma mistura de dois marcadores e um quarto nucleotídeo é não marcado (escuro).

36. Uso de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado de acordo com as reivindicações 23 a 29, ou um kit de acordo com qualquer uma das reivindicações

30 a 35 no sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridização, análise genética, análise de RNA ou um ensaio de ligação de proteína.

37. O uso de acordo com a reivindicação 36 em um instrumento de sequenciamento automatizado, em que o referido instrumento de sequenciamento automatizado compreende dois lasers que operam em diferentes comprimentos de onda.

38. Um método de sequenciamento compreendendo incorporar um nucleotídeo marcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29 em um ensaio de sequenciamento.

39. O método da reivindicação 38, compreendendo adicionalmente detectar o nucleotídeo marcado.

40. O método da reivindicação 38 ou 39, em que o ensaio de sequenciamento é realizado em um instrumento de sequenciamento automatizado, e em que o instrumento de sequenciamento automatizado compreende duas fontes de luz que operam em diferentes comprimentos de onda.

41. Um método para sintetizar um composto de Fórmula (I) como descrito na presente invenção.