BR112015022448B1 - molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado, métodos para preparar o crescimento de polinucleotídeo complementar a polinucleotídeo alvo de fita simples em reação de sequenciação e para determinar a sequência de polinucleotídeo alvo de fita simples e kit - Google Patents

Abstract

NUCLEOSÍDEOS OU NUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS Algumas realizações descritas neste documento referem- se a moléculas de nucleotídeo e nucleosídeo modificadas com grupos de proteção 3?- hidróxi inovadores. Ditos grupos de proteção 3'-hidróxi formam uma estrutura ?O-C(R)2N3 ligada de forma covalente ao átomo 3?-carbono, em que R é como definido nas Reivindicações. Também são fornecidos neste documento métodos para preparo dessas moléculas de nucleotídeo e nucleosídeo modificadas e sequenciamento por processos de síntese usando tais moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo modificadas.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO ANTECEDENTES Campo da Invenção

[0001]Algumas realizações descritas neste documento se referema nucleotídeos ou nucleosídeos modificados, compreendendo grupos de proteção 3’-hidróxi e seu uso em métodos de sequenciamento de polinucleotídeos. Algumas realizações descritas neste documento se referem a método de preparo dos nucleotídeos ou nucleosídeos protegidos por 3’-hidróxi.

Descrição da Técnica Relacionada

[0002]Avanços no estudo de moléculas têm sido levados, emparte, pela melhoria nas tecnologias usadas para caracterizar as moléculas ou suas reações biológicas. Em particular, o estudo dos ácidos nucleicos DNA e RNA tem se beneficiado do desenvolvimento de tecnologias usadas para a análise de sequência e o estudo de eventos de hibridização.

[0003]Um exemplo das tecnologias que melhoraram o estudo deácidos nucleicos é o desenvolvimento de conjuntos ordenadosfabricados de ácidos nucleicos imobilizados. Esses conjuntos ordenados consistem tipicamente de uma matriz de alta densidade de polinucleotídeos imobilizados em um material de suporte sólido. Ver, por exemplo, Fodor et al., Trends Biotech. 12: 19-26, 1994, que descreve formas de montagem dos ácidos nucleicos usando uma superfície de vidro quimicamente sensibilizado protegido por uma máscara, mas exposto em áreas definidas para permitir a ligação de fosforamiditas de nucleotídeo apropriadamente modificadas. Conjuntos ordenados fabricados podem também ser fabricados através da técnica de “marcação” de polinucleotídeos conhecidos em um suporte sólido em posições predeterminadas (por exemplo, Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6379-6383, 1995).

[0004]Uma forma de determinação da sequência de nucleotídeo deum ácido nucleico ligado a um conjunto ordenado é chamada de “sequenciamento por síntese” ou “SBS”. Essa técnica para a determinação da sequência de DNA idealmente requer a incorporação controlada (isto é, um de cada vez) do nucleotídeo complementar correto oposto ao ácido nucleico sendo sequenciado. Isso permite o sequenciamento preciso através da adição de nucleotídeos em ciclos múltiplos, uma vez que cada resíduo de nucleotídeo é sequenciado um por vez, prevenindo, assim, a ocorrência de uma série descontrolada de incorporações. O nucleotídeo incorporado é lido usando um rótulo apropriado ligado ao mesmo antes da remoção do segmento de rótulo e a rodada seguinte subsequente de sequenciamento.

[0005]A fim de garantir que apenas uma única incorporaçãoocorra, uma modificação estrutural “grupo de proteção”) é adicionada a cada nucleotídeo rotulado que é adicionado à cadeia crescente, para garantir que apenas um nucleotídeo seja incorporado. Depois de o nucleotídeo com o grupo de proteção ter sido adicionado, o grupo de proteção é então removido, sob condições de reação que não interferem com a integridade do DNA sendo sequenciado. O ciclo de sequenciamento pode, então, continuar com a incorporação donucleotídeo rotulado protegido seguinte.

[0006]Para serem úteis no sequenciamento de DNA, nucleotídeos,e mais comumente nucleotídeo trifosfatos, geralmente requerem um grupo de proteção 3’-hidróxi, de modo a prevenir que a polimerase usada para incorporar em uma cadeia de polinucleotídeo continue a replicar uma vez que a base sobre o nucleotídeo é adicionada. Há muitas limitações de tipos de grupos que podem ser adicionados em um nucleotídeo e ainda se apropriado. O grupo de proteção deve prevenir que moléculas de nucleotídeo adicionais sejam adicionadas à cadeia de polinucleotídeo, ao passo que sendo simultaneamente facilmente removível do segmento de açúcar, sem causar dano à cadeia de polinucleotídeo. Ademais, o nucleotídeo modificado precisa ser tolerado pela polimerase ou outra enzima apropriada usada para incorporá-lo na cadeia de polinucleotídeo. O grupo de proteção ideal, portanto, apresenta estabilidade de longo prazo, é eficientemente incorporado pela enzima polimerase, causa bloqueio de incorporação de nucleotídeo secundária ou adicional e tem a capacidade de ser removido sob condições moderadas, que não causem danos à estrutura de polinucleotídeo, preferencialmente sob condições aquosas.

[0007]Grupos de proteção reversíveis foram descritosanteriormente. Por exemplo, Metzker et al., (Nucleic Acids Research, 22 (20):4259-4267,1994) revela a síntese e uso de oito 2desoxirribonucleosídeo 5’-trifosfatos (dNTPs 3’-modificados) e teste em dois ensaios de modelo de DNA para atividade de incorporação. O WO 2002/029003 descreve um método de sequenciamento que pode incluir o uso de um grupo de proteção alila para tampar o grupo 3’-OH sobre um filamento crescente de DNA em uma reação de polimerase.

[0008]Além disso, nós anteriormente reportamos odesenvolvimento de um número de grupos de proteção reversíveis e métodos de sua desproteção sob condições compatíveis de DNA na Publicação do Pedido Internacional n° WO 2004/018497, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade.

SUMÁRIO

[0009]Algumas realizações descritas neste documento se referema uma molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificada, compreendendo uma base purina ou pirimidina e um segmento açúcar de ribose ou desoxirribose tendo um grupo de proteção 3’-hidróxi removível formando uma estrutura -O-C(R)2N3 ligada covalentemente ao átomo 3’-carbono, em que R é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, - C(R1)m(R2)n, -C(=O)OR3, -C(=O)NR4R5, -C(R6)2O(CH2)pNR7R8 e - C(R9)2O-pH-C(=O)NR10R11; cada R1 eR2é independentemente selecionado de hidrogênio, alquila opcionalmente substituída ou halogênio; R3 é selecionado de hidrogênio ou alquila opcionalmente substituída; cada R4 e R5 é selecionado independentemente de hidrogênio,alquila opcionalmentesubstituída,arila opcionalmentesubstituída,heteroarilaopcionalmente substituída, ou aralquila opcionalmente substituída; cada R6 e R9 é selecionado de hidrogênio, alquila opcionalmente substituída ou halogênio; cada R7, R8, R10 e R11 é independentemente selecionado de hidrogênio,alquila opcionalmentesubstituída,arila opcionalmentesubstituída,heteroarilaopcionalmente substituída, ou aralquila opcionalmente substituída; m é um inteiro de 0 a 3; e n é um inteiro de 0 a 3; desde que o total de m+n seja igual a 3; e p é um inteiro de 0 a 6; desde que R1 e R2 não possam ser ambos halogênio; e pelo menos um R não é hidrogênio.

[0010]Algumas realizações descritas neste documento se referema um método de preparo de um polinucleotídeo crescente complementar a um polinucleotídeo de filamento único alvo em uma reação de sequenciamento, compreendendo a incorporação de uma molécula de nucleotídeo modificada descrita neste documento no polinucleotídeo complementar crescente, em que a incorporação do nucleotídeo modificado previne a introdução de qualquer nucleotídeo subsequente no polinucleotídeo complementar crescente.

[0011]Algumas realizações descritas neste documento se referema um método para a determinação da sequência de um polinucleotídeo de filamento único alvo, compreendendo a monitoração da incorporação sequencial de nucleotídeos complementares, em que pelo menos um nucleotídeo complementar incorporado é uma molécula de nucleotídeo modificada descrita neste documento; e detecção da identidade da molécula de nucleotídeo modificada. Em algumas realizações, a incorporação da molécula de nucleotídeo modificada é conseguida por uma transferase terminal, uma polimerase terminal ou uma transcriptase reversa.

[0012]Algumas realizações descritas neste documento referem-sea um kit compreendendo uma pluralidade de moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo modificada descrita neste documento, e materiais para o empacotamento das mesmas. Em algumas realizações, a identidade do nucleotídeo modificado é determinada pela detecção do rótulo detectável vinculado à base. Em algumas tais realizações, o grupo de proteção 3’- hidróxi e o rótulo detectável são removidos antes da introdução do nucleotídeo complementar seguinte. Em algumas tais realizações, o grupo de proteção 3’-hidróxi e o rótulo detectável são removidos em uma única etapa de reação química.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013]A FIG. 1A ilustra uma variedade de grupos de proteção 3’-OH.

[0014]A FIG. 1B ilustrou a estabilidade térmica de vários gruposde proteção 3’-OH.

[0015]A FIG. 2A ilustra a curva de taxa de desproteção de trêsgrupos de proteção 3’-OH diferentes.

[0016]A FIG. 2B mostra um gráfico de meio tempo de três gruposde proteção 3’-OH diferentes.

[0017]A FIG. 3 mostra os valores de faseamento e pré-faseamentode vários nucleotídeos modificados com um grupo de proteção 3’-OH termicamente estável em comparação com o grupo de proteção padrão.

[0018]A FIG. 4A mostra os dados de sequenciamento 2x400bp deisômero ffNs-A mono-F em mistura de incorporação (IMX).

[0019]A FIG. 4B mostra os dados de sequenciamento 2x400bp deisômero ffNs-B mono-F em mistura de incorporação (IMX).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0020]Uma realização é um nucleotídeo ou nucleosídeo modificadocompreendendo um grupo de proteção 3’-OH.Em uma realização, o grupo de proteção 3’-OH é um grupo de proteção azidometila mono- fluormetila substituída.Em outra realização, o grupo de proteção 3’-OH é um grupo de proteção azidometila C-amido substituída.Ainda outra realização se refere a nucleotídeos modificados tendo grupos de proteção 3’-OH azidometila difluormetila substituídas.

Definições

[0021]A menos que de outro modo definido, todos os termostécnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa de conhecimento comum na técnica. O uso do termo “incluindo”, bem como outras formas, tais como “incluir”, “inclui” e “incluído”, não sem limitação. O uso do termo “tendo”, bem como outras formas, tais como “ter”, “tem” e “teve” é não limitador. Como usado nesta especificação, seja em uma frase transitória ou no corpo da Reivindicação, os termos “compreende(m)” e “compreendendo” devem ser interpretados como tendo um significado aberto. Isto é, os termos acima devem ser interpretados de forma sinônima com as frases “tendo pelo menos” ou “incluindo pelo menos”.Por exemplo, quando usado no contexto de um processo, o termo “compreendendo” significa que o processo inclui pelo menos as etapas enumeradas, mas pode incluir etapas adicionais.Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo “compreendendo” significa que o composto, composição, ou dispositivo inclui pelo menos as características ou componentes enumerados, mas podem também incluir características ou componentes adicionais.

[0022]Como usado neste documento, abreviações orgânicascomuns são definidas como se segue: AcAcetila Ac2OAnidrido acético aq.Aquoso BnBenzila BzBenzoila BOC ou Bocterc-Butóxicarbonila Bun-Butila  cat.Catalítico CbzCarbobenzilóxi °CTemperatura em graus Centígrados dATPDesoxiadenosina trifosfato dCTPDesoxicitidina trifosfato dGTPDesoxiguanosina trifosfato dTTPDesoxitimidina trifosfato ddNTP(s)Didesoxinucleotídeo(s) DBU1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DCAÁcido dicloroacético DCE1,2-Dicloroetano DCMCloreto de metileno DIEADiisopropiletilamina DMADimetilacetamida DMEDimetoxietano DMFN,N’-Dimetilformamida DMSODimetilsulfóxido DPPADifenilfosforila azida EtEtila EtOAcAcetato de etila ffNNucleotídeo totalmente funcional gGrama(s) GPCCromatografia de permeação em gel h ou hrHora(s) iPrIsopropila KPiTampão 10 mM fosfato de potássio a pH 7,0 KPSPersulfato de potássio IPAÁlcool isopropílico IMXMistura de incorporação LCMSEspectrometriademassasacopladaa cromatografia líquida LDADiisopropilamida de lítio m ou minMinuto(s) mCPBAÁcido meta-cloroperoxibenzóico MeOHMetanol MeCNAcetonitrila Mono-F-CH2F ffN Mono-FNucleotídeosmodificadoscom-CH2F substituído em posição de metileno de grupo de proteção 3’-OH azidometila mLMililitro(s) MTBEÉter metil-terciário butílico NaN3Azida de sódio NHSN-hidroxisuccinimida PGGrupo de proteção PhFenila pptPrecipitado rtTemperatura ambiente SBSSequenciamento por Síntese TEATrietilamina TEMPO(2,2,6,6-Tetrametilpiperidin-1-il)oxila TCDI1,1’-Tiocarbolina diimidazol Terc, tterciário TFAÁcido trifluoracético THFTetrahidrofurano TEMEDTetrametiletilenediamina gLMicrolitro(s)

[0023]Como usado neste documento, o termo “conjunto ordenado”se refere a uma população de moléculas sondas diferentes que sãoligadas a um ou mais substratos, tal que as moléculas sondas diferentes podem ser diferenciadas umas das outras de acordo com a localização relativa. Um conjunto ordenado pode incluir moléculas sondas diferentes, que são, cada uma, localizadas em uma localização endereçável diferente sobre um substrato.Alternativamente ou adicionalmente, um conjunto ordenado inclui substratos diferentes, cada um portando uma molécula sonda diferente, em que as moléculas sondas diferentes podem ser identificadas de acordo com as localizações dos substratos sobre uma superfície à qual os substratos estão ligados ou de acordo com as localizações dos substratos em um líquido. Conjuntos ordenados exemplificativos em que substratos separados estão localizados sobre uma superfície inclui, sem limitação, aqueles incluindo grânulos em poços, como descrito, por exemplo, na Patente US 6.355.431 B1, US 2002/0102578 e Publicação PCT WO 00/63437. Formatos exemplificativos que podem ser usados na invenção para distinguir grânulos em um conjunto ordenado líquido, por exemplo, usando um dispositivo microfluídico, tal como um separador de células por fluorescência ativada (FACS), são descritos, por exemplo, na Pat. US 6.524.793. Exemplos adicionais de conjuntos ordenados que podem ser usados na invenção incluem, sem limitação, aqueles descritos nas Pat. US 5.429.807; 5.436.327; 5.561.071; 5.583.211; 5.658.734; 5.837.858; 5.874.219;5.919.523;6.136.269;6.287.768;6.287.776; 6.288.220;6.297.006; 6.291.193; 6.346.413; 6.416.949; 6.482.591; 6.514.751 e 6.610.482; e WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287; e EP 799 897.

[0024]Como usado neste documento, o termo “anexado de formacovalente” ou “ligado de forma covalente”, se refere à formação de uma ligação química que é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Por exemplo, um revestimento de polímero ligado de forma covalente se refere a um revestimento de polímero que forma ligações químicas com uma superfície funcionalizada de um substrato, comparado com ligação à superfície por outros meios, por exemplo, adesão ou interação eletrostática. Será apreciado que polímeros que são ligados de forma covalente a uma superfície podem também ser ligados via meios além da ligação covalente.

[0025]Como usado neste documento, qualquer (quaisquer)grupo(s) “R”, tais como, sem limitação, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 representam substituintes que podem ser ligados ao átomo indicado. Qualquer grupo R pode ser substituído ou insubstituído. Se dois grupos “R” são descritos como sendo “tomados juntos”, os grupos R e os átomos, eles são ligados para poder formar um cicloalquila, arila, heteroarila ou heterociclo. Por exemplo, sem limitação, se R2 e R3, ou R2, R3 ou R4, e o átomo ao qual é ligado, são indicados para serem “tomados juntos” ou “unidos”, significa que eles são ligados de forma covalente um ao outro para formar um anel, um exemplo de que é estabelecido abaixo:

[0026]Sempre que um grupo for descrito como sendo“opcionalmente substituído”, aquele grupo pode ser insubstituído ou substituído por um ou mais dos substituintes indicados. Da mesma forma, quando um grupo é descrito como sendo “insubstituído ou substituído”, se substituído, o substituinte pode ser selecionado de um ou mais dos substituintes indicados. Se nenhum substituinte for indicado, isso significa que o grupo “opcionalmente substituído” ou “substituído” indicado pode ser individualmente e independentemente substituído por um ou mais grupo(s) individualmente e independentemente selecionado de um grupo de funcionalidades incluindo, mas, sem limitação, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila, heteroaralquila, (heteroaliciclil)alquila, hidróxi, hidroxila protegida, alcóxi, arilóxi, acila, mercapto, alquiltio, ariltio, ciano, halogênio, tiocarbonila, O-carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, N- tiocarbamila, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C- carbóxi, C-carbóxi protegido, O-carbóxi, isocianato, tiocianato, isotiocianato, nitro, silila, sulfenila, sulfinila, sulfonila, haloalquila, haloalcóxi, trihalometanosulfonila, trihalometanosulfonamido, amino, grupo amino monossubstituído, grupo amino dissubstituído e derivados protegidos dos mesmos.

[0027]Como usado neste documento, “alquila” se refere a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, que compreende um grupo de hidrocarboneto totalmente saturado (sem ligações duplas ou triplas). Em algumas realizações, o grupo alquila pode ter de 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aparecer, neste documento, uma variação numérica tal como “1 a 20”, ela se refere a cada inteiro na dada variação, inclusive pontos finais; por exemplo, “1 a 20 átomos de carbono” significa que o grupo alquila pode consistir de 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquila” onde nenhuma variação numérica é designada). O grupo alquila pode também ser uma alquila de tamanho médio tendo cerca de 7 a cerca de 10 átomos de carbono. O grupo alquila pode também ser uma alquila inferior tendo de 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila dos compostos pode ser designado como “alquila C1-C4” ou designações similares. A título de exemplo apenas, “alquila C1-C4” indica que há de um a quatro átomos de carbono na cadeia alquila, isto é, a cadeia alquila é selecionada de metila, etila, propila, iso-propila, n-butila, iso-butila, sec-butila, e t-butil. Grupos alquila típicos incluem, mas não são de forma alguma limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciário, pentila e hexis. O grupo alquila pode ser substituído ou insubstituído.

[0028]Como usado neste documento, “alquenila” se refere a um grupo alquila que contém na cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada uma ou mais ligações duplas. Um grupo alquenila pode ser insubstituído ou substituído.

[0029]Como usado neste documento, “alquinila” se refere a um grupo alquila que contém, na cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, uma ou mais ligações triplas. Um grupo alquinila pode ser insubstituído ou substituído.

[0030]Como usado neste documento, “cicloalquila” se refere a um sistema de anel de hidrocarboneto mono ou multicíclico, completamente saturado (sem ligações duplas ou triplas). Quando composto de dois ou mais anéis, os anéis podem ser unidos de uma forma fundida. Grupos cicloalquila podem conter de 3 a 10 átomos no(s) anel(anéis). Em algumas realizações, grupos cicloalquila podem conter de 3 a 8 átomos no(s) anel (anéis). Um grupo cicloalquila pode ser insubstituído ou substituído. Grupos cicloalquila típicos incluem, mas não estão limitados de forma alguma a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila e ciclo-octila.

[0031]Como usado neste documento, “aril” se refere a um sistema de anel aromático monocíclico ou multicíclico carbocíclico (todo carbono) (incluindo, por exemplo, sistemas de anel fundidos, em ponte, ou spiro, onde dois anéis carbocíclicos compartilham uma ligação química, por exemplo, um ou mais anéis arila, com um ou mais anel arila ou não arila), que tem um sistema de elétron pi totalmente deslocalizado em toda parte de pelo menos um dos anéis. O número de átomos de carbono em um grupo aril pode variar. Por exemplo, em algumas realizações, o grupo arila pode ser um grupo arila C6-C14, um grupo arila C6-C10, ou um grupo arila C6. Exemplos de grupos arila incluem, mas, sem limitação, benzeno, naftaleno e azuleno. Um grupo arila pode ser substituído ou insubstituído.

[0032]Como usado neste documento, “heterociclila” se refere a sistemas de anel incluindo pelo menos um heteroátomo (por exemplo, O, N, S). Tais sistemas podem ser insaturados, podem incluir alguma insaturaçãooupodemconter algumapartearomática ou sertodo aromático.Um grupo heterociclilapodeser insubstituído ou substituído.

[0033]Como usado neste documento, “heteroarila” se refere a um sistema de anel aromático monocíclico ou multicíclico (um sistema de anel tendo pelo menos um anel com um sistema de elétron pi totalmente deslocado), que contém (contêm) um ou mais heteroátomos, isto é, um elemento outro que não carbono, incluindo, mas, sem limitação, nitrogênio, oxigênio, e enxofre, e pelo menos um anel aromático. O número de átomos no(s) anel (anéis) de um grupo heteroarila pode variar. Por exemplo, em algumas realizações, um grupo heteroarila pode conter de 4 a 14 átomos no(s) anel (anéis), de 5 a 10 átomos no(s) anel (anéis) ou de 5 a 6 átomos no(s) anel (anéis). Ademais, o termo “heteroarila” inclui sistemas de anel fundidos, onde dois anéis, tais como pelo menos um anel arila e pelo menos um anel heteroarila, ou pelo menos dois anéis heteroarila, compartilham pelo menos uma ligação química. Exemplos de anéis heteroarila incluem, mas, sem limitação, furano, furazano, tiofeno, benzotiofeno, ftalazina, pirrol, oxazol, benzoxazol, 1,2,3-oxadiazol, 1,2,4-oxadiazol, tiazol, 1,2,3- tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, benzotiazol. imidazol, benzimidazol, indol, indazol, pirazol, benzopirazol, isoxazol, benzoisoxazol, isotiazol, triazol, benzotriazol, tiadiazol, tetrazol, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, purina, pteridina, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina, cinolina e triazina. Um grupo heteroarila pode ser substituído ou insubstituído.

[0034]Como usado neste documento, “heteroalicíclico” ou “heteroaliciclila” se refere a sistema de anel monocíclico, bicíclico e tricíclico de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, até 18 membros, em que átomos de carbono, juntos com de 1 a 5 heteroátomos, constituem dito sistema de anel. Um heterociclo pode opcionalmente conter uma ou mais ligações insaturadas, situadas de tal modo, contudo, que um sistema de elétron pi totalmente deslocado não ocorra por todos os anéis. Os heteroátomos são independentemente selecionados de oxigênio, enxofre e nitrogênio. Um heterociclo pode ainda conter uma ou mais funcionalidades carbonila ou tiocarbonila, de modo a fazer a definição incluir sistemas oxo e sistemas tio, tais como lactamos, imidas cíclicas, tioimidas cíclicas e carbamatos cíclicos. Quando compostos de dois ou mais anéis, os anéis podem ser unidos de uma forma fundida.Adicionalmente, quaisquer nitrogênios em um heteroalicíclico podem ser quaternizados.Grupos heteroaliciclila ou heteroalicíclicos podem ser insubstituídos ou substituídos. Exemplos de tais grupos “heteroalicíclicos” ou “heteroaliciclila” incluem, mas, sem limitação, 1,3-dioxina, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, 1,2-dioxolano, 1,3- dioxolano, 1,4-dioxolano, 1,3-oxatiano, 1,4-oxatiina, 1,3-oxatiolano, 1,3-ditiol, 1,3-ditiolano, 1,4-oxatiano, tetrahidro-1,4-tiazina, 2H-1,2- oxazina, maleimida, succinimida, ácido barbitúrico, ácido tiobarbitúrico, dioxopiperazina, hidanotoína, dihidrouracila, trioxano, hexahidro-1,3,5-triazina, imidazolina, imidazolidina, isoxazolina, isoxazolidina, oxazolina, oxazolidina, oxazolidinona, tiazolina, tiazolidina, morfolina, oxirano, N-Óxido de piperidina, piperidina, piperazina, pirrolidina, pirrolidona, pirrolidiona, 4-piperidona, pirazolina, pirazolidina, 2-oxopirrolidina, tetrahidropirano, 4H-pirano, tetrahidrotiopirano, tiamorfolina, sulfóxido de tiamorfolina, tiamorfolina sulfona, e seus análogos benzofundidos (por exemplo, benzimidazolidinona, tetrahidroquinolina, 3,4-metilenodioxifenil).

[0035]Como usado neste documento, “aralquila” e “aril(alquila)” se referem a um grupo arila conectado, como um substituinte, por meio de um grupo alquileno inferior. Os grupos alquileno inferior e arila de uma aralquila podem ser substituídos ou insubstituídos. Exemplos incluem, mas, sem limitação benzila, 2-fenilalquila, 3-fenilalquila e naftilalquila.

[0036]Como usado neste documento, “heteroaralquila” e “heteroaril(alquila)” se referem a um grupo heteroarila conectado, como um substituinte, por meio de um grupo alquileno inferior. O alquileno inferior e grupo heteroarila da heteroaralquila podem ser substituídos ou insubstituídos. Exemplos incluem, mas, sem limitação, 2- tienilalquila, 3-tienilalquila, furilalquila, tienilalquila, pirrolilalquila, piridilalquila, isoxazolilalquila, e imidazolilalquila, e seus análogos benzofundidos.

[0037]Como usado neste documento, “alcóxi” se refere à fórmula -OR, em que R é uma alquila, uma alquenila, uma alquinila, uma cicloalquila, uma cicloalquenila ou uma cicloalquinila, é definido acima. Uma lista não limitadora de alcóxis é metóxi, etóxi, n-propóxi, 1- metiletóxi (isopropóxi), n-butóxi, iso-butóxi, sec-butóxi, e terc-butóxi.Um alcóxi pode ser substituído ou insubstituído.

[0038]Como usado neste documento, um grupo “C-amido” se refere a um grupo “-C(=O)N(RaRb)”, em que Ra e Rb podem ser independentemente hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila ou (heteroaliciclil)alquila. Um C-amido pode ser substituído ou insubstituído.

[0039]Como usado neste documento, um grupo “N-amido” se refere a um grupo “RC(=O)NRa)-”, em que R e Ra podem ser independentemente hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila ou (heteroaliciclil)alquila. Um N-amido pode ser substituído ou insubstituído.

[0040]O termo “átomo de halogênio”, “halogênio” ou “halo”, como usado neste documento, significa qualquer um dos átomos radioestáveis da coluna 7 da Tabela Periódica dos Elementos, tais como flúor, cloro, bromo e iodo.

[0041]O termo “amina”, como usado neste documento, se refere a um grupo -NH2, em que um ou mais hidrogénios podem ser opcionalmente substituídos por um grupo R. R pode ser independentemente hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila ou (heteroaliciclil)alquila.

[0042]O termo “aldeído”, como usado neste documento, se refere a um grupo -Rc-C(O)H, em que Rc pode estar ausente ou ser independentemente selecionado de alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, cicloalquinileno, arileno, heteroarileno, heteroaliciclileno, aralquileno, ou (heteroaliciclil)alquileno.

[0043]O termo “amino”, como usado neste documento, se refere a um grupo -NH2.

[0044]O termo “hidróxi”, como usado neste documento, se refere a um grupo -OH.

[0045]O termo grupo “ciano”, como usado neste documento, se refere a um grupo “-CN”.

[0046]O termo “azido”, como usado neste documento, se refere a um grupo -N3.

[0047]O termo “tiol”, como usado neste documento, se refere a um grupo -SH.

[0048]O termo “ácido carboxílico”, como usado neste documento, se refere a -C(O)OH.

[0049]Otermo“tiocianato”,comousadonestedocumento,se refere a um grupor .

[0050]Otermo“oxo-amina”,comousadonestedocumento,se refere a um grupo -O-NH2, em que um ou mais hidrogênio do -NH2 pode ser opcionalmente substituído por um grupo R. R pode ser independentemente hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila, ou (heteroaliciclil)alquila.

[0051]Como usado neste documento, um “nucleotídeo” inclui um nitrogênio contendo base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. Eles são unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. Em RNA, o açúcar é uma ribose, e, em DNA, uma desoxirribose, isto é, um açúcar sem um grupo hidroxila, que está presente em ribose. O nitrogênio contendo base heterocíclica pode ser base purina ou pirimidina. Bases purinas incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos às mesmas.Bases pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), e derivados modificados ou análogos às mesmas. O átomo C-1 da desoxirribose é ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina.

[0052]Como usado neste documento, um “nucleosídeo” é estruturalmente similar a um nucleotídeo, mas está faltando os segmentos fosfatos. Um exemplo de um análogo a nucleosídeo seria um em que o rótulo está ligado à base e não há grupo fosfato ligado à molécula de açúcar. O termo “nucleosídeo” é usado neste documento em seu sentido comum, como entendido por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem, mas, sem limitação, um ribonucleosídeo compreendendo um segmento ribose e um desoxirribonucleosídeo compreendendo um segmento desoxirribose. Um segmento pentose modificado é um segmento pentose em que um átomo de oxigênio foi substituído por um carbono e/ou um carbono foi substituído por um enxofre ou um átomo de oxigênio. Um “nucleosídeo” é um monômero que pode ter uma base e/ou segmento de açúcar substituído. Adicionalmente, um nucleosídeo pode ser incorporado em polímeros e oligômeros de DNA e/ou RNA maiores.

[0053]O termo “base purina” é usado neste documento em seu sentido comum, como entendido por aqueles versados na técnica, e inclui seus tautômeros. De forma similar, o termo “base pirimidina” é usado neste documento em seu sentido comum, como entendido por aqueles versados na técnica, e inclui seus tautômeros. Uma lista não limitadora de bases purinas opcionalmente substituídas inclui purina, adenina, guanina, hipoxantina, xantina, aloxantina, 7-alquilguanina (por exemplo, 7-metilguanina), teobromina, cafeína, ácido úrico e isoguanina. Exemplos de bases pirimidinas incluem, mas, sem limitação, citosina, timina, uracila, 5,6-dihidrouracila e 5-alquilcitosina (por exemplo, 5-metilcitosina).

[0054]Como usado neste documento, “derivado” ou “análogo” significa um derivado de nucleotídeo ou nucleosídeo sintético tendo segmentos de base modificados e/ou segmentos de açúcar modificados. Tais derivados e análogos são discutidos, por exemplo, em Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman, et al., Chemical Reviews 90:543-584,1990. Análogos ao nucleotídeo podem também compreender ligações em cadeia de fosfodiéster, incluindo fosforotioato, fosforoditioato, alquil-fosfonato, fosforanilidato e ligações em cadeia de fosforamidato. “Derivado”, “análogo” e “modificado”, como usados neste documento, podem ser usados indistintamente, e são englobados pelos termos “nucleotídeo” e “nucleosídeo” definidos neste documento.

[0055]Como usado neste documento, o termo “fosfato” é usado em seu sentido comum, como entendido por aqueles versados na técnica e

inclui suas formas protonadas (por exemplo,’’e~). Como usado neste documento, os termos “monofosfato”, “difosfato” e “trifosfato” são usados em seus sentidos comuns, como entendidos por aqueles versados na técnica, e incluem formas protonadas.

[0056]Os termos “grupo de proteção” e “grupos de proteção”, como usados neste documento, se referem a qualquer átomo ou grupo de átomos que é adicionado a uma molécula, a fim de prevenir grupos existentes na molécula de sofrerem reações químicas indesejadas. Às vezes, “grupo de proteção” e “grupo de bloqueio” podem ser usados indistintamente.

[0057]Como usado neste documento, os prefixos “foto” ou “foto-“ significa em relação a luz ou radiação eletromagnética. O termo pode englobar todo ou parte do espectro eletromagnético, incluindo, mas, sem limitação, um ou mais da variedade comumente conhecida como partes rádio, micro-ondas, infravermelho, visível, ultravioleta, raio x ou raio gama do espectro. A parte do espectro pode ser uma que seja bloqueada por uma região de metal de uma superfície, tal como aqueles metais estabelecidos neste documento. Alternativamente ou adicionalmente, a parte do espectro pode ser uma que passe através de uma região intersticial de uma superfície, tal como uma região feita de vidro, plástico, sílica ou outro material estabelecido neste documento. Em realizações em particular, a radiação pode ser usada, que seja capaz de passar através de um metal.Alternativamente ou adicionalmente, radiação pode ser usada, que seja mascarada por vidro, plástico, sílica ou outro material estabelecido neste documento.

[0058]Como usado neste documento, o termo “faseamento” se refere a fenômenos em SBS, que sejam causados por remoção incompleta dos terminadores 3’ e fluoroforos e falha em completar a incorporação de uma parte de filamentos de DNA dentro de cachos (clusters) por polimerases em um dado ciclo de sequenciamento. O pré- faseamento é causado pela incorporação de nucleotídeos sem terminadores 3’ eficazes e o evento de incorporação segue 1 ciclo adiante. O faseamento e o pré-faseamento fazem com que as intensidades extraídas para um ciclo específico consistam do sinal do ciclo corrente, bem como ruído dos ciclos precedentes e seguintes. À medida que o número de ciclos aumenta, a fração de sequências por cluster afetado pelo faseamento aumenta, dificultando a identificação da base correta. O pré-faseamento pode ser causado pela presença de uma pequena quantidade de nucleotídeos 3’-OH desprotegidos ou desbloqueados durante o sequenciamento por síntese (SBS). Os nucleotídeos 3’-OH desprotegidos poderiam ser gerados durante os processos de fabricação ou possivelmente durante os processos de armazenamento e manuseio de reagente. Consequentemente, a descoberta de análogos a nucleotídeos que diminuem a incidência de pré-faseamento é surpreendente e fornece uma grande vantagem nas aplicações de SBS sobre análogos de nucleotídeo existentes. Por exemplo, os análogos a nucleotídeos fornecidos podem resultar em tempo de ciclo de SBS mais rápido, valores de faseamento e pré- faseamento menores, e comprimento de leitura de sequeciamento mais longo.

Grupos de proteção 3’-OH -C(RhN3

[0059]Algumas realizações descritas neste documento se referem a uma molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificada, tendo um grupo de proteção 3’-hidróxi removível -C(R)2N3, em que R é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, -C(R1)m(R2)n, -C(=O)OR3,- C(=O)NR4R5, -C(R6)2O(CH2)pNR7R8 e -C(R9)2O-Ph-C(=O)NR10R11, em que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, m, n e p são definidos acima.

[0060]Em algumas realizações, um de R é hidrogênio e o outro R é -C(R1)m(R2)n. Em algumas tais realizações, -C(R1)m(R2)n é selecionado de -CHF2, -CH2F, -CHCl2 ou -CH2Cl. Em uma realização, -C(R1)m(R2)n é -CHF2. Em outra realização, -C(R1)m(R2)n é -CH2F.

[0061]Em algumas realizações, um de R é hidrogênio e o outro R é -C(=O)OR3. Em alguma tal realização, R3 é hidrogênio.

[0062]Em algumas realizações, um de R é hidrogênio e o outro R é -C(=O)NR4R5. Em algumas tais realizações, ambos R4 e R5 são hidrogênio. Em algumas outras tais realizações, R4 é hidrogênio e R5 é alquila C1-6. Em ainda algumas outras realizações, ambos R4 e R5 são alquila C1-6.Em uma realização, R5 é n-butila.Em outra realização, ambos R4 e R5 são metila.

[0063]Em algumas realizações, um de R é hidrogênio e o outro R é -C(R6)2O(CH2)pNR7R8. Em algumas tais realizações, ambos R6 são hidrogênio. Em algumas tais realizações, ambos R7 e R8 são hidrogênio. Em alguma tal realização, p é 0. Em alguma outra tal realização, p é 6.

[0064]Em algumas realizações, um de R é hidrogênio e o outro R é -C(R9)2O-Ph-C(=O)NR10R11. Em algumas tais realizações, ambos R9 são hidrogênio. Em algumas tais realizações, ambos R10 e R11 são hidrogênio. Em algumas tais realizações, R10 é hidrogênio e R11 é uma alquila substituída. Em uma realização, R11 é uma alquila amino substituída.

Desproteção dos Grupos de Proteção 3’-OH

[0065]Em algumas realizações, o grupo de proteção 3’-OH é removido em uma reação desprotegida com uma fosfina. O grupo azido em -C(R)2N3 pode ser convertido em um grupo amino através do contato das moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo modificadas com uma fosfina. Alternativamente, grupo azido em -C(r)2N3 pode ser convertido em um grupo amino através do contato de tais moléculas com os tióis, em particular, tióis solúveis em água, tais como ditiotreitol (DTT). Em uma realização, a fosfina é tris(hidroximetil)fosfina (THP). A menos que de outro modo indicado, a referência a nucleotídeos é também destinada a ser aplicável a nucleosídeos.

Rótulos Detectáveis

[0066]Algumas realizações descritas neste documento se referem ao uso de rótulos detectáveis convencionais. Detecção pode ser conduzida através de qualquer método apropriado, incluindo espectroscopia de fluorescência ou através de outros meios óticos. O rótulo preferido é um fluoróforo, que, após a absorção de energia, emite radiação em um comprimento de onda definido. Muitos rótulos fluorescentes apropriados são conhecidos. Por exemplo, Welch et al. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960,1999) revela segmentos fluorescentes funcionalizados por dansyl que podem ser usados na presente invenção. Zhu et al. (Cytometry 28:206-211,1997) descreve o uso dos rótulos fluorescentes Cy3 e Cy5, que podem também ser usados na presente invenção. Rótulos apropriados para uso são também revelados em Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (Biotechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) e Smith et al. (Nature 321:674,1986). Outros rótulos fluorescentes comercialmente disponíveis incluem, mas, sem limitação, fluoresceína, rodamina (incluindo TMR, vermelho Texas e Rox), alexa, bodipi, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno e as cianinas.

[0067]Múltiplos rótulos podem também ser usados no presente pedido, por exemplo, cassetes FRET de fluoróforo (Tet. Let. 46:88678871,2000). Sistemas dendriméricos multiflúor (J. Am. Chem. Soc. 123:8101-8108,2001) podem também ser usados. Embora rótulos fluorescentes sejam preferidos, outras formas de rótulos detectáveis ficarão aparentes como úteis àqueles de conhecimento comum na técnica. Por exemplo, micropartículas, incluindo pontos quânticos (Empodocles et al., Nature 399:126-130, 1999), nanopartículas de ouro (Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) e microesferas (Lacoste et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466,2000) podem ser usadas.

[0068]Rótulos multicomponentes podem também ser usados no presente pedido. Um rótulo multicomponente é um que é dependente da interação com um composto adicional para detecção. O rótulo multicomponente mais comum usado em biologia é o sistema biotina- estreptavidina. Biotina é usada como o rótulo ligado à base nucleotídeo. Estreptavidina é então adicionada separadamente para permitir que a detecção ocorra.Outros sistemas multicomponentes estão disponíveis.Por exemplo, dinitrofenol tem um anticorpo fluorescente comercialmente disponível, que pode ser usado para detecção.

[0069]A menos que indicado de outro modo, a referência a nucleotídeos é também destinada a ser aplicável a nucleosídeos. O presente pedido também será adicionalmente descrito com referência a DNA, embora a descrição também seja aplicável a RNA, PNA e outros ácidos nucleicos, a menos que de outro modo indicado. Ligantes

[0070]Em algumas realizações descritas neste documento, a base purina ou pirimidina das moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo modificadas podem ser ligadas a um rótulo detectável, como descrito acima. Em algumas tais realizações, os ligantes usados são cliváveis. O uso de um ligante clivável garante que o rótulo possa, se requerido, ser removido após a detecção, evitando qualquer sinal de interferência com qualquer nucleotídeo ou nucleosídeo rotulado incorporado subsequentemente.

[0071]Em algumas outras realizações, os ligantes usados são não cliváveis. Uma vez que em cada caso onde um nucleotídeo rotulado da invenção é incorporado, nenhum nucleotídeo precisa ser subsequentemente incorporado e, assim, o rótulo não precisa ser removido do nucleotídeo.

[0072]Aqueles versados na técnica estarão cientes da utilidade de didesoxinucleosídeo trifosfatos nos chamados métodos de sequenciamento Sanger, e protocolos relacionados (tipo Sanger), que dependem de terminação de cadeia randomizada em um tipo particular de nucleotídeo. Um exemplo de um protocolo de sequenciamento do tipo Sanger é o método BASS, descrito por Metzker.

[0073]Métodos Sanger e do tipo Sanger geralmente operam pela condução de um experimento em que oito tipos de nucleotídeos são fornecidos, quatro dos quais contêm um grupo 3’-OH; e quatro dos quais omitem o grupo OH e que são rotulados diferentemente uns dos outros. Os nucleotídeos usados, que omitem o grupo 3’-OH - didesóxi nucleotídeos (ddNTPs). Como sabido por uma pessoa versada na técnica, uma vez que os ddNTPs são rotulados diferentemente, através da determinação das posições dos nucleotídeos terminais incorporados, e combinação dessa informação, a sequência do oligonucleotídeo alvo pode ser determinada.

[0074]Os nucleotídeos do presente pedido, será reconhecido, podem ser de utilidade em métodos Sanger e protocolos relacionados, uma vez que o mesmo efeito alcançado através do uso de ddNTPs pode ser alcançado pelo uso dos grupos de proteção 3’-OH descritos neste documento:ambos previnem a incorporação de nucleotídeos subsequentes.

[0075]Ademais, será apreciado que o monitoramento da incorporação de nucleotídeos protegidos 3’-OH pode ser determinado pelo uso de 32P radioativo nos grupos fosfatos ligados. Estes podem estar presentes tanto nos próprios ddNTPs, quanto nos iniciadores usados para a extensão.

[0076]Ligantes cliváveis são conhecidos na técnica, e química convencional podem ser aplicados para ligar um ligante a uma base de nucleotídeo e rótulo. O ligante pode ser clivado por qualquer método apropriado, incluindo a exposição a ácidos, bases, nucleófilos, eletrófilos, radicais, metais, agentes de redução ou de oxidação, luz, temperatura, enzimas, etc. O ligante, como discutido neste documento, pode também ser clivado com o mesmo catalisador usado para clivar a ligação do grupo de proteção 3’-O. Ligantes apropriados podem ser adaptados de grupos de proteção química padrão, como revelado em Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Ligantes cliváveis apropriados adicionais usados em síntese de fase sólida são revelados em Guillier et al. (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).

[0077]O uso do termo “ligante clivável” não se destina a implicar que se requer que todo o ligante seja removido, por exemplo, da base de nucleotídeo. Onde o rótulo detectável é ligado à base, o sítio de clivagem de nucleosídeo pode estar localizado no ligante, que garante que parte do ligante permanece ligado à base de nucleotídeo após a clivagem.

[0078]Onde o rótulo detectável é ligado à base, o ligante pode ser ligado em qualquer posição na base de nucleotídeo, desde que o emparelhamento de base Watson-Crick possa ainda ser conduzido. No contexto de bases purinas, é preferido se o ligante for ligado por meio da posição 7 da purina ou o análogo de deazapurina preferido, por meio de uma purina 8-modificada, por meio de uma adenosina N-6 modificada ou guanina N-2 modificada. Para pirimidinas, ligação é preferencialmente por meio da posição 5 em citosina, timidina, ou uracila e a posição N-4 em citosina.

A.Ligantes clivados eletrofilicamente

[0079]Ligantes clivados eletrofilicamente são tipicamente clivados por prótons e incluem clivagens sensíveis a ácidos. Ligantes apropriados incluem os sistemas benzílicos modificados, tais como tritila, ésteres p-alcoxibenzilícos e amidas de p-alcoxibenzil. Outros ligantes apropriados incluem grupos terc-butiloxicarbonila (Boc) e o sistema acetal.

[0080]O uso de metais tiofílicos, tais como níquel, prata ou mercúrio, na clivagem de tioacetal ou outros grupos de proteção contendo enxofre podem também ser considerados para a preparação de moléculas de ligante apropriadas.

B.Ligantes clivados nucleofilicamente

[0081]A clivagem nucleofílica é também um método bem conhecido no preparo de moléculas de ligante. Grupos tais como ésteres que sejam lábeis em água (isto é, podem ser clivados simplesmente em pH básico) e grupos que sejam lábeis a nucleófilos não aquosos, podem ser usados. Íons de flúor podem ser usados para clivar ligações silício- oxigênio em grupos tais como triisopropil silano (TIPS) ou t-butildimetil silano (TBDMS).

C.Ligantes fotocliváveis

[0082]Os ligantes fotocliváveis têm sido usados amplamente na química de carboidrato. É preferível que a luz requerida para ativar a clivagem não afete os outros componentes dos nucleotídeos modificados. Por exemplo, se um fluoróforo for usado como o rótulo, é preferível se ele absorver luz de um comprimento de onda diferente àquele requerido para clivar a molécula do ligante. Ligantes apropriados incluem aqueles baseados em compostos O-nitrobenzil e compostos nitroveratril.Ligantes baseados em química benzoína podem também ser usados (Lee et al., J. Org. Chem. 64:3454-3460, 1999).

D.Clivagem sob condições redutivas

[0083]Há muitos ligantes conhecidos que são suscetíveis para clivagem redutiva. Hidrogenação catalítica usando catalisadores baseados em paládio foram usados para clivar grupos benzil e benziloxicarbonil. Redução de ligação dissulfeto é também conhecida na técnica.

E.Clivagem sob condições oxidativas

[0084]Abordagens baseadas em oxidação são bem conhecidas na técnica. Estas incluem a oxidação de grupos p-alcoxibenzil e a oxidação de ligantes de enxofre e selênio. O uso de iodo aquoso para clivar dissulfetos e outros ligantes baseados em enxofre e selênio está também dentro do escopo da invenção.

F.Ligantes de captura de segurança

[0085]Os ligantes de captura de segurança são aqueles que clivam em duas etapas. Em um sistema preferido, a primeira etapa é a geração de um centro nucleofílico reativo, seguida por uma segunda etapa envolvendo uma ciclização intramolecular que resulta em clivagem. Por exemplo, ligações em cadeia de éster levulínico podem ser tratadas com hidrazina ou fotoquímica, para liberar uma amina ativa, que pode, então, ser ciclisada para clivar um éster em outro local na molécula (Burgess et al., J. Org. Chem. 62:5165-5168, 1997).

G.Clivagem por mecanismos de eliminação

[0086]As reações de eliminação podem também ser usadas. Por exemplo, a eliminação catalisada por base de grupos tais como Fmoc e cianoetil e a eliminação redutiva catalisada por paládio de sistemas alílicos podem ser usadas.

[0087]Em algumas realizações, o ligante pode compreender uma unidade espaçadora. O comprimento do ligante não é importante, desde que o rótulo seja mantido a uma distância suficiente do nucleotídeo, de modo a não interferir com qualquer interação entre o nucleotídeo e uma enzima.

[0088]Em algumas realizações, o ligante pode consistir da funcionalidade similar que o grupo de proteção 3’-OH. Isso fará a desproteção e o processo de desproteção mais eficientes, uma vez que apenas um único tratamento será requerido para remover tanto o rótulo quanto o grupo de proteção.Ligantes particularmente preferidos são azida clivável por fosfina contendo ligantes.

Métodos de sequenciamento

[0089]Os nucleosídeos ou nucleotídeos modificados descritos neste documento podem ser usados em conjunto com uma variedade de técnicas de sequenciamento. Em algumas realizações, o processo para determinar a sequência de nucleotídeo de um ácido nucleico alvo pode ser um processo automatizado.

[0090]Os análogos a nucleotídeo apresentados neste documento podem ser usados em um procedimento de sequenciamento, tal como uma técnica de sequenciamento por síntese (SBS). Brevemente, SBS pode ser iniciado pelo contato dos ácidos nucleicos alvos com um ou mais nucleotídeos rotulados, DNA polimerase, etc. Aquelas características onde um iniciador é estendido usando o ácido nucleico alvo como modelo incorporarão um nucleotídeo rotulado que pode ser detectado. Opcionalmente, os nucleotídeos rotulados podem ainda incluir uma propriedade de terminação reversível que termina extensão de iniciador adicional, uma vez que um nucleotídeo tenha sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um análogo a nucleotídeo tendo um segmento de terminador reversível pode ser adicionado a um iniciador tal que extensão subsequente não pode ocorrer até que um agente de desbloqueio seja distribuído para remover o segmento. Assim, para realizações que usam terminação reversível, um reagente de desbloqueio pode ser distribuído à célula de fluxo (antes ou depois de a detecção ocorrer).Lavagens podem ser conduzidas entre as várias etapas de distribuição. O ciclo pode, então, ser repetido n vezes para estender o iniciador por n nucleotídeos, detectando, assim, uma sequência de comprimento n. Procedimentos SBS, sistemas fluídicos e plataforma de detecção exemplificativos que podem ser facilmente adaptados para uso com um conjunto ordenado produzido pelos métodos da presente revelação são descritos, por exemplo, em Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; Patente US 7.057.026; 7.329.492; 7.211.414; 7.315.019; ou 7,405.281 e Publicação de Pedido de Patente US 2008/0108082 A1, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.

[0091]Outros procedimentos de sequenciamento que usam reações cíclicas podem ser usados, tais como pirossequenciamento. Pirossequenciamento detecta a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi), à medida que nucleotídeos particulares são incorporados em um filamento de ácido nucleico nascente (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al., Science 281(5375),365(1998); Patentes US 6.210.891; 6.258.568 e 6.274.320, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência).Em pirossequenciamento, PPi liberado pode ser detectado sendo convertido para adenosina trifosfato (ATP) por ATP sulfurilase, e o ATP resultante pode ser detectado por meio de fótons produzidos por luciferase.Assim, a reação de sequenciamento pode ser monitorada por meio de um sistema de detecção por luminescência.Fontes de radiação por excitação usadas para sistemas de detecção baseados em fluorescência não são necessários para procedimentos de pirossequenciamento. Sistemas fluídicos, detectores e procedimentos úteis que podem ser usados para a aplicação de pirossequenciamento a conjuntos ordenados da presente revelação são descritos, por exemplo, no Ser. de Pedido de Patente WIPO PCT/US11/57111, Publicação de Pedido de Patente US 2005/0191698 A1, Patente US 7.595.883, e Patente US 7.244.559, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.

[0092]Reações de sequenciamento por ligação são também úteis, incluindo, por exemplo, aquelas descritas em Shendure et al., Science 309:1728-1732 (2005); Patente US 5.599.675; e Patente US 5.750.341, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência. Algumas realizações podem incluir procedimentos por sequenciamento por hibridização, como descrito, por exemplo, em Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767773 (1995); e WO 1989/10977, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.Tanto nos procedimentos de sequenciamento por ligação, quanto nos de sequenciamento por hibridização, ácidos nucleicos que estão presentes em poços contendo gel (ou outras características côncavas) são submetidos a ciclos repetidos de distribuição e detecção de oligonucleotídeo.Sistemas fluídicos para métodos de SBS são estabelecidos neste documento, ou em referências citadas neste documento, podem ser facilmente adaptados para a distribuição de reagentes para procedimentos de sequenciamento por ligação ou de sequenciamento por hibridização.Tipicamente, os oligonucleotídeos são rotulados de forma fluorescente e podem ser detectados usando detectores de fluorescência similar àqueles descritos em relação a procedimentos de SBS neste documento ou em referências citadas neste documento.

[0093]Algumas realizações podem utilizar métodos envolvendo o monitoramento em tempo real de atividade de DNA polimerase. Por exemplo, incorporações de nucleotídeo podem ser detectadas através de interações de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) entre uma polimerase portando fluoróforo e nucleotídeos rotulados por Y-fosfato, ou com guias de ondas de modo zero. Técnicas e reagentes para sequenciamento baseado em FRET são descritos, por exemplo, em Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33,1026-1028 (2008); Korlach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), as revelações dos quais são incorporadas neste documento por referência.

[0094]Algumas realizações de SBS incluem detecção de um próton liberado com a incorporação de um nucleotídeo em um produto de extensão. Por exemplo, sequenciamento baseado em detecção de prótons liberados pode usar um detector elétrico e técnicas associadas que estãocomercialmente disponíveisporIon Torrent(Guilford,CT, uma subsidiária de Life Technologies) ou métodos de sequenciamento e sistemasdescritos naPublicaçãodePedido de Patente US 2009/0026082A1;2009/0127589A1;2010/0137143A1; ou 2010/0282617 A1, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.

EXEMPLOS

[0095]Realizações adicionais são reveladas em maiores detalhes nos seguintes exemplos, que não estão de qualquer modo destinados a limitar o escopo das Reivindicações. A síntese de vários nucleotídeos modificados com grupo de proteção 3’-hidróxi é demonstrada nos Exemplos 1-3.Exemplo 1Síntese de Nucleotídeos com grupo de proteção 3’-OH

[0096]Esquema 1 ilustra uma rota sintética para o preparo dosnucleotídeos modificados com azidometila monofluormetil substituído como grupos de proteção 3’-OH. Compostos 1a-1f empregam uma timina modificada (T-PA) como a base. Outros exemplos não limitadores das bases que podem ser usados incluem Cbz-PA, ADMF-PA e GPac-PA, as estruturas das quais são mostradas acima no Esquema 1.

Procedimentos Experimentais

[0097]A uma solução do nucleosídeo primário 1a (1,54 g, 2,5 mmol) em CH3CN anidro (25 ml) foram adicionados 2,6-lutidina (0,87 mL, 7,5 mmol), (2-fluoretil)(4-metoxifenil)sulfano (MPSF) (3,26 g, 17,5 mmol) e depois BZ2O2 (50% puro, 8,47 g, 17,5 mmol) a 4 °C. A mistura reagente foi permitida aquecer-se lentamente para temperatura ambiente. A mistura foi agitada por outras 6 horas. TLC monitorado (EtOAc:DCM=2:8 v/v) para ver consumo completo do nucleosídeo primário. A reação foi então concentrada sob pressão reduzida para resíduo oleoso. A essa mistura, éter de petróleo (500 ml) foi adicionado e agitado vigorosamente por 10 min. A camada do éter de petróleo foi decantada e o resíduo foi repetido para tratar com o éter de petróleo (x2). O resíduo oleoso foi particionado entre DCM/NaHCO3 (1:1) (300 mL). A camada orgânica foi separada e a aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x150 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO4, filtradas e os voláteis evaporados sob pressão reduzida. O produto cru 1c foi purificado por coluna de sílica gel Biotag (50g), usando um gradiente de éter de petróleo para éter de petróleo:EtOAc 1:1 (v/v), para fornecer 1,63g de nucleosídeo 1b como uma espuma amarela pálida (diastereômeros, rendimento de 82%). 1H RMN (d6 DMSO, 400 MHz): Ô, 0,95 (s, 9H, tBu), 2,16 - 2,28 (m, 2H, H- 2’), 3,67 (s, OMe), 3,65 - 3,85 (m, 2H, HH-5’), 3,77 (dd, J = 11,1, 4,5 Hz, 1H, HH-5’), 3,95-3,98 (m, 1H, H-4’), 4,04 (m, 2H, CH2F), 4,63 - 4,64 (m, 1H, H-3’), 5,01 - 5,32 (s, 1H, CH), 6,00 (m, 1H, H-1’), 6,72 - 6,87 (m, 3H, Ar), 7,35 - 7,44 (m, 7H, Ar), 7,55 - 7,60 (m, 4H, Ar), 7,88 (s, 1H, H- 6), 9,95 (brt, 1H, NH), 11,70 (s, 1H, NH).

[0098]A umasoluçãodo nucleosídeo primário 1b (1,14g,1,4 mmol) emCH2CI2(14 mL)com peneira molecular (4 Â) sob N2foi adicionadociclohexeno (1,44mL, 14 mmol). A mistura foi resfriada com um banhode geloseco/acetona para -78 °C. A solução de cloretode sulfurilo (580 gL, 7,2 mmol) em DCM (14 ml) foi lentamente adicionada por 90 minutos sob N2. Depois de 20 minutos naquela temperatura TLC (EtOAc: éter de petróleo =1:1v/v), indicou o total consumo do nucleosídeo primário. Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida (e temperatura ambiente de 25 °C) e o resíduo oleoso foi rapidamente submetido a alto vácuo por 10 minutos adicionais até que espumou. O produto cru foi purgado com N2 e depois dissolvido em DMF anidro (5 mL) e NaN3 (470 mg, 7 mmol) adicionado de uma vez. A suspensão resultante foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas ou até que TLC indicou a conclusão da reação e a formação de 1c como dois isômeros (a e b). A mistura reagente foi particionada entre EtOAc:NaHCO3 (1:1)(200 mL). A camada orgânica foi separada e a aquosa foi adicionalmente extraída em EtOAc (2x100 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sobre pressão reduzida. Os dois diastereoisômeros de 1c (A e B) foram separados por coluna de sílica gel Biotag (25 g), usando um gradiente de éter de petróleo para éter de petróleo: EtOAc 1:1(v/v), como uma espuma amarela pálida.

[0099]Isômero A (370 mg, rendimento: 38%). 1H RMN (d6 DMSO, 400 MHz): ô 1,02 (s, 9H, tBu), 2,35 - 2,43 (m, 2H, H-2’), 3,76 - 3,80 (m, 1H, H-5’), 3,88 - 3,92 (m, 1H, H-5’), 4,10 - 4,12 (m, 1H, H-4’), 4,14 (d, J = 4,1 Hz 2H, NHCH2), 4,46 - 4,60 (m, 3H, H-3’, CH2F), 5,05 - 5,09 (m, 1H, CHN3), 6,11 (t, J = 6,1 Hz, 1H, H-1’), 7,47 - 7,51 (m, 6H, Ar), 7,64 - 7,68 (m, 4H, Ar), 7,97 (s, 1H, H-6), 10,03 (bt, 1H, J = 10,0 Hz, NH), 11,76 (s, 1H, NH). 19F RMN: -74,3 (CF3), -230,2 (CH2F).

[00100] Isômero B (253 mg, rendimento 26%). 1H RMN (d6 DMSO, 400 MHz): ô 1,01 (s, 9H, tBu), 2,38 - 2,42 (m, 2H, H-2’), 3,74-3,78 (m, 1H, H-5’), 3,86-3,90 (m, 1H, H-5’), 4,00 - 4,05 (m, 1H, H-4’), 4,12 (d, J = 4,1 Hz 2H, NHCH2), 4,45-4,60 (m, 3H, H-3’, CH2F), 5,00-5,14 (m, 1H, CHN3), 609 (t, J = 6,1 Hz, 1H, H-1’), 7,41 - 7,50 (m, 6H, Ar), 7,63-7,66 (m, 4H, Ar), 7,95 (s, 1H, H-6), 10,01 (bs, 1H, NH), 11,74 (s, 1H, NH). 19F RMN: -74,5 (CF3), -230,4 (CH2F).

[00101] O material primário 1c (isômero A) (500 mg, 0,71 mmol) foi dissolvido em THF (3 mL) e resfriado para 4 °C em banho de gelo. Depois, TBAF (1,0 M em THF, 5% de massa de água, 1,07 mL, 1,07 mmol) foi adicionado lentamente durante um período de 5 mins. A mistura reagente foi lentamente aquecida para temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (éter de petróleo: EtOAc 3:7(v/v)). A reação foi parada após 1 hora, quando mais nenhum material primário estava visível por TLC. A solução reagente foi dissolvida em EtOAc (50 mL) e adicionada a NaHCO3 (60 mL).As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com DCM adicional (50 mLx2).As extrações orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4), filtradas e evaporadas, para fornecer um óleo amarelo. O produto cru 1d (isômero A) foi purificado por coluna de sílica gel Biotag (10g), usando um gradiente de éter de petróleo: EtOAc 8:2 (v/v) para EtOAc como um sólido branco (183 mg, rendimento: 56%).

[00102] Isômero A: 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): ô 2,24-2,35 (m, 2H, H-2’), 3,56-3,66 (m, 2H, H-5’), 3,96-4,00 (m, 1H, H-4’), 4,23 (s, 2H, CH2NH), 4,33-4,37 (m, 1H, H-3’), 4,43-4,51 (m, CH2F), 5,12 (br.s, 1H, CHN3), 5,23 (br.s, 1H, 5’-OH), 6,07 (t, J=6,7 Hz, 1H, H-1’), 8,26 (s, 1H, H-6), 10,11 (br s, 1H, NH), 11,72 (br s, 1H, NH). 19F RMN: -74,3 (CF3), - 230,5 (CH2F)

[00103] A mesma reação foi realizada para 1c (isômero B) a 360 mg de escala e forneceu o produto correspondente 1d (Isômero B, 150 mg, 63%). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): ô 2,24-2,37 (m, 2H, H-2’), 3,573,70 (m, 2H, H-5’), 3,97-4,01(m,1H, H-4’), 4,23 (br.s, 2H, CH2NH), 4,33-4,37(m,1H,H-3’),4,44-4,53(m, CH2F),5,11-5,21 (br.s, 1H, CHN3), 5,23 (br.s, 1H, 5’-OH, 6,07 (t, J=6,6 Hz, 1H, H-1’), 8,23 (s, 1H, H-6), 10,09 (br s, 1H, NH), 11,70 (br s, 1H, NH), 19F RMN: -74,1 (CF3), - 230,1 (CH2F).

[00104] O preparo dos trifosfatos correspondentes 1e e a ligação adicional de corante ao nucleobase para fornecer o nucleosídeo trifosfato totalmente funcional (ffN) 1f foi reportado em WO 2004/018497 e são geralmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica.Exemplo 2Síntese de Nucleotídeos com grupo de proteção 3’-OH

[00105] O esquema 2 ilustra uma rota sintética para o preparo dos nucleotídeos modificados com azidometila C-amido substituída como grupos de proteção 3’-OH. Os compostos 2a-2i empregam uma timina modificada (T-PA) como a base. Outros exemplos não limitadores das bases que podem ser usadas incluem Cbz-PA, ADMF-PA, e GPac-PA, as estruturas dos quais são mostradas acima no Esquema 1. No procedimento experimental, o composto 2f com um grupo de proteção azidometila N,N-dimetil-C(=O)- substituído (R = NMe2) e as reações subsequentes foram reportados. Compostos com outros grupos C-amido foram também preparados, tais como N-etil-C(=O)- (R = NHEt). Procedimentos Experimentais

[00106] A uma solução do nucleosídeo primário 2a (4,27 g, 6,9 mmol) em CH3CN anidro (50 ml) foram adicionados 2,6-lutidina (2,4 mL, 20,7 mmol), S(CH2CH2OAc)2 (12,2 g, 69 mmol) e depois BZ2O2 (50% puro, 33,4 g, 69 mmol) a 4°C. A mistura reagente foi permitida aquecer-se lentamente para temperatura ambiente. A mistura foi agitada por outras 12 horas. TLC monitorado (EtOAc:DCM = 4:6 v/v) para ver completo consumo do nucleosídeo primário. A reação foi então concentrada sob pressão reduzida para um resíduo oleoso. A essa mistura, éter de petróleo (800 ml) foi adicionado e agitado vigorosamente por 10 min. A camada do éter de petróleo foi decantada e o resíduo foi repetidamente tratado com o éter de petróleo (x2). O resíduo oleoso foi particionado entre DCM/NaHCO3 (1:1) (1000 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x500 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO4, filtradas e os voláteis evaporados sob pressão reduzida. O produto cru 2b foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (100g), usando um gradiente de éter de petróleo para éter de petróleo:EtOAc 2:8(v/v), como uma espuma amarela pálida (4,17g,rendimento: 74%, diastereoisômeros).

[00107]A uma solução do nucleosídeo primário 2b (4,54g, 5,56 mmol) em CH2CI2 (56 mL) com peneira molecular (4 Â) sob N2 foi adicionado ciclohexeno (5,62 mL, 56 mmol). A mistura foi resfriada com um banho de gelo para 4 °C. A solução de cloreto de sulfurilo (1,13 mL, 13,9 mmol) em DCM (25 ml) foi lentamente adicionada por 90 minutos sob N2. Depois de 30 minutos naquela temperatura TLC (EtOAc: DCM = 4:6 v/v), indicou que 10% do nucleosídeo primário 2b tinha deixado. Cloreto de sulfurila (0,1 mL) adicional foi adicionado à mistura reagente. TLC indicou conversão completa de 2b. Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida (e temperatura ambiente de 25 °C) e o resíduo oleoso foi rapidamente submetido a alto vácuo por 10 minutos adicionais até que espumou. O produto cru foi purgado com N2 e depois dissolvido em DMF anidro (5 mL) e NaN3 (1,8 g, 27,8 mmol) adicionado de uma vez. A suspensão resultante foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas ou até que TLC indicou a conclusão da reação e a formação de 2c como dois isômeros (A e B). A mistura reagente foi particionada entre EtOAc:NaHCO3 (1:1) (1000 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi adicionalmente extraída em EtOAc (2x300 mL).Os extratos orgânicos combinados foram então secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sobre pressão reduzida. Os dois diastereoisômeros de 2c (isômero A e B) foram separados por uma coluna de sílica gel Biotag (100 g), usando um gradiente de éter de petróleo para éter de petróleo: EtOAc 1:1 (v/v), como uma espuma amarela pálida. Isômero A: 1,68 g, rendimento: 40,7%. Isômero B: 1,79 g, rendimento: 43,2%.

[00108] A uma solução do nucleosídeo primário 2c (isômero A) (1,63 g, 2,2 mmol) em MeOH/THF (1:1) (20 mL) foi lentamente adicionado NaOH (1M em água) (2,2 mL, 2,2 mmol) e agitada em 4 °C. O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc: DCM = 4:6 v/v). A reação foi parada após 1 hora quando mais nenhum material primário estava visível por TLC. A mistura reagente foi particionada entre DCM: NaHCO3 (1:1) (150 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x70 mL).Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sobre pressão reduzida. O produto cru 2d foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (10g), usando um gradiente de éter de petróleo: EtOAc (8:2)(v/v) para EtOAc como uma espuma amarela pálida (1,1g, rendimento: 71%).

[00109] A mesma reação foi repetida para 2c (isômero B, 1,57g) e forneceu o produto correspondente 2d (isômero B, 1,01 g, 69% de rendimento).

[00110] A uma solução do nucleosídeo primário 2d (isômero A) (700 mg, 1mmol) em CH3CN (10 mL) foi tratada com TEMPO (63 mg, 0,4 mmol) e BAIB (644 mg, 2 mmol) a temperatura ambiente. A progressão da reação foi monitorada por TLC (EtOAc:DCM = 7:3 v/v). A reação foi parada após 2 horas, quando mais nenhum material primário estava visível por TLC.A mistura reagente foi particionada entre DCM/Na2S2O3 (1:1) (100 mL).A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x70 mL). Os extratos orgânicos combinados então lavados com NaCl (sat.). A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida, sem secar sobre MgSO4, a fim de prevenir que o produto precipite para fora. O produto cru 2e foi purificado por coluna de sílica gel Biotag (10g), usando um gradiente de éter de petróleo: EtOAc 1:1 (v/v) para EtOAc para MeOH: EtOAc (1:9) como uma espuma amarela pálida (isômero A, 482 mg, rendimento 68%).

[00111] A mesma reação foi realização para 2d (isômero B, 700 mg) e forneceu o produto correspondente 2e (isômero B, 488 mg, rendimento 69%).

[00112] A uma solução do nucleosídeo primário 2e (isômero A) (233 mg, 0,33 mmol) em CH3CN (10 mL), foram adicionados base de Huning (173 gL, 1 mmol) e BOP (165 mg, 0,39 mmol) a temperatura ambiente. Após agitar por 5 minutos, a solução foi tratada com Me2NH (2 M em THF) (0,41 ml, 0,82 mmol). A progressão da reação foi monitorada por TLC (MeOH: DCM = 1:9 v/v). A reação foi parada após 2 horas, quando mais nenhum material primário estava visível por TLC. A mistura reagente foi particionada entre DCM: NaHCO3 (1:1) (50 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x30 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sob pressão reduzida. O produto cru 2f (R = NMe2) foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (10 g), usando um gradiente de DCM:EtOAc (8:2) (v/v) paraEtOAc como uma espuma amarela pálida (isômero A, 220 mg, 90% de rendimento).

[00113]A mesma reação foi realizada para 2e (isômero B, 249, mg)e forneceu o produto correspondente 2f (isômero B, 240 mg, 92% de rendimento).

[00114] O material primário 2f (mistura de isômero A e B) (455 mg, 0,61 mmol) foi dissolvido em THF (2 mL) e resfriado para 4 °C com banho de gelo. Depois, TBAF (1,0 M em THF, 5% de massa de água, 1,0 mL, 1,0 mmol) foi adicionado lentamente por um período de 5 min. A mistura reagente foi lentamente aquecida para temperatura ambiente.A progressão da reação foi monitorada por TLC (EtOAc).A reação foi parada após 1 hora, quando mais nenhum material primário estava visível por TLC.A solução reagente foi dissolvida em DCM (30 mL) e adicionada a NaHCO3 (30 mL).As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com DCM adicional (30 mLx2).As extrações orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4), filtradas e evaporadas, para fornecer um óleo amarelo. O produto cru 2g foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (10 g), usando um gradiente de DCM: EtOAc 8:2 (v/v) para EtOAc para MeOH: EtOAc (2:8) como um sólido branco (52% de rendimento, 160 mg).

[00115] O preparo dos trifosfatos correspondentes 2h e a ligação adicional de corante à nucleobase, para fornecer o nucleosídeo trifosfato totalmente funcional (ffN) 2i, foram reportados no WO 2004/018497 e são geralmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica.Exemplo 3Síntese de Nucleotídeos com grupo de proteção 3’-OH

[00116] O esquema 3 ilustra uma rota sintética para o preparo de nucleotídeos modificados com grupos de proteção azidometila difluormetil substituído 3’-OH. Os compostos 3a-3i emprega uma timina modificada (T-PA) como a base. Outros exemplos não limitadores das bases que podem ser usados incluem Cbz-PA, ADMF-PA e GPac-PA, as estruturas dos quais são mostradas acima no Esquema 1. O procedimento para a síntese de 3b, 3c e 3d foram descritos no Exemplo 2.

Procedimentos Experimentais

[00117] A uma solução do nucleosídeo primário 3d (isômero A) (490 mg, 0,7 mmol) e DBU (209 gL, 1,4 mmol) em DCM anidro (5 mL) foram adicionados lentamente uma solução de cloreto de N-terc-butila benzeno sulfinimidoila (181 mg, 0,84 mmol) em DCM anidro (2 mL) a - 78 °C. O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc : DCM 4:6 v/v). A reação foi parada após 2 horas, quando ainda havia 10% de material primário deixado por TLC, para prevenir a sobre reação. A mistura reagente foi particionada entre DCM:NaHCO3 (1:1) (50 mL). A camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x30 mL).As extrações orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4), filtradas, e evaporadas para fornecer um óleo amarelo. O produto cru 3e foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (10 g), usando um gradiente de éter de petróleo: EtOAc (8:2) (v/v) para éter de petróleo: EtOAc (2:8) (v/v) como uma espuma amarela pálida (isômero A, 250 mg, 51% de rendimento).

[00118] A mesma reação foi realizada para 3d (isômero B, 480 mg) e forneceu o produto correspondente 3e (isômero B, 240 mg, 50% de rendimento).

[00119] A uma solução do nucleosídeo primário 3e (isômero A) (342 mg, 0,49 mmol), EtOH (15 gL, 0,25 mmol) em DCM (2,5 mL) a 4 °C (banho de gelo). A mistura reagente foi agitada por 1h a 4°C. A progressão da reação foi monitorada por TLC (EtOAc: éter de petróleo = 3:7 v/v). A reação foi parada após 1 hora. A mistura reagente foi particionada entre DCM: NaHCO3 (1:1) (50 mL). A camada aquosa foi adicionalmente extraída em DCM (2x30 mL).As extrações orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4), filtradas e evaporadas, para fornecer um óleo amarelo. O produto cru 3f foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (10 g) usando um gradiente de éter de petróleo: EtOAc (9:1) (v/v) para éter de petróleo: EtOAc (2:8) (v/v) como uma espuma amarela pálida (isômero A, 100 mg, 28%).

[00120] A mesma reação foi realizada para 3e (isômero B, 480 mg) e forneceu o produto 3f correspondente (isômero B, 240 mg, rendimento 50%).

[00121] O material primário 3f (isômero A) (124 mg, 0,17 mmol) foi dissolvido em THF (2 mL) e resfriado para 4 °C com um banho de gelo. Depois, TBAF (1,0 M em THF, 5% de massa de água, 255 gL, 10,255 mmol) foi adicionado lentamente por um período de 5 min. A mistura reagente foi lentamente aquecido até temperatura ambiente. A progressão da reação foi monitorada por TLC (EtOAc).A reação foi parada após 1 hora, quando mais nenhum material primário estava visível por TLC.A solução de reação foi dissolvida em DCM (30 mL) e adicionada a NaHCO3 (30 mL).As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com DCM adicional (30 mL x2).As extrações orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4), filtradas, e evaporadas para fornecer um óleo amarelo. O produto cru 3g foi purificado por uma coluna de sílica gel Biotag (4 g) usando um gradiente de DCM: EtOAc 8:2 (v/v) para EtOAc para MeOH: EtOAc (2:8) como uma espuma amarela pálida (isômero A, 54% de rendimento, 44 mg).

[00122] Isômero A: 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): ô 2,24-2,35 (m, 2H, H-2’), 3,56-3,66 (m, 2H, H-5’), 3,96-4,00 (m, 1H, H-4’), 4,23 (s, 2H, CH2NH), 4,33-4,37 (m, 1H, H-3’), 4,85 (s, 2H, OCH2N3), 5,23 (t, J=5,1 Hz, 1H, 5’-OH), 6,07 (t, J=6,7 Hz, 1H, H-1’), 8,19 (s, 1H, H-6), 10,09 (br s, 1H, NH), 11,70 (br s, 1H, NH). 19F RMN: -74,4 (CF3), -131,6 (CH2F).

[00123] A mesma reação foi realizada para 3f (isômero B, 133 mg) e forneceu o produto correspondente 3g (isômero B, 48 mg, 54% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): ô 2,27-2,44 (m, 2H, H-2’), 3,58-3,67 (m, 2H, H-5’), 4,00-4,02 (m, 1H, H-4’), 4,24 (d, J=4,1 Hz, 2H, CH2NH), 4,57-4,58 (m,1H, H-3’), 5,24-5,29 (m, 2H, 5’-OH, OCHN3), 6,07-6,34 (m, 2H, H-1’, CHF2), 8,19 (s, 1H, H-6), 10,09 (br s, 1H, NH), 11,70 (br s, 1H, NH). 19F RMN: -74,2 (CF3), -131,4 (CH2F).

[00124] O preparo dos trifosfatos correspondentes 3h e a ligação adicional de corante à nucleobase para fornecer o nucleotídeo totalmente funcional (ffN) 3i foram reportados no WO 2004/018497 e são geralmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

Exemplo 4Teste de Estabilidade Térmica dos grupos de proteção 3’-OH

[00125] Uma variedade de grupos de proteção 3’-OH foram investigados a respeito de sua estabilidade térmica (FIG. 1A). A estabilidade térmica foi avaliada pelo aquecimento de 0,1 mM de cada nucleotídeo protegido por 3’-OH em um tampão de pH = 9 (tis-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, tween 0,05%, Mg2SO4 6mM) a 60 °C. Vários pontos temporais foram tomados e HPLC foi usado para analisar a formação de materiais desbloqueados. Descobriu-se que as estabilidades de -CH2F e -C(O)NHBu eram cerca de 2 vezes maior do que o grupo de proteção azidometila (-CH2N3) padrão. Descobriu-se que a estabilidade do grupo - CF2H era cerca de 10 vezes maior do que o padrão (FIG. 1B).

Exemplo 5Desproteção dos grupos de proteção 3’-OH

[00126] As taxas de reação de desproteção de diversos grupos de proteção 3’-OH foram também estudadas. A taxa de desproteção do grupo de proteção azidometila padrão foi comparada com o azidometila -CH2F substituída e azidometila -C(O)NHBu substituída. Foi observado que ambos os grupos de proteção 3’-OH mais termicamente estáveis foram removidos mais rápido do que o grupo de proteção azidometil padrão usando fosfinas (1mM THP) como o agente de desproteção. Ver FIG. 2A. Por exemplo, a meia vida de -CH2F e -C(O)NHBu foi de 8,9 minutos e 2,9 minutos, respectivamente, comparado com os 20,4 minutos de meia vida de azidometil (FIG. 2B).

Exemplo 6Teste de Sequenciamento

[00127] Nucleotídeos modificados com grupo de proteção 3’-OH azidometila -CH2F(mono-F) substituída foram preparados e seu desempenho de sequenciamento foi avaliado em plataformas Miseq. Foi previsto que estabilidade térmica aumentada de grupos de proteção 3’- OH levaria a uma qualidade mais alta de nucleotídeos para química de sequenciamento com nucleotídeos 3’-desbloqueados menos contaminados. A presença de nucleotídeos 3’-desbloqueados nos kits de sequenciamento SBS resultaria, portanto, em eventos de pré- faseamento, que foram numerados como valores de pré-faseamento.

[00128] Experimentos de sequenciamento de 12 ciclos curtos foram primeiro usados para gerar valores de faseamento e pré-faseamento.ffNs protegidos por azidometila mono-F substituídas foram usadas de acordo com as seguintes concentrações: ffA-corante 1 (2uM); ffT-corante 2 (10uM), ffC-corante 3 (2uM) e ffG-corante 4 (5uM). Grupo azidometila mono-F substituída compreende ambos isômeros A e B. Dois corantes - corante 2 como nos kits Miseq padrões e corante 5 foram usados para rotular ffT. A Tabela 1 mostra várias combinações de nucleotídeos com isômeros A e B de azidometila mono-F substituída, que foram avaliados em relação a impactos de faseamento e pré-faseamento. Em todos os casos, os valores de pré-faseamento foram substancialmente mais baixos do que o controle que os nucleotídeos de kits V2 Miseq padrões usaram (FIG. 3).Tabela 1.

Teste de Qualidade de Sequenciamento

[00129] Sequenciamento 2x400bp foi conduzido em Miseq para avaliar o potencial destes nucleotídeos para melhoria da qualidade de sequenciamento. O sequenciamento executado foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Illumina Inc., San Diego, CA). O tampão de incorporação padrão foi substituído por um tampão de incorporação contendo todos FFNs bloqueados por mono-F, cada um com um rótulo de corante separado: ffA-corante 1 (2uM), ffT-corante 2 (1uM), ffC-corante 3 (2uM) e ffG-corante 4 (5 uM). A biblioteca de DNA usada foi feita seguindo o protocolo TruSeq HT padrão de DNA genômico de B cereus.

[00130] Em ambos experimentos de sequenciamento (com isômero A e B mono-F bloqueado), valores de pré-faseamento muito baixos foram observados. Acompanhados de valores de faseamento baixos, a aplicação destes novos nucleotídeos gerou dados de sequenciamento 2x400bp superiores, com >80% de bases acima de Q30 em ambos os casos (ver FIG. 4A para a pontuação Q do isômero A e FIG. 4B para o quadro de pontuação Q do isômero B). Estes resultados demonstram uma grande melhoria comparada com kits Miseq v2 (2x250bp, 80% de bases >Q30 em experimentos de sequenciamento P&D típicos, ou 70% de bases > Q30, como as especificações determinaram). Como mostrado abaixo, a Tabela 2 sumariza os dados de sequenciamento quando usando todos isômeros A ffNs mono-F em IMX. A Tabela 3 sumariza os dados de sequenciamento usando todos isômeros B ffNs mono-F em IMX.Tabela 2.

Tabela 3.

Claims (15)

1.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, que compreende uma base de purina ou pirimidina e um grupamento de açúcar de ribose ou desoxirribose tendo um grupo de proteção 3’-hidroxi removível formando uma estrutura -O-C(R)2N3 ligada de forma covalente ao átomo 3’-carbono, caracterizada por que um de R é hidrogênio e o outro R é -CHF2, -CH2F, -CHCl2 ou - CH2Cl; ou um de R é hidrogênio e o outro R é -C(=O)NR4R5, em que cada R4 e R5 é selecionado a partir de hidrogênio ou alquil C1-6.

2.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que um de R é hidrogênio e o outro R é -CHF2 ou -CH2F.

3.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que um de R é hidrogênio e o outro R é -C(=O)NR4R5 e em que R4 é hidrogênio e R5 é alquil C1-6.

4.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizada por que R5 é n-butil.

5.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizada por que a molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo compreende um grupamento de desoxirribose.

6.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizada por que a molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo compreende uma 7-deaza purina.

7.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, caracterizada por que o grupo de proteção 3’-hidroxi é removido numa reação de desproteção com uma fosfina.

8.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizada por que a fosfina é tris(hidroximetil) fosfina (THP).

9.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizada por que a referida base é ligada a um marcador detectável através de um ligante clivável ou um ligante não clivável e em que o marcador detectável é um fluoróforo.

10.Molécula de Nucleotídeo ou Nucleosídeo Modificado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizada por que o referido grupo de proteção 3’-hidroxi é ligado a um marcador detectável através de um ligante clivável ou um ligante não clivável e em que o marcador detectável é um fluoróforo.

11.Método Para Preparar o Crescimento de Polinucleotídeo Complementar a Polinucleotídeo Alvo de Fita Simples em Reação de Sequenciação, que compreende a incorporação de uma molécula de nucleotídeo modificado conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10 no crescimento de polinucleotídeo complementar, caracterizado por que a incorporação do nucleotídeo modificado previne a introdução de qualquer nucleotídeo subsequente no crescimento do polinucleotídeo complementar.

12.Método Para Preparar o Crescimento de Polinucleotídeo Complementar em Polinucleotídeo Alvo de Fita Simples em Reação de Sequenciação, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a incorporação da molécula de nucleotídeo modificado é realizada por uma transferase terminal, uma polimerase terminal ou uma transcriptase reversa.

13.Método Para Determinar a Sequência de Polinucleotídeo Alvo de Fita Simples, caracterizado por que compreende monitorar a incorporação sequencial de nucleotídeos complementares, em que pelo menos um nucleotídeo complementar incorporado é uma molécula de nucleotídeo modificado conforme definida na Reivindicação 9 ou 10; e detectar a identidade da molécula de nucleotídeo modificado.

14.Método Para Determinar a Sequência de Polinucleotídeo Alvo de Fita Simples, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a identidade do nucleotídeo modificado é determinada através da detecção do marcador detectável ligado à base.

15.Kit, caracterizado por que compreende uma pluralidade de moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado conforme definidas em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10 e materiais de embalagem para os mesmos.

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