KR20240050459A - 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법 - Google Patents

표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법 Download PDF

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KR20240050459A
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밍수안 장
슈앙 저우
샤오주안 롱
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후이 지앙
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엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디.
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Abstract

본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 완전 중합은 뉴클레오티드 혼합물과 중합효소의 여러 번 중합을 통해 달성되며, 중합 반응이 수행되는 동안 마커가 검출된다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 분석하거나 서열분석하는 데 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다.

Description

표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법
본 발명은 효율적이고 충분한 중합을 달성하기 위해 뉴클레오티드 혼합물과 중합효소를 여러 번 중합하는 단계 및 중합 반응을 수행하는 동안 표지(label)를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드(target polynucleotide) 서열을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 분석하거나 서열분석하는 데 사용될 수 있는 키트(kit)에 관한 것이다.
합성에 의한 서열분석(SBS)이 상업적 주류인 고처리량 서열분석은 주로 가역적 종결 및 형광 표지가 있는 DNA 중합효소와 뉴클레오티드를 사용하여 DNA 서열을 식별한다. 이는 한 번에 수십만 내지 수백만 개의 DNA 분자를 병렬로 서열분석할 수 있으며, 높은 처리량, 빠른 검출 속도, 유연성 및 다양성, 및 저렴한 비용과 같은 장점을 갖는다.
현재, 합성에 의한 특정 서열분석 과정은 증폭 또는 롤링 서클 복제를 사용하여 많은 수의 DNA 주형을 생성한 다음, 특정 서열분석 프라이머(primer)를 고정하고 DNA 중합효소와 형광 표지된 뉴클레오티드를 반응 시스템에 동시에 첨가하거나 DNA 중합효소와 형광 표지된 뉴클레오티드 및 비형광 변형된 뉴클레오티드의 혼합물을 반응 시스템에 동시에 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 dNTP의 3'-OH는 보호되고, 따라서 한 번에 하나의 dNTP만이 첨가될 수 있다. dNTP가 첨가될 때마다, DNA 쇄의 복제 반응이 정지되고, 이어서 형광 신호가 여기되어 수집된 다음, 화학적 시약을 첨가하여 형광 신호를 소멸시키고, 다음 라운드 서열분석 반응이 수행될 수 있도록 dNTP 3'-OH 보호 그룹이 제거된다.
그러나, 이 서열분석 기술은 특히 높은 합성 효율을 필요로 한다. 여러 사본 간의 불완전한 합성은 신호 혼란을 유발하여 서열분석 정확도와 서열분석 판독 길이에 영향을 미친다. 이는 현재 2세대 서열분석이 직면한 주요 기술적 문제 중 하나이기도 하다. 사람들이 더 짧은 서열분석 시간과 더 많은 처리량을 요구함에 따라 중합효소의 반응 효율이 제한되고, 특히 형광성 그룹이 있는 뉴클레오티드의 중합 능력이 제한되며, 이들은 중합 효율이 서열분석 품질에 영향을 미치게 한다. 중합 효율이 서열분석 속도를 따라가지 못하면, 여러 사본에서 불완전한 중합이 발생하고, 이는 서열분석 동안 신호 혼란을 유도하고, 따라서 서열분석의 판독 길이와 정확도를 제한된다.
따라서, 전체 반응 시간을 늘리지 않고 보다 효율적인 반응 및 서열분석 효과를 달성하여 서열분석의 판독 길이 및 정확도를 향상시키는 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 신호를 수집하면서 뉴클레오티드를 중합하는 용액을 제공함으로써, 중합 효율을 개선하고 전체 반응 시간의 변화 없이 보다 효율적인 중합 효율을 달성한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 출원은
(a) 표적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(b) 혼성화(hybridization) 또는 어닐링(annealing)을 허용하는 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 프라이머와 접촉시켜 표적 폴리뉴클레오티드와 성장 쇄(growing chain)로서 사용되는 프라이머를 포함하는 부분 이중체(partial duplex)를 형성하는 단계;
(c) 중합효소가 뉴클레오티드 중합 반응을 수행하도록 허용하는 조건 하에 부분 이중체를 중합효소 및 제1 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시켜 성장 쇄를 연장하는 단계로서, 여기서 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 표지로 표지된 적어도 한 종류의 뉴클레오티드를 포함하고,　
상기 제1 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티(moiety)에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 단계;
(d) 중합효소가 뉴클레오티드 중합 반응을 수행하도록 허용하는 조건 하에 이전 단계의 생성물을 중합효소 및 제2 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시켜 성장 쇄를 연장하는 단계로서, 여기서 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 적어도 하나(예: 1, 2, 3 또는 4개)의 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 비가역적 차단 뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드와 비가역적 차단 뉴클레오티드의 조합을 포함하고;
상기 제2 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 단계; 및
사진 중합 용액(photographic polymerization solution)을 제공하고, 이를 제2 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시키고, 사진 중합 반응을 통해 단계 (c)의 생성물에서 표지의 존재를 검출하는 단계;
(e) 이전 단계의 생성물에 함유된 보호 그룹 및 표지를 제거하는 단계;
(f) 임의로, 단계 (c) 내지 (e)를 한 번 이상 반복하는 단계를 포함하고;
이로 인해, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 정보를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하기 위한 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 사진 중합 용액은 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 계면활성제 및 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 사진 중합 용액은 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 핵산 혼성화를 위한 시약(예: 염화나트륨), Mg2 + 함유 염, 계면활성제 및 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약과 같은 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (c)에서, 연장은 표적 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하는 연장이다. 특정 구현예에서, 연장은 하나의 뉴클레오티드의 연장이다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 혼합물은 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드 또는 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (d)에서, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 적어도 한 종류의 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (d)에서, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드, 및 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 각각 독립적으로 동일하거나 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 발광 표지(예: 형광 표지)이다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 각각 독립적으로 쿠마린, 알렉사플루오르(AlexaFluor), 바디피(Bodipy), 플루오레세인, 테트라메틸로다민, 페녹사진, 아크리딘, Cy5, Cy3, AF532, 텍사스 레드(Texas Red) 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 구현예에서, 핵산 분자의 연장 생성물은 DNA이다.
특정 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물(예: 동물, 식물, 진균), 원핵생물(예: 박테리아, 악티노마이세트(actinomycete)), 바이러스, 파지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 샘플로부터 수득된다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 A, T, C, G 및 U로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 A, T, C, G이다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 A, T, C, G, U로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 각각 A, T, C, G이다.
특정 구현예에서, 비가역적 차단 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지 뉴클레오티드로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우; 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나;
제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 광 신호를 검출하기 위한 사진 촬영은 단계 (d)에서 중합 반응이 수행되는 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 완충액 시약은 트리즈마 염기, 트리스(하이드록시메틸)메틸글리신(TRICINE), N,N-디하이드록시에틸글리신(BICINE), 트리스(하이드록시메틸)메틸아미노프로판 설폰산(TAPS) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 핵산 혼성화를 위한 시약은 염화나트륨, 염화칼륨, 칼륨 아세테이트 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, Mg2 + 함유 염은 황산마그네슘, 염화마그네슘, 질산마그네슘, 크롬산마그네슘 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 계면활성제는 10% 트윈 20, 트윈 80, 라우레스(brij-35), 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르(트린톤 X-100), 에틸페닐 폴리에틸렌 글리콜(NP-40), 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 나트륨 아스코르베이트, 디티오트레이톨(DTT), 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산(트롤록스), 아스코르브산 유도체(예: 나트륨 아스코르빌 포스페이트, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코사이드, 아스코르빌 팔미테이트, 테트라에틸데카놀 아스코르빌, 아스코르빌 메틸실란올 펙틴산 에스테르, 3-O-에틸 아스코르브산), 환원된 글루타티온(GSH), N,N '-디메틸티오우레아(DMTU), 암모늄 피롤리딘 디티오카바메이트(APDTC), 스페르미딘, 스페르미딘 트리하이드로클로라이드, 요산, 나트륨 피루베이트, L-시스테인, β-머캅토에틸아민, 시스타민 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 나트륨 아스코르베이트 또는 환원된 글루타티온으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현에에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 환원된 글루타티온(GSH) 및 디티오트레이톨(DTT) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현에에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 환원된 글루타티온(GSH)이다.
제2 양태에서, 본 출원은 키트를 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
(a) 제1 뉴클레오티드 혼합물로서, 여기서 제1 뉴클레오티드 혼합물이 표지로 표지된 적어도 한 종류의 뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제1 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 제1 뉴클레오티드;
(b) 제2 뉴클레오티드 혼합물로서, 여기서 제2 뉴클레오티드 혼합물이 적어도 하나(예: 1, 2, 3 또는 4개)의 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 비가역적 차단 뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드와 비가역적 차단 뉴클레오티드의 조합을 포함하고;
상기 제2 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 제2 뉴클레오티드 혼합물;
(c) 사진 중합 용액.
특정 구현예에서, 사진 중합 용액은 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 계면활성제 및 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 사진 중합 용액은 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 핵산 혼성화를 위한 시약(예: 염화나트륨), Mg2 + 함유 염, 계면활성제 및 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 상보적인 프라이머, 핵산 증폭 완충액, 효소(예: 핵산 중합효소)를 위한 작업 완충액, 물 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 서열분석 슬라이드, 뉴클레오티드 상의 보호 그룹 및 표지를 제거하기 위한 시약으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 폴리뉴클레오티드를 분석하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 키트는 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 혼합물은 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드 또는 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지 뉴클레오티드로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나;
상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 여기서 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드, 및 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 여기서 제2 뉴클레오티드 혼합물은 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 여기서 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 각각 독립적으로 동일하거나 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 발광 표지(예: 형광 표지)이다.
특정 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지, 제3 표지 및 제4 표지는 각각 독립적으로 쿠마린, 알렉사플루오르, 바디피, 플루오레세인, 테트라메틸로다민, 페녹사진, 아크리딘, Cy5, Cy3, AF532, EF700, 텍사스 레드 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 구현예에서, 핵산 분자의 연장 생성물은 DNA이다.
특정 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물(예: 동물, 식물, 진균), 원핵생물(예: 박테리아, 악티노마이세트), 바이러스, 파지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 샘플로부터 수득된다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 A, T, C, G 및 U로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제3 뉴클레오티드 및 제4 뉴클레오티드는 각각 A, T, C, G이다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 A, T, C, G, U로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드는 각각 A, T, C, G이다.
특정 구현예에서, 비가역적 차단 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 광 신호를 검출하기 위한 사진 촬영은 단계 (d)에서 중합 반응이 수행되는 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 완충액 시약은 트리즈마 염기, 트리스(하이드록시메틸)메틸글리신(TRICINE), N,N-디하이드록시에틸글리신(BICINE), 트리스(하이드록시메틸)메틸아미노프로판 설폰산(TAPS) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 핵산 혼성화를 위한 시약은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, Mg2 + 함유 염은 황산마그네슘, 염화마그네슘, 질산마그네슘, 크롬산마그네슘 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 계면활성제는 10% 트윈 20, 트윈 80, 라우레스(brij-35), 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르(트린톤 X-100), 에틸페닐 폴리에틸렌 글리콜(NP-40), 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 나트륨 아스코르베이트, 디티오트레이톨(DTT), 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산(트롤록스), 아스코르브산 유도체(예: 나트륨 아스코르빌 포스페이트, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코사이드, 아스코르빌 팔미테이트, 테트라에틸데카놀 아스코베이트, 아스코르빌 메틸실란올 펙틴산 에스테르, 3-O-에틸 아스코르브산, 환원된 글루타티온(GSH), N,N '-디메틸티오우레아(DMTU), 암모늄 피롤리딘디티오카바메이트(APDTC), 스페르미딘, 스페르미딘 트리하이드로클로라이드, 요산, 나트륨 피루베이트, L-시스테인, β-머캅토에틸아민, 시스타민 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 나트륨 아스코르베이트 또는 환원된 글루타티온(GSH)이다.
하나의 구현에에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 환원된 글루타티온(GSH) 및 디티오트레이톨(DTT) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현에에서, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약은 환원된 글루타티온(GSH)이다.
용어 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 특허, 출원 및 기타 간행물은 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 모순되거나 일치하지 않는 정도로, 본원에 제시된 정의가 우선한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 등을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나, 단일 가닥 서열 및 이중 가닥 서열을 모두 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 형태(예: 게놈 DNA, PCR 및 증폭 생산물 등)로부터 유래될 수 있거나, 단일 가닥 형태의 DNA(ssDNA) 또는 RNA로부터 유래될 수 있고, dsDNA 형태로 변환될 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 정확한 서열은 공지될 수 있거나 공지되지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예시적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예: 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 수송체 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA 및 전술한 서열 중 임의의 것의 핵산 프로브, 프라이머 또는 증폭 사본.
폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 일반적으로 사카라이드(예: 리보스 또는 데옥시리보스), 염기 및 적어도 하나의 포스페이트 그룹을 함유한다. 뉴클레오티드는 무염기성(즉, 염기 결여)일 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 당-포스페이트 백본 뉴클레오티드 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는, 예를 들어, 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함한다. 변형된 염기를 함유하는 뉴클레오티드 유사체도 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 함유될 수 있는 예시적인 변형된 염기는, 천연 백본 또는 유사한 구조를 갖든, 예를 들어, 이노신, 크사닌, 하이포크사닌, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, 2-프로필구아닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로겐화 우라실, 15-할로겐화 시토신, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 6-아조우라실, 6-아조시토신, 6-아조티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로겐화 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노아데닌 또는 구아닌, 8-티오아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록시아데닌 또는 구아닌, 5-할로겐화 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데자구아닌, 7-데자아데닌, 3-데자구아닌, 3-데자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어, 아데노신 5'-포스포릴 설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 없다.
일반적으로, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 A, C, G, T 또는 U를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 A"는 아데닌(A)을 함유하는 뉴클레오티드 또는 이의 변형 또는 유사체, 예를 들어, ATP, dATP를 지칭한다. "뉴클레오티드 G"는 구아닌(G)을 함유하는 뉴클레오티드 또는 이의 변형 또는 유사체, 예를 들어, GTP, dGTP를 지칭한다. "뉴클레오티드 C"는 시토신(C)을 함유하는 뉴클레오티드 또는 이의 변형 또는 유사체, 예를 들어, CTP, dCTP를 지칭한다. "뉴클레오티드 T"는 티민(T)을 함유하는 뉴클레오티드 또는 이의 변형 또는 유사체, 예를 들어, TTP, dTTP를 지칭한다. "뉴클레오티드 U"는 우라실(U)을 함유하는 뉴클레오티드 또는 이의 변형 또는 유사체, 예를 들어, UTP, dUTP를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "디데옥시뉴클레오티드"는 2',3'-디데옥시뉴클레오티드로서 공지되기도 한 리보스의 2'- 및 3'-탄소에서 탈산소화된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 디데옥시뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 A, C, G, T 또는 U를 포함한다. 용어 "디데옥시뉴클레오티드 A"는 아데닌(A)을 함유하는 디데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 예를 들어, ddATP를 지칭한다. "디데옥시뉴클레오티드 G"는 구아닌(G)을 함유하는 디데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 예를 들어, ddGTP를 지칭한다. "디데옥시뉴클레오티드 C"는 시토신(C)을 함유하는 디데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 예를 들어, ddCTP를 지칭한다. "디데옥시뉴클레오티드 T"는 티민(T)을 함유하는 디데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 예를 들어, ddTP를 지칭한다. "디데옥시뉴클레오티드 U"는 우라실(U)을 함유하는 디데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 예를 들어, ddUTP를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, ddNTP는 디데옥시아데노신 트리포스페이트(ddATP), 디데옥시구아노신 트리포스페이트(ddGTP), 디데옥시시티딘 트리포스페이트(ddCTP), 디데옥시우리딘 트리포스페이트(ddUTP), 디데옥시티미딘 트리포스페이트(ddTTP) 또는 이의 둘 이상의 조합 중 하나를 지칭하고, 여기서 디데옥시우리딘 트리포스페이트 및 디데옥시티미딘 트리포스페이트는 동시에 나타나지 않는다.
본원에 사용된 용어 "표지"는 특정 조건 하에 발광 신호를 방출할 수 있는 그룹을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발광 표지"는 적절한 여기 파장에 의해 여기될 때 특정 방출 파장에서 형광을 방출할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 이러한 발광 표지는, 예를 들어, 상이한 발광 동역학을 유발하는 생화학발광 표지 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 화학발광 표지일 수 있으며, 예를 들어, 화학발광 표지는 상이한 발광 동역학을 유발하는 루시퍼라제 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고; 이러한 발광 표지는, 예를 들어, 쿠마린, 알렉사플루오르, 바디피, 플루오레세인, 테트라메틸로다민, 페녹사진, 아크리딘, Cy5, Cy3, EF700, AF532, 텍사스 레드 및 이들의 유도체 등으로부터 선택된 형광단일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보호 그룹"은 중합효소(해당 그룹을 함유하는 뉴클레오티드를 합성 중인 폴리뉴클레오티드 쇄에 혼입함)가 해당 그룹을 함유하는 뉴클레오티드가 합성 중인 폴리뉴클레오티드 쇄에 혼입된 후 또 다른 뉴클레오티드의 혼입을 연속적으로 촉매하는 것을 방지하는 그룹을 지칭한다. 이러한 보호 그룹은 본원에서 3'-OH 보호 그룹으로 지칭되기도 한다. 이러한 보호 그룹을 함유하는 뉴클레오티드는 본원에서 3'-차단된 뉴클레오티드로 지칭되기도 한다. 보호 그룹은 보호 그룹이 또 다른 뉴클레오티드 분자가 폴리뉴클레오티드 쇄에 첨가되는 것을 방지하고 폴리뉴클레오티드 쇄를 손상시키지 않고 뉴클레오티드의 당 부분으로부터 쉽게 제거되는 한 뉴클레오티드에 첨가될 수 있는 임의의 적합한 그룹일 수 있다. 또한, 보호 그룹으로 변형된 뉴클레오티드는 중합효소 또는 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 쇄에 혼입하는 데 사용되는 기타 적절한 효소에 대한 내성이 있어야 한다. 따라서, 이상적인 보호 그룹은 장기적인 안정성을 보이고, 중합효소에 의해 효율적으로 혼입될 수 있으며, 뉴클레오티드의 2차 혼입 또는 추가 혼입을 방지하고, 온화한 조건, 바람직하게는 수성 조건 하에 폴리뉴클레오티드 구조를 손상시키지 않고 제거될 수 있다.
종래 기술에는 상기 설명에 부합하는 다양한 보호 그룹이 기재되어 있다. 예를 들어, WO91/06678은 3'-OH 보호 그룹이 에스테르 및 에테르, -F, -NH2, -OCH3, -N3, -OPO3, -NHCOCH3, 2-니트로벤젠 카보네이트, 2,4-설페닐디니트로 및 테트라하이드로푸란 에테르를 포함한다고 개시한다. 문헌[Metzker et al. (Nucleic Acids Research, 22(20):4259-4267, 1994)]은 8개의 3'-변형된 2-데옥시리보뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트(3'-변형된 dNTP)의 합성 및 적용을 개시한다. WO2002/029003은 중합효소 반응에서 성장하는 DNA 쇄에 3'-OH 그룹을 캡핑하기 위한 알릴 보호 그룹의 사용을 기재한다. 바람직하게는, 예를 들어, WO2014139596의 도 1A의 예시적인 보호 그룹 및 청구범위에 명시된 3'-하이드록실 보호 그룹(즉, 보호 그룹) 및, 예를 들어, WO2004/018497의 도 3 및 도 4에 예시된 보호 그룹 및 청구범위에 명시된 보호 그룹을 포함하여 국제 출원 공보 WO2014139596 및 WO2004/018497에 보고된 다양한 보호 그룹이 사용될 수 있다. 상기 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "가역적 차단 그룹"은 합성 중인 폴리뉴클레오티드 쇄에 혼입될 때, 중합효소가 다음 라운드의 중합으로 진행할 수 없게 하여 중합 반응을 종결시키는 그룹을 지칭하고, 이 경우에, 중합의 각 라운드에서, 하나 및 하나의 염기만이 성장하는 핵산 쇄에 혼입되고; 또한, 이 그룹은 제거될 수 있으며, 이후 성장하는 핵산 쇄는 다음 라운드의 중합을 거칠 수 있고, 염기가 다시 도입된다. 가역적 차단 그룹의 예는 3'-OH의 H가 에스테르, 에테르, -F, -NH2, -OCH3, -N3, -OPO3, -NHCOCH3, 2-니트로벤젠 카보네이트, 2,4-설페닐디니트로 및 테트라하이드로푸란 에테르 -CH2-CH=CH2, S-S로 치환되거나, 염기가 큰 입체 방해 그룹 및 형광 그룹으로 차단되고 S-S를 통해 형광에 연결된 경우이다.
본원에 사용된 용어 "비가역적 차단 뉴클레오티드"는 합성 중인 폴리뉴클레오티드 쇄에 혼입시, 차단 효과로 인해 후속 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 쇄로의 후속 혼입을 방지하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 그리고, 이 차단 효과는 비가역적이다. 비가역적 차단 뉴클레오티드는 일반적으로 디데옥시뉴클레오티드, 또는 3'-OH가 3' 말단에서 메톡시 그룹(3'-OMe 또는 3'-OCH3)으로 교체된 뉴클레오티드 및 3'-말단 아지드(3'-N3)와 3'-말단 에톡시(3'-OEt, 3'-OCH2CH3)를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
서열분석에서, 본 발명은 더 높은 중합 효율을 달성하기 위해 신호를 수집하면서 뉴클레오티드를 중합시키기 위한 기술적 해결책을 제공하고, 여기서 상기 해결책은 신호 수집 동안 추가 라운드의 중합 반응을 신호를 수집하면서 수행할 수 있도록 최적화되고, 중합된 뉴클레오티드는 형광 변형을 갖지 않고 차단 그룹만을 보유하는 뉴클레오티드, 바람직하게는 가역적 차단 그룹으로 변형된 뉴클레오티드, 비가역적 차단 뉴클레오티드, 또는 둘의 혼합물이 뒤따르며, 이는 중합 효율을 향상시키고, 서열분석의 전체 반응 시간을 크게 단축시키며, 보다 효율적인 중합 효율을 달성한다.
도 1은 합성에 의해 이. 콜리(E. coli) DNA를 서열분석하기 위한 대조군 및 실험 그룹의 흐름도를 보여준다.
도 2는 대조군 1과 실험 그룹의 각 사이클에 대한 Q30(%) 비율 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 Q30(%) 비율이다.
도 3은 대조군 1과 실험 그룹의 각 사이클에 대한 서열분석 오차율(%) 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 서열분석 오차율(%)이다.
도 4는 대조군 1과 실험 그룹의 각 사이클에 대한 지연(%) 비율 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 지연(%) 비율이다.
도 5는 대조군 2와 실험 그룹 4의 각 사이클에 대한 Q30(%) 비율 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 Q30(%) 비율이다.
도 6은 대조군 2와 실험 그룹 4의 각 사이클에 대한 서열분석 오차율(%) 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 서열분석 오차율(%)이다.
도 7은 대조군 2와 실험 그룹 4의 각 사이클에 대한 지연(%) 비율 결과를 보여준다. 이 중, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클의 지연(%) 비율이다.
본 발명은 이제, 본 발명을 예시하기 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아닌 다음 실시예를 참조하여 기재될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 분자 생물학 실험 방법은 기본적으로 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, 차가운 Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and F. M. Ausubel et al., Compiled Experimental Guide to Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]을 참조한다. 당업자는 실시예가 본 발명을 예로서 기재하고, 본 발명이 보호하고자 하는 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해할 것이다.
1. 실시예에 사용된 주요 장비: MGISEQ-2000RS 서열분석기, MGIDL-200H 로더, MGISEQ-2000RS 서열분석 슬라이드, MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 시약 세트, MGISEQ-200RS 서열분석기, MGISEQ-200RS 고처리량 서열분석 시약 세트, MGISEQ-200RS 서열분석 슬라이드.
2. 실시예에 사용된 주요 시약은 아래 표 1에 제시되어 있다:
[표 1]
실시예 1
이 실시예에서, 다양한 시약을 미리 제조했다.
1) 뉴클레오티드 혼합물 용액 1의 제조
아래 표 2에 제시된 바와 같이, 뉴클레오티드 혼합물 용액 1의 모든 뉴클레오티드는 가역적 차단 그룹만을 가지고 있었으며, 여기서 A, T, G 및 C는 각각 아데닌 뉴클레오티드, 티민 뉴클레오티드, 구아닌 뉴클레오티드 및 시토신 뉴클레오티드였다.
[표 2]
이 중, 차가운 dATP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 아데닌 뉴클레오티드를 지칭하고, 차가운 dTTP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 티민 뉴클레오티드를 지칭하고, 차가운 dGTP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 구아닌 뉴클레오티드를 지칭하고, 차가운 dCTP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 시토신 뉴클레오티드를 지칭한다.
2) 뉴클레오티드 혼합물 용액 2의 제조
아래 표 3에 제시된 바와 같이, 뉴클레오티드 혼합물 용액 2의 모든 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드이고, 여기서 ddATP는 아데닌 트리포스페이트 디데옥시뉴클레오티드를 지칭하고, ddTTP는 티민 트리포스페이트 디데옥시뉴클레오티드를 지칭하고, ddGTP는 구아닌 트리포스페이트 디데옥시뉴클레오티드를 지칭하고, ddCTP는 시토신 트리포스페이트 디데옥시뉴클레오티드를 지칭한다.
[표 3]
3) 뉴클레오티드 혼합물 용액 3의 제조
아래 표 4에 제시된 바와 같이, 뉴클레오티드 혼합물 용액 3의 모든 뉴클레오티드는 가역적 차단 그룹만을 가지고 있었으며, 여기서 A, T 및 C는 각각 아데닌 뉴클레오티드, 티민 뉴클레오티드 및 시토신 뉴클레오티드였다.
[표 4]
이 중, 차가운 dATP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 아데닌 뉴클레오티드를 지칭하고, 차가운 dTTP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 티민 뉴클레오티드를 지칭하고, 차가운 dCTP는 가역적 차단 그룹으로만 변형된 시토신 뉴클레오티드를 지칭한다.
4) 사진 중합 용액 1의 제조
아래 표 5에 따르면, 사진 중합 용액 1을 제조하고, NaOH와 HCl을 사용하여 pH 8.7로 조정하고, 추후 사용을 위해 잘 혼합하였다.
[표 5]
5) 사진 중합 용액 2의 제조
표 6에 따르면, 사진 중합 용액 2를 제조하고, NaOH와 HCl을 사용하여 pH 8.7로 조정하고, 추후 사용을 위해 잘 혼합하였다.
[표 6]
6) 사진 중합 용액 3의 제조
표 7에 따르면, 사진 중합 용액 3을 제조하고, NaOH와 HCl을 사용하여 pH 8.7로 조정하고, 추후 사용을 위해 잘 혼합했다.
[표 7]
7) 사진 용액의 제조
표 8에 따라, 사진 용액을 제조하고, NaOH와 HCl을 사용하여 pH 8.2로 조정하고, 추후 사용을 위해 잘 혼합하였다.
[표 8]
8) 사진 중합 용액 4의 제조
표 9에 따르면, 사진 중합 용액 4를 제조하고, NaOH와 HCl을 사용하여 pH 8.7로 조정하고, 추후 사용을 위해 잘 혼합하였다.
[표 9]
실시예 2
다음의 모든 실험에서, 이. 콜리 단일 가닥 원형 DNA를 주형으로 사용하였고, MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하여 후속 서열분석을 위해 칩에 로딩된 DNA 나노구체의 제조를 완료했다.
이 실시예에서 언급된 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹 변형과 Cy5 형광 변형이 모두 있는 아데닌 뉴클레오티드를 지칭하는 dATP-1; 가역적 차단 그룹 변형과 ROX 형광 변형이 모두 있는 티민 뉴클레오티드를 지칭하는 dTTP-1; 가역적 차단 그룹 변형과 Cy3 형광 변형이 모두 있는 구아닌 뉴클레오티드를 지칭하는 dGTP-1; 가역적 차단 그룹 변형과 EF700 형광 변형이 모두 있는 시토신 뉴클레오티드를 지칭하는 dCTP-1을 포함했다. (상이한 플랫폼으로, 형광 변형과 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 다양할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹 또는 다른 유형의 변형이 있는 뉴클레오티드만이 혼입될 수 있다.)
대조군 1: MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 키트 내 #10 웰 시약을 제거하고, 상기 제조된 바와 같은 사진 중합 용액으로 교체했다. 도 1에 도시된 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행했다. 즉, 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음, 용출 시약으로 유리 뉴클레오티드를 용출시키고, 사진 용액 하에 신호를 수집하고, 절제 시약으로 보호 그룹을 제거하고, 용출 시약을 사용하여 세척 단계를 수행했다. 그런 다음, 각 사이클의 Q30 감소율과 각 사이클의 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
실험 그룹 1 : MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음, 유리 뉴클레오티드를 용출 시약으로 용출시킨 다음, 키트 내 #10 웰 시약을 제거하고 본 발명의 사진 중합 용액 1로 교체하여 중합 보충이 수행되는 동시에 신호가 수집될 수 있도록 하였다. 이때, 중합된 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹으로 변형된 뉴클레오티드였고, 대조군과 동일한 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행하였다. 그런 다음, 각 사이클에 대한 Q30 감소율과 각 사이클에 대한 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
실험 그룹 2: MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 형광 변형 및 가역적 차단을 가진 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음, 유리 뉴클레오티드를 용출 시약으로 용출시킨 다음, 키트 내 #10 웰 시약을 제거하고 본 발명의 사진 중합 용액 2로 교체하여 중합 보충이 수행되는 동시에 신호가 수집될 수 있도록 하였다. 이때, 중합된 뉴클레오티드 혼합물 용액은 디데옥시뉴클레오티드였고, 대조군과 동일한 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행하였다. 그런 다음, 각 사이클에 대한 Q30 감소율과 각 사이클에 대한 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
실험 그룹 3: MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음, 유리 뉴클레오티드를 용출 시약으로 용출시킨 다음, 키트 내 #10 웰 시약을 제거하고 본 발명의 사진 중합 용액 3으로 교체하여 중합 보충이 수행되는 동시에 신호가 수집될 수 있도록 하였다. 이때, 중합된 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹 변형된 뉴클레오티드와 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물 용액이었고, 대조군과 동일한 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행하였다. 그런 다음, 각 사이클에 대한 Q30 감소율과 각 사이클에 대한 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
결과: 도 2 내지 도 4 및 아래 표 10 내지 12에 제시된 바와 같이, 도 2는 상기 조건에 상응하는 각 서열분석 사이클에 대한 Q30(%) 비율 결과를 나타냈고, 여기서 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 Q30(%) 비율이었다. 도 3은 상기 조건 하에 서열분석 오차율(%) 결과를 나타냈고, 여기서 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 서열분석 오차율(%)이었다. 도 4는 상기 조건에 상응하는 각 서열분석 사이클에 대한 지연(%) 비율 결과를 나타냈고, 여기서 지연은 서열분석 반응이 완료되는지 여부를 측정하는 데 사용되는 지표이며, 서열분석이 N 위치까지 진행될 때 N-1 위치에 반응하는 일부 사본의 비율을 지칭하며, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 지연(%) 비율이었다.
각 사이클에 대한 Q30(%) 감소율이 작을수록, 서열분석 오차율(%)이 낮고, 지연 증가율(%)이 낮을수록 서열분석 품질이 더 우수하고 더 안정적임을 나타낸다. 표 10에 제시된 바와 같이, 대조군은 50사이클 후 가장 큰 Q30(%) 감소를 보였으며, 이는 모든 실험 그룹보다 나빴다. 실험 그룹 1은 실험 그룹 3보다 약간 더 우수했고, 실험 그룹 3은 실험 그룹 2보다 약간 더 우수했다. 표 11에 제시된 바와 같이, 대조군은 모든 실험 그룹보다 상당히 더 높은 오차율을 나타냈으며, 여기서 실험 그룹 1은 실험 그룹 3보다 약간 더 우수했고, 실험 그룹 3은 실험 그룹 2보다 약간 더 우수했다. 표 12에 제시된 바와 같이, 대조군은 50사이클 이후 모든 실험 그룹보다 유의하게 더 높은 지연 증가율(%)을 보였으며, 실험 그룹 간에는 유의미한 차이가 없었다.
[표 10]
[표 11]
[표 12]
실시예 3
다음의 모든 실험에서, 이. 콜리 단일 가닥 원형 DNA를 주형으로 사용하였고, MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하여 후속 서열분석을 위해 칩에 로딩된 DNA 나노구체의 제조를 완료했다.
이 실시예에서 언급된 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹 변형과 Cy3 및 Cy5 형광 변형이 모두 있는 아데닌 뉴클레오티드를 지칭하는 dATP-1; 가역적 차단 그룹 변형과 Cy5 형광 변형이 모두 있는 티민 뉴클레오티드를 지칭하는 dTTP-1; 가역적 차단 그룹 변형만이 있는 구아닌 뉴클레오티드를 지칭하는 dGTP-1; 및 가역적 차단 그룹 변형과 Cy3 형광 변형이 모두 있는 시토신 뉴클레오티드를 지칭하는 dCTP-1을 포함했다. (상이한 플랫폼으로, 형광 변형과 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 다양할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 그룹 뉴클레오티드 또는 다른 유형의 변형만이 혼입될 수 있다.)
대조군 2: MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 키트의 #18 웰 시약을 제거하고, 상기 제조된 사진 용액으로 교체하고, 도 1의 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행했다. 간단히 말해, 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음, 용출 시약으로 유리 뉴클레오티드를 용출시키고, 사진 용액 하에 신호를 수집하고, 절제 시약을 사용하여 보호 그룹을 제거하고, 용출 시약을 사용하여 세척을 수행했다. 그런 다음, 각 사이클에 대한 Q30 감소율과 각 사이클에 대한 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
실험 그룹 4: MGISEQ-2000RS 고처리량 서열분석 키트를 사용하고, 형광 변형 및 가역적 차단이 있는 뉴클레오티드 혼합물 용액은 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 연속적으로 중합을 거친 다음(대조군 2와 동일), 유리 뉴클레오티드를 용출 시약으로 용출시킨 다음, 키트의 #18 웰 시약을 제거하고 본 발명의 사진 중합 용액 4로 교체하여 중합 보충이 수행되는 동시에 신호가 수집될 수 있도록 하였다. 이때, 중합된 뉴클레오티드 혼합물 용액은 가역적 차단 변형 뉴클레오티드였고, 대조군 2와 동일한 실험 과정에 따라 MGISEQ-2000RS 서열분석 플랫폼에서 SE50 서열분석을 수행하였다. 그런 다음, 각 사이클에 대한 Q30 감소율과 각 사이클에 대한 서열분석 오차율 곡선을 계산하여 서열분석 품질을 평가했다.
결과: 도 5 내지 도 7 및 아래 표 13 내지 15에 제시된 바와 같이, 도 5는 상기 조건에 상응하는 각 서열분석 사이클에 대한 Q30(%) 비율 결과를 나타냈으며, 여기서 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 Q30(%) 비율이었다. 도 6은 상기 조건 하에 서열분석 오차율(%) 비율 결과를 나타냈으며, 여기서 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 서열분석 오차율(%) 비율이었다. 도 7은 상기 조건에 상응하는 각 서열분석 사이클에 대한 지연(%) 비율을 나타냈으며, 여기서 지연은 서열분석 반응이 완료되는지 여부를 측정하는 지표이며, 이는 서열분석이 위치 N으로 진행할 때 단지 위치 N-1에만 반응한 이의 사본의 비율을 지칭하며, 횡축은 서열분석 사이클 수이고, 종축은 각 사이클에 대한 지연(%) 비율이었다.
사이클당 Q30(%) 감소가 작을수록 서열분석 오차율(%)이 낮고, 지연 증가율 (%)이 낮을수록 서열분석 품질이 더 우수하고 더 안정적임을 나타낸다. 표 13으로부터, 50사이클 후 대조군의 Q30(%) 감소가 실험 그룹 4보다 더 심했다는 것을 알 수 있다. 표 14에 제시된 바와 같이, 대조군의 오차율은 실험 그룹 4보다 유의하게 더 높았다. 표 15로부터, 50사이클 후 대조군의 지연 증가율(%)이 실험 그룹 4보다 유의하게 더 높았다는 것을 알 수 있다.
[표 13]
[표 14]
[표 15]

Claims (10)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법으로서,
    (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (b) 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 프라이머와 접촉시켜 표적 폴리뉴클레오티드와 성장 쇄로서 사용되는 프라이머를 포함하는 부분 이중체를 형성하는 단계;
    (c) 중합효소가 뉴클레오티드 중합 반응을 수행하도록 허용하는 조건 하에 부분 이중체를 중합효소 및 제1 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시켜 성장 쇄를 연장하는 단계로서, 여기서 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 표지로 표지된 적어도 한 종류의 뉴클레오티드를 포함하고,　
    상기 제1 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 단계;
    (d) 중합효소가 뉴클레오티드 중합 반응을 수행하도록 허용하는 조건 하에 이전 단계의 생성물을 중합효소 및 제2 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시켜 성장 쇄를 연장하는 단계로서, 여기서 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 적어도 하나(예: 1, 2, 3 또는 4개)의 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 비가역적 차단 뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드와 비가역적 차단 뉴클레오티드의 조합을 포함하고;
    상기 제2 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 단계; 및
    사진 중합 용액을 제공하고, 이를 제2 뉴클레오티드 혼합물과 접촉시키고, 사진 중합 반응을 통해 단계 (c)의 생성물에서 표지의 존재를 검출하는 단계;
    (e) 이전 단계의 생성물에 함유된 보호 그룹 및 표지를 제거하는 단계;
    (f) 임의로, 단계 (c) 내지 (e)를 한 번 이상 반복하는 단계를 포함하고;
    이로 인해, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 정보를 수득하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 사진 중합 용액이 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 계면활성제 및 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 분석하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 상기 연장이 표적 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하는 연장이고, 바람직하게는 상기 연장이 하나의 뉴클레오티드의 연장이고;
    바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드 또는 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드, 또는, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오시드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (d)에서, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드를 포함하고;
    임의로, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함하고;
    임의로, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 적어도 하나의 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (d)에서, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드, 및 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함하고;
    임의로, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 각각 독립적으로 동일하거나 상이하고;
    바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 상이하고;
    바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 발광 표지(예: 형광 표지)이고;
    보다 바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 각각 독립적으로 쿠마린, 알렉사플루오르(AlexaFluor), 바디피(Bodipy), 플루오레세인, 테트라메틸로다민, 페녹사진, 아크리딘, Cy5, Cy3, AF532, 텍사스 레드(Texas Red) 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합이고; 바람직하게는, 상기 핵산 분자의 연장 생성물이 DNA이고;
    바람직하게는, 상기 표적 폴리뉴클레오티드가 진핵생물(예: 동물, 식물, 진균), 원핵생물(예: 박테리아, 악티노마이세트(actinomycete)), 바이러스, 파지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 샘플로부터 수득되고;
    바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 A, T, C, G 및 U로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 상이하고;
    추가로 바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 각각 A, T, C, G이고;
    바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 A, T, C, G 및 U로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 상이하고;
    추가로 바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 각각 A, T, C, G이고;
    바람직하게는, 상기 비가역적 차단 뉴클레오티드가 디데옥시뉴클레오티드이고;
    바람직하게는,
    상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나;
    상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제3 뉴클레오사이드를 포함하는, 방법.
  6. 키트로서,
    (a) 제1 뉴클레오티드 혼합물로서, 여기서 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 표지로 표지된 적어도 한 종류의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 제1 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 제1 뉴클레오티드 혼합물;
    (b) 제2 뉴클레오티드 혼합물로서, 여기서 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 적어도 하나(예: 1, 2, 3 또는 4개)의 표지되지 않은 뉴클레오티드, 또는 비가역적 차단 뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드와 비가역적 차단 뉴클레오티드의 조합을 포함하고;
    상기 제2 뉴클레오티드 혼합물 중의 각각의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 이의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 핵산 쇄 연장을 차단할 수 있는 보호 그룹(예: 2'- 또는 3'-산소 원자를 통해 부착된 보호 그룹)을 포함하는, 제2 뉴클레오티드 혼합물;
    (c) 사진 중합 용액으로서,
    바람직하게는, 상기 사진 중합 용액이 다음 시약: 핵산 중합효소, 완충액 시약, 계면활성제, 레이저 사진술 하에 핵산 손상을 줄이기 위한 시약을 포함하는, 사진 중합 시약을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 키트가 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 상보적인 프라이머, 핵산 증폭 완충액, 효소(예: 핵산 중합효소)를 위한 작업 완충액, 물 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 상기 키트가 서열분석 슬라이드, 뉴클레오티드 상의 보호 그룹 및 표지를 제거하기 위한 시약으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 상기 키트가 폴리뉴클레오티드를 분석하는 데 사용되고;
    바람직하게는, 상기 키트가 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 데 사용되는, 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드 또는 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 제4 표지로 표지된 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나;　
    상기 제1 뉴클레오티드 혼합물이 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제3 표지로 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 표지로 표지된 제1 뉴클레오티드, 제2 표지로 표지된 제2 뉴클레오티드, 제1 표지와 제2 표지로 공동 표지된 제3 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드 및 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제1 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제2 뉴클레오티드, 표지되지 않은 제3 뉴클레오티드, 및 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드를 포함하고;
    임의로, 상기 제2 뉴클레오티드 혼합물이 표지되지 않은 제4 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 각각 독립적으로 동일하거나 상이하고;
    바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 상이하고;
    바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 발광 표지(예: 형광 표지)이고;
    보다 바람직하게는, 상기 제1 표지, 상기 제2 표지, 상기 제3 표지 및 상기 제4 표지가 각각 독립적으로 쿠마린, 알렉사플루오르, 바디피, 플루오레세인, 테트라메틸로다민, 페녹사진, 아크리딘, Cy5, Cy3, AF532, 텍사스 레드 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, DNA, RNA 또는 이들의 임의의 조합이고; 바람직하게는, 상기 핵산 분자의 연장 생성물이 DNA이고;
    바람직하게는, 상기 표적 폴리뉴클레오티드가 진핵생물(예: 동물, 식물, 진균), 원핵생물(예: 박테리아, 악티노마이세트), 바이러스, 파지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 샘플로부터 수득되고;
    바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 A, T, C, G 및 U로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 상이하고;
    추가로 바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드, 상기 제2 뉴클레오티드, 상기 제3 뉴클레오티드 및 상기 제4 뉴클레오티드가 각각 A, T, C 및 G이고;
    바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 A, T, C, G, U로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 상이하고;
    추가로 바람직하게는, 상기 제1 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제2 비가역적 차단 뉴클레오티드, 상기 제3 비가역적 차단 뉴클레오티드 및 상기 제4 비가역적 차단 뉴클레오티드가 각각 A, T, C 및 G이고;
    바람직하게는, 상기 비가역적 차단 뉴클레오티드가 디데옥시뉴클레오티드인, 키트.
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