CN105112516A - 一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单分子靶向测序(SMTS)方法、装置、系统及应用，所述方法包括：(i)将靶向引物连接到基底表面；(ii)将靶向引物与末端修饰有光学检测标记的模板核酸进行杂交形成靶向引物/模板核酸复合物；(iii)对复合物进行成像；(iv)添加带光学检测标记的核苷酸，使之延伸至探针引物链的3’端；(v)对延伸中的靶向引物链进行成像以鉴定步骤(iv)引入的核苷酸种类；(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次。本发明提供的单分子靶向测序方案通过靶向引物捕获模板核酸，实现单分子靶向测序。

Description

一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用。

背景技术

二代测序技术广泛应用在很多领域，但其内在缺陷带来诸如起始样品量大，测序时间长，费用高，PCR扩增过程带来的测序错误等开始凸显。以直接针对单个DNA分子的测序技术(SMS)为特征的新三代测序技术则针对解决二代技术的缺陷应运而生，并越来越多的引起人们的关注。

世界上首个基于单分子测序技术(tSMS)的测序仪是由Helicos公司于2008年推向市场的。其原理是通过检测单个碱基荧光信号来实现边合成边测序。具体而言，在测序前，待测DNA被打断成约200bp的片段，并需要在片段3’末端加上40bp带有荧光标记的poly(A)尾，文库退火形成单链，与芯片上固定的OligodT(40bp)探针结合。Helicos公司在2012年发表的学术论文则进一步改进了此项技术，把待测的带荧光，但无polyA尾修饰的单个DNA分子杂交捕获在特定的探针上面进行直接测序。其结果显示出此项技术潜在的应用前景，尤其是临床应用领域。但Helicos公司发布的产品由于其高昂的价格和不稳定性等特点，没有得到市场的认可，于2011年底破产。

此外，太平洋生物公司的单分子测序仪(SMRT)具有读长长等特点，但是受物理原件和制作工艺的局限，该仪器通量不高，试剂昂贵，尚未真正应用到临床。因此，利用单分子技术的优势以及临床需求而开发的单分子靶向测序技术(SMTS)，有望成为应用于遗传病检测和精准医疗市场新一代测序仪器。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用。本发明提供的单分子靶向测序方法、装置、系统用于对任何一条或多条DNA、RNA、mRNA、染色体、基因组、或其他核酸序列进行快速和准确地测序。

第一方面，本发明提供了一种单分子靶向测序方法，包括：

(i)将靶向引物的5’端连接到基底表面；

(ii)将末端修饰有光学检测标记的模板核酸与所述步骤(i)中连接到基底表面上的靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；

(iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；

(iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链的3’端；获得延伸产物；

(v)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤(iii)中靶向引物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序列；

(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：

(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷酸。

本发明通过延伸反应、成像检测和切除光学检测标记分子的反复循环，实现SMTS实时测序。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为5’端具有10-30bp的polyT的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端连接到基底表面。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端连接到基底表面。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为5’端顺次连接有10-30bp的polyT以及烷基链的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

优选地，所述烷基链为-(CH₂)_n-(优选为-(CH₂)₆-)，其中，n为自然数。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：-(CH₂)₆-通过氨基与基底表面的环氧基连接。

在本发明一实施例中，靶向引物为通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基基底(包括但不限于玻璃基底、石英基底等)。在本发明一优选实施例中，将带有光学检测标记的靶向引物的5’端连接到基底表面的步骤包括：

a)将环氧基修饰的玻璃基底浸泡在含0.4-3.2nM靶向引物的固定液中(优选45min-120min)；清洗基底；

b)将基底浸入磷酸盐钝化液中，摇晃(优选10-15小时)；清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底。

在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，所述固定液为0.02-0.3M的K₂HPO₄溶液。

在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，所述固定液中靶向引物的浓度优选为0.8-3.2nM，进一步优选为0.8-1.6nM。

在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，采用3xSSC+0.1％Triton,3xSSC,150mMK₂HPO₄pH＝8.5清洗基底。

在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤b中，摇晃的条件为置于摇床上摇晃(优选为40-80转/分钟)。

在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤b中，磷酸盐钝化液为pH＝9.0，0.2-1M(优选0.2-0.8M)K₂HPO₄溶液。

在本发明一实施例中，所述模板核酸的3’端和/或5’端带有光学检测标记。

在本发明一实施例中，所述光学检测标记为荧光标记。

优选地，所述荧光标记物选自荧光素，罗丹明，花青，Cy5，Cy3中的一种或多种。

在本发明一优选实施例中，带有荧光标记的核苷酸为单色可逆末端终止子。

在本发明一优选实施例中，带有荧光标记的核苷酸为多色可逆末端终止子。

如本发明所述的，单色可逆末端终止子为A、T、C、G中的任一种均带有相同的荧光标记；每次循环只添加一种核苷酸。

如本发明所述的，多色可逆末端终止子为A、T、C、G各自带有互不相同的荧光标记，每次循环可同时添加多种核苷酸，并通过对不同的荧光标记分别读取各核苷酸的荧光信息。

在本发明一实施例中，所述步骤(iii)中，对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：

在每个延伸循环反应中，对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前后不同时间点进行成像。

在本发明一实施例中，步骤(iv)的延伸反应之前的步骤(iii)中，通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来精确定位靶向引物/模板核酸复合物所处的位置。

在本发明一实施例中，所述的聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶或DNA聚合酶。

在本发明一实施例中，步骤(iv)还包括对获得的延伸产物进行清洗。在本发明一实施例中，步骤(vi)中，所述核苷酸的可断裂的基团为光可裂解的终止基团、化学断裂的终止基团或酶催化断裂的终止基团。

在本发明一实施例中，步骤(vi)还包括对除去光学检测标记处理后的延伸产物进行清洗。

在本发明一实施例中，还包括同步地对多个靶核酸测序。

在本发明一实施例中，所述步骤(v)中，所述的对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：

在延伸反应后的同一时间点，对靶向引物/模板核酸复合物中的模板核酸、以及在该延伸反应中结合到靶向引物链3’端的带光学检测标记的核苷酸进行成像。

在本发明一实施例中，所述(v)的步骤包括：通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来鉴定步骤(iv)引入的核苷酸种类。

本发明提供的单分子靶向测序方法中的图像采集步骤优选采用全内反射显微系统(TIRF)，提升信噪比。本发明提供的方法在每次步骤(iv)的延伸反应之后分别对模板核酸和带荧光标记的核苷酸拍照；通过对同一个坐标视野的前后两次成像，纠正进行拍照时，由于载物台的轻微移动或样品漂移产生的些许偏差。

在本发明一实施例中，所述步骤(v)中，所述的进行图像比对和纠偏的步骤包括：

对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前后不同时间点的成像进行图像比对和纠偏；以及

对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

在本发明一优选实施例中，对不同时间点对同一位置拍摄的多个单分子图像的比对和纠偏的方法包括：

1、首先读取第一时间点的单分子成像图片，然后再读取第二时间点的单分子成像图片，均在matlab里面保存为uint16格式的矩阵；

2、对第一时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵fft_ref；

3、对第二时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵fft_frame；

4、取两个时间点图片傅里叶变换后的矩阵的卷积prod＝fft_ref.*conj(fft_frame)；

5、对prod矩阵进行二维傅里叶反变换得到矩阵cc＝ifft2(prod)；

6、对cc这个矩阵进行fftshift变换，找到变换后矩阵最大值的坐标，再减去原始图片大小的一半，得到的不同时间点图片的偏移量；

7、最后再根据偏移量对第二时间点的图片用circshift函数来矫正偏移量。

在本发明一实施例中，所述单分子靶向测序方法还包括对测序结果进行生物信息学分析。

第二方面，本发明提供了一种单分子靶向测序装置，包括：

基底，用于结合一条或多条靶向引物；

流路系统，用于可控地操控各种试剂在基底所在的芯片腔室内的进出；

温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；

光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；

检测器组件，用于检测和记录荧光信号；

计算机，具有用于控制系统以及图像处理的各个模块，其中，所述图像处理模块用于对延伸反应前后靶向引物/模板核酸复合物的定位结果进行图像比对和纠偏，以及用于对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

在本发明一实施例中，所述计算机控制的系统包括：流路系统，温控系统，光学和检测系统。还包括数据分析软件。

在本发明一实施例中，所述的靶向引物如第一方面任一所述的靶向引物。

第三方面，本发明提供了一种单分子靶向测序系统，包括如第二方面所述的单分子靶向测序装置。

第四方面，本发明提供了一种单分子靶向测序试剂盒，包括基底、靶向引物、固定反应试剂、延伸反应试剂、成像试剂、切除光学检测标记分子的试剂。

可以理解的是，所述单分子靶向测序试剂盒还包括缓冲液或其他测序必要试剂。比如，本领域技术人员根据需要分别配置针对的固定反应试剂、延伸反应试剂、切除光学检测标记分子等不同过程的缓冲液。

第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单分子靶向测序方法在DNA或RNA测序中的用途。

本发明提供的单分子靶向测序方案先在基底上随机固定多个靶向设计的引物；将末端带有光学检测标记的小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确定位，通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后模板所处的位置；逐次加入带有可切除光学检测标记的单色或者多色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像，记录本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的光学检测标记，洗涤，加帽，准备好下一个核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环，就可以实现单分子靶向实时测序。

附图说明

图1为本发明实施例提供的单分子测序原理示意图；

图2为本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图。

图3-6为本发明实施例提供的核酸芯片固定反应结果。

具体实施方式

本发明提供的单分子靶向测序装置或系统可用于对平面基底进行成像，其中基底结合有靶向引物。在用于测序时，本发明提供的方法、装置、系统可选地包括：

基底，用于结合一条或多条靶向引物；

流路系统，用于可控地操控各种试剂(例如緩冲剂、酶、荧光标记核苷酸等)在基底所在的芯片腔室内的进出；

温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；

光学系统，包括激光光源(例如一个或多个激光器)，所述光学系统用于激发荧光；

检测器组件(例如EMCCD相机等)，用于检测和记录荧光信号；

计算机，具有用于控制系统(比如流路系统，温控系统，光学和检测系统、图像系统。还包括数据分析软件)的各个组件。

本发明提供了如下实施例。

在本发明一实施例中，本发明提供的单分子测序技术采用了本发明提供的单分子测序装置，包括如下步骤：将模板/引物双链与基底表面上的环氧基团共价结合；进行边测序边合成(SBS)反应对掺入的核苷酸进行光学检测。

本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的方法可用于部分测序，DNA指纹，多态性鉴定，例如单核苷酸多态性(SNP)的检测，以及遗传癌症研究应用。本发明的方法也可用于RNA序列测序以确定替代剪接位点，拷贝数，检测基因表达，识别未知的细胞中以低拷贝数存在的RNA分子。本发明的方法也可用于确定哪些序列转录来注释基因组，确定系统发育关系，阐明细胞分化，促进组织工程。

针对不同医疗应用，通过对应的方法提取所需检测的核酸模板并进行预处理。在本发明一实施例中，核酸模板分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。核酸模板分子可以从含有各种其它成分，如蛋白质，脂质和非模板核酸的生物样品中分离出来。核酸模板分子可以来自动物，植物，细菌，真菌，或任何其他细胞生物体获得。本发明的生物样品包括病毒(DNA或RNA病毒)。核酸模板分子可以直接从生物体获得的生物样品，例如从血液，尿，脑脊髓液，精液，唾液，痰，粪便或其他组织获得。任何组织或体液样品可以用作核酸在本发明中使用的来源。核酸模板分子也可以从培养的细胞，如原代细胞培养物或细胞系中分离。样品还可以是从生物样品提取的总RNA或基因组DNA。

核酸从生物样品提取后通常被打断以产生合适的片段进行分析获得的。一般而言，随机打断为200bp左右的片段。在一个实施方案中，从生物样品中提取的核酸通过超声处理打断。一般地，从生物样品中提取的核酸的各种技术为行业内常规技术，例如Maniatis等人所述的《分子克隆实验室手册》，冷泉港，NY，第280-281(1982)。通常，单个核酸模板分子的长度可以为约5个碱基至约20kb。核酸分子可以是单链的，双链的，或双链的单链区(例如，茎和环结构)。

靶向引物(与待测核酸片段的部分序列互补)尽可能覆盖所需待测序基因片段，稳定高效的捕获靶向DNA片段，比如针对HBV病毒的测序，需要尽可能设计覆盖所有的基因突变点和耐药位点的靶向引物。靶向引物一般固定在光学透明的经过修饰的基底上面。基底表面需要经过化学修饰以便于靶向引物通过化学键或者物理吸附作用固定在基底表面。基底为具有低的天然荧光或基本上不发荧光的任何合适的载体。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的基底可以是二维或三维的，并且可以包括一个平坦表面(例如，玻璃载玻片)，或者可以是其他形状。本发明的基底可以包括玻璃(例如，可控孔度玻璃(CPG))，石英，塑料(如聚苯乙烯，不限于低交联和高交联的聚苯乙烯)，聚碳酸酯，聚丙烯和聚甲基丙烯酸甲酯(methymethacrylate)，丙烯酸共聚物，聚酰胺，硅，金属(例如，烷基硫醇(alkanethiolate)-衍生金)，纤维素，尼龙，乳胶，葡聚糖，凝胶基质(例如，硅胶)，聚丙烯醛，或复合材料。

合适的三维基底包括，例如，球，微粒，珠，膜，载玻片，平板，微机械加工的芯片，管(例如，毛细管)，微孔，微流体装置，通道，过滤器，或任何其它合适用于锚定核酸的结构。基底可包括具有靶向引物区域的平面阵列或矩阵，比如包括核苷衍生的CPG和聚苯乙烯基底片；衍生的磁基底片等。

靶向引物(优选地，靶向引物5’端包括聚胸腺嘧啶核苷酸(聚dT)的寡核酸链)通过行业内常规的化学键或者物理吸附作用固定在基底表面，可以直接或间接(如通过生物素)固定在基底表面。在一个具体实施方案中，我们使用的是经环氧硅烷处理的低荧光玻璃表面，其表面的环氧键可以和靶向引物末端的氨基进行化学键合。在一些实施方案中，靶向引物分子的5’端连接聚胸腺嘧啶核苷酸(聚dT)的寡核酸链的3’端，聚dT寡核酸链的5’端通过氨基与基底表面的环氧键键合。在一个优选的实施方案中，靶向引物分子的5’端顺次连接有聚胸腺嘧啶核苷酸(聚dT)的寡核酸链和烷基链(比如，-(CH₂)₆-)和末端氨基，其中，聚dT寡核酸链的3’端与靶向引物分子的5’端相连，聚dT寡核酸链的5’端与烷基链相连，烷基链通过氨基与基底表面的环氧键键合。

固定好的引物密度要求为在保证单分子级别的分散度上，尽可能的密度高一些，这样可以保证尽可能高的测序通量。在一实施方案中，基底可以采用行业内其他处理方式，以改善核酸附着效率。在其他实施方案中，可以对本发明中使用的基片进行处理，以降低背景噪音。用于对基底进行修饰的环氧化物还可以为环氧化物的衍生物。

在基底固定了靶向引物之后，还需要经过化学钝化处理以消除未封闭的环氧基团和防止测序过程中的产生的非特异性吸附带来的噪声。表面钝化处理有很多种方法，由于测序中的荧光标记的碱基分子是负电的，在我们的具体实验中，使用磷酸盐来封闭玻璃表面的环氧基团，并产生负电层，以减小负电性的碱基吸附。

结合图1，本发明提供的单分子测序方法，包括：

样品制备，基底表面处理以及靶向引物(优选地，靶向引物5端包括聚胸腺嘧啶核苷酸(聚dT)的寡核酸链)的固定，成像，和图像处理获得序列的分析步骤。

在一具体实施方案中，如图1所示，为本发明单分子测序原理示意图。测序前需要首先将待的跟疾病相关的待测序列打断成小片段DNA模板，DNA模板的末端标记有可光学检测的标记分子，从而通过光学显微镜进行记录和定位DNA模板的坐标；同时在基底上随机固定多个5端包括聚dT的靶向引物；将小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确定位，通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后小片段DNA模板所处的位置；逐次加入带有检测标记的核苷酸及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像，记录本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的荧光分子，洗涤，加帽，准备好下一个核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环，就可以实现实时测序。

本发明提供的单分子测序方法采用到的聚合酶，优选为降低核酸外切酶活性的Klenow聚合酶。可选地，本发明可用核酸聚合酶包括但不限于本领域文献记载或商用的DNA聚合酶，RNA聚合酶，逆转录酶，和/或任何上述聚合酶突变形式。

在本发明一实施方案中，每个循环反应中，采用的带有检测标记的核苷酸为多色核苷酸(比如，四种核苷酸分别带不同的待测标记)，可同时加入同一个循环反应的反应体系。本发明采用的核苷酸上的检测标记可选自行业内常规标记，包括但不限于：荧光素，罗丹明，花青，Cy5，Cy3，BODIPY，Alexa及其衍生物等。

以单分子测序为标志的第三代测序的技术，需采用循环可逆终结(cyclicreversibletermination,CRT)的办法来实现单个核苷酸的延伸以提高测序准确度。即当某一个带有抑制基团的核苷酸加到DNA链上之后，可以阻止下一个核苷酸的延伸；在温和条件下该抑制核苷酸可以被除去从而使该DNA链得以继续延伸。每增加一个核苷酸，可以通过对其所带荧光的检测实现对该DNA链的实时测序。这样一个带抑制基团的核苷酸被称作终止子(terminator)。在本发明一实施方案中，采用的带有检测标记的核苷酸为可切除荧光标记的单色或者多色可逆末端终止子。在本发明一优选实施方案中，可逆末端终止子为光可断裂的荧光标记可逆终端化合物。在本发明另一优选实施方案中，可逆末端终止子为化学断裂或酶催化断裂的荧光标记可逆终端化合物。

在一些实施方案中，至少3个，至少5个，至少10个，至少20个，至少30个，至少50个，至少100个，至少500个，至少1000个或至少10000个连续循环反应用于延伸特异性杂交有模板链的靶向引物，每次循环，延伸1个带荧光标记可逆终止子，每进入下一次循环之前，带荧光标记可逆终止子去掉其荧光标记及抑制基团。

鉴于边合成边测序的原理需要精确的温度控制和经历多次化学冲洗，测序样品被封装在一个设计好的微流体控制系统，保证精准的温度和试剂流动。为保证测序的通量，在本发明一优选实施方案中，可以设置多个通道。装配好的样品最终被放置在一个可观察单分子信号的全内反射光学显微镜上面。光学信号包括荧光，拉曼，散射等。在本发明一具体实验中，观察的光学信号是单分子的荧光信号。为防止定位信号和测序信号发生重叠，本发明使用不同激发信号分别激发定位荧光分子和测序标记分子。在多次成像过程中，荧光分子会发生淬灭，导致测序信号丢失和测序读长短，为改善这些问题，本发明特别关注了荧光淬灭问题，并在成像时通过加入研发的成像试剂，缩短曝光时间，减弱激发强度等手段来保证测序的准确性。

在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：图像采集过程。图像采集采用的是全内反射显微系统(TIRF)，单分子信号非常弱，TIRF系统能够显著降低背景噪音，从而提升信噪比。本发明实施例中采用的系统为双色激光光路系统，每次采集图像之前，需要按照化学冲洗流程对封装在微流控系统的样品进行处理，然后进行拍照，为了防止样品漂移，定位信息需要每次延伸反应之前进行拍照，然后碱基延伸后再拍照以获得测序信号。

本发明提供的单分子靶向测序方法中的图像采集步骤优选采用全内反射显微系统(TIRF)，提升信噪比。本发明提供的方法在每次步骤(iii)的延伸反应之前进行一次拍照，然后在每次步骤(iii)的碱基延伸后再拍照一次；通过对同一个坐标视野的前后两次成像，纠正进行拍照时，由于载物台的轻微移动或样品漂移产生的些许偏差。

在本发明一具体实施例中，对不同时间点对同一位置拍摄的多个单分子图像的纠偏的方法包括：

1、首先读取第一时间点的单分子成像图片，然后再读取第二时间点的单分子成像图片，均在matlab里面保存为uint16格式的矩阵；

2、对第一时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵fft_ref；

3、对第二时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵fft_frame；

4、取两个时间点图片傅里叶变换后的矩阵的卷积prod＝fft_ref.*conj(fft_frame)；

5、对prod矩阵进行二维傅里叶反变换得到矩阵cc＝ifft2(prod)；

6、对cc这个矩阵进行fftshift变换，找到变换后矩阵最大值的坐标，再减去原始图片大小的一半，得到的不同时间点图片的偏移量；

7、最后再根据偏移量对第二时间点的图片用circshift函数来矫正偏移量。

在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：图像处理过程。在成像步骤中，每次核苷酸延伸反应所获的图像可能有几十或者上千个视野。对于图像的处理，需要精准计算出每个反应的坐标位置并记录；在之后的每次碱基延伸过程中所获的图像要经过图像处理软件进行位置纠偏，以校对化学冲洗过程以及样品移动造成的位置漂移。然后再进行图像重叠，对有测序反应的位置进行逐次叠加、计算以获得每个位置的碱基序列。

在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：生物信息学分析过程。在所获得的碱基序列的基础上，通过碱基判定和比对，最终获得所测DNA片段的完整序列。生物信息学介入以完成对该片段的生物学意义的分析，并帮助医生判断药物的选择，疾病的筛查等。

具体实施例

材料及试剂说明：

非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

20xSSC:在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。SSC是分子生物学上最为标准的印迹及分子杂交处理液，20*SSC用于杂交实验变性及清洗常用浓缩型缓冲液。

DNA芯片固定

如图2所示，图2为本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图。图2包括a-b，a为在环氧基玻片上固定靶向引物DNA示意图，b为在修饰有其他基团的玻片上固定靶向引物的流程示意图。该技术利用了环氧基团本身不稳定，张力较大，能和修饰有-NH₂的DNA发生化学反应的优点，通过新的-CH₂-NH-这个共价键将待固定的DNA单链固定在修饰有环氧基团的芯片表面。该固定技术仅是本发明的一种具体实施例，本发明方法的优化对所有的固定载体和DNA序列均有效。DNA序列5’端连有可以和芯片发生化学反应的基团，如氨基、醛基、羧基、巯基等；3’端用单分子荧光物质修饰，如Cy3、Cy5，目的在于统计固定的数目。

具体地，本发明实施例提供了一种单分子测序方法，包括将靶向引物固定在芯片上，具体包括如下步骤：

1)将待固定序列的芯片用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基，基底玻片来自于为SCHOTT公司的环氧基修饰的系列玻片)；

2)用固定液(0.02-0.3MK₂HPO₄，本实施例中采用0.2M)将DNA稀释成浓度为800-1600pM(本实施例中采用0.8nM)，将芯片浸泡在DNA-固定液中45min-120min(本实施例中采用60min)，固定液没过芯片即可；

3)然后依次用3xSSC+0.1％Triton,3xSSC,150mMK₂HPO₄pH＝8.5，清洗芯片；

4)再用pH＝9.0，0.2-1MK₂HPO₄(本实施例中采用1M)溶液稍稍没过芯片即可，于室温下在摇床上以80转/分钟(r/min)摇晃15小时。

5)依次用PBS，150mMHepes+150mMNaCl清洗芯片，最后再用双蒸水清洗芯片。

6)通过荧光显微镜对固定好的芯片进行照相，每个芯片拍连续的20个视野，然后统计每张照片的单分子荧光点数，计算每个视野下荧光点数的平均值。

具体地，为观察引物尾部polyT对固定密度的影响，本发明如下DNA进行(下划线部分为-NH₂(CH₂)₆-)固定：

T50-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

为SEQUENCENO.1所示。

T10C50-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.2所示。

C50-Cy3(5’→3’)：

AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3

具体地，所述

CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.3所示。

在本实施例中，将T50-Cy3、C50-Cy3、T10C50-Cy3分别固定在芯片上，按上述的固定步骤进行操作，重复六次并统计固定上的序列数目。结果如图3所示。由图3可知，DNA由T50-Cy3换为C50-Cy3时，固定密度会由2800降为150；在C50的5’端加入10bp的polyT时，固定密度又增加至2800(经后续实验验证，10-30bppolyT，优选为10-20bppolyT均可提高固定密度至2800左右，优选为2500-3200)，这说明DNA的5’端存在一段碱基T会大大提高固定的密度。

因此，本发明优选在待固定靶向引物的5’端连接10-30bp(优选10bp)的polyT。

具体地，为进一步观察引物尾部polyT的数量以及不同靶向引物序列对固定密度的影响，本发明如下DNA进行(下划线部分为-NH₂(CH₂)₆-)固定：

T10C20-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.4所示。

C20-Cy3(5’→3’)：

AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.5所示。

T10C30-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为

SEQUENCENO.6所示。

C30-Cy3(5’→3’)：

AmMC6AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为

SEQUENCENO.7所示。

T10C40-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.8所示。

C40-Cy3(5’→3’)：

AmMC6AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.9所示。

T20C20-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.10所示。

C20-Cy3(5’→3’)：

AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.11所示。

T20C50-Cy3(5’→3’)：

AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.12所示。

C50-Cy3(5’→3’)：

AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，

具体地，所述

CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.13所示。

采用前述DNA芯片固定方法进行固定，实验结果显示，上述DNA均获得与T10C50-Cy3类似的固定效果，以及“T10C50-Cy3和C50-Cy3”类似的固定规律：DNA由polyT-(CH₂)n-DNA-Cy3换为-(CH₂)n-DNA-Cy3时，固定密度会由2000-3500降为150左右；在-(CH₂)n-的5’端加入10-30bp的polyT时，固定密度又增加至2000-3500，这说明DNA的5’端存在一段碱基T会大大提高固定的密度。本实施方式中的部分实验结果如图3所示。

DNA芯片的钝化中转速对荧光斑点的影响

按照上述的“DNA芯片固定”中记载的实验方法进行操作，不同的是：

步骤1)中，待固定的DNA为T10C50-Cy3，其浓度分别为0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM；此外，步骤4)中，在钝化时，分为两批进行平行试验，两组实验分别在0rpm/min和80rpm/min摇晃条件下钝化。本发明实施例中，“rpm/min”与“r/min”可以互换。

重复三次并统计固定上的序列数目。荧光显微镜拍照结果如图4和图5所示。图4为钝化过程中转速为0rpm/min时荧光显微镜拍照结果，包括a-d，分别0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM的T10C50-Cy3的固定效果。图5为钝化过程中转速为80rpm/min时荧光显微镜拍照结果，包括a-d，分别0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM的T10C50-Cy3的固定效果。

图6为转速设置为80rpm/min，不同浓度固定DNA的固定密度。

由图4-6可知：

1.对比对应浓度下532荧光照片可以看出，在钝化过程中将摇床的转速设置为40-80rpm/min(优选为80rpm/min)可以显著消除掉大的荧光斑点；

2.在钝化过程中转速一定的条件下，固定的密度会随着待固定DNA浓度的提高而提高，由此可以根据我们需要的固定浓度来选择最佳的固定浓度。在后续的杂交实验中，当固定的密度高于4000以上时，固定DNA浓度过高会造成对待杂交的DNA分子空间位阻过大，会导致杂交密度过低，故根据杂交实验结果，我们选择较为适宜的固定浓度为0.8-1.6nM。

值得注意的是，在DNA芯片固定实验中，本发明实施例在靶向引物的3’端标记荧光，目的是更好的追踪引物位置，摸索出更合适的固定密度。在应用中，靶向引物的3’端没有荧光标记，便于核苷酸在聚合酶的催化下得以延伸。

可以理解的是，本领域技术人员可以根据需要在靶向引物3’端之外的其他位置(不影响延伸反应)标记光学检测标记，比如荧光标记。

DNA单分子测序

具体地，以一具体样品为例，本发明实施例提供的一种单分子靶向测序方法包括：

1.测序反应：测序前需要首先将待的跟疾病相关的测序列打断成小片段，并在其末端标记荧光；同时在基底上随机固定多个靶向设计的引物；将小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确定位，通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后模板所处的位置；逐次加入带有可切除荧光标记的单色或者多色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像，记录本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的荧光分子，洗涤，加帽，准备好下一个核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环，就可以实现实时测序。

2.图像采集：图像采集采用的是全内反射显微系统(TIRF)，因为单分子信号非常弱，TIRF系统能够显著降低背景噪音，从而提升信噪比。这个系统为双色激光光路系统，每次采集图像之前，需要按照化学冲洗流程对封装在微流控系统的样品进行处理，然后进行拍照，为了防止样品漂移，定位信息需要每次延伸反应之前进行拍照，然后碱基延伸后再拍照以获得测序信号。

3.图像处理：在步骤1中，本发明依据所需测序要求进行成像，每次碱基延伸反应所获的图像可能有几十或者上千个视野。对于图像的处理，需要精准计算出每个反应的坐标位置并记录；再之后的每次碱基延伸过程中所获的图像，要经过图像处理软件进行位置纠偏，校对所经历的化学冲洗过程以及样品移动造成的位置漂移。然后再进行图像重叠，对有测序反应的位置进行逐次叠加以获得每个位置的碱基序列。

4.生物信息学分析：在所获得的碱基序列的基础上，通过碱基判定和比对，最终获得所测DNA片段的完整序列。生物信息学介入以完成对该片段的生物学意义的分析，并帮助医生判断药物的选择，疾病的筛查等。

Claims (12)

1.一种单分子靶向测序方法，其特征在于，包括：

(i)将靶向引物的5’端连接到基底表面；

(ii)将末端修饰有光学检测标记的模板核酸与所述步骤(i)中连接到基底表面上的靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；

(iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；

(iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链的3’端；获得延伸产物；

(v)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤(iii)中靶向引物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序列；

(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：

(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷酸。

2.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，靶向引物为5’端具有10-30bp的polyT的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

3.如权利要求1或2所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，靶向引物为通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基的基底。

4.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述模板核酸末端修饰的光学检测标记为荧光标记。

5.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述核苷酸的可断裂的基团为光可裂解的终止基团、化学断裂的终止基团或酶催化断裂的终止基团。

6.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：

在每个延伸循环反应中，对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应后不同时间点进行成像。

7.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iv)中，所述的对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：在延伸反应后的同一时间点，对靶向引物/模板核酸复合物中的模板核酸、以及在该延伸反应中结合到靶向引物链3’端的带光学检测标记的核苷酸进行成像。

8.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iv)中，所述的进行图像比对和纠偏的步骤包括：

对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前后不同时间点的成像进行图像比对和纠偏；以及

对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

9.一种单分子靶向测序装置，其特征在于，包括：

基底，用于固定一条或多条靶向引物；

流路系统，用于可控地操控各种试剂在基底所在的芯片腔室内的进出；

温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；

光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；

检测器组件，用于检测和记录荧光信号；

计算机，具有用于控制系统以及图像处理的各个模块，其中，所述图像处理模块用于对延伸反应前后靶向引物/模板核酸复合物的定位结果进行图像比对和纠偏，以及用于对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

10.一种单分子靶向测序系统，其特征在于，包括如权利要求7所述的单分子靶向测序装置。

11.一种单分子靶向测序试剂盒，其特征在于，包括基底、如权利要求1所述的靶向引物、固定反应试剂、延伸反应试剂、成像试剂、切除光学检测标记分子的试剂。

12.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法在在DNA或RNA测序中的应用。