CN113227399A - 使用热依赖性荧光团标签进行核酸测序的增强光学检测 - Google Patents

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Abstract

本文公开了利用荧光染料的发光强度的温度依赖性对核酸进行测序的改进的方法和系统。在每个测序循环期间调节测序反应的温度，并且使用这些荧光染料在不同温度下或在不同温度范围内达到或超过阈值的光的发射或不发射来检测掺入的dNTP的荧光标记物，从而对核酸进行测序。所公开的方法使得能够以合理数目的化学步骤确定在任何给定位点处掺入的dNTP，而无需现有技术系统所必需的复杂光学器件。

Description

使用热依赖性荧光团标签进行核酸测序的增强光学检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年9月13日提交的名称为“ENHANCED OPTICAL DETECTION FORNUCLEIC ACID SEQUENCING USING THERMALLY-DEPENDENT FLUOROPHORE TAGS”的美国非临时申请16/569,823的权益，该申请据此以引用方式并入本文以用于所有目的。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)是核酸的一个示例。DNA是仅由四种可能的组分分子或核苷酸碱基(在本文中也简称为“核苷酸”)构成的聚合物或链：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。
DNA链可以是单链或双链的。单链DNA(ssDNA)可与其独特的ssDNA互补序列结合以形成自身的双链形式(dsDNA)。腺嘌呤碱基仅与胸腺嘧啶碱基结合，并且胞嘧啶碱基仅与鸟嘌呤碱基结合。例如，序列ACTGGC与TGACCG互补并结合。因为碱基可以任何顺序出现，所以DNA测序的目标是“读取”特定ssDNA链或模板，即可靠地确定其碱基的序列。
用于DNA测序的一类核酸测序被称为“合成测序”(SBS)。SBS涉及引物杂交的模板DNA的结合、脱氧核苷三磷酸(dNTP)的掺入以及掺入的dNTP的检测。ssDNA(即，待测序的链)通过其互补序列的迭代构建进行测序，其中聚合酶用于加速核苷酸掺入的速率。在一种类型的SBS中，待测序的DNA的长链被切割成较小链，并且这些较小链可同时测序，潜在地在使用本领域已知的过程诸如桥扩增的“扩增”(例如，复制)之后进行测序。
在SBS的一种方法中，通过检测荧光推断被测序的DNA链的碱基的互补序列的积聚进程。荧光部分连接至四种dNTP(A、T、C和G)中的每一种。然后可以区分将不同dNTP掺入到生长的核酸链中，因为荧光部分中的每个荧光部分激发并发射不同波长的光，这使得能够确定靶序列。通常，荧光标记的dNTP由荧光测序仪器中的四种光学滤光器中的一种光学滤光器激发和测量，每种光学滤光器对应一种不同的染料。
此类技术可使用荧光来生成图像，例如使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜。用被荧光团吸收的一个或多个特定波长的光照射样本，从而使它们发射较长波长的光(例如，具有与所吸收的光不同的颜色)。光谱发射滤光器将照明光与发射较弱的荧光分离。荧光显微镜通常包括光源(例如，激光器)、激发滤光器、二向色镜(或分束器)和发射滤光器。选择滤光器和二向色镜/分束器以匹配用于标记样本的荧光团的光谱激发和发射特性。一次对单个荧光团的分布(例如，颜色、波长等)进行成像。必须组合若干单色图像以产生若干类型荧光团的多色图像。
依赖于荧光信号检测的最先进的测序系统每次运行可提供高达200亿个读数的吞吐量。然而，实现这种性能需要大面积流通池、高精度自由空间成像光学器件和昂贵的高功率激光器来产生足够的荧光信号以实现成功的碱基检测。
因此，一直需要改进核酸测序技术。
发明内容
本概述代表本发明的非限制性实施方案。
本文公开了对DNA测序的改进，其中使用荧光团来标记dNTP类型。所选择的荧光团在室温和高温(例如，100℃)之间的温度范围内以依赖于温度的方式发光。当发射光的强度低于用于捕获光的检测器的灵敏度阈值时，荧光团未被检测到。反之，当发射光的强度高于灵敏度阈值时，检测到荧光团。通过检测在多个不同温度下(或在多个不同且不重叠的温度范围内)的发光强度(或发光强度超过阈值的情况)，可通过合理数目的(例如，少于常规的基于荧光团的系统)化学步骤确定在任何给定位点掺入的dNTP的测定，而无需现有系统所需的更复杂的光学器件。
在一些实施方案中，对核酸进行测序的方法使用包括具有多个位点的流体通道的测序设备，该多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面。在一些此类实施方案中，该方法包括在一轮或多轮添加中向流体通道添加(i)多条核酸链，(ii)多个核酸聚合酶分子，(iii)包含第一荧光标记物的第一荧光标记的核苷酸前体，以及(iv)包含第二荧光标记物的第二荧光标记的核苷酸前体。在第一温度范围和第二温度范围内，第一荧光标记物的强度大于或等于第一阈值，第二温度范围低于第一温度范围，并且第二荧光标记物的强度小于或等于第一温度范围内的第二阈值并且大于或等于第二温度范围内的第二阈值。该方法还包括将流体通道内的温度设定在第一温度范围内，检测当流体通道的温度在第一温度范围内时该多个位点中的每个位点处的第一强度，以及响应于该多个位点中的特定位点处的第一强度大于或等于第一值，从而确定第一荧光标记的核苷酸前体已在特定位点处掺入到可延伸引物中。在特定位点处检测到的第一强度可为零或非零。该方法还包括将流体通道内的温度设定在第二温度范围内，检测当流体通道的温度在第二温度范围内时该多个位点中的每个位点处的第二强度，以及响应于特定位点处的第二强度大于或等于第二值并且该特定位点处的第一强度小于第一值，从而确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。在特定位点处检测到的第二强度也可为零或非零。
在一些实施方案中，第一阈值和第二阈值大致相同。在其他实施方案中，第一阈值和第二阈值不同。
在一些实施方案中，第一值和第二值大致相同。在其他实施方案中，第一值和第二值不同。
在一些实施方案中，第一值为第一阈值，并且第二值为第二阈值。在一些实施方案中，第一值基于第一阈值，并且第二值基于第二阈值。
在一些实施方案中，该方法还包括向流体通道添加包含第三荧光标记物的第三荧光标记的核苷酸前体，其中该第三荧光标记物的强度在第一温度范围和第二温度范围内小于第三阈值并且在第三温度范围内大于或等于第三阈值，第三温度范围低于第二温度范围；将流体通道内的温度设定在第三温度范围内；当流体通道的温度在第三温度范围内时，检测该多个位点中的每个位点处的第三强度(其可为零或非零)；以及响应于特定位点处的第三强度大于或等于第三值，并且该特定位点处的第一强度小于第一值，并且该特定位点处的第二强度小于第二值，从而确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些此类实施方案中，基本上同时将第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体和第三荧光标记的核苷酸前体添加到流体通道。
在一些实施方案中，该方法还包括响应于特定位点处的第一强度小于第一值，并且该特定位点处的第二强度小于第二值，并且该特定位点处的第三强度小于第三值，从而确定第四未标记的前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。在一些此类实施方案中，第一阈值、第二阈值和第三阈值中的至少两者大致相同。在一些实施方案中，第一阈值和第二阈值不同。
在一些实施方案中，第一值、第二值和第三值中的至少两者大致相同。在一些实施方案中，第一值、第二值和第三值不同。
在一些实施方案中，该方法还包括向流体通道添加包含第四荧光标记物的第四荧光标记的核苷酸前体，其中第四荧光标记物的强度在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围的每一者中小于第四阈值，并且在第四温度范围内大于或等于第四阈值，第四温度范围低于第三温度范围；将流体通道内的温度设定在第四温度范围内；当流体通道的温度在第四温度范围内时，检测该多个位点中的每个位点处的第四强度(其可为零或非零)；以及响应于特定位点处的第四强度大于或等于第四值，并且该特定位点处的第一强度小于第一值，并且该特定位点处的第二强度小于第二值，并且该特定位点处的第三强度小于第三值，从而确定第四荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些此类实施方案中，第一阈值、第二阈值、第三阈值和第四阈值中的两者或更多者大致相同。
在一些实施方案中，第一值、第二值、第三值和第四值中的两者或更多者大致相同。
在一些实施方案中，基本上同时将第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体、第三荧光标记的核苷酸前体和第四荧光标记的核苷酸前体添加到流体通道。
在一些实施方案中，提供了使用包括具有多个位点的流体通道的测序设备对核酸进行测序的方法，该多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面，该方法包括：在一轮或多轮添加中，向流体通道添加(i)多条核酸链，(ii)多个核酸聚合酶分子，(iii)包含第一荧光标记物的第一荧光标记的核苷酸前体，其中第一荧光标记物的强度在第一温度范围内小于第一阈值并且在第二温度范围内大于或等于第一阈值，第二温度范围低于第一温度范围，(iv)包含第二荧光标记物的第二荧光标记的核苷酸前体，其中第二荧光标记物的强度大于或等于第一温度范围和第二温度范围内的第二阈值，以及(v)包含第一荧光标记物和第二荧光标记物的第三荧光标记的核苷酸前体；将流体通道内的温度设定在第一温度范围内；当流体通道的温度在第一温度范围内时，检测该多个位点中的每个位点处的第一强度(其可为零或非零)；将流体通道内的温度设定在第二温度范围内；当流体通道的温度在第二温度范围内时，检测该多个位点中的每个位点处的第二强度(其可为零或非零)；以及确定第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体或第三荧光标记的核苷酸前体中的一者是否已在该多个位点中的特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些此类实施方案中，基本上同时将第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体和第三荧光标记的核苷酸前体添加到流体通道。
在一些实施方案中，确定第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体或第三荧光标记的核苷酸前体中的一者是否已在该多个位点中的特定位点处掺入可延伸引物中包括：响应于特定位点处的第一强度小于第一值，并且该特定位点处的第二强度大于或等于第二值，从而确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中；响应于该特定位点处的第一强度大于或等于第一值，并且该特定位点处的第二强度大于或等于第三值，第三值大于第一值和第二值中的每一者，从而确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中；以及响应于该特定位点处的第一强度大于或等于第一值，并且该特定位点处的第二强度大于或等于第二值且小于第三值，从而确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些此类实施方案中，该方法还包括响应于特定位点处的第一强度小于第一值，并且该特定位点处的第二强度小于第二值，从而确定第四未标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些实施方案中，该方法还包括确定第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体或第三荧光标记的核苷酸前体中没有一者已在特定位点处掺入到可延伸引物中，并且响应于确定该第一荧光标记的核苷酸前体、该第二荧光标记的核苷酸前体或该第三荧光标记的核苷酸前体中没有一者已在该特定位点处掺入到可延伸引物中，从而推断第四未标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在一些实施方案中，第一阈值和第二阈值大致相同。在其他实施方案中，第一阈值和第二阈值不同。
在一些实施方案中，第一值和第二值基本上相同。在其他实施方案中，第一值和第二值不同。
在一些实施方案中，第三值大致为或恰好为第一值和第二值的总和。
在一些实施方案中，第一值为第一阈值，并且第二值为第二阈值。
在一些实施方案中，第一值基于第一阈值，并且第二值基于第二阈值。
在一些实施方案中，第三值大致为第一值和第二值的总和。
在一些实施方案中，用于进行核酸测序的系统包括流体通道、联接到流体通道的加热器、成像系统和至少一个处理器。在一些实施方案中，流体通道具有多个位点，该多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面。在一些实施方案中，加热器被配置为将流体通道的内容物的温度设定在不重叠的第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围中的任一者内。在一些实施方案中，成像系统被配置为检测在第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围中的每一者内的多个位点中的每个位点处的强度。在一些实施方案中，第二温度范围低于第一温度范围，第三温度范围低于第二温度范围，并且第四温度范围低于第三温度范围。
该至少一个处理器被配置为执行至少一个机器可读指令。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，使得该至少一个处理器响应于该多个位点中的特定位点处的强度大于或等于第一温度范围和第二温度范围中的第一阈值而识别第一荧光标记的核苷酸前体或该第一荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，使得该至少一个处理器响应于该多个位点中的特定位点处的强度小于第一温度范围内的第二阈值并且大于或等于第二温度范围内的第二阈值而识别第二荧光标记的核苷酸前体或该第二荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，使得该至少一个处理器响应于该多个位点中的特定位点处的强度小于第一温度范围和第二温度范围中的第三阈值并且大于或等于第三温度范围中的第三阈值而识别第三荧光标记的核苷酸前体或该第三荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，使得该至少一个处理器响应于该多个位点中的特定位点处的强度小于第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围中的每一者中的第三阈值并且大于或等于第四温度范围中的第四阈值而识别第四荧光标记的核苷酸前体或该第四荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。
在一些实施方案中，流体通道包括具有多个位点的结构(例如，腔、脊等)，该多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面。
在一些实施方案中，加热器包括热传感器或微处理器。
在一些实施方案中，成像系统包括相机、光源(例如，激光器)、照明光学器件、检测器、光学阻挡滤光器、模数转换器(ADC)或一个或多个传感器。照明光学器件可被配置为将激发光基本上均匀地分布在多个位点上方。在一些实施方案中，检测器包括透镜。在一些此类实施方案中，成像系统包括光学阻挡滤光器，该光学阻挡滤光器位于系统内，使得其将透镜与光源发射的光基本上隔离。在一些实施方案中，成像系统的一个或多个传感器包括电荷耦合器件(CCD)传感器。
在一些实施方案中，当由至少一个处理器执行时，该至少一个机器可读指令还使得该至少一个处理器控制加热器、成像系统或两者。
在一些实施方案中，用于进行核酸测序的系统包括流体通道、联接到流体通道的加热器、成像系统和至少一个处理器。在一些实施方案中，流体通道具有多个位点，该多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面。在一些实施方案中，加热器被配置为将流体通道的内容物的温度设定在第一温度范围和第二温度范围中的任一者内，其中第一温度范围和第二温度范围不重叠。在一些实施方案中，成像系统被配置为检测第一温度范围和第二温度范围中的每一者内的多个位点中的每个位点处的强度。
该至少一个处理器被配置为执行至少一个机器可读指令。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，使得该至少一个处理器指示加热器将流体通道内的温度设定在第一温度范围内，并且从成像系统获取当流体通道的温度在第一温度范围内时在该多个位点中的每个位点处的第一强度的指示。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，还使得该至少一个处理器指示加热器将流体通道内的温度设定在第二温度范围内，并且从成像系统获取当流体通道的温度在第二温度范围内时在该多个位点中的每个位点处的第二强度的指示。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，还使得该至少一个处理器响应于该多个位点中的特定位点处的第一强度小于第一值并且该特定位点处的第二强度大于或等于第二值而确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，还使得该至少一个处理器响应于特定位点处的第一强度大于或等于第一值并且该特定位点处的第二强度大于或等于第二值且小于第三值，第三值大于第一值和第二值中的每一者，而确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令当被执行时，还使得该至少一个处理器响应于该特定位点处的第一强度大于或等于第一值并且该特定位点处的第二强度大于或等于第三值而确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
附图说明
通过结合附图对某些实施方案的以下描述，本公开的目的、特征和优点将变得显而易见，其中：
图1A示出了荧光染料的荧光强度的温度依赖性。
图1B示出了附加的荧光染料的荧光强度的温度依赖性。
图1C是图1B的注释版本，示出了如何利用四种荧光染料的发射的温度依赖性进行核酸测序。
图2A示出了根据一些实施方案的四个强度测量事件、四个温度范围和四种荧光标记的核苷酸前体用于核酸测序的用途。
图2B概念性地示出了根据一些实施方案的三个强度测量事件、三个温度范围和三种荧光标记的核苷酸前体(每一种具有不同的荧光标记物)的用途。
图2C概念性地示出了根据一些实施方案的两个强度测量事件、两个温度范围和两种荧光标记的核苷酸前体(每一种具有不同的荧光标记物)的用途。
图3A是示出根据一些实施方案对核酸进行测序的方法的流程图。
图3B示出了根据一些实施方案的该方法可如何在图3A之后继续。
图3C示出了根据一些实施方案的该方法可在图3A之后继续的另一种方式。
图3D示出了根据一些实施方案的图3A中所示方法的元素的另选排序。
图3E示出了根据一些实施方案的图3A中所示方法的元素的另一另选排序。
图4A和图4B示出了根据一些实施方案对核酸进行测序的方法。
图5是示出根据一些实施方案的用于核酸测序的系统的框图。
图6是根据一些实施方案的可使用的成像系统的部件的框图。
具体实施方式
如本文所用，术语“核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者，以及经修饰的核苷酸，诸如双脱氧核苷酸和其他链终止子核苷酸。其还包括多核苷酸内的核苷酸残基。术语“核苷酸”和“碱基”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“荧光染料”是指可通过荧光检测其存在的染料。在特定实施方案中，本文所用的荧光染料适用于核酸测序。
术语“核酸聚合酶”包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。DNA聚合酶可以是DNA依赖性的或RNA依赖性的(即，逆转录酶)。DNA聚合酶包括例如Taq DNA聚合酶(水生栖热菌DNA聚合酶)、Taq DNA聚合酶的突变形式(诸如Taq G46D F667Y DNA聚合酶)以及本领域已知的其他形式。
如本文所用，术语“核酸底物”是指通过化学或酶促反应修饰的核酸，或用作化学或酶促反应模板的核酸。例如，在核酸测序反应中，由聚合酶延伸的寡核苷酸和模板核酸均为本文所用的术语“核酸底物”。
如本文所用，术语“链终止子核苷酸”是指能够通过核酸聚合酶掺入生长的多核苷酸链中并且当掺入时终止链的单核苷酸，因为在其3'处包含链终止子核苷酸的多核苷酸末端不能用作通过核酸聚合酶添加另一核苷酸的底物。典型的终止子是其中核碱基为嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶、正常核碱基或它们的共同类似物并且糖部分是戊糖的那些，该戊糖包括阻断进一步合成的3'-取代基，诸如双脱氧核苷酸(ddNTP)。ddNTP的示例为ddGTP、ddATP、ddTTP、和ddCTP。阻止进一步合成的取代基包括但不限于氨基、脱氧基、卤素、烷氧基和芳氧基。示例性终止子包括但不限于其中糖-磷酸酯部分为3'-(C1-C6)烷基核糖-5'-三磷酸酯、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷基核糖-5'-三磷酸酯、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷氧基核糖-5'-三磷酸酯、2'-脱氧-3'-(C5-C14)芳氧基核糖-5'-三磷酸酯、2'-脱氧-3'-卤代核糖-5'-三磷酸酯、2'-脱氧-3'-氨基核糖-5'-三磷酸酯、2',3'-二脱氧核糖-5'-三磷酸酯或2',3'-二脱氢核糖-5'-三磷酸酯。
用于区分样品中的不同碱基的现有基于荧光的技术(例如，在基于荧光的核酸测序技术中)依赖于例如由与特定类型的核苷酸相关联的检测部分产生的信号的质量。例如，传统荧光测序技术利用可鉴定地不同的荧光部分，这些荧光部分各自附接到测序反应中利用的四种核苷酸A、T、C和G中的一种。
一种常规的DNA测序方法涉及使ssDNA适应于与测序设备的固相支撑物的附接，并使用诸如聚合酶链反应的技术来扩增ssDNA的量，以产生具有短前导序列的许多DNA分子。然后可添加与短前导序列互补的寡核苷酸，使得在前导序列处存在dsDNA的短区段。结合分子的双链部分是在高温下有效的合适DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶)的引物。
然后可采用若干方法中的一种来进行测序。例如，测序可使用四种荧光标记的3'-阻断NTP(荧光标记的双脱氧核苷酸终止子)的混合物，其中荧光标记是3'-阻断基团的一部分。荧光标记用作聚合反应的“可逆终止子”。NTP中的每种NTP由不同的标记物标记(例如，A、G、C和T核苷酸中的每种核苷酸具有不同的标记物)，并且不同的标记物可通过荧光光谱法或通过其他光学手段来区分。
四种荧光标记的核苷酸前体可用于对数百万簇平行的DNA链进行测序。DNA聚合酶催化在DNA合成的顺序循环期间将荧光标记的dNTP掺入DNA模板链中。在每个测序循环中，将结合的双链DNA分子暴露于DNA聚合酶和四种荧光标记的3'-阻断NTP的混合物。聚合酶将四种dNTP中的一种添加到生长中的寡核苷酸链(即，无论哪种dNTP与ssDNA中的下一个未配对碱基互补)。然后通过在防止游离dNTP与ssDNA结合但不会高到使dsDNA去杂交的温度下进行洗涤，将未掺入的dNTP和在反应期间留下未反应或产生的其他杂质从支撑物结合的DNA附近分离。
因为四种类型的dNTP中仅有一种将被添加到寡核苷酸，而且四种荧光标记是能够区分的，所以可通过激光激发和成像来鉴定掺入的dNTP的身份。具体地讲，四个滤光器中的每一个用于确定是否发射特定波长(例如，颜色)的光。然后可将荧光标记酶促裂解以允许下一轮掺入。因为每个碱基类型可与仅一个其他碱基类型配对，所以可从掺入的dNTP的身份(其从发射光的波长获知)来知道未知ssDNA序列中的刚好配对的碱基的身份。因此，在每个循环期间直接从荧光测量来鉴定碱基。
上述方法的一个缺点是，需要复杂的光学系统来滤除不同波长的光以检测所掺入的dNTP的荧光标记物并区分不同的发射颜色。已经开发出其他方法来简化光学系统，但它们的测序较慢并且在每个测序循环内需要中间化学步骤。因此，这些方法已被引入到较小、较便宜的入门级测序系统中，但未被引入到需要快速吞吐的较高级的系统中。
本文公开了对核酸进行测序的改进方法。发明人认识到，一些荧光染料以随温度变化的强度发射光，并且发光强度的这种温度依赖性可用于核酸测序应用。本发明所公开的方法能够使用比上述常规四染料方法更简单的光学系统，因为它们不需要波长滤波。相反，在每个测序循环期间调节系统的温度(例如，通过使用测序设备的集成加热元件)。此外，可在单个步骤中引入所有四种碱基。荧光染料在不同温度下(或在不同温度范围内)光的发射或不发射可用于检测掺入的dNTP的荧光标记物，从而对核酸进行测序。例如，并且如下文将在一些实施方案的上下文中进一步详细描述的，在包含四个链终止子核苷酸的组合物中，每个链终止子核苷酸连接到不同的荧光染料，四种荧光染料中的每一种将以依赖于温度的方式发射光，使得它与其他染料可区分。
荧光染料的温度响应已被用于对微流体和生物系统进行微观尺度局部温度测量。一些此类系统在由D.Ross、M.Gaitan和L.Locasco于2001年出版的名称为“TemperatureMeasurement in Microfluidic Systems Using aTemperature-Dependent FluorescentDye”的论文(Analytical Chemistry，第73卷，第17期，2001年9月1日)中有所描述。本文中的图1A示出了一种此类荧光染料即罗丹明B的荧光强度的温度依赖性。如图1A所示，强度随着温度升高而单调降低。在室温(假定为20摄氏度)以上，发射光的强度迅速降低。因此，如果核酸测序设备中的检测器具有峰值强度的例如80％的检测阈值，则其将在低于约32摄氏度但不高于该温度的温度下检测染料。
作为比较，图1B示出了各种香豆素染料的荧光强度的温度依赖性，所述染料即4-甲基-7-甲氧基(在图1B中标记为“I”)、4-甲基-5,7-二乙氧基(标记为“II”)、4-甲基-5-乙氧基-7-甲氧基(标记为“III”)和4-甲基-7,8-二乙氧基(标记为“IV”)。(参见例如，R.Giri，“Temperature effect study upon the fluorescence emission of substitutedcoumarins”，Spectrochimica Acta Part A:Molecular Spectroscopy，第48卷，第6期，1992年6月，第843页-848页。)如图1B所示，4-甲基-7,8-二乙氧基(IV)的强度对温度相对不敏感。相比之下，4-甲基-7-甲氧基(I)的强度随温度升高而快速降低。
因此，发明人认识到可利用强度响应，使得对温度变化具有不同响应的两种不同荧光标记物可用于区分核酸测序中的两种核苷酸。例如，罗丹明(图1A)和香豆素(III)(图1B)的温度响应的比较表明，在50摄氏度下，罗丹明的强度是其在室温下的值的一半，而香豆素(III)的强度是其在室温下的值的百分之九十。假设罗丹明和香豆素(III)的强度在室温下大致相同，则通过将光电探测器调节为具有设定为介于50％和90％(例如，75％)之间值的光强度的最小灵敏度，光电探测器将在室温下检测来自两种染料的光，但在50摄氏度下仅检测来自香豆素(III)的光。该方法相对于核酸测序的常规方法的一个优点是不需要过滤发射光的波长或确定由染料发射的光的颜色；了解染料被激发成荧光时发射的光强度的温度依赖性可以区分不同的染料。因此，减少或完全消除了对与需要具有光学滤光器相关联的复杂性和费用的需要。
应当理解，所选择的染料的强度分布无需为单调的、平滑的或线性的。预期所选择的染料可在一些温度范围内具有可预测的发光强度，并且在其他范围内具有不可预测的(或非线性的、随机的等)发光强度。
图1C是图1B的注释版本以示出可如何使用不同荧光染料的温度依赖性来区分染料。应当理解，图1B和图1C示出了四种荧光染料的归一化强度。因此，该解释假定由这些荧光染料中的每一者在室温下发射的光的峰值强度(如果20摄氏度为室温，则为大约273开尔文)大致相同。
如图1C所示，已选择大致85％强度的阈值作为示例。在标有“范围1”的最高温度范围内，仅染料IV以达到或超过阈值的强度发射光。在标记为“范围2”的下一最高温度范围内，仅染料III和IV以达到或超过阈值的强度发射光。在下一最高温度范围(标记为“范围3”)、最低温度范围内，仅染料II、III和IV以达到或超过阈值的强度发射光。最后，在最低温度范围(标记为“范围4”)内，所有四种荧光染料以达到或超过阈值的强度发射光。
继续图1C所示的示例，在DNA测序应用中，四种核苷酸中的每一种可用所示的四种荧光染料中不同的一种标记。例如，A可用染料I标记，G可用染料II标记，T可用染料III标记，并且C可用染料IV标记。当温度在范围1内时，仅染料IV将以达到或超过阈值的强度发射光。因此，如果在温度范围1内，检测到光等于或高于阈值，则掺入的碱基必为胞嘧啶(C)。另一方面，如果在温度范围1内没有检测到等于或高于阈值的光，则掺入的碱基不是胞嘧啶(C)。可在四个温度范围中的每一者内拍摄图像以记录检测到的光(或不存在检测到的光)。如本文所用，术语“图像”是指发射光的存在或不存在的任何记录(例如，在多个物理位置上方的光学响应)。例如，图像可以从字面上讲是测序设备的流体通道的图像，其使用相机来记录，潜在地使用滤光器在核酸链(或链的部分)附接或结合的特定物理位置处检测特定波长的光。又如，图像可以是记录在核酸附接或结合的各种物理位置处发射光的检测到强度(例如，单位为坎德拉、流明或任何其他合适的单位)的数据文件。再如，图像可以是记录在核酸附接或结合的特定位置处是否检测到光的数据文件(例如，如果检测到光超过阈值，则为1；如果未检测到光超过阈值，则为0)。无论其形式如何，图像都可以暂时或永久地存储(例如，使得其内容可以与其他图像进行比较)，或者其可以是瞬态的(例如，实时创建并与先前创建和存储的图像进行比较)。
当温度在范围2内时，仅染料III(T)和IV(C)将以达到或超过阈值的强度发射光。因此，如果在温度范围2内，检测到光等于或高于阈值，则掺入的碱基不是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。基于了解当温度在范围1内时是否检测到高于阈值的光，可确定掺入的碱基是胞嘧啶(C)(在范围1和范围2中检测到光)还是胸腺嘧啶(T)(在范围1中未检测到光，在范围2中检测到光)。
当温度在范围3内时，除染料I之外的所有染料将以高于阈值的强度发射光。因此，如果在温度范围3内，检测到光等于或高于阈值，则可断定掺入的碱基不是腺嘌呤(A)。基于了解当温度在范围1内、范围2内和范围3内时是否检测到高于阈值的光，可确定掺入的碱基是胞嘧啶(C)(在范围1、2和3中检测到光)、胸腺嘧啶(T)(在范围1中未检测到光，但在范围2和3中检测到光)还是鸟嘌呤(G)(在范围1和2中未检测到光，但在范围3中检测到光)。
当温度在范围4内时，所有染料将发出等于或高于阈值的光。基于对在四个温度范围中的每一者内的光(或不存在光)的检测的评估，可确定测序步骤中哪个核苷酸已被掺入。具体地讲，如果在所有四个温度范围内检测到光，则核苷酸为胞嘧啶(C)；如果仅在2、3和4范围内检测到光，则核苷酸为胸腺嘧啶(T)；如果仅在范围3和4内检测到光，则核苷酸为鸟嘌呤(G)；并且如果仅在范围4内检测到光，则核苷酸为腺嘌呤(A)。
如该示例所示，通过操纵每个测序步骤期间的温度(例如，在测序循环期间将温度设定为不同的值并检测是否存在等于或高于阈值的发射光)，可将不同的掺入的碱基彼此区分开。这些温度范围可以任何顺序测试。应当理解，当希望确定在被测序的特定核酸链中是否和哪个碱基已被掺入时，从范围1开始可能是有利的，因为如果在循环期间在范围1中检测到光，则可以断定掺入的核苷酸是胞嘧啶(C)。因此，如果在范围1中检测到等于或高于阈值的发射光，则不需要检查范围2、3或4。还应当理解，首先在范围3中测试可能是有利的，因为如果在范围3中未检测到光，则可以断定掺入的核苷酸是腺嘌呤(A)。因此，不需要检查范围1、2或4。
如前文所述，在一些类型的SBS中，长链DNA(或来自单个供体生物体的DNA的多个长链)在测序之前被分割成较小的随机长度片段。来自相同供体的所有这些较短链是待测序的完整链的随机化子链。例如，如果完整链包括序列ATGGCTTAGCCATACCGAT，则较短链可包括例如不同的子链(例如，TGGCTT和CCATACCGA)，以及如果将多个较长链分割成子链，则较短链可包括部分或完全与其他子链重叠的子链(例如，CTTAGCCAT和ATGGCTTAGCC)。所有较短的随机化子链可同时被测序，这可能是在扩增之后。在此类应用中，应当理解，因为子链不表示相同的子序列，所以希望确定这些温度范围中的每一者内的强度，因为对子链的测序不会在子链之间协调(或同步)。例如，在单个测序循环期间，第一子链可掺入胞嘧啶，第二子链可掺入胸腺嘧啶，并且第三子链可掺入腺嘌呤。为了对较大核酸链的多个随机片段进行测序，希望在每个测序循环中确定是否掺入了每种dNTP以及每种dNTP在哪个物理位置掺入。
如本领域的技术人员参考本文的公开内容将会理解的那样，如果不同染料的峰强度不同，则可使用如图1C的上下文中所述相同的一般程序。在此类情况下，适用于不同温度范围内的强度阈值可不同，并且可基于对每种荧光染料的温度依赖性特性的了解来确定适当的值。
图2A至图2C示出了根据一些实施方案如何可使用这些原理识别不同的掺入的核苷酸。四种核苷酸中的每一种可用不同的染料标记，每种染料具有对温度的不同荧光强度依赖性。染料的颜色是无关紧要的，只要每种染料的荧光强度下降到阈值以下时的温度是不同的。
图2A概念性地示出了根据一些实施方案的四幅图像、四幅温度范围和四种荧光标记的核苷酸前体的用途，每种核苷酸前体具有不同的荧光标记物(其可以是可裂解的)。图2A实际上为可单独应用的逻辑表，以确定对于每条核酸链或子链，哪种核苷酸已被掺入到该链或子链中。例如，如果假定图1C中所示的荧光染料、阈值和温度范围，则A用染料I标记，G用染料II标记，T用染料III标记，并且C用染料IV标记。在将核苷酸掺入生长的核酸链中后，将反应温度设定在其中一个温度范围内。出于该解释的目的，假定测试从最高温度进行到最低温度。如上所述，该顺序是任意的，并且这些温度范围可以任何顺序测试。此外，根据当温度在特定范围内时获取的结果，在测序循环中测试多于一个温度范围可能是不必要的。如上所述，当随机化子链同时测序时，应当理解，因为子链不表示相同的子序列，所以希望确定这些温度范围中的每一者内的强度，因为对子链的测序不会在子链之间协调(或同步)。
在将温度设定在范围1内(在该示例中，假定该范围为四个温度范围中的最高温度)之后，然后将反应暴露于光，并且观察荧光并记录为图像1；这构成了第一成像事件和第一荧光检测模式。然后将温度降低至范围2内。再次照射反应位置，并且捕获荧光并记录为图像2，从而构成第二成像事件(例如，第二荧光检测图案)。然后将温度降低至范围3内。再次照射反应位置，并且捕获荧光并记录为图像3，从而构成第三成像事件(例如，第三荧光检测图案)。然后将温度降低至范围4内。再次照射反应位置，并且捕获和记录荧光的任何变化，从而构成第四成像事件(例如，第四荧光检测模式)。
如图2A所示，图像1当温度在范围1内时拍摄，图像2当温度在范围2内时拍摄，图像3当温度在范围3内时拍摄，并且图像4当温度在范围4内时拍摄。在温度范围4内，所有四种染料均以大于阈值的强度发射光，如图2A所示，因此不可能从单独的图像4中确定四种荧光标记的核苷酸前体中的哪一种已经掺入到可延伸引物中。然而，在温度范围3内，仅标记G、T和C的荧光染料将以大于阈值的强度发射光。因此，基于图像4中大于阈值强度的发射光的存在以及图像3中不存在等于或高于阈值的发射光，可确定掺入的核苷酸前体为A。类似地，仅标记T和C的荧光染料将在温度范围2内以大于阈值的强度发射光。因此，基于图像4和3中大于阈值强度的发射光的存在以及图像2中不存在等于或高于阈值的发射光，可确定掺入的核苷酸前体为G。类似地，仅标记C的荧光染料将在温度范围1内以大于阈值的强度发射光。因此，基于图像4、3和2中大于阈值强度的发射光的存在以及图像1中不存在等于或高于阈值的发射光，可以确定掺入的核苷酸前体为T。当然，如果检测到强度在所有四幅图像中超过阈值，则可以确定掺入的核苷酸前体为C。
因为所有四种荧光标记的核苷酸前体在温度范围4中以达到或超过阈值的强度发射光，所以可以通过消除温度范围4中的成像来简化程序。图2B概念性地示出了根据一些实施方案的三幅图像、三个温度范围和三种荧光标记的核苷酸前体(每一种具有不同的荧光标记物)的用途。类似于图2A，图2B实际上为可单独应用的逻辑表，以确定对于每条核酸链或子链，哪种核苷酸已被掺入到该链或子链中。第四核苷酸前体(在图2B中显示为鸟嘌呤(G))是未标记的。在该方法中，图像1当温度在范围1内时拍摄，图像2当温度在范围2内时拍摄，并且图像3当温度在范围3内时拍摄。
标记胞嘧啶(C)的荧光染料是在温度范围1内以大于或等于阈值的强度发射光的唯一染料。因此，如果在图像1中检测到强度大于或等于阈值，则可确定掺入的核苷酸前体为胞嘧啶(C)。否则，图像2可用于确定掺入的核苷酸前体是否为T：因为仅标记胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的荧光染料将以大于温度范围2内的阈值的强度发射光，图像2中大于阈值强度而图像1中小于阈值强度的发射光的存在表明掺入的核苷酸前体为胸腺嘧啶(T)。类似地，标记腺嘌呤(A)的荧光染料将仅在范围3内以大于阈值的强度发射光。因此，基于图像3中而不是图像2或图像1中大于阈值强度的发射光的存在，可确定掺入的核苷酸前体为腺嘌呤(A)。如果在图像1、2或3中的任一者中未检测到大于阈值强度的发射光，则可断定(例如，推断)掺入的核苷酸为鸟嘌呤(G)。
图2C示出了根据一些实施方案的另选的实施方案，其中仅使用两幅图像来确定四种核苷酸前体中的哪一种已被掺入。该实施方案使用强度敏感高于其强度阈值的光电检测器，这意味着它不仅检测到存在发射光，而且还检测到发射光的强度。类似于图2A和图2B，图2C实际上为可单独应用的逻辑表，以确定对于每条核酸链或子链，哪种核苷酸已被掺入到该链或子链中。一种核苷酸(如图2C中的T所示)用第一染料标记，并且第二核苷酸(如图2C中的C所示)用第二染料标记。一种核苷酸(如图2C中的A所示)用两种染料标记。第四核苷酸(如图2C中的G所示)是未标记的。
有多种方法来附接荧光标记物，并且在必要时裂解荧光标记物。例如，荧光标记物可附接到碱基，在这种情况下它们可被化学裂解。又如，荧光标记物可附接到磷酸盐，在这种情况下，它们可被聚合酶裂解，或者如果经由接头附接，则可通过裂解接头而裂解。
在一些实施方案中，荧光标记物连接至核苷酸前体的含氮碱基(A、C、T、G或衍生物)。在掺入核苷酸前体并检测发射光后，将荧光标记物从掺入的核苷酸上裂解下来。
在一些实施方案中，荧光标记物经由可裂解的接头附接。可裂解的接头是本领域已知的，并且已例如在美国专利7,057,026、7,414,116以及这些专利的继续申请和改进中进行了描述。在一些实施方案中，荧光标记物经由包含烯丙基或叠氮基团的接头附接到嘧啶中的5-位或嘌呤中的7-位。在其他实施方案中，接头包含二硫化物、吲哚、Sieber基团、叔丁基Sieber基团或二烷氧基苄基基团。接头还可包含选自烷基(C1-6)或烷氧基(C1-6)、硝基、氰基、氟基团或具有类似性能的基团的一个或多个取代基。简而言之，接头可被水溶性膦或基于膦的含过渡金属的催化剂裂解。其他接头和接头裂解机制是本领域已知的。例如，包括三苯甲基基团、对烷氧基苄酯基团、对烷氧基苄酰胺基团、叔丁氧羰基(Boc)基团和基于缩醛的基团的接头可在酸性条件下被质子释放裂解剂诸如酸裂解。可使用亲硫金属(诸如，镍、银或汞)裂解硫缩醛或其他含硫接头。裂解保护基团也可考虑用于制备合适的接头分子。含酯和二硫化物的接头可在还原条件下裂解。包含三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的接头可在存在F离子的情况下裂解。以不影响反应混合物的其他组分的波长裂解的可光裂解的接头包括包含邻硝基苄基基团的接头。包含苄氧羰基基团的接头可被钯系催化剂裂解。
在一些实施方案中，核苷酸前体包含附接到多磷酸盐部分的荧光标记物，如例如美国专利7,405,281和8,058,031中所述。简而言之，核苷酸前体包括核苷部分和3个或更多个磷酸酯基团的链，其中氧原子中的一个或多个氧原子任选地用例如S取代。标记物可直接或经由接头附接到α、β、γ或更高级的磷酸酯基团(如果存在的话)。在一些实施方案中，荧光标记物经由非共价接头附接到磷酸酯基团，如例如美国专利8,252,910中所述。在一些实施方案中，接头为选自以下项的烃：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基以及取代或未取代的杂环烷基；参见例如美国专利8,367,813。接头还可包含核酸链；参见例如美国专利9,464,107。
在其中荧光标记物连接至磷酸基团的实施方案中，核苷酸前体通过核酸聚合酶掺入到新生链中，该核酸聚合酶还裂解和释放可检测的荧光标记物。在一些实施方案中，通过裂解接头来移除荧光标记物，例如，如美国专利9,587,275中所述。
在一些实施方案中，核苷酸前体是不可延伸的“终止子”核苷酸，即具有被阻断“终止子”基团阻断下一个核苷酸添加的3'端的核苷酸。阻断基团为可逆终止子，其可被移除以继续如本文所述的链合成过程。将可移除的阻断基团附接到核苷酸前体是本领域已知的。参见例如美国专利7,541,444、8,071,739以及这些专利的继续申请和改进。简而言之，阻断基团可包含烯丙基基团，该烯丙基基团可通过在存在膦或氮-膦配体的情况下在水溶液中与金属-烯丙基络合物反应而断裂。用于通过合成测序的可逆终止子核苷酸的其他示例包括描述于提交于2018年12月19日并且名称为“3’-Protected Nucleotides”的美国临时专利申请序列号62/781,638中的经修饰的核苷酸，该专利申请据此全文以引用方式并入以用于所有目的。
在图2C所示的实施方案中，图像1在第一温度范围内的温度下拍摄，并且图像2在第二、较低温度范围内的温度下拍摄。如果两幅图像中的发光强度均低于阈值，则确定掺入的核苷酸为鸟嘌呤(G)。如果发光强度高于图像2中的阈值但低于图像1中的阈值，则确定掺入的核苷酸为胞嘧啶(C)。如果两幅图像中的发光强度均高于阈值，则可通过比较两幅图像中的发射光的强度来区分腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)。在图2C的示例中，如果检测到强度在两幅图像中大致相同，则可确定掺入的核苷酸为胸腺嘧啶(T)，因为第一染料在两个温度范围内发射已知强度的光。应当理解，当(在该示例中)掺入胸腺嘧啶时，发射光的强度在图像1和2中可大致相同。例如，如果图1C的染料IV用于标记胸腺嘧啶，则强度将大致相同。另选地，与胸腺嘧啶相关联的强度可在图像1和图像2中不同。例如，如果图1C的染料II用于标记胸腺嘧啶，则两幅图像中的测量强度可不同。然而，将已知的是，在拍摄图像1和2的相应温度下从标记胸腺嘧啶的染料预期强度是多少。
因为第三核苷酸(在图2C中显示为腺嘌呤(A))已经用两种染料标记，其中一种染料也标记胸腺嘧啶(T)，并且标记胸腺嘧啶的染料发光的强度对于获取图像1和2的两个温度是已知的，可以确定掺入了腺嘌呤(A)还是胸腺嘧啶(T)，因为当掺入的核苷酸是腺嘌呤(A)时，图像2的发光强度将高于当其是胸腺嘧啶(T)时的发光强度。因此，如果检测到强度在图像2中比在图像1中高，并且其大于标记胸腺嘧啶(T)的染料的预期发光强度，则可确定掺入的核苷酸是腺嘌呤(A)。该实施方案的一个优点是，在拍摄两幅图像之间不需要添加任何化学试剂来改变或移除任何标记物。可仅通过比较图像1和2中的检测到强度水平来确定掺入的核苷酸。下表提供了与图2C所示和上文所述的示例相关联的决策表，其中阈值1是检测温度范围1内的第一染料的强度阈值；可与阈值1相同或不同的阈值2是在温度范围2内检测第一染料的强度阈值；阈值3是在温度范围2内检测第二染料的强度阈值；并且大于阈值2和3两者的阈值4是在温度范围2内检测第一染料和第二染料两者的存在的强度阈值。
图像1强度 图像2强度 测定
<阈值1 <阈值2 鸟嘌呤(G)
<阈值1 ≥阈值3 胞嘧啶(C)
≥阈值1 ≥阈值2且<阈值4 胸腺嘧啶(T)
≥阈值1 ≥阈值4 腺嘌呤(A)
图2C所示并且如上所述的方法的一个有益效果是，与使用两个成像事件的常规方法不同，它不需要循环内的任何附加化学步骤。
图3A是示出根据一些实施方案对核酸进行测序的方法100的流程图。方法100涉及测序设备的用途，该测序设备包括具有多个位点的流体通道，该多个位点用于将核酸聚合酶的多个分子或多条核酸链(例如，如上文所述和本领域已知的)结合到流体通道的表面。在102处，该方法开始。在104处，将材料添加到流体通道。该材料包含至少多条核酸链、核酸聚合酶的多个分子、第一荧光标记的核苷酸前体和第二荧光标记的核苷酸前体。
在步骤104中添加的材料可同时或以一轮或多轮添加的方式添加到流体通道。例如，在一些实施方案中，核酸聚合酶的分子首先在这些位点处结合到流体通道的表面，然后将剩余的材料添加到该流体通道。在其他实施方案中，核酸链首先在这些位点处结合到流体通道的表面，然后将剩余的材料添加到该流体通道。
第一荧光标记的核苷酸前体包含第一荧光标记物(其可以是可裂解的)。第一荧光标记物发出的强度在第一温度范围内以及在低于该第一温度范围且不与第一温度范围重叠的第二温度范围内大于或等于第一阈值。换句话讲，第一荧光标记物将在第一温度范围和第二温度范围内以至少第一阈值的强度发射光。第一温度范围和第二温度范围可以是相邻的(例如，第一温度范围从30摄氏度至50摄氏度，并且第二温度范围从10摄氏度至30摄氏度)，或者它们可以由温度间隙隔开(例如，第一温度范围是40摄氏度至50摄氏度，并且第二温度范围从20摄氏度至35摄氏度)。
第二荧光标记的核苷酸前体包含第二荧光标记物(其可以是可裂解的)。由第二荧光标记物发出的强度在第一温度范围内小于第二阈值，在第二温度范围内大于或等于第二阈值。换句话讲，仅考虑第一温度范围和第二温度范围，第二荧光标记物将仅在第二(较低)温度范围内以至少第二阈值的强度发射光；在第一(较高)温度范围内，第二荧光标记物将不发射强度达到或超过第二阈值的光。第一阈值和第二阈值可以相同，或者它们可以不同。应当理解，第二荧光标记物可以在第一温度范围和第二温度范围之外的温度范围内以至少第二阈值的强度发射光。例如，第二荧光标记物可以在低于第二温度范围的温度下以至少第二阈值的强度发射光。还可以设想，第二荧光标记物可以在高于第一温度范围的温度下以至少第二阈值的强度发射光。
有多种方法来附接荧光标记物，并且如果需要的话，裂解荧光标记物。例如，荧光标记物可附接到碱基，在这种情况下它们可被化学裂解。又如，荧光标记物可附接到磷酸盐，在这种情况下，它们可被聚合酶裂解，或者如果经由接头附接，则可通过裂解接头而裂解。
在一些实施方案中，荧光标记物连接至核苷酸前体的含氮碱基(A、C、T、G或衍生物)。在掺入核苷酸前体并检测后，将荧光标记物从掺入的核苷酸上裂解下来。
在一些实施方案中，荧光标记物经由可裂解的接头附接。可裂解的接头是本领域已知的，并且已例如在美国专利7,057,026、7,414,116以及这些专利的继续申请和改进中进行了描述。在一些实施方案中，荧光标记物经由包含烯丙基或叠氮基团的接头附接到嘧啶中的5-位或嘌呤中的7-位。在其他实施方案中，接头包含二硫化物、吲哚、Sieber基团、叔丁基Sieber基团或二烷氧基苄基基团。接头还可包含选自烷基(C1-6)或烷氧基(C1-6)、硝基、氰基、氟基团或具有类似性能的基团的一个或多个取代基。简而言之，接头可被水溶性膦或基于膦的含过渡金属的催化剂裂解。其他接头和接头裂解机制是本领域已知的。例如，包括三苯甲基基团、对烷氧基苄酯基团、对烷氧基苄酰胺基团、叔丁氧羰基(Boc)基团和基于缩醛的基团的接头可在酸性条件下被质子释放裂解剂诸如酸裂解。可使用亲硫金属(诸如，镍、银或汞)裂解硫缩醛或其他含硫接头。裂解保护基团也可考虑用于制备合适的接头分子。含酯和二硫化物的接头可在还原条件下裂解。包含三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的接头可在存在F离子的情况下裂解。以不影响反应混合物的其他组分的波长裂解的可光裂解的接头包括包含邻硝基苄基基团的接头。包含苄氧羰基基团的接头可被钯系催化剂裂解。
在一些实施方案中，核苷酸前体包含附接到多磷酸盐部分的标记物，如例如美国专利7,405,281和8,058,031中所述。简而言之，核苷酸前体包括核苷部分和3个或更多个磷酸酯基团的链，其中氧原子中的一个或多个氧原子任选地用例如S取代。标记物可直接或经由接头附接到α、β、γ或更高级的磷酸酯基团(如果存在的话)。在一些实施方案中，标记物经由非共价接头附接到磷酸酯基团，如例如美国专利8,252,910中所述。在一些实施方案中，接头为选自以下项的烃：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基以及取代或未取代的杂环烷基；参见例如美国专利8,367,813。接头还可包含核酸链；参见例如美国专利9,464,107。
在其中荧光标记物连接至磷酸基团的实施方案中，核苷酸前体通过核酸聚合酶掺入到新生链中，该核酸聚合酶还裂解和释放可检测的荧光标记物。在一些实施方案中，通过裂解接头来移除荧光标记物，例如，如美国专利9,587,275中所述。
在一些实施方案中，核苷酸前体是不可延伸的“终止子”核苷酸，即具有被阻断“终止子”基团阻断下一个核苷酸添加的3'端的核苷酸。阻断基团为可逆终止子，其可被移除以继续如本文所述的链合成过程。将可移除的阻断基团附接到核苷酸前体是本领域已知的。参见例如美国专利7,541,444、8,071,739以及这些专利的继续申请和改进。简而言之，阻断基团可包含烯丙基基团，该烯丙基基团可通过在存在膦或氮-膦配体的情况下在水溶液中与金属-烯丙基络合物反应而断裂。用于通过合成测序的可逆终止子核苷酸的其他示例是本领域已知的。
再次参见图3A，在106处，在已将核酸链、聚合酶分子以及第一荧光标记的核苷酸前体和第二荧光标记的核苷酸前体添加到流体通道之后，将流体通道的内容物的温度设定在第一温度范围内。在108处，当温度在第一温度范围内时，照射设备(例如，通过激光器)，并且捕获流体通道的内容物的第一图像，例如，当流体通道的温度在第一温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第一强度。第一图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。如前所述，图像是发射光的存在或不存在的记录(例如，多个物理位置上方的光学响应)。
在110处，评估图像以确定第一图像在该多个位点中的特定位点处的强度是否大于或等于第一值。如果第一图像在特定位点处的强度大于或等于第一值，则在112处确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入到可延伸引物中。对于其他位点中的一些或全部，可使用相同的方法确定第一荧光标记的核苷酸前体是否已在那些位点处掺入到可延伸引物中。
如果在110处确定第一图像在该特定位点处的强度不大于或等于第一值，则在114处，流体通道的内容物的温度被设定在第二(较低)温度范围内。在116处，当温度在第二温度范围内时，照射设备(例如，通过激光器)，并且捕获流体通道的内容物的第二图像，例如，当流体通道的温度在第二温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第二强度。第二图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。在118处，确定第二图像在该多个位点中的特定位点处的强度是否大于或等于第二值，以及第一图像在该特定位点处的强度是否小于第一值。第一值和第二值可以大致相同，或者它们可以不同。在一些实施方案中，第一值为第一阈值，并且第二值为第二阈值。在一些实施方案中，第一值基于第一阈值，并且第二值基于第二阈值。例如，第一值可以是第一阈值的倍数或第一阈值的百分比。类似地，第二值可以是第二阈值的倍数或第二阈值的百分比。
如果第二图像在该多个位点的特定位点处的强度大于或等于第二值并且第一图像在该特定位点处的强度小于第一值，则在120处确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入到可延伸引物中。对于其他位点中的一些或全部，可使用相同的方法确定第二荧光标记的核苷酸前体是否已在那些位点处掺入到可延伸引物中。
如上所述，图3A所示的方法100使得能够确定两种荧光标记的核苷酸前体中的任一种是否已在核苷酸测序过程的循环期间掺入。步骤104至120可在一个或多个后续测序循环中再次进行，例如，在裂解第一荧光标记物和第二荧光标记物之后。
如下文更详细地描述，在一些实施方案中，方法100包括除图3A所示的那些之外的步骤。例如，在一些实施方案中，方法100包括图3B所示的步骤或图3C所示的步骤。
应当理解，尽管图3A示出了方法100，好像流体通道的内容物的温度最初被设定在最高温度范围内然后冷却一样，但是具体实施可以第二温度范围内的温度开始，然后将流体室的内容物加热到第一(更高)温度范围内。在图3D中示出了此类实施方案。如图所示，与第一温度范围和第一图像相关联的步骤可发生在与第二温度范围和第二图像相关联的步骤之后。
再次参见图3A，在一些实施方案中，方法100在112之后终止，因为已确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入。然而，应当理解，虽然图3A示出了以特定顺序发生的步骤(例如，在步骤114之前发生的步骤110)，但这些步骤中的各种步骤可以与所示顺序不同的顺序发生。例如，如上文在图3D的上下文中所解释的，可首先测试较低温度范围。又如，不需要在成像步骤之间确定强度是否大于或等于指定值。在一些实施方案中，捕获了第一图像和第二图像，然后分析图像以确定是掺入第一荧光标记的核苷酸前体还是第二荧光标记的核苷酸前体。图3E示出了此类实施方案。应当理解，虽然图3E示出了在步骤114和116之前发生的步骤106和108，但步骤114和116可在步骤106和108之前执行。
再次参见图3A，如果在118处确定第二图像在该特定位点处的强度不大于或等于第二值或第一图像在该特定位点处的强度不小于第一值，然后得出结论，第一荧光标记的核苷酸前体和第二荧光标记的核苷酸前体均未在该特定位点处掺入。在这种情况下，方法100可结束，或者可执行进一步的分析。图3B示出了根据一些实施方案的方法100可如何继续。图3B示出了确定至少第三荧光标记的核苷酸前体是否已在特定位点处掺入的步骤。图3B还提供了第四荧光标记的核苷酸前体是否已在特定位点处掺入的测定。图3A和图3B的组合示出了实现图2A所示方法的方法100，如上所述。
参见图3B，在130处，将第三荧光标记的核苷酸前体添加到流体通道。步骤130可以与图3A所示的步骤104结合(例如，可以基本上同时将第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体和第三荧光标记的核苷酸前体添加到流体室中)，或者可以是单独的步骤。第三荧光标记的核苷酸前体包含第三荧光标记物(其可以是可裂解的)。由第三荧光标记物发出的强度在第一温度范围和第二温度范围内小于第三阈值，在低于第一温度范围和第二温度范围两者的第三温度范围内大于或等于第三阈值。换句话讲，仅考虑第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围，第三荧光标记物将仅在第三温度范围内以至少第三阈值的强度发射光；在较高的第一温度范围和第二温度范围内，第三荧光标记物将不发射强度达到或超过第三阈值的光。第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围是不重叠的，并且它们可彼此相邻，或者在第一温度范围与第二温度范围之间和/或在第二温度范围与第三温度范围之间可存在温度间隙。应当理解，第三荧光标记物可以在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围之外的温度范围内以至少第三阈值的强度发射光。例如，第三荧光标记物可以在低于第三温度范围的温度下以至少第三阈值的强度发射光。还可以设想，第三荧光标记物可以在高于第一温度范围的温度下以至少第三阈值的强度发射光。第三阈值可与第一阈值和/或第二阈值大致相同(即，等于)。另选地，第三阈值可不同于第一阈值和/或第二阈值。
在132处，将流体通道的内容物的温度设定在第三温度范围内。在134处，当温度在第三温度范围内时，照射设备，并且捕获流体通道的内容物的第三图像，例如，当流体通道的温度在第三温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第三强度。第三图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。
在136处，评估第三图像以确定第三图像在该多个位点中的特定位点处的强度是否大于或等于第三值。第三值可与第一值和/或第二值大致相同(或等于)。如果第三图像在该特定位点处的强度大于或等于第三值，并且第一图像在该特定位点处的强度小于第一值，并且第二图像在该特定位点处的强度小于第二值，则在138处，确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入到可延伸引物中。对于其他位点中的一些或全部，可使用相同的方法确定第三荧光标记的核苷酸前体是否已在那些位点处掺入到可延伸引物中。
如果在136处确定第三图像在该特定位点处的强度不大于或等于第三值，则在140处，将第四荧光标记的核苷酸前体添加到流体室中。步骤140可与步骤130和/或步骤104(在图3A中示出)组合。第四荧光标记的核苷酸前体包含第四荧光标记物(其可以是可裂解的)。由第四荧光标记物发射的强度在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围内小于第四阈值，并且在低于所有第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围的第四温度范围内大于或等于第四阈值。换句话讲，仅考虑第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围，第四荧光标记物将仅在第四温度范围内以至少第四阈值的强度发射光；在较高的第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围内，第四荧光标记物将不发射强度达到或超过第四阈值的光。应当理解，第四荧光标记物可以在第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围之外的温度范围内以至少第四阈值的强度发射光。例如，第四荧光标记物可以在低于第四温度范围的温度下以至少第四阈值的强度发射光。还可以设想，第四荧光标记物可以在高于第一温度范围的温度下以至少第四阈值的强度发射光。第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围是不重叠的，并且它们可彼此相邻，或者在第一温度范围与第二温度范围之间、在第二温度范围与第三温度范围之间和/或在第三温度范围与第四温度范围之间可存在温度间隙。第四阈值可与第一阈值、第二阈值和/或第三阈值大致相同(即，等于第一阈值、第二阈值和/或第三阈值)，或者其可与第一阈值、第二阈值和/或第三阈值不同。
在142处，将流体通道的内容物的温度设定在第四温度范围内。在144处，当温度在第四温度范围内时，照射设备，并且捕获流体通道的内容物的第四图像，例如，当流体通道的温度在第四温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第四强度。第四图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。在146处，确定该多个位点中的特定位点处的第四图像的强度是否大于或等于第四值。第四值可与第一值、第二值和/或第三值大致相同(即，等于)。如果是这样，并且如果第一图像在该特定位点处的强度小于第一值，并且第二图像在该特定位点处的强度小于第二值，并且第三图像在特定位点处的强度小于第三值，则在148处，确定第四荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入到可延伸引物中。对于其他位点中的一些或全部，可使用相同的方法确定第四荧光标记的核苷酸前体是否已在那些位点处掺入到可延伸引物中。
应当理解，图3D或图3E可替代图3A。同样，应当理解，可以对图3A和图3B的组合进行类似于上文在图3D和图3E的上下文中所述那些的变化。具体地讲，测试温度范围的顺序不需要从最高到最低，或甚至为单调的(例如，可以设想，温度范围可以任何顺序测试)。类似地，在拍摄每幅图像之后并且在改变流体通道的内容物的温度之前分析每幅图像是不必要的(例如，可在任何分析之前拍摄两幅或更多幅图像)。此外，并且如上所述，当要将两种以上核苷酸前体添加到流体室时，可在一轮或多轮添加中添加它们(例如，可在步骤104中添加所有材料，或者可组合步骤104、130和140中的两者或更多者)。
如上文在图2B的上下文中所解释的，一些实施方案仅使用三幅图像来确定四种核苷酸前体中的哪一种已在特定位点处掺入。图3A和图3C的组合示出了根据一些此类实施方案的方法100。在步骤118(图3A)之后，方法100继续步骤160，其中将第三荧光标记的核苷酸前体和第四未标记的核苷酸前体添加到流体通道。步骤160可与步骤104(图3A)组合，或者其可为单独的步骤。第三荧光标记的核苷酸前体包含第三荧光标记物，如上所述。第四核苷酸前体是未标记的。
在162处，将流体通道的内容物的温度设定在第三温度范围内。在164处，当温度在第三温度范围内时，照射设备，并且捕获流体通道的内容物的第三图像，例如，当流体通道的温度在第三温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第三强度。第三图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。
在166处，评估第三图像以确定第三图像在该多个位点中的特定位点处的强度是否大于或等于第三值。第三值可与第一值和/或第二值大致相同(即，等于)，或者其可不同。如果第三图像在该特定位点处的强度大于或等于第三值，并且第一图像在该特定位点处的强度小于第一值，并且第二图像在该特定位点处的强度小于第二值，则在168处，确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该位点处掺入到可延伸引物中。对于其他位点中的一些或全部，可使用相同的方法确定第三荧光标记的核苷酸前体是否已在那些位点处掺入到可延伸引物中。
如果在166处确定第三图像在特定位点处的强度不大于或等于第三值，则在170处推断第四未标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入。
如上文在图2C的上下文中所解释的，一些实施方案仅使用两幅图像来确定四种核苷酸前体中的哪一种已在特定位点处掺入。图4A和图4B示出了根据一些此类实施方案的方法200。
在202处，在一轮或多轮添加中，将材料添加到测序设备的流体通道。该材料包含至少多条核酸链、多个核酸聚合酶分子、第一荧光标记的核苷酸前体、第二荧光标记的核苷酸前体、第三荧光标记的核苷酸前体和第四未标记的核苷酸前体。先前在图3A的上下文中描述了核酸链和核酸聚合酶，并且这些描述也适用于此。此外，先前已解释核酸聚合酶或多条核酸链分子可如何结合至测序设备的流体通道的表面。这些解释也适用于此。
第一荧光标记的核苷酸前体包含第一荧光标记物。第一荧光标记物发出的强度在第一温度范围内小于第一阈值，在低于第一温度范围的第二温度范围内大于或等于第一阈值。换句话讲，第一荧光标记物将在第二温度范围内但不在第一温度范围内以至少第一阈值的强度发射光。标记物不需要是可裂解的。应当理解，第一荧光标记物可以在第一温度范围和第二温度范围之外的温度范围内以至少第一阈值的强度发射光。例如，第一荧光标记物可以在低于第二温度范围的温度下以至少第一阈值的强度发射光。还可以设想，第一荧光标记物可以在高于第一温度范围的温度下以至少第一阈值的强度发射光。
第二荧光标记的核苷酸前体包含第二荧光标记物(其不需要是可裂解的)。第二荧光标记物发出的强度在第一温度范围和第二温度范围内大于或等于第二阈值。换句话讲，仅考虑第一温度范围和第二温度范围，第二荧光标记物将在第一温度范围和第二温度范围内以至少第二阈值的强度发射光。第二阈值可与第一阈值大致相同(即，等于)，或者两个阈值可不同。
第三荧光标记的核苷酸前体包含第一荧光标记物和第二荧光标记物两者。
第四核苷酸前体不包含荧光标记物。
有多种方法将荧光标记物附接到第一荧光标记的核苷酸前体和第二荧光标记的核苷酸前体，如上文在图3A的上下文中所述。
再次参见图4A，在204处，将流体通道的内容物的温度设定在第一温度范围内。在206处，当温度在第一温度范围内时，照射设备，并且捕获流体通道的内容物的第一图像，例如，当流体通道的温度在第一温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第一强度。第一图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。在208处，将流体通道的内容物的温度设定在第二温度范围内。在210处，当温度在第二温度范围内时，照射设备，并且捕获流体通道的内容物的第二图像，例如，当流体通道的温度在第二温度范围内时，检测多个位点中的每个位点处的第二强度。第二图像捕获了该多个位点中的每个位点处的强度。
在212处，使用第一图像和第二图像确定第一核苷酸前体、第二核苷酸前体、第三核苷酸前体或第四核苷酸前体中的哪一者已在该多个位点中的特定位点处掺入。图4B示出了根据一些实施方案的步骤212。在220处，确定第一图像在该特定位点处的强度是否小于第一值，以及第二图像在该特定位点处的强度是否大于或等于第二值。第一值和第二值可以大致相同(即，相等)，或者它们可以不同。第一值和第二值可分别等于第一阈值和第二阈值。另选地，第一值和第二值可分别基于第一阈值和第二阈值(例如，它们可为第一阈值和第二阈值的倍数或百分比)。如果第一图像在特定位点的强度小于第一值并且第二图像在该特定位点的强度大于或等于第二值，则在222处确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入。如果不是，则在224处，确定第一图像在该特定位点处的强度是否大于或等于第一值，以及第二图像在该特定位点处的强度是否大于或等于第三值，该第三值大于第一值和第二值中的每一者。第三值可为例如第一值和第二值的总和。如果第一图像在特定位点的强度大于或等于第一值并且第二图像在特定位点的强度大于或等于第三值，则在226处确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点掺入。如果不是，则在228处，确定第一图像在该特定位点处的强度是否大于或等于第一值，以及第二图像在该特定位点处的强度是否大于或等于第二值但小于第三值。如果是这样，则在230处，确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入。
如果在228处未确定第一图像在该特定位点处的强度大于或等于第一值，以及第二图像在该特定位点处的强度大于或等于第二值但小于第三值，则可在234处推断第四未标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入。另选地，并且任选地，可在步骤232肯定地确定第一图像在该特定位点处的强度是否小于第一值，以及第二图像在该特定位点的强度小于第二值，在这种情况下，然后在234处确定第四未标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入。
图3A至图3E以及图4A和图4B的解释假定荧光标记物的发光强度具有与本文档别处(例如1A至图1C以及图2A至图2C中)一般说明的那些类似的特性和强度分布。应当理解，如果荧光标记物的强度具有不同的特性，则可以适当地修改图3A至图3E(例如110、118、136、146、166)和/或图4A和图4B(例如220、224、228、232)的某些元素。根据本文的公开内容，本领域的普通技术人员将理解，作出的修改是合适的。
图5示出了用于对核酸进行测序的系统500。如前所述，系统500包括流体通道515，该流体通道具有用于将待测序的多条核酸链附接到流体通道515的表面的多个位点。例如，流体通道515可包括被配置为将核酸或核酸聚合酶锚定到近侧壁的结构(例如，腔或脊)。加热器510耦接到流体通道515。加热器510设定流体通道515的内容物的温度。应当理解，加热器510可包括冷却元件以及或代替加热元件。加热器510的主要特性是其能够控制流体通道515的内容物的温度。例如，加热器510能够将流体通道515的内容物的温度设定在非重叠的第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围中的至少任一者内。第二温度范围可低于第一温度范围，第三温度范围可低于第二温度范围，并且第四温度范围可低于第三温度范围。加热器510可包括例如热传感器、微处理器或软件。
系统500还包括成像系统520。成像系统520被配置为检测流体通道515的多个位点中的每个位点处的强度。例如，成像系统520能够检测第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围中的每一者内的多个位点中的每个位点处的强度。
如图6所示，成像系统520可包括例如以下中的一些或全部：相机521、激发光源522(例如，激光器)、照明光学器件523(例如，被配置为均匀地分布激发光并减少杂散光)、检测器524(例如，具有大孔径以增加光收集效率的透镜)、光学阻挡滤光器525(例如，用于将检测器524与激发光隔离)、模数转换器(ADC)和/或将检测到强度转换成数字化信号或值的一个或多个传感器526(例如，电荷耦合器件(CCD)传感器，其本身可包括其他部件，诸如ADC)。应当理解，上文列出的部件和元件仅为示例性的，并非旨在进行限制。成像系统520可耦接到存储设备(未示出)。在此类实施方案中，存储设备可存储由成像系统520收集的强度数据。
系统500还包括耦接到成像系统520和加热器510的至少一个处理器505。处理器505执行机器可读指令。处理器505可引导或控制系统500的其他元件。例如，处理器505可引导加热器510将流体通道515的内容物的温度设定在指定范围内。类似地，处理器505可引导成像系统520检测流体通道515的多个位点中的全部或子组处的强度。除此之外或另选地，处理器505可从成像系统获取流体通道515的多个位点中的全部或子组处的检测到强度的指示。
例如，响应于该多个位点中的特定位点处的强度在第一温度范围和第二温度范围内大于或等于第一阈值，处理器505可识别第一荧光标记的核苷酸前体或第一荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。例如，如果处理器505确定该特定位点的强度对应于附接到鸟嘌呤前体的荧光标记物，则处理器505可将鸟嘌呤识别为检测到的标记物，或将胞嘧啶识别为被测序核酸片段中的下一个碱基。
类似地，响应于在该多个位点中的该特定位点处的强度在第一温度范围内小于第二阈值并且在第二温度范围内大于或等于第二阈值，处理器505可识别第二荧光标记的核苷酸前体或第二荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。同样，响应于在该多个位点中的该特定位点处的强度在第一温度范围和第二温度范围内小于第三阈值并且在第三温度范围内大于或等于第三阈值，处理器505可识别第三荧光标记的核苷酸前体或第三荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。并且最后，响应于该多个位点中的该特定位点处的强度在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围中的每一者内小于第四阈值并且在第四温度范围中大于或等于第四阈值，处理器505可识别第四荧光标记的核苷酸前体或第四荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。
处理器505可指示加热器510将流体通道内的内容物的温度设定在第一温度范围内。然后，当流体通道520的内容物的温度在第一温度范围内时，处理器505可从成像系统520获取在该多个位点中的一些或全部位点处的第一强度的指示。处理器505可指示加热器510将流体通道内的温度设定在第二温度范围内。然后，当流体通道515的温度在第二温度范围内时，处理器505可从成像系统520获取在该多个位点中的一些或全部位点处的第二强度的指示。响应于在该多个位点中的特定位点处的第一强度小于第一值，并且在该特定位点处的第二强度大于或等于第二值，处理器505可确定第一荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。例如，如果处理器505确定该特定位点处的强度对应于附接到腺嘌呤前体的荧光标记物，则处理器505可将腺嘌呤识别为检测到的标记物，或将胸腺嘧啶识别为被测序核酸片段中的下一个碱基。另选地，响应于该特定位点处的第一强度大于或等于第一值，并且该特定位点处的第二强度大于或等于第二值且小于第三值，第三值大于第一值和第二值中的每一者，处理器505可确定第二荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。最后，响应于该特定位点处的第一强度大于或等于第一值，并且该特定位点处的第二强度大于或等于第三值，处理器505可确定第三荧光标记的核苷酸前体已在该特定位点处掺入到可延伸引物中。
在前面的描述和附图中，阐述了特定术语来提供对本发明所公开的实施方案的透彻理解。在一些情况下，术语或附图可暗示实践本发明所不需要的具体细节。
为了避免不必要地模糊本公开，熟知的部件以框图形式示出和/或并未详细讨论，或在一些情况下完全不讨论。
除非本文另有具体定义，否则所有术语应被赋予其最广泛的可能解释，包括本说明书和附图所暗示的含义以及本领域技术人员理解的和/或如字典、图书等中所定义的含义。如本文明确阐述的，一些术语可能不符合其普通或惯常含义。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”不排除复数指代，除非另外指明。除非另外指明，否则词语“或”应被解释为包括性的。因此，短语“A或B”应解释为以下所有含义：“A和B都”、“A但不是B”和“B但不是A”。本文中对“和/或”的任何使用并不意味着词语“或”单独表示排他性。
如本说明书和所附权利要求书中所用，形式“A、B和C中的至少一者”、“A、B或C中的至少一者”、“A、B或C中的一者或多者”以及“A、B和C中的一者或多者”的短语是可互换的，并且各自涵盖以下所有含义：“仅为A”、“仅B”、“仅C”、“A和B但不是C”、“A和C但不是B”、“B和C但不是A”以及“A、B和C中的全部”。
就在具体实施方式或权利要求书中使用术语“包括”、“具有”及其变体的程度而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式包括在内，即，意味着“包括但不限于”。术语“示例性”和“实施方案”用于表示示例，而不是偏好或要求。
附图未必按比例绘制，并且特征的维度、形状和尺寸可显著不同于它们在附图中的描绘方式。
尽管已公开了具体实施方案，但将显而易见的是，在不脱离本公开的更广泛的实质和范围的情况下，可对其进行各种修改和改变。例如，至少在可行的情况下，实施方案中任一实施方案的特征或方面可与实施方案中任何其他实施方案组合来应用，或代替其对应的特征或方面来应用。因此，本说明书和附图被认为是示例性意义的而不是限制性意义的。

Claims (45)

1.一种使用测序设备对核酸进行测序的方法，所述测序设备包括具有多个位点的流体通道，所述多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的表面，所述方法包括：
在一轮或多轮添加中，向所述流体通道添加(i)所述多条核酸链，(ii)多个核酸聚合酶分子，(iii)包含第一荧光标记物的第一荧光标记的核苷酸前体，其中当被激发成荧光时，由所述第一荧光标记物发射的光的强度在第一温度范围和第二温度范围内大于或等于第一阈值，所述第二温度范围低于所述第一温度范围，以及(iv)包含第二荧光标记物的第二荧光标记的核苷酸前体，其中当被激发成荧光时，由所述第二荧光标记物发射的光的强度在所述第一温度范围内小于或等于第二阈值并且在所述第二温度范围内大于或等于所述第二阈值；
将所述流体通道内的温度设定在所述第一温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第一温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第一强度；
响应于所述多个位点中的特定位点处的所述第一强度大于或等于第一值，从而确定所述第一荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到可延伸引物中；
将所述流体通道内的所述温度设定在所述第二温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第二温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第二强度；以及
响应于所述特定位点处的所述第二强度大于或等于第二值并且所述特定位点处的所述第一强度小于所述第一值，从而确定所述第二荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值大致相同。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值不同。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一值和所述第二值大致相同。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一值和所述第二值不同。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一值为所述第一阈值，并且所述第二值为所述第二阈值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一值基于所述第一阈值，并且所述第二值基于所述第二阈值。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括：
向所述流体通道添加包含第三荧光标记物的第三荧光标记的核苷酸前体，其中当激发成荧光时，由所述第三荧光标记物发射的光的强度在所述第一温度范围和所述第二温度范围内小于第三阈值并且在第三温度范围内大于或等于所述第三阈值，所述第三温度范围低于所述第二温度范围；
将所述流体通道内的所述温度设定在所述第三温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第三温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第三强度；以及
响应于所述特定位点处的所述第三强度大于或等于第三值，并且所述特定位点处的所述第一强度小于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度小于所述第二值，从而确定所述第三荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中基本上同时将所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体和所述第三荧光标记的核苷酸前体添加到所述流体通道。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括：
响应于所述特定位点处的所述第一强度小于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度小于所述第二值，并且所述特定位点处的所述第三强度小于所述第三值，从而确定第四未标记的前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一阈值、所述第二阈值和所述第三阈值中的至少两者大致相同。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值不同。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一值、所述第二值和所述第三值中的至少两者大致相同。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一值、所述第二值和所述第三值不同。
15.根据权利要求8所述的方法，还包括：
向所述流体通道添加包含第四荧光标记物的第四荧光标记的核苷酸前体，其中当激发成荧光时，由所述第四荧光标记物发射的光的强度在所述第一温度范围、所述第二温度范围和所述第三温度范围的每一者内小于第四阈值并且在第四温度范围内大于或等于所述第四阈值，所述第四温度范围低于所述第三温度范围；
将所述流体通道内的所述温度设定在所述第四温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第四温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第四强度；以及
响应于所述特定位点处的所述第四强度大于或等于第四值，并且所述特定位点处的所述第一强度小于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度小于所述第二值，并且所述特定位点处的所述第三强度小于所述第三值，从而确定所述第四荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一阈值、所述第二阈值、所述第三阈值和所述第四阈值中的两者或更多者大致相同。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一值、所述第二值、所述第三值和所述第四值中的两者或更多者大致相同。
18.根据权利要求15所述的方法，其中基本上同时将所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体、所述第三荧光标记的核苷酸前体和所述第四荧光标记的核苷酸前体添加到所述流体通道。
19.一种使用测序设备对核酸进行测序的方法，所述测序设备包括具有多个位点的流体通道，所述多个位点用于将待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的表面，所述方法包括：
在一轮或多轮添加中，向所述流体通道添加(i)所述多条核酸链，(ii)多个核酸聚合酶分子，(iii)包含第一荧光标记物的第一荧光标记的核苷酸前体，其中当被激发成荧光时，由所述第一荧光标记物发射的光的强度在第一温度范围小于第一阈值并且在第二温度范围内大于或等于所述第一阈值，所述第二温度范围低于所述第一温度范围，(iv)包含第二荧光标记物的第二荧光标记的核苷酸前体，其中当被激发成荧光时，由所述第二荧光标记物发射的光的强度在所述第一温度范围和所述第二温度范围内大于或等于第二阈值，以及(v)包含所述第一荧光标记物和所述第二荧光标记物的第三荧光标记的核苷酸前体；
将所述流体通道内的温度设定在所述第一温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第一温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第一强度；
将所述流体通道内的所述温度设定在所述第二温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第二温度范围内时，检测所述多个位点中的每个位点处的第二强度；以及
基于所检测到的第一强度和第二强度，确定所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体或所述第三荧光标记的核苷酸前体中的一者是否已在所述多个位点中的特定位点处掺入到可延伸引物中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中基本上同时将所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体和所述第三荧光标记的核苷酸前体添加到所述流体通道。
21.根据权利要求19所述的方法，其中确定所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体或所述第三荧光标记的核苷酸前体中的一者是否已在所述多个位点中的所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中包括：
响应于所述特定位点处的所述第一强度小于第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度大于或等于第二值，从而确定所述第一荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中；
响应于所述特定位点处的所述第一强度大于或等于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度大于或等于第三值，所述第三值大于所述第一值和所述第二值中的每一者，从而确定所述第三荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中；以及
响应于所述特定位点处的所述第一强度大于或等于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度大于或等于所述第二值且小于所述第三值，从而确定所述第二荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括：
响应于所述特定位点处的所述第一强度小于所述第一值，并且所述特定位点处的所述第二强度小于所述第二值，从而确定第四未标记核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
23.根据权利要求21所述的方法，还包括：
确定所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体或所述第三荧光标记的核苷酸前体中没有一者已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中；以及
响应于确定所述第一荧光标记的核苷酸前体、所述第二荧光标记的核苷酸前体或所述第三荧光标记的核苷酸前体中没有一者已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中，从而推断第四未标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值大致相同。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值不同。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一值和所述第二值基本上相同。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一值和所述第二值不同。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述第三值大致为或恰好为所述第一值和所述第二值的总和。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一值为所述第一阈值，并且所述第二值为所述第二阈值。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一值基于所述第一阈值，并且所述第二值基于所述第二阈值。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第三值大致为所述第一值和所述第二值的总和。
32.一种用于对核酸进行测序的系统，包括：
流体通道，所述流体通道具有用于将待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的表面的多个位点；
加热器，所述加热器耦接到所述流体通道，用于将所述流体通道的内容物的温度设定在第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围中的任一者内，其中所述第一温度范围、所述第二温度范围、所述第三温度范围和所述第四温度范围不重叠；
成像系统，所述成像系统被配置为检测在所述第一温度范围、所述第二温度范围、所述第三温度范围和所述第四温度范围中的每一者内的所述多个位点中的每个位点处发射的光的强度；和
至少一个处理器，所述至少一个处理器耦接到所述成像系统和所述加热器并且被配置为执行至少一个机器可读指令，所述至少一个机器可读指令当被执行时使得所述至少一个处理器：
响应于在所述多个位点中的特定位点处发射的光的强度在所述第一温度范围和所述第二温度范围内大于或等于第一阈值，识别第一荧光标记的核苷酸前体或所述第一荧光标记的核苷酸前体的互补碱基，
响应于在所述多个位点的所述特定位点处发射的光的所述强度在所述第一温度范围内小于第二阈值并且在所述第二温度范围内大于或等于所述第二阈值，识别第二荧光标记的核苷酸前体或所述第二荧光标记的核苷酸前体的互补碱基，
响应于在所述多个位点的所述特定位点处发射的光的所述强度在所述第一温度范围和所述第二温度范围内小于第三阈值并且在所述第三温度范围内大于或等于所述第三阈值，识别第三荧光标记的核苷酸前体或所述第三荧光标记的核苷酸前体的互补碱基，以及
响应于在所述多个位点中的所述特定位点处发射的光的所述强度在所述第一温度范围、所述第二温度范围和所述第三温度范围中的每一者内小于第四阈值并且在所述第四温度范围内大于或等于第四阈值，识别第四荧光标记的核苷酸前体或所述第四荧光标记的核苷酸前体的互补碱基。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述第二温度范围低于所述第一温度范围，所述第三温度范围低于所述第二温度范围，并且所述第四温度范围低于所述第三温度范围。
34.根据权利要求32所述的系统，其中所述流体通道包括结构，其中所述结构包括用于将待测序的所述多条核酸链附接到所述流体通道的所述表面的所述多个位点。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述结构包括腔或脊。
36.根据权利要求32所述的系统，其中所述加热器包括热传感器或微处理器。
37.根据权利要求32所述的系统，其中所述成像系统包括以下中的一者或多者：相机、光源、照明光学器件、检测器、光学阻挡滤光器、模数转换器(ADC)或一个或多个传感器。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述成像系统包括所述光源，并且其中所述光源包括激光器。
39.根据权利要求37所述的系统，其中所述成像系统包括所述照明光学器件，并且其中所述照明光学器件被配置为将所述激发光基本上均匀地分布在所述多个位点上方。
40.根据权利要求37所述的系统，其中所述成像系统包括所述检测器，并且其中所述检测器包括透镜。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述成像系统包括所述光学阻挡滤光器，并且其中所述光学阻挡滤光器位于所述系统内以将所述透镜与由所述光源发射的光基本上隔离。
42.根据权利要求37所述的系统，其中所述成像系统包括所述一个或多个传感器，并且其中所述一个或多个传感器包括电荷耦合器件(CCD)传感器。
43.根据权利要求32所述的系统，其中当由所述至少一个处理器执行时，所述至少一个机器可读指令还使得所述至少一个处理器控制所述加热器。
44.根据权利要求32所述的系统，其中当由所述至少一个处理器执行时，所述至少一个机器可读指令还使得所述至少一个处理器控制所述成像系统。
45.一种用于对核酸进行测序的系统，包括：
流体通道，所述流体通道具有用于将待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的表面的多个位点；
加热器，所述加热器用于将所述流体通道的内容物的温度设定在第一温度范围和第二温度范围中的任一者内，其中所述第一温度范围和所述第二温度范围不重叠；
成像系统，所述成像系统被配置为检测在所述第一温度范围和所述第二温度范围中的每一者内的所述多个位点中的每个位点处发射的光的强度；和
至少一个处理器，所述至少一个处理器耦接到所述成像系统并且被配置为执行至少一个机器可读指令，所述至少一个机器可读指令当被执行时使得所述至少一个处理器：
指示所述加热器将所述流体通道内的温度设定在所述第一温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第一温度范围内时，从所述成像系统获取在所述多个位点中的每个位点处发射的光的第一强度的指示；
指示所述加热器将所述流体通道内的所述温度设定在所述第二温度范围内；
当所述流体通道的所述温度在所述第二温度范围内时，从所述成像系统获取在所述多个位点中的每个位点处发射的光的第二强度的指示；
响应于在所述多个位点的特定位点处发射的光的所述第一强度小于第一值，并且在所述特定位点处发射的光的所述第二强度大于或等于第二值，确定第一荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到可延伸引物中，
响应于在所述特定位点处发射的光的所述第一强度大于或等于所述第一值，并且在所述特定位点处发射的光的所述第二强度大于或等于所述第二值且小于第三值，所述第三值大于所述第一值和所述第二值中的每一者，确定第二荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中，以及
响应于在所述特定位点处发射的光的所述第一强度大于或等于所述第一值，并且在所述特定位点处发射的光的所述第二强度大于或等于所述第三值，确定第三荧光标记的核苷酸前体已在所述特定位点处掺入到所述可延伸引物中。
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