JP2022525821A - フォトスイッチ可能なラベルを使用した核酸シーケンシングのための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本開示の実施形態は、光スイッチ可能な化合物で標識されたヌクレオチドに関する。また、本明細書では、シーケンシングアプリケーションのためにこれらの標識ヌクレオチドを使用する方法およびキットを提供する。

Description

（背景）
（分野）
本開示は、概して、光スイッチ可能な標識で標識されたヌクレオチド、およびポリヌクレオチドシーケンシング法および応用におけるそれらの使用に関する。

生体サンプル中に存在する核酸配列等の分析物の検出は、微生物の識別と分類、感染症の診断、遺伝子異常の検出と特徴付け、癌に関連する遺伝子変化の特定、病気に対する遺伝的感受性、およびさまざまなタイプの治療に対する反応の測定の研究等の方法として使用される。生体試料中の核酸配列等の分析物を検出するための一般的な手法は、核酸シーケンシングである。

ハイスループットで小型で安価なＤＮＡシーケンシングテクノロジーの必要性は、ゲノムシーケンシングの恩恵を享受する上で有益であることが明らかになっている。個別化医療は最前線に向かっており、そのようなテクノロジーの恩恵を受けるであろう。潜在的な突然変異や異常を特定するための個人のゲノムのシーケンシングは、ある人が特定の疾患を持っているかどうかを特定する上で重要であり、その後、その個人に合わせた治療が続く。このような積極的な取り組みに対応するために、シーケンシングは前進し、そのハイスループット機能だけでなく、使いやすさ、時間とコストの効率、および臨床医による機器と試薬へのアクセスという点でも、ハイスループット技術に対応できるようになる必要がある。

光スイッチ可能な蛍光プローブは、超解像蛍光顕微鏡法における重要な新開発であり、改善された空間分解能にアクセスするには、暗状態から発光状態に切り替えることができる色素が必要である。 Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８８ （２０１４） ３６０３-３６１２ を参照。フォトスイッチング可能な蛍光プローブは、適切な波長および強度の光による照射時に、異なる吸収スペクトルを持つ状態間で可逆的にスイッチングするフォトクロミック化合物を利用する。写真で生成された種は、通常、熱的手段または追加の照明によって、開始種に戻る。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が、最近、光スイッチ可能な消光剤に共有結合された赤色発光蛍光体からなる小分子ダイアドの合成と、生物学的イメージングのためのダイアドの使用が報告された。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２０１６， １８， ３６６６～３６６９を参照。同様の作業で、Ｂｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．が、クマリンフルオロフォアと超解像イメージング用の抗体と結合したオキサジン フォトクロームを備えたダイアドの合成を報告した。Ｂｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｃ２０１６， １２０， １２８６０－１２８７０を参照。

次世代シーケンシングアプリケーションを含む生物学的イメージングアプリケーションで利用できる新しい光スイッチ可能な蛍光標識を開発する必要がある。

（概要）
本開示のいくつかの実施形態は、光スイッチ可能な標識を含むヌクレオチドコンジュゲートに関し、光スイッチ可能な標識は、任意選択でリンカーを介してフォトクロミック部分に共有結合した蛍光部分を含む。レーザーまたはＬＥＤライト等の光源を照射すると、光スイッチ可能なラベルは「オン」状態から「オフ」状態に、またはその逆の状態に可逆的に変化する可能性がある。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドコンジュゲートの蛍光部分は、赤色発光蛍光体、例えば、シリコンローダミンであり得る。いくつかの実施形態において、光スイッチ可能な標識のフォトクロミック部分は、式（Ｉ）の構造を有するスピロピラノまたはスピロチオピラノ部分を含む：

ＸはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ１－６ハロアルコキシ
Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１－６アルキル、および－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ４からなる群から選択され、
Ｒ^４は、Ｃ_６－１０アリール、５から１０員のヘテロアリール、３から７員のカルボシクリル、および３から７員のヘテロシクリルからなる群から選択され、それぞれ置換されていてもよい。
環ＡはＣ_６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり、それぞれが少なくとも１つの電子吸引基で置換されている。そして
ｎは１～６の整数である。

いくつかの他の実施形態において、光スイッチ可能な標識のフォトクロミック部分は、式（ＩＩ）の構造を含む：

ＹはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ_１－６ハロアルコキシそして
環ＢはＣ_６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり；それぞれが少なくとも１つの電子吸引基で置換されている。ここで、＊は蛍光部分への結合点を示す。

本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチドコンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。

本開示のいくつかのさらなる実施形態は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法に関し、以下の１つまたは複数のサイクルを含むシーケンシング反応を実行することを含む：
（ｉ）異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートを標的ポリヌクレオチドに相補的な複数のポリヌクレオチドに組み込んで、伸長ポリヌクレオチドを生成し、第１タイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれが第１光スイッチ可能標識を含み、第２タイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれが第２タイプを含む、光スイッチ可能な標識、および第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれは、第３の標識を含む。
（ｉｉ）最初の画像化イベントを介して、各サイクルで伸長ポリヌクレオチドからの信号の最初のコレクションを検出すること。
（ｉｉｉ）第１の画像化事象の後に伸長ポリヌクレオチドを光源で照射して、第１の光スイッチ可能な標識および第２の光スイッチ可能な標識の発光信号に変化を生じさせること；
（ｉｖ）第２の画像化イベントを介して伸長ポリヌクレオチドからの信号の第２の集合を検出すること；そして
連続的に組み込まれたヌクレオチド結合体に基づいて、標的ポリヌクレオチドの配列を決定すること。いくつかの実施形態では、４つの異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートが同時に存在し、各サイクルにおける取り込み中に、標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドへの取り込みについて競合する。そのようないくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートの第１のタイプの取り込みは、第１の画像化事象における信号状態および第２の画像化事象における暗状態から決定される。そのようないくつかの実施形態において、ヌクレオチドコンジュゲートの第２のタイプの取り込みは、第１の画像化事象における暗状態および第２の画像化事象における信号状態から決定される。そのようないくつかの実施形態において、ヌクレオチドコンジュゲートの第３のタイプの取り込みは、第１の画像化事象および第２の画像化事象における信号状態から決定される。そのようないくつかの実施形態では、第４のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みは、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントにおける暗状態から決定される。いくつかのさらなる実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは式（Ｉ）のフォトクロミック部分を含み、第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは式（ＩＩ）のフォトクロミック部分を含む。

本開示のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書に記載されるように、１つまたは複数のタイプのヌクレオチドコンジュゲートと光スイッチ可能な標識とを含むキットに関する。キットは、シーケンシング、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、ＲＮＡ分析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合または細胞機能分析）、またはタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイまたはタンパク質活性アッセイ） 等のアプリケーションで使用できる。）。使用は、自動シーケンシング機器等の特定の技術を実行するための自動機器で行うことができる。シーケンシング装置には、異なる検出可能なラベルを区別するために、１つのレーザーのみが含まれている場合がある。シーケンシング装置は、光スイッチ可能な標識を「オン」状態から「オフ」状態に、またはその逆に活性化するために、異なる波長で動作する追加のレーザーまたは光源を含んでもよい。

図１Ａは、標準的なイルミナの１チャンネル合成合成（ＳＢＳ）ケミストリーのフローチャートを示す。図１Ｂは、標準の１チャネルＳＢＳからの画像１および画像２がどのように画像解析ソフトウェアによって処理され、どの塩基が組み込まれているかを識別する方法を示す。 図２は、本明細書に開示される光スイッチ可能な色素を使用する１チャネルシーケンシングプロセスのフローチャートを示す。

（詳細な説明）
イルミナの次世代シーケンシングシステムであるｉＳｅｑ１００（商標）は、ＣＭＯＳベースのテクノロジーを使用して、簡素化されたアクセス可能なベンチトップシーケンシングソリューションを提供する。図１Ａおよび１Ｂには、標準的なシーケンスワークフローが示される。これは、１チャネルシーケンスとも呼ばれる。各シーケンスサイクルには、２つの化学ステップと２つのイメージングステップが含まれる。図１Ａでは、最初の化学ステップで、フローセルを、蛍光標識されたアデニンおよびチミンを含むヌクレオチドの混合物にさらす。最初のイメージングステップ中に、各クラスターからの発光がＣＭＯＳセンサーによって記録される。２番目の化学ステップでは、アデニンから蛍光標識を除去し、シトシンに蛍光標識を追加する。両方の化学ステップで、グアニンは暗色（ラベルなし）である。２枚目の画像が記録される。図１Ｂでは、画像１と画像２の組み合わせが画像解析ソフトウェアによって処理され、どの塩基が各クラスター位置に組み込まれているかを識別する。このシーケンスサイクルは、「ｎ」回繰り返されて、「ｎ」塩基の読み取り長が作成される。シーケンサーがヌクレオチドごとに異なる色素を使用する４チャネルＳＢＳケミストリーとは異なり、ｉＳｅｑ１００（商標）システムはシーケンスサイクルごとに１つの色素を使用する。１チャネル化学では、アデニンには取り外し可能なラベルがあり、最初の画像にのみラベルが付けられています。シトシンには、ラベルを結合できるリンカーグループがあり、２番目の画像にのみラベルが付けられています。チミンには永続的な蛍光標識が付いているため、両方の画像で標識されており、グアニンは永久に暗い色である。ヌクレオチドは、２つの画像全体の各塩基の異なる発光パターンの分析によって識別される。

本開示の実施形態は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための新しい方法に関する。特に、この方法は、光源での照射時に光誘起色変化を受けることができる、光スイッチ可能な染料で標識されたヌクレオチドの使用を含む。

光スイッチ可能なフルオロフォアの使用に関連するいくつかの利点がある。光スイッチ可能な色素は、単一のイメージングイベントにのみ必要であり、その後すぐに切断されるため、スイッチングの堅牢性を示す必要はない。これらの染料は、疲労耐性を示すことなく何度も切り替えることができることが知られている。このアプローチでは、色素の発光状態の変換が光子エネルギーを介して「リモートで」誘導されるため、専用の切断混合物または交換試薬を導入する必要もない。切り替えはマイクロ秒未満の時間スケールで行われるため、フローセルへの試薬の注入および排出に必要な時間が大幅に短縮されるため、合計サイクル時間も最小限に抑える必要がある。照射に基づく変換は、通常、高収量であり、信号の混合または放出の抑制を回避するために不可欠な特性である。

さらに、蛍光マーカーの発光状態を制御する能力は、核酸シーケンシングアプリケーションに非常に役立つ。例えば、多くの同様のタグでよく見られる問題は、プロセスステップでの使用に成功した後、残留放射が不要なバックグラウンド信号に寄与する可能性があることである。異性化、コンフォメーション変化、または可逆的な開環プロセスに基づいて、放出プロファイルの変化をリモートで誘発すると、信号対雑音比を改善する可能性がある。

いくつかの実施形態では、この方法は以下のステップを含んでもよい：
（ａ）以下の繰り返しサイクルを含むシーケンシング反応の実行：
（ｉ）４つの異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートを標的ポリヌクレオチドに相補的な複数のポリヌクレオチドに組み込んで、伸長ポリヌクレオチドを生成し、第１タイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれは、第１光スイッチ可能な標識を含み、第２タイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれは、第２の光スイッチ可能な標識、および第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートのそれぞれは、第３の標識を含む。
（ｉｉ）最初の画像化イベントを介して、各サイクルで伸長ポリヌクレオチドからの信号の最初のコレクションを検出すること。
（ｉｉｉ）第１の画像化事象の後に伸長ポリヌクレオチドを光源で照射して、第１の光スイッチ可能な標識および第２の光スイッチ可能な標識の発光信号に変化を生じさせること；
（ｉｖ）第２の画像化イベントを介して伸長ポリヌクレオチドからの信号の第２の集合を検出すること；
（ｂ）連続的に組み込まれたヌクレオチド結合体に基づいて、標的ポリヌクレオチドの配列を決定する。

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドコンジュゲートの第１のタイプの取り込みは、第１の画像化イベントにおける信号状態および第２の画像化イベントにおける暗状態から決定される。ヌクレオチドコンジュゲートの第２のタイプの取り込みは、第１の画像化イベントにおける暗状態および第２の画像化イベントにおける信号状態から決定される。ヌクレオチド結合体の第３のタイプの取り込みは、第１の画像化事象および第２の画像化事象における信号状態から決定される。そして、第４のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みは、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントにおける暗状態から決定される。

検出イベントに関して使用される「信号状態」は、検出イベントで特定の信号が生成される状態を意味する。例えば、ヌクレオチドサブユニットは、シーケンシング法における蛍光標識の励起および発光による蛍光検出工程で検出される蛍光標識に結合したときに、シグナル状態にあり、検出可能であり得る。検出事象に関して用いられる用語「暗状態」は、検出事象において特定の信号が生成されない状態を意味する。例えば、ヌクレオチドが蛍光標識を欠いている場合、および／またはシーケンシング法の蛍光検出ステップで特異的に検出される蛍光を発しない場合、ヌクレオチドサブユニットは暗状態であり得る。暗状態の検出には、蛍光標識がなくても存在する可能性のあるバックグラウンド蛍光が含まれる場合がある。例えば、一部の反応成分は、特定の波長で励起されたときに最小限の蛍光を示す場合がある。そのため、蛍光部分が存在しなくても、そのようなコンポーネントからのバックグラウンド蛍光が存在する可能性がある。さらに、バックグラウンド蛍光は、例えば隣接するシーケンシング反応からの光散乱によるものである可能性があり、これは検出器によって検出され得る。したがって、「暗状態」は、蛍光標識を欠くヌクレオチドが本明細書に記載の方法で利用される場合等、蛍光部分が特に含まれない場合のようなバックグラウンド蛍光を含むことができる。しかし、そのようなバックグラウンド蛍光は、シグナル状態から区別できると考えられており、したがって、非標識ヌクレオチド（または「ダーク」ヌクレオチド）のヌクレオチド取り込みは依然として識別可能である。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、少なくとも５０回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３５０回、４００回、４５０回、または５００回繰り返される。いくつかの実施形態では、４つの異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートが同時に存在し、各サイクル中に取り込みについて競合する。いくつかのさらなる実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートの取り込みはポリメラーゼによって行われる。

いくつかの実施形態において、異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートは、可逆的ターミネーター部分を含む。いくつかのさらなる実施形態において、ステップ（ａ）は、次の取り込みサイクルの前に、取り込まれたヌクレオチド結合体から可逆的ターミネーター部分を切断することをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、ヌクレオチドコンジュゲートは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびそれらの非天然ヌクレオチド類似体からなる群から選択されるヌクレオチドタイプを含む。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲートおよび第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの標識は、同じ蛍光部分を含み得る。別の実施形態において、第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲートおよび第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの標識は、同じ蛍光部分を含み得る。他の実施形態では、第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲート、第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲート、および第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの標識は、異なる蛍光部分を含み得る。異なる蛍光部分は、同じ発光フィルターまたは異なる発光フィルターを使用して検出することができる。いくつかの実施形態において、第４のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは、蛍光部分で標識されていない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射は、第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの第３の標識から検出される信号を変化させないか、または実質的に変化させない

いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源は、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源は、第１の画像化イベントで使用される励起波長とは異なる波長を有する。そのようないくつかの実施形態では、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源は、約３５０ｎｍから約４５０ｎｍの波長を有し得る。一実施形態において、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源は、約４０５ｎｍの波長を有する。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントは、同じまたは実質的に同じ励起波長を有する。そのような実施形態では、第１の標識、第２の標識および第３の標識は、１つの検出チャネルを使用して検出することができる。そのようないくつかの実施形態では、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントは、約５５０ｎｍ～約６５０ｎｍの励起波長を有することができる。一実施形態では、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントは、約６３３ｎｍの励起波長を有する。

（第１のフォトスイッチ可能なラベル）
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のステップ（ａ）（ｉｉｉ）に記載の光源を照射すると、第１の光スイッチ可能な標識の発光信号が、例えば、信号状態から暗状態に変化する。言い換えれば、観測される発光信号は「オン」から「オフ」に切り替わる可能性がある。

いくつかの実施形態において、第１の光スイッチ可能な標識は、任意選択で第１のリンカーを介して第１のフォトクロミック部分に共有結合した第１の蛍光部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、第１の蛍光部分のパイ共役系の一部であり得る。そのようないくつかの実施形態において、第１の蛍光部分は、赤色光、例えば、約６００ｎｍから約７００ｎｍの間の波長を有する赤色光を発するフルオロフォアを含む。そのようないくつかの実施形態では、第１の蛍光部分は、シリコンローダミンフルオロフォアを含む。一実施形態において、ローダミンフルオロフォアは以下の構造を含む：

。

いくつかの実施形態において、第１のフォトクロミック部分は、スピロピラノまたはスピロチオピラノ部分を含み得る。そのようないくつかの実施形態では、第１のフォトクロミック部分は、式（Ｉ）の構造を含む：

ＸはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ１－６ハロアルコキシ
Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１－６アルキル、および－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^４からなる群から選択され、
Ｒ^４は、Ｃ_６－１０アリール、５から１０員のヘテロアリール、３から７員のカルボシクリル、および３から７員のヘテロシクリルからなる群から選択され、それぞれ置換されていてもよい。
環ＡはＣ_６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり、それぞれが少なくとも１つの電子吸引基で置換されている。ｎは１～６の整数である。

そのようないくつかの実施形態では、照射ステップ（ａ）（ｉｉｉ）は、式（Ｉ）のスピロ炭素＊－Ｘ結合の切断を引き起こし、その結果、第１のフォトクロミック部分を抑制可能なクエンチャーに変換する開環反応が生じる。最初の蛍光部分の発光。場合によっては、スピロ炭素＊―Ｘ結合の切断は可逆的である。

式（Ｉ）の第１のフォトクロミック部分のいくつかの実施形態において、５員ピロリジンに融合したフェニル部分は、場合により置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、ＸはＳである。いくつかのさらなる実施形態において、各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはＣ１～６アルキルであり、例えば、各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはメチルである。いくつかの実施形態において、環Ａは、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである。電子吸引基の非限定的な例は、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、トリフリル（－Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ_３）、－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキル、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたスルホニル。

一実施形態では、第１のフォトクロミック部分は、式（Ｉａ）の構造を含む：

。

一実施形態では、第１の光スイッチ可能なラベルは以下の構造を含む：

ここで、Ｌ１は第１のリンカーである。そのようないくつかの実施形態において、第１のリンカーＬ１は、アジド部分を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、第１の光スイッチ可能な標識は、第１のリンカーを介して、または第１のフォトクロミック部分または第１の蛍光部分のいずれかに付着した異なる位置を介してヌクレオチドに共有結合している。

あるいは、第１の光スイッチ可能な標識は、フォトクロミック部分および任意選択でリンカーのみを含むことができ、フォトクロミック部分は、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）。

（第２の光スイッチ可能なラベル）
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）に記載の光源を照射すると、第２の光スイッチ可能な標識の発光信号が、例えば非発光暗状態から信号状態に変化する。言い換えれば、観測される発光信号は「オフ」から「オン」に切り替わる可能性がある。

いくつかの実施形態において、第２の光スイッチ可能な標識は、任意選択で第２のリンカーを介して、第２のフォトクロミック部分に共有結合した第２の蛍光部分を含む。いくつかの実施形態において、第２のリンカーは、第２の蛍光部分のパイ共役系の一部であり得る。いくつかの実施形態において、第２の蛍光部分は、赤色光、例えば、約６００ｎｍから約７００ｎｍの間の波長を有する赤色光を発するフルオロフォアを含む。そのようないくつかの実施形態において、いくつかのそのような実施形態において、第２の蛍光部分は、クマリンフルオロフォアを含む。一実施形態において、クマリンフルオロフォアは以下の構造を含む：

。

いくつかの実施形態において、第２のフォトクロミック部分は、オキサジン部分またはチアジン部分を含み得る。そのようないくつかの実施形態では、第２のフォトクロミック部分は、式（ＩＩ）の構造を含む：

（ＩＩ）
ＹはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ１－６ハロアルコキシ
環ＢはＣ_６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり；それぞれが少なくとも１つの電子吸引基で置換されている。ここで、＊は蛍光部分への結合点を示す。

そのようないくつかの実施形態において、照射ステップ（ａ）（ｉｉｉ）は、式（ＩＩ）における炭素＊－Ｙ結合の切断を引き起こし、第２の蛍光部分を発光状態に活性化する開環反応をもたらす。場合によっては、炭素＊―Ｙ結合の切断は可逆的である。

式（ＩＩ）の第２のフォトクロミック部分のいくつかの実施形態において、５員ピロリジン部分に融合したフェニル部分は、任意に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、ＹはＯである。いくつかのさらなる実施形態において、各Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはＣ１～６アルキルであり、例えば、各Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはメチルである。いくつかの実施形態において、環Ｂは、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである。他の実施形態において、環Ｂは、ピリジルまたはピリミジル等の６員ヘテロアリールから選択され得る。電子吸引基の非限定的な例は、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、トリフリル（－Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ_３）、－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキル、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたスルホニル。

一実施形態において、第２のフォトクロミック部分は、式（ＩＩａ）の構造を含む：

。

一実施形態では、第２の光スイッチ可能なラベルは構造を含む：

、ここで、Ｌ２は第２のリンカーである。 そのようないくつかの実施形態において、第２のリンカーＬ２は、パイ共役構造（例えば、１つ以上の二重結合）を含み得る。 一例において、Ｌ２は、クマリンと第２のフォトクロミック部分を接続する二重結合である。 いくつかの実施形態において、第２の光スイッチ可能な標識は、第２のリンカーを介して、または波線

によって示される点を介してヌクレオチドに共有結合している。

あるいは、第２の光スイッチ可能な標識は、フォトクロミック部分のみ、および任意選択でリンカーを含み得、フォトクロミック部分は、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）に記載された光源による照射時に非発光暗状態から発光状態に切り替えることができる、それ自体が蛍光体として作用し得る。

光スイッチ可能な標識またはフォトクロミック部分の非限定的な例は、ジアリールエテン（例えば、以下に例示すビスチエニルエテン誘導体）、アジン（例えば、以下に例示すアゾベンゼン）、フォトクロミックキノン（例えば、フォノキシナフタセンキノン）、スピロオキサジン、スピロチアジン、メソアルデヒド１－アリル－１－フェニル－２－フェニルサゾン、テトラクロロ－１，２－ケトナフタレノン、チオインジゴイド、ジニトロベンジルピリジン、クロミック等も含む。

本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、複数の伸長ポリヌクレオチドは、基板、例えばフローセルの表面に付着される。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、フローセルの表面上のナノウェルに付着される。

本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、信号の第１の集合および信号の第２の集合を検出することは、基板の画像を取得することを含む。

追加の例示的な実施形態を以下に説明する。

いくつかの実施形態では、核酸をシーケンシングする方法は、３つの異なるヌクレオチドタイプと、蛍光シグナルの存在によって検出されないが、代わりに欠損または欠損によって検出される１つのヌクレオチドタイプの直接または間接検出のための１つの蛍光標識の使用を含む。蛍光信号の欠如。いくつかの実施形態において、核酸をシーケンシングする方法は、３つの異なるヌクレオチドタイプおよび１つのヌクレオチドタイプによって検出されない１つのヌクレオチドタイプの直接または間接検出のための同じまたは類似の励起／発光スペクトルを含む２つ以上の異なる蛍光標識の使用を含む。蛍光シグナルの存在は、代わりに蛍光シグナルの欠如または欠如によって検出される。同一または類似の励起および発光スペクトルは、レーザーが２つ以上の異なる蛍光標識を励起し、光学フィルターがそれらの発光蛍光信号を捕捉するようなものである。核酸サンプルの配列を決定するための蛍光の検出は、時間空間で、例えばシーケンシング反応中の異なる時間に行われる（すなわち、酵素的切断、環境ｐＨの変化等の反応条件の変化の前後に、追加試薬）、蛍光遷移パターン等の蛍光パターンを提供し、それらの累積パターンが核酸標的の配列を決定する。このように、本明細書に記載の方法は、時間と費用が効率的であり、関連するシーケンシング機器の簡素化を可能にする。

標的核酸配列を決定するために時空間蛍光パターンの違いを利用する典型的なアプリケーションは、合成による配列（ＳＢＳ）の方法論および技術である。このように、本明細書に記載の実施形態は、合成蛍光アプリケーションによるシーケンスにおいて特定の有用性を見出す。本明細書に記載の実施形態は、蛍光シーケンシングの革新的な方法の例であるが、開示された実施形態は、サンプル中の複数の分析物（すなわち、ヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの断片）の検出が望まれる他のさまざまな用途にも有用である。

最小限の色素セットを使用したシーケンシングの実施形態の開発において、実験により、１つまたは２つの蛍光部分のみを使用してヌクレオチド取り込みを区別するための代替戦略が明らかになりました。これらの戦略は、シーケンスサイクルに同時に存在する４つのヌクレオチドタイプすべてを提供し、最小限の色素と光学フィルターセットを使用する。いくつかの実施形態では、１つまたは２つの励起および発光フィルターを使用して、反応中に存在する４つすべてのヌクレオチドタイプの取り込みを決定するために、３つ以下の蛍光標識が利用される。好ましい実施形態では、２つ以下の蛍光標識（または２つまたは３つの同じまたは類似の励起／発光スペクトル）を利用して、１つの光励起範囲および１つの励起範囲を使用して、反応中にすべて存在する４つのヌクレオチドタイプすべての取り込みを決定する。検出発光フィルター。

いくつかの実施形態において、最小限の色素セットを使用するシーケンシングは、ガラス、プラスチック、半導体チップ、または複合由来基板等の基板上で実行される。いくつかの実施形態では、例えば単一標的シーケンシングのために、１つの核酸種が基板上に提供される。他の実施形態では、シーケンシングは、例えばフローセルまたはアレイタイプの形式で、複数の核酸標的が検出され、並行してシーケンシングされる多重フォーマットでもあり得る。本明細書に記載の実施形態は、並列シーケンシングまたは大規模並列シーケンシングを実行する場合に特に有利である。蛍光並列シーケンスを実行するプラットフォームには、Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．が提供するプラットフォーム （ＨｉＳｅｑ、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＭｉＳｅｑ、ｉＳｅｑ、ｉＳｃａｎ プラットフォーム等）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＳＯＬｉＤ 等）、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ 等） が含まるが、これらに限定されない。 ）、４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （コネチカット州ブランフォード） および Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （例えば、ＳＭＡＲＴ）。フローセル、チップ、および複数の核酸種に対応できる他のタイプの表面は、並列シーケンシングに利用される基板の例である。複数の核酸種が並行してシーケンシングされるマルチプレックス形式では、クローン増幅された標的配列 （例えば、エマルジョン ＰＣＲ （ｅｍＰＣＲ） またはブリッジ増幅を介して） は、通常、基板上に共有結合で固定化される。例えば、エマルジョン ＰＣＲ を実行する場合、目的のターゲットはビーズに固定化されるが、クローン増幅されたターゲットはフローセルのチャネルまたはアレイまたはチップ上の特定の場所に固定化される。

本明細書に記載の組成物および方法とともに使用するフローセルは、多くの方法でシーケンシングに使用することができる。例えば、ＤＮＡライブラリー等のＤＮＡサンプルは、１つ以上のエッチングされたフローチャネルを含むフローセルまたは流体デバイスに適用することができ、フローセルは、その表面に共有結合したプローブ分子の集団をさらに含むことができる。フローセルチャネルに取り付けられたプローブは、チャネル内の異なるアドレス指定可能な位置に有利に配置され、ＤＮＡライブラリー分子をフローセルチャネルに追加することができ、ここで相補配列が結合できる（本明細書に記載されているように、さらにＷＯ２０１２／０９６７０３に記載されているように、本明細書に組み込まれている）。全体を参照することにより）。本出願で使用するフローセルの別の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９０６，３２０号および第９，９９０，３８１号に記載されているＣＭＯＳフローセルを含む。本明細書に記載のようにブリッジ増幅を実施し、続いて本明細書に記載の合成方法および組成物によるシーケンシングを行うことができる。シーケンシングのためにフローセルを作成および利用する方法は、当技術分野で知られている。本明細書に提供され、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる参照。本明細書に記載の方法および組成物は、フローセル指向シーケンシング方法論の特定の製造または方法に限定されないことが考慮される。

本明細書に記載の方法および組成物を利用したシーケンシングは、マイクロタイタープレート、例えば高密度反応プレートまたはスライドで行うこともできる（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ ４３７（７０５７）： ３７６－３８０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ゲノム ターゲットは、ｅｍＰＣＲ 技術によって準備できる。反応プレートまたはスライドは、反応、例えば蛍光または発光反応から発生した光を捕捉および記録できる光ファイバー材料から作成することができる。コア材料をエッチングして、少なくとも１つのｅｍＰＣＲ反応ビーズを保持できる個別の反応ウェルを提供することができる。このようなスライド／プレートには、１６０ 万以上のウェルを含めることができる。作成されたスライド／プレートには、ターゲット シーケンシング反応 ｅｍＰＣＲ ビーズをロードし、シーケンシング試薬が提供され、シーケンシングが行われる機器に取り付けることができる。

Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ） によって実行されるように、チップまたはスライド上で ＤＮＡ ナノボールを含むパターン化された基板を実行する場合、本明細書に開示される組成物および方法を利用してターゲットをシーケンシングするためのアレイ化された基板の例が提供される。 Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９６１）： ７８－８１ に記載されているように、シリコン ウエハーは二酸化ケイ素とチタンで層を形成し、その後フォトリソグラフィーとドライ エッチング技術を使用してパターン化することができる。ウエハーを ＨＭＤＳ で処理し、フォトレジスト層でコーティングして、シラン化とそれに続くシーケンシングのための ＤＮＡ ナノボールの共有結合のための個別の領域を定義することができる。当業者は、シーケンシング方法論で使用する核酸の固定化のための個別の位置を有するスライド／チップを作成するための多くの方法が存在し、本方法はシーケンシングのために基板を準備する方法に限定されないことを理解するであろう。

本明細書に記載の実施形態を限定することを意図せず、説明のために、一般的な戦略シーケンシングサイクルは、一連のステップによって説明することができる。以下の例は、シークエンシングによるシークエンシング反応に基づいているが、本明細書に記載の方法は、特定のシークエンシング反応方法論に限定されない。

４つのヌクレオチドタイプＡ、Ｃ、ＴおよびＧは、通常、可逆的にブロックされた（ｒｂ）ヌクレオチド（例えば、ｒｂＡ、ｒｂＴ、ｒｂＣ、ｒｂＧ）等のシーケンシング反応用に設計された修飾ヌクレオチドであり、４つのタイプのうち３つが蛍光標識される。目的のテンプレートシーケンスが配置され、シーケンス反応が発生する場所（フローセル、チップ、スライド等）に、他の反応成分とともに追加される。標的配列に基づいて成長する配列の核酸鎖にヌクレオチドを組み込んだ後、反応を光にさらし、蛍光を観察して記録する。これは、第１のイメージングイベントと第１の蛍光検出パターンを構成する。最初の画像化イベントに続いて、サンプルは光源で照射され、第１および第２の蛍光標識の発光信号に識別可能かつ測定可能な変化を引き起こす。反応位置が再び照らされ、蛍光の変化が捕捉されて記録される。２番目のイメージングイベント（つまり、２番目の蛍光検出パターン）を構成する。取り込まれたヌクレオチド上に存在するブロッカーは、次のシーケンシングサイクルの準備として、２回目のイメージングイベントの後に存在する他の試薬とともに除去され、洗い流される。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、第１の画像化イベントから第２の画像化イベントへの蛍光の識別可能かつ測定可能な変化を直接的または間接的に引き起こし得る化学試薬の使用を伴わない。２つの画像化イベントからの蛍光パターンが比較され、ヌクレオチドの取り込みが行われ、その特定のサイクルに対する標的核酸の配列が決定される。

（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。用語「有している（ｈａｖｉｎｇ）」ならびに「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有した（ｈａｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。本明細書で使用されているように、クレームの移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｒａｓｅ）中であっても本体部（ｂｏｄｙ）中であっても、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンド化された意味を有すると解釈されるべきである。即ち、上記の用語は、句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と同義的に解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、プロセスが少なくとも記載されたステップを含むが、追加のステップを含んでもよいことを意味する。化合物、組成物、またはデバイスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、化合物、組成物、またはデバイスが少なくとも記載された特徴または成分を含むが、追加の特徴または成分もまた含んでもよいことを意味する。

本明細書で使用される一般的な有機略語は、次のように定義される。
℃ 摂氏温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸
ｄｄＮＴＰ ジデオキシヌクレオチド三リン酸
ｆｆＮ 完全に機能化されたヌクレオチド
ＬＥＤ 発光ダイオード

本明細書で使用される「アレイ」という用語は、異なるプローブ分子が相対位置に従って互いに区別できるように、１以上の基板に付着した異なるプローブ分子の集団を指す。アレイは、基板上の異なるアドレス指定可能な位置にそれぞれ配置された異なるプローブ分子を含むことができる。代替的または追加的に、アレイは、それぞれが異なるプローブ分子を有する別個の基板を含むことができ、異なるプローブ分子は、基板が付着する表面上の基板の位置に従って、または基板の位置に従って識別され得る液体で。別個の基板が表面上に位置する典型的なアレイには、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、米国特許第２００２／０１０２５７８号およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３４３７号に記載されているウェル内にビーズを含むアレイが含まれるが、これらに限定されない。例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等のマイクロ流体デバイスを使用して、液体アレイ内のビーズを区別するために本発明で使用できる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第５，００３，００３号に記載されている。いいえ。６，５２４，７９３。本発明で使用できるアレイのさらなる例には、米国特許第５，４２９，８０７号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。５，４３６，３２７；５，５６１，０７１；５，５８３，２１１；５，６５８，７３４；５，８３７，８５８；５，８７４，２１９；５，９１９，５２３；６，１３６，２６９；６，２８７，７６８；６，２８７，７７６；６，２８８，２２０；６，２９７，００６；６，２９１，１９３；６，３４６，４１３；６，４１６，９４９；６，４８２，５９１；６，５１４，７５１と６，６１０，４８２；およびＷＯ９３／１７１２６；ＷＯ９５／１１９９５；ＷＯ９５／３５５０５；ＥＰ７４２２８７；およびＥＰ７９９８９７。

本明細書で使用される場合、用語「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子間での電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合されたポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用を介した表面への結合と比較して、基板の官能化された表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーは、共有結合に加えて手段を介して結合することもできることが理解されよう。

本明細書で使用される「Ｒ」基は、示された原子に結合することができる置換基を表す。Ｒ基は、置換されていても置換されていなくてもよい。２つの「Ｒ」基が「それらが結合している原子とともに」環または環系を形成すると記載されている場合、原子、介在結合、および２つのＲ基の集合単位が列挙された環であることを意味する。例えば、以下のサブ構造が存在し：

かつＲ^１およびＲ^２が水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義されるか、またはＲ^１およびＲ^２がそれらが結合している原子とともにアリールまたはカルボシクリルを形成するものとして定義される場合、Ｒ^１およびＲ^２は、水素またはアルキルから選択され得るか、あるいは、当該サブ構造は、以下の構造を有し：

式中、Ａは、描かれた二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルである。

特定のラジカル命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りの部分への２つの結合点を必要とする場合、置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、２つの結合点を必要とするアルキルとして識別される置換基には、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－等のジラジカルが含まれる。他のラジカル命名規則は、ラジカルが「アルキレン」や「アルケニレン」等のジラジカルであることを明確に示す。

本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素の周期表の列７の放射線安定性原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有してもよい（本明細書中に現れる場合は常に、「１～２０」といった数値範囲は、指定された範囲内の各整数を指す；例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等で、２０個までの炭素原子からなってもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現もカバーする）。アルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中型アルキルであってもよい。アルキル基はまた、１～６個の炭素原子を有するより低級のアルキルであり得た。アルキル基は、「Ｃ_１－４アルキル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ_１－６アルキル」は、アルキル鎖に１～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、Ｒが上記で定義されるアルキルである式－ＯＲを指し、例えば「Ｃ_１－９アルコキシ」であり、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、１－メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ－ブトキシ、ｉｓｏ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、およびｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の出現もカバーする。アルケニル基はまた、２から９個の炭素原子を有する中型アルケニルであってもよい。アルケニル基はまた、２～６個の炭素原子を有するより低級のアルケニルであってもよい。アルケニル基は、「Ｃ_２－６アルケニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ_２－６アルケニル」は、アルケニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルケニル鎖がエテニル、プロペン－１－イル、プロペン－２－イル、プロペン－３－イル、ブテン－１－イル、ブテン－２－イル、ブテン－３－イル、ブテン－４－イル、１－メチル－プロペン－１－イル、２－メチル－プロペン－１－イル、１－エチル－エテン－１－イル、２－メチル－プロペン－３－イル、ブタ－１，３－ジエニル、ブタ－１，２，－ジエニル、およびブタ－１，２－ジエン－４－イルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の出現もカバーする。アルキニル基はまた、２～９個の炭素原子を有する中型アルキニルであってもよい。アルキニル基はまた、２～６個の炭素原子を有するより低級のアルキニルであり得た。アルキニル基は、「Ｃ_２－６アルキニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ_２－６アルキニル」は、アルキニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキニル鎖がエチニル、プロピン－１－イル、プロピン－２－イル、ブチン－１－イル、ブチン－３－イル、ブチン－４－イル、および２－ブチニルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格に炭素のみを含む芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系の場合、系内のすべての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アリール」という用語の出現もカバーする。いくつかの実施形態では、アリール基は、６から１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ_６－１０アリール」、「Ｃ_６またはＣ_１０アリール」、または同様の呼称として指定され得る。アリール基の例としては、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられる。

「アラルキル」または「アリールアルキル」は、「Ｃ_７－１４アラルキル」といった、置換基としてアルキレン基を介して結合されたアリール基であり、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち、Ｃ_１－６アルキレン基）である。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１以上のヘテロ原子、すなわち、環骨格中の窒素、酸素および硫黄が挙げられるがこれらに限定されない、炭素以外の元素を含む芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の各環は、芳香族である。ヘテロアリール基は、５～１８個の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子の数）を有してもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の出現もカバーする。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、５～１０の環員数または５～７個の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５－７員のヘテロアリール」、「５－１０員のヘテロアリール」、または同様の呼称として指定してもよい。ヘテロアリール環の例としては、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。

「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、置換基として、アルキレン基を介して結合されたヘテロアリール基である。例としては、２－チエニルメチル、３－チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち、Ｃ_１－６アルキレン基）である。

本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格に炭素原子のみを含む非芳香族環状環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環は、融合、架橋、またはスピロ接続された様式で一緒に結合されてもよい。環系の少なくとも１つの環が芳香族でない限り、カルボシクリルは、任意の程度の飽和度を有してもよい。したがって、カルボシクリルとしては、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが挙げられる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有してもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない「カルボシクリル」という用語の出現もカバーする。カルボシクリル基はまた、３～１０個の炭素原子を有する中型カルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基はまた、３～６個の炭素原子を有するカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基は、「Ｃ３－６カルボシクリル」または同様の呼称として指定してもよい。カルボシクリル環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクル［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和したカルボシクリル環または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格に少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香族環状環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋、またはスピロ結合の方法で一緒に結合してもよい。ヘテロシクリルは、環系の少なくとも１つの環が芳香族でない限り、任意の程度の飽和度を有してもよい。ヘテロ原子は、環系の非芳香族環または芳香族環のいずれかに存在してもよい。ヘテロシクリル基は、３～２０の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の出現もカバーする。ヘテロシクリル基はまた、３～１０の環員数を有する中型ヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基はまた、３～６の環員数を有するヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基は、「３－６員ヘテロシクリル」または同様の呼称として指定してもよい。好ましい６員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳの１つから３つまで選択され、好ましい５員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳの１つまたは２つのヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例としては、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、４－ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３－ジオキシニル、１，３－ジオキサニル、１，４－ジオキシニル、１，４－ジオキサニル、１，３－オキサチアニル、１，４－オキサチイニル、１，４－オキサチアニル、２Ｈ－１，２－オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジニル、１，３－ジオキソリル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオリル、１，３－ジチオラニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３－オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロイオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ－１，４－チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。

「Ｏ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指す。

「Ｃ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルからなる群から選択される「Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指す。非限定的な例には、カルボキシル（すなわち、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が含まれる。

「スルホニル」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される「－ＳＯ_２Ｒ」基を指す。

「Ｓ－スルホンアミド」基とは、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＳＯ_２ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指す。

「Ｎ－スルホンアミド」基とは、Ｒ_ＡおよびＲ_ｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｎ（Ｒ_Ａ）ＳＯ_２Ｒ_Ｂ」基を指す。

「Ｃ－アミド」基とは、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指す。

「Ｎ－アミド」基とは、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｎ（Ｒ_Ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ_Ｂ」基を指す。

「アミノ」基とは、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_３－７カルボシクリル、Ｃ_６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および３－１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指す。非限定的な例には、遊離アミノ（すなわち、－ＮＨ_２）が含まれる。

「アミノアルキル」基とは、アルキレン基を介して接続されたアミノ基を指す。

「アルコキシアルキル」基とは、「Ｃ_２－８アルコキシアルキル」等といった、アルキレン基を介して結合したアルコキシ基を指す。

本明細書で使用される場合、置換基は、１以上の水素原子が別の原子または基と交換された非置換の親基に由来する。特に明記しない限り、基が「置換された」と見なされる場合、その基は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１－Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１－Ｃ_６ヘテロアルキル、Ｃ_３－Ｃ_７カルボシクリル（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、Ｃ_３－Ｃ_７－カルボシクリル－Ｃ_１－Ｃ_６－アルキル（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、３－１０員ヘテロシクリル（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、３－１０員ヘテロシクリル－Ｃ_１－Ｃ_６－アルキル（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、アリール（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、アリール（Ｃ_１－Ｃ_６）アルキル（任意でハロで置換、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシ）、５－１０員ヘテロアリール（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、５－１０員ヘテロアリール（Ｃ_１－Ｃ_６）アルキル（任意でハロ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１－Ｃ_６ハロアルコキシで置換）、ハロ、－ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ_１－Ｃ_６）アルキル（例、－ＣＦ３）、ハロ（Ｃ_１－Ｃ_６）アルコキシ（例、－ＯＣＦ_３）、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ_１－Ｃ_６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルホニル、－ＳＯ_３Ｈ、－ＯＳＯ_２Ｃ_１－_４アルキル、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１以上の置換基で置換されていることを意味する。基が「任意で置換された」と記載されている場合はいつでも、その基を、上記の置換基で置換することができる。

本明細書で使用される「アジド」という用語は、－Ｎ_３基を指す。

本明細書で使用される「ヌクレオチド」には、窒素含有複素環式塩基、糖、および１以上のリン酸基が含まれる。それらは、核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは糖はリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、つまりリボースに存在する水酸基を持たない糖である。窒素含有複素環塩基は、プリンまたはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれます。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。

本明細書で使用される「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドに構造的に類似しているが、リン酸部分が欠けている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合し、リン酸基が糖分子に結合していないものである。本明細書では、「ヌクレオシド」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用される。例には、リボース部分を含むリボヌクレオシドおよびデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。修飾ペントース部分は、酸素原子が炭素で置き換えられているおよび／または炭素が硫黄または酸素原子で置き換えられているペントース部分である。「ヌクレオシド」は、置換された塩基および／または糖部分を有することができるモノマーである。さらに、ヌクレオシドをより大きなＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリマーおよびオリゴマーに組み込むことができる。

本明細書では、「プリン塩基」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、その互変異性体を含む。同様に、「ピリミジン塩基」という用語は、当業者に理解される通常の意味で本明細書で使用され、その互変異性体を含む。置換されていてもよいプリン塩基の非限定的なリストには、プリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、アロキサンチン、７－アルキルグアニン（例えば、７－メチルグアニン）、テオブロミン、カフェイン、尿酸およびイソグアニンが含まれる。ピリミジン塩基の例には、シトシン、チミン、ウラシル、５，６－ジヒドロウラシルおよび５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「誘導体」または「類似体」は、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を意味する。そのような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ， １９８０） および Ｕｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４， １９９０ で議論されている。ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアニリデートおよびホスホルアミデート結合。本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」および「修飾された」は交換可能に使用され、本明細書で定義される「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」という用語に包含される。

本明細書で使用される「リン酸塩」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、そのプロトン化された形を含む（例えば、

および

）。本明細書で使用される「一リン酸」、「二リン酸」、および「三リン酸」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、プロトン化された形態を含む。

本明細書で使用される「保護基」および「保護基」という用語は、分子内の既存の基が望ましくない化学反応を起こすのを防ぐために分子に付加される任意の原子または原子団を指す。「保護基」と「保護基」は同じ意味で使用される場合がある。

本明細書で使用される接頭辞「ｐｈｏｔｏ」または「ｐｈｏｔｏ－」は、光または電磁放射に関することを意味する。この用語は、電波、マイクロ波、赤外線、可視、紫外線、Ｘ線、またはスペクトルのガンマ線部分として一般的に知られている１つまたは複数の範囲を含むがこれらに限定されない電磁スペクトルのすべてまたは一部を含むことができる。スペクトルの一部は、本明細書に記載の金属等、表面の金属領域によってブロックされるものであり得る。代替的または追加的に、スペクトルの一部は、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に記載の他の材料でできた領域等、表面の隙間領域を通過するものであり得る。特定の実施形態では、金属を通過できる放射線を使用することができる。代替的または追加的に、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に記載の他の材料によってマスクされた放射線を使用することができる。

（標識ヌクレオチド）
本開示の一態様によれば、記載された組み込み用ヌクレオチドは検出可能な標識を含み、そのようなヌクレオチドは標識ヌクレオチドと呼ばれる。標識（例えば、蛍光色素）は、疎水性引力、イオン引力、および共有結合を含むさまざまな手段によって、オプションのリンカーを介して結合することができる。いくつかの局面において、染料は、共有結合によって基質にコンジュゲートされる。より具体的には、共有結合はリンカー基による。場合によっては、そのような標識ヌクレオチドは「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれます。いくつかの実施形態において、色素は、切断可能なリンカーを介してヌクレオチドに共有結合している。このようないくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アジド部分、アジドメチル部分、ジスルフィド部分、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）－、または本明細書に記載の他の共有結合リンカーを含む１以上の部分を含み得る。

標識ヌクレオチドは、非限定的な例として、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチドシーケンシング（例えば、固相シーケンシング）、ニックトランスレーション反応等において、酵素合成によって形成されたポリヌクレオチドを標識するために有用である。

いくつかの実施形態において、色素は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合され得る。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置に付着した標識を有することができる。

特に明記しない限り、ヌクレオチドへの言及はヌクレオシドにも適用できるものとする。本出願はまた、ＤＮＡを参照してさらに説明されるが、特に明記しない限り、説明はＲＮＡ、ＰＮＡ、および他の核酸にも適用可能である。

本開示のいくつかの実施形態は、光スイッチ可能な標識を含むヌクレオチドコンジュゲートに関し、光スイッチ可能な標識は、任意選択でリンカーを介してフォトクロミック部分に共有結合した蛍光部分を含む。いくつかの実施形態において、光スイッチ可能な標識は、切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合している。いくつかのさらなる実施形態において、光スイッチ可能な標識は、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置に結合される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、光スイッチ可能な標識で標識されている。光源を照射すると、光スイッチ可能な標識の発光信号が、例えば信号状態から暗状態に変化する。言い換えれば、観測される発光信号は「オン」から「オフ」に切り替わる可能性がある。あるいは、光スイッチ可能なラベルは、非発光暗状態を信号状態に変化させてもよい。言い換えれば、観測される発光信号は「オフ」から「オン」に切り替わる可能性がある。

いくつかの実施形態では、光スイッチ可能な標識は、任意選択でリンカーを介してフォトクロミック部分に共有結合した蛍光部分を含む。いくつかのそのような実施形態において、蛍光部分は、赤色光、例えば、約６００ｎｍから約７００ｎｍの間の波長を有する赤色光を発するフルオロフォアを含む。

いくつかの実施形態において、光スイッチ可能な標識の蛍光部分は、シリコンローダミンフルオロフォアを含む。一実施形態において、ローダミンフルオロフォアは以下の構造を含む：

。このようないくつかの実施形態では、光スイッチ可能な標識のフォトクロミック部分は、スピロピラノまたはスピロチオピラノ部分を含み得る。例えば、フォトクロミック部分は式（Ｉ）の構造を含む：

ここで、Ｘ、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ３、Ｒ４、および環Ａの定義は本明細書に記載されており、アスタリスク＊で標識された炭素は、適切な光源で照射すると化学変換を受けるスピロ炭素である。

式（Ｉ）のフォトクロミック部分のいくつかの実施形態において、５員ピロリジンに融合したフェニル部分は、場合により置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、ＸはＳである。いくつかのさらなる実施形態において、各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはＣ１～６アルキルであり、例えば、各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａはメチルである。いくつかの実施形態において、環Ａは、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである。電子吸引基の非限定的な例は、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、トリフリル（－Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ_３）、－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキル、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたスルホニル。一実施形態において、フォトクロミック部分は、式（Ｉａ）の構造を含む：

。一実施形態では、光スイッチ可能なラベルは以下の構造を含む：

、ここで、Ｌ１は第１のリンカーである。そのようないくつかの実施形態において、第１のリンカーＬ１は、アジド部分を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、第１の光スイッチ可能な標識は、第１のリンカーを介して、または第１のフォトクロミック部分または第１の蛍光部分のいずれかに結合する異なる位置を介してヌクレオチドに共有結合される。

いくつかの他の実施形態において、光スイッチ可能なものの蛍光部分は、クマリンフルオロフォアを含む。一実施形態において、クマリンフルオロフォアは以下の構造を含む：

。そのようないくつかの実施形態では、光スイッチ可能な標識のフォトクロミック部分は、オキサジンまたはチアジン部分を含み得る。例えば、フォトクロミック部分は、式（ＩＩ）の構造を含む。

ここで、Ｙ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、および環Ｂの定義は本明細書に記載されており、アスタリスク＊で標識された炭素は、直接または第２のリンカーを介して、蛍光部分への結合点を示す。式（ＩＩ）の炭素＊―Ｙ結合は、適切な光源の照射により化学変化を起こす。

式（ＩＩ）のフォトクロミック部分のいくつかの実施形態において、５員ピロリジン部分に融合したフェニル部分は、任意に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、ＹはＯである。いくつかのさらなる実施形態において、各Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはＣ１～６アルキルであり、例えば、各Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂはメチルである。いくつかの実施形態において、環Ｂは、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである。他の実施形態において、環Ｂは、ピリジルまたはピリミジル等の６員ヘテロアリールから選択され得る。電子吸引基の非限定的な例は、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、トリフリル（－Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ_３）、－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキル、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたスルホニル。一実施形態において、フォトクロミック部分は、式（ＩＩａ）の構造を含む：

。一実施形態では、光スイッチ可能なラベルは以下の構造を含む：

、ここで、Ｌ２は第２のリンカーである。そのようないくつかの実施形態において、第２のリンカーＬ２は、パイ共役構造（例えば、１つ以上の二重結合）を含み得る。一例では、Ｌ２はクマリンとフォトクロミック部分をつなぐ二重結合である。いくつかの実施形態において、光スイッチ可能な標識は、第２のリンカーＬ２を介して、または波線

によって示される点を介してヌクレオチドに共有結合している。

あるいは、本明細書に記載の光スイッチ可能な標識は、フォトクロミック部分および任意選択でリンカーのみを含むことができ、フォトクロミック部分は、それ自体がフルオロフォアとして機能し、非発光暗状態から発光状態へ、または発光状態から切り替えることができる適切な光源を照射すると、暗状態になる。

本開示のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチドコンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。

（リンカー）
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ヌクレオチド分子のプリンまたはピリミジン塩基は、上記の検出可能な標識に結合することができる。そのようないくつかの実施形態では、使用されるリンカーは切断可能である。切断可能なリンカーを使用すると、必要に応じて検出後に標識を確実に除去でき、その後に組み込まれる標識ヌクレオチドとの干渉信号を回避できる。

いくつかの他の実施形態では、使用されるリンカーは切断不可能である。本明細書に記載の標識ヌクレオチドが組み込まれる各場合において、その後にヌクレオチドを組み込む必要がなく、したがって、ヌクレオチドから標識を除去する必要がない。

切断可能なリンカーは当技術分野で知られており、従来の化学を適用して、リンカーをヌクレオチド塩基および標識に結合させることができる。リンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素等への暴露を含む、任意の適切な方法によって切断することができる。３’－Ｏ－ブロッキンググループ結合を切断するために使用される。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ に開示されている標準的な化学保護基から適合させることができる。固相合成で使用されるさらに適切な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １００：２０９２－２１５７， ２０００）に開示される。

検出可能な標識が塩基に付着している場合、ワトソン・クリック塩基対形成が依然として実行できる限り、リンカーはヌクレオチド塩基上の任意の位置に付着することができる。プリン塩基の文脈では、リンカーがプリンまたは好ましいデアザプリン類似体の７位を介して、８修飾プリンを介して、Ｎ－６修飾アデノシンまたはＮ－２修飾グアニンを介して結合している場合が好ましい。ピリミジンの場合、結合はシトシン、チミジンまたはウラシルの５位およびシトシンのＮ－４位を介することが好ましい。

いくつかの実施形態では、リンカーはスペーサーユニットを含むことができる。ヌクレオチドと酵素、例えばポリメラーゼとの間の相互作用を妨害しないように、標識がヌクレオチドから十分な距離を保っている限り、リンカーの長さは重要ではない。

いくつかの実施形態において、リンカーは、３価ＯＨ保護基と同様の官能基からなり得る。これにより、ラベルと保護基の両方を１回の処理で除去するだけで済むため、脱保護と脱保護のプロセスがより効率的になる。

用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体が除去される必要があることを意味するものではない。切断部位は、リンカーの一部が切断後に色素および／または基質部分に結合したままであることを保証するリンカー上の位置に配置することができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元的条件下（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能であり、安全キャッチリンカーの使用を介して切断可能であり、排除メカニズムによって切断可能であるものであってもよい。切断可能なリンカーを使用して色素化合物を基質部分に結合させることにより、必要に応じて、検出後に標識を除去することができるようになり、下流ステップでの干渉シグナルを回避することができる。

有用なリンカー基は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得、その例としては、遷移金属および少なくとも部分的に水溶性の配位子から形成された水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使用して切断され得るリンカーが挙げられる。水溶液中で、後者は少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体、例えば、Ｐｄ（ＩＩ）錯体およびＴＨＰを形成する。そのような切断可能なリンカーを使用して、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載の色素といった標識に接続することができる。

特別なリンカーとしては、以下の式の部分を含むものといった、ＰＣＴ公開番号国際公開２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる：

（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱを含む基から選択され、Ｑは、Ｃ１－１０置換または非置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素またはＣ_１－Ｃ_１０置換または非置換アルキル基であり、かつ＊は、部分がヌクレオチドの残りの部分に接続されている場所を示す）。いくつかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば、本明細書に記載の色素化合物といった、標識に接続する。

リンカーの追加の例としては、以下の式の部分を含むものといった、米国公開番号２０１６／００４０２２５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる：

（式中＊は、部分がヌクレオチドの残りの部分に接続されている場所を示す）。本明細書に示されるリンカー部分は、ヌクレオチド／ヌクレオシドと標識との間のリンカー構造全体または部分を含んでもよい。

特別な実施形態では、蛍光色素（フルオロフォア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することによって変更することができ、それにより、グアニン塩基と当該分野で公知の他のリンケージを介して結合した同じフルオロフォアと比較して蛍光強度を増加させる。例示的なリンカーおよびそれらの特性は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００７０２０４５７号（参照により本明細書に組み込まれる）に示される。リンカーの設計、特にそれらの長さの増加により、ＤＮＡ等のポリヌクレオチドに組み込まれたときにグアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロフォアの輝度を向上させることができる。したがって、色素がグアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする分析方法で使用する場合、リンカーが、国際公開第２００７／０２０４５７号に記載されているように式－（（ＣＨ_２）_２Ｏ）_ｎ－のスペーサー基であって、式中ｎが２と５０との間の整数であるものを含むと、有利である。

ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識され得る。当該分野で公知のように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１以上のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖は、リボースであり、ＤＮＡでは、デオキシリボース、すなわちリボースに存在するヒドロキシ基を欠く糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンは、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）、またはＲＮＡの文脈では、ウラシル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、糖のＣ－３またはＣ－５に結合したヒドロキシ基でエステル化が起こる。ヌクレオチドは通常、一、二、または三リン酸である。

塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドがＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受ける能力を変化させない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、コア構造が親化合物と同じであるか、またはそれに非常に類似しているが、例えば、異なるまたは追加の側鎖といった、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを別の分子に結合させることを可能にする、化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。例えば、塩基は、デアザプリンであってもよい。特別な実施形態では、誘導体は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋペアリングを受けることが可能であるべきである。「誘導体」および「類似体」はまた、例えば、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を含む。そのような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，１９８０）およびＵｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，１９９０で考察されている。ヌクレオチド類似体はまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合等を含む修飾ホスホジエステル結合を含み得る。

色素は、例えばリンカーを介して、ヌクレオチド塩基上の任意の位置に結合させることができる。特別な実施形態では、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成は、得られた類似体に対して依然として実施することができる。特定の核酸塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。上記のように、リンカー基を使用して、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。

特別な実施形態では、標識されたヌクレオチドは、酵素的に組み込まれ、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、化合物が核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨害しないように、ヌクレオチドを化合物に接続するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーはスペーサーユニットを含むこともできる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチド塩基を離す。

本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式を有してもよい：

式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり；Ｂは、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンといった、核酸塩基であり；Ｌは、存在しても存在しなくてもよい任意のリンカー基であり；Ｒ’は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、またはブロッキング基によって保護された－Ｏ－であり得；Ｒ’’は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミダイト、または３’－ＯＨブロッキング基であり、Ｒ’’’は、ＨまたはＯＨである。Ｒ’’がホスホルアミダイトである場合、Ｒ’は、酸で切断可能なヒドロキシル保護基であり、自動合成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする。

特別な実施形態では、ブロッキング基は、色素化合物とは別個であり、独立しており、すなわち、それに結合していない。あるいは、色素は、３’－ＯＨブロッキング基の全部または一部を含み得る。したがって、Ｒ’’は、色素化合物を含んでもよく含まなくてもよい３’－ＯＨブロッキング基であり得る。

さらに別の代替の実施形態では、ペントース糖の３’炭素上にブロッキング基はなく、例えば、塩基に結合した色素（または色素およびリンカー構築物）は、さらなるヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに十分なサイズまたは構造であり得る。したがって、ブロックは、色素が糖の３’位置に結合しているかどうかに関係なく、立体障害が原因である場合もあり得、サイズ、電荷、および構造の組み合わせが原因である場合もあり得る。

さらに別の代替の実施形態では、ブロッキング基は、ペントース糖の２’または４’炭素上に存在し、さらなるヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに十分なサイズまたは構造であり得る。

ブロッキング基を使用すると、ヌクレオチドが組み込まれたときに伸長を停止するといったことにより、重合を制御することが可能になる。ブロッキング効果が可逆的である場合、例えば、化学的条件の変更または化学的ブロックの除去による非限定的な例として、伸長を特定の時点で停止し、その後継続させることができる。

別の特別な実施形態では、３’－ＯＨブロッキング基は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００４／０１８４９７号および国際公開第２０１４／１３９５６９号に開示された部分を含むであろう。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（－ＣＨ_２Ｎ_３）または置換アジドメチル（例、－ＣＨ（ＣＨＦ_２）Ｎ_３またはＣＨ（ＣＨ_２Ｆ）Ｎ_３）、またはアリルであり得る。

特別な実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドの間）およびブロッキング基は両方とも存在し、かつ別個の部分である。特別な実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は両方とも、実質的に同様の条件下で切断可能である。したがって、色素化合物とブロッキング基の両方を除去するために必要な処理は１回だけであるため、脱保護および非ブロック化プロセスはより効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は、同様の条件下で切断可能である必要はなく、代わりに、別個の条件下で個別に切断可能である。

本開示はまた、色素化合物を組み込んだポリヌクレオチドを包含する。そのようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから各々構成されるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、本明細書に記載の標識化ヌクレオチド以外の非天然に存在する（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを、本明細書に記載の少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識）と組み合わせて含んでもよい。本開示によるポリヌクレオチドはまた、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾を含んでもよい。リボヌクレオチドおよび少なくとも１つの標識化ヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造もまた企図される。

本明細書に記載される非限定的な例示的な標識化ヌクレオチドとしては、以下が挙げられる：

式中、Ｌは、リンカーを表し、Ｒは、上記のまたは５’位が１、２、または３つのリン酸で置換された糖残基を表す。

いくつかの実施形態では、非限定的な例示的な蛍光色素コンジュゲートは、下記に示される：

式中、ＰＧは、本明細書に記載されている３つのヒドロキシ ブロック グループを表す。

（キット）
本開示はまた、本明細書に記載の標識されたヌクレオチドを含むキットを提供する。そのようなキットは、概して、少なくとも１つのさらなる成分と共に、色素（例えば、本明細書に記載の光スイッチ可能な染料）で標識された少なくとも１つのヌクレオチドを含むであろう。さらなる構成要素は、本明細書に記載の方法または以下の実施例のセクションに記載の方法で特定される１以上の構成要素であってもよい。本開示のキットに組み合わせることができる構成要素のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。

特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つの標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドを、標識または非標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとともに含むことができる。例えば、染料で標識されたヌクレオチドは、非標識または天然ヌクレオチド、および／または蛍光標識ヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて供給され得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個別の成分（例えば、容器またはチューブごとに１つのヌクレオチドタイプ）またはヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器またはチューブ内で混合された２つ以上のヌクレオチド）として提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の染料は、本明細書に開示される光スイッチ可能な染料から選択される。

キットが、それぞれが色素化合物で標識された複数、特に２つ、または３つ、またはより具体的には４つの標識ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合物で標識されてもよいし、色素化合物なしで１つが暗色であってもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、その色素化合物が１つまたは複数の画像化イベントを通じてスペクトル的に区別可能な蛍光色素であることは、キットの特徴である。蛍光色素化合物で標識された２つのヌクレオチドがキットの形で提供される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素が、例えば同じレーザー等によって同じ波長で励起できることが、いくつかの実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識された４つのヌクレオチドがキットの形で提供される場合、いくつかの実施形態の特徴は、スペクトル的に区別可能な蛍光色素のうちの２つが両方とも１つの波長で励起でき、他の２つのスペクトル的に区別可能な色素がそのような波長で励起されないことである。いくつかの実施形態において、４つの異なるタイプのヌクレオチドのうちの１つは標識されていない。

本明細書では、異なる色素化合物で標識された異なるヌクレオチドを有する構成に関してキットが例示されているが、キットは、同じ色素化合物を有する２、３、４またはそれ以上の異なるヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。

特定の実施形態において、キットは、ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。そのようなキットに含まれる他の成分には、緩衝液等が含まれる。本開示のヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキットに提供され得る。そのような実施形態では、適切な希釈緩衝液も含まれ得る。ここでも、本明細書に記載の方法で特定される構成要素の１以上を、本開示のキットに含めることができる。

本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのタイプの標識ヌクレオチドを含むキットに関し、ヌクレオチドは、本明細書に記載の光スイッチ可能な色素で標識されている。いくつかのさらなる実施形態において、キットは、２つ以上のタイプの異なるヌクレオチドを含み、第１のタイプのヌクレオチドは、本明細書に記載の第１の光スイッチ可能な標識で標識され、第２のタイプのヌクレオチドは、本明細書に記載の第２の光スイッチ可能な標識で標識される。さらなる実施形態において、キットは、第１の光スイッチ可能標識と同じまたは実質的に同じ波長で発光する標識を含む第３のタイプのヌクレオチド、または第１の標識と同じまたは実質的に同じ励起波長を使用して励起され得る標識を含む、フォトスイッチ可能なラベル。さらなる実施形態において、キットは、非標識の第４のタイプのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、第１のタイプ、第２のタイプ、および第３のタイプのヌクレオチドは、同じ波長での検出によって測定され得る。

本明細書に記載のキットの任意の実施形態では、自動シーケンシング装置で使用することができ、自動シーケンシング装置は、異なる励起波長で動作する２つのレーザーと、固定発光波長に設定された単一の検出チャネルを有する検出システムとを含む。

光スイッチ可能な標識に開示されている蛍光部分に加えて、蛍光部分として使用するための他の例示的な蛍光部分またはその誘導体には、フルオレセインおよびカルボキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、カルボキシナプトフルオレセイン、フルオレセインイソチオネート等のフルオレセイン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。、ＮＨＳ－フルオレセイン、ヨードアセトアミドフルオレセイン、フルオレセインマレイミド、ＳＡＭＳＡ－フルオレセイン、フルオレセインチオセミカルバジド、カルボヒドラジノメチルチオアセチル－アミノフルオレセイン、ローダミンおよびローダミン誘導体、例えばＴＲＩＴＣ、ＴＭＲ、リサミンローダミン、Ｂ１、ローダミン、ＴＭＲ－ヨードアセトアミド、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、リサミンローダミンＢスルホニルヒドラジン、テキサスレッドスルホニルクロリド、テキサスレッドヒドラジド、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－ＮＨＳ、ＡＭＣＡ－スルホ－ＮＨＳ、ＡＭＣＡ－ＨＰＤＰ、ＤＣＩＡ等のクマリンおよびクマリン誘導体、ＡＭＣＥ－ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹおよびＢＯＤＩＰＹＦＬＣ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ等の誘導体５３０／５５０Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０Ｃ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０Ｃ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３Ｃ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹＦＬＣ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹＦＬＩＡ、ＢＯＤＩＰＹ５ＩＡ４－１ＢＯＤＩＰＹ５３０／５３０カスケードブルーアセチルアジド、カスケードブルーカダベリン、カスケードブルーエチレンジアミン、カスケードブルーヒドラジド、ルシファーイエロー等のブルーおよび誘導体、およびルシファーイエローヨードアセトアミド、ルシファーイエローＣＨ、シアニンおよびインドリウム系シアニン色素、ベンゾインドリウム系等の誘導体シアニン色素、ピリジウムベースのシアニン色素、チオゾリウムベースのシアニン色素、キノリニウムベースのシアニン色素、イミダゾリウムベースのシアニン色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ランタニドキレートおよび誘導体、例えばＢＣＰＤＡ、ＴＢＰ、ＴＭＴ、ＢＨＨＣＴ、ＢＣＯＴ、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ染料、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、Ａｔｔｏ染料、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅｄ染料、ＣＡＬ小麦粉染料、ＪＯＥおよびその誘導体、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ染料、ＷｅｌｌＲＥＤ染料、ＩＲＤ染料、フィコエリトリンおよびフィコビリン染料、マラサイトグリーン、スチルベン、ＤＥＧ染料に記載ＵＳ２０１０／０００９３５３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＮＲ染料、近赤外染料、およびハウグランド、モレキュラー・プローブ・ハンドブック（オレゴン州ユージーン）第６版に記載されているもののような当技術分野で既知の他のもの； Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ カタログ （ヒューストン、テキサス）、Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第 ２ 版、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第 ２ 版、ＵＳ２０１０／０００９３５３ または ＷＯ ９８／５９０６６。参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第３の標識は、本明細書に記載の例示的な蛍光部分またはその誘導体のいずれかから選択することもできる。

（シーケンシングアプリケーション）
本開示による標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに付着した蛍光標識の検出を含む方法等の任意の分析方法で使用することができる。この文脈において、「ポリヌクレオチドに組み込まれる」という用語は、５’リン酸がリン酸ジエステル結合で第２の（修飾または非修飾）ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基に結合していることを意味し、それ自体が長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成している可能性がある。本明細書に記載のヌクレオチドの３’末端は、さらなる（修飾または非修飾）ヌクレオチドの５’リン酸にホスホジエステル結合で結合していても結合していなくてもよい。したがって、１つの非限定的な実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の少なくとも１つのヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと、および（ｂ）組み込まれたヌクレオチドを検出することを含む、ポリヌクレオチドに組み込まれるヌクレオチドを検出する方法を提供する。ヌクレオチドに結合した色素化合物からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに挿入する。

この方法は、本開示による１以上のヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる合成ステップ（ａ）、および検出によってポリヌクレオチドに組み込まれた１以上のヌクレオチドが検出される検出ステップ（ｂ）を含むことができる。またはそれらの蛍光を定量的に測定する。

本出願のいくつかの実施形態は、以下を含むシーケンシング方法を対象とする。（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと；（ｂ）ヌクレオチドに付着した新しい蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに組み込まれた標識ヌクレオチドを検出する。

１つの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素の作用により合成ステップでポリヌクレオチドに組み込まれる。しかしながら、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに結合する他の方法、例えば、化学的オリゴヌクレオチド合成または標識オリゴヌクレオチドの非標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションを使用することができる。したがって、「組み込む」という用語は、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関して使用される場合、化学的方法および酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。

特定の実施形態では、合成ステップが実施され、本開示の蛍光標識ヌクレオチドを含む反応混合物と共にテンプレートポリヌクレオチド鎖をインキュベートすることを任意に含み得る。テンプレートポリヌクレオチド鎖にアニールされたポリヌクレオチド鎖上の遊離３’ヒドロキシ基とヌクレオチド上の５’リン酸基との間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下でポリメラーゼを提供することもできる。したがって、合成ステップは、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの相補的塩基対形成によって指示されるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。

本方法のすべての実施形態において、標識ヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチド鎖がテンプレート鎖にアニールされる間、または２本の鎖が分離される変性工程の後に、検出工程を実施することができる。合成工程と検出工程との間に、さらなる工程、例えば化学または酵素反応工程または精製工程を含めることができる。特に、標識ヌクレオチドを組み込んだ標的鎖を単離または精製し、さらに処理するか、またはその後の分析に使用することができる。例として、合成ステップにおいて本明細書に記載のヌクレオチドで標識された標的ポリヌクレオチドは、続いて標識プローブまたはプライマーとして使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載の合成ステップの生成物は、さらなる反応ステップにかけられてもよく、必要に応じて、これらの後続ステップの生成物は精製または単離されてもよい。

合成ステップに適した条件は、標準的な分子生物学技術に精通している者にはよく知られている。一実施形態では、合成ステップは、本明細書に記載のヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的なプライマー伸長反応に類似し、適切なポリメラーゼ酵素の存在下でテンプレート鎖に相補的な伸長標的鎖を形成することができる。他の実施形態では、合成工程自体が増幅反応の一部を形成し、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピーに由来するアニールされた相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を生成する。他の例示的な合成ステップには、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムＤＮＡ標識等が含まれる。合成ステップに特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載のヌクレオチドの取り込みを触媒できるものである。さまざまな天然または修飾ポリメラーゼを使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクル条件を使用して実行される合成反応に使用することができるが、等温プライマー伸長反応には熱安定性ポリメラーゼは望ましくない場合がある。本開示によるヌクレオチドを組み込むことができる適切な熱安定性ポリメラーゼには、ＷＯ２００５／０２４０１０またはＷＯ０６１２０４３３に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。３７℃等の低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はない。したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性等といった多数の因子に依存するであろう。

特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸シーケンシング、再シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、一塩基多型スコアリングの方法、ポリヌクレオチドに組み込まれた場合の本明細書に記載の標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を含む他の適用を包含する。蛍光色素を含むヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用に利益をもたらす他の様々な用途はいずれも、本明細書に記載の色素で標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドを使用することができる。

特定の実施形態において、本開示は、本開示による標識ヌクレオチドの合成によるポリヌクレオチドシーケンシング反応における使用を提供する。合成によるシーケンシングは、通常、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖に１つまたは複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを５’から３’方向に順次追加して、テンプレート核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成する。順序付けられた追加されたヌクレオチドの１つまたは複数に存在する塩基の同一性は、検出または「イメージング」ステップで決定することができる。付加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド取り込みステップの後に決定することができる。次に、テンプレートのシーケンスは、従来のワトソン－クリック塩基対形成規則を使用して推測することができる。単一塩基の同一性を決定するための本明細書に記載の標識ヌクレオチドの使用は、例えば、単一ヌクレオチド多型のスコアリングにおいて有用である可能性があり、そのような単一塩基伸長反応は本開示の範囲内である。

本開示の一実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドの配列は、組み込まれたポリヌクレオチドに付着した蛍光標識の検出を通じて、シーケンシングされるテンプレートポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への１つ以上のヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。ヌクレオチド。テンプレートポリヌクレオチドのシーケンシングは、適切なプライマー（またはヘアピンの一部としてプライマーを含むヘアピンコンストラクトとして準備）でプライムすることができ、３’末端へのヌクレオチドの付加によって新生鎖が段階的に伸長される。ポリメラーゼ触媒反応におけるプライマーの量。

特定の実施形態において、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）のそれぞれは、独特のフルオロフォアで標識され得、制御されない重合を防止するために３’位にブロッキング基も含む。または、４つのヌクレオチドの１つが非標識（暗色）である可能性がある。ポリメラーゼ酵素は、テンプレートポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込み、ブロッキンググループはヌクレオチドのさらなる組み込みを防ぎます。取り込まれていないヌクレオチドはすべて洗い流すことができ、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルは、レーザー励起および適切な発光フィルターを使用する電荷結合素子等の適切な手段によって光学的に「読み取る」ことができる。次に、３’－ブロッキング基と蛍光色素化合物を同時にまたは連続して除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチド取り込みのために新生鎖を露出させることができる。通常、組み込まれたヌクレオチドの同一性は、各組み込みステップの後に決定されるが、これは厳密には必須ではない。同様に、米国特許Ｎｏ．米国特許第５，３０２，５０９号（参照により本明細書に組み込まれる）は、固体支持体に固定化されたポリヌクレオチドを配列する方法を開示している。

この方法は、上に例示したように、蛍光標識された３’－ブロックヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴを、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、固定化ポリヌクレオチドに相補的な成長鎖に組み込むことを利用する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込んでいるが、３’－ブロッキング基によってそれ以上の付加が妨げられている。次に、取り込まれたヌクレオチドの標識を決定し、化学的切断によって保護基を除去して、さらに重合を行うことができる。合成によるシーケンシング反応においてシーケンシングされる核酸テンプレートは、シーケンシングが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。シーケンシング反応のための核酸テンプレートは、典型的には、シーケンシング反応におけるさらなるヌクレオチドの付加のためのプライマーまたは開始点として機能する遊離の３’ヒドロキシ基を有する二本鎖領域を含む。シーケンシングされるテンプレートの領域は、相補鎖上のこの無料の３’ヒドロキシ基をオーバーハングする。シーケンシングされるテンプレートのオーバーハング領域は、一本鎖でもよいが、シーケンシングされるテンプレート鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」ことにより、開始のための遊離の３’ＯＨ基を提供するという条件で、二本鎖でもよい。シーケンス反応。そのような実施形態では、シーケンシングは鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態において、遊離３’ヒドロキシ基を有するプライマーは、シーケンシングされるテンプレートの一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として加えられ得る。あるいは、シーケンシングされるプライマーおよびテンプレート鎖は、例えばヘアピンループ構造等の分子内二本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部をそれぞれ形成することができる。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に付着させる方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／５７２４８およびＷＯ２００５／０４７３０１に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドは、成長するプライマーに連続して追加され、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖が合成される。付加された塩基の性質は、特に各ヌクレオチド付加後に決定されるが、必ずしもそうである必要はないので、核酸テンプレートの配列情報を提供する。したがって、ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して、ヌクレオチドを核酸鎖の遊離３’ヒドロキシル基に結合することにより、ヌクレオチドが核酸鎖（またはポリヌクレオチド）に組み込まれます。

シーケンシングされる核酸テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子でさえあり得る。核酸テンプレートは、シーケンシング反応におけるテンプレートのコピーを妨げない限り、天然および／または非天然ヌクレオチドおよび天然または非天然骨格結合を含んでもよい。

特定の実施形態では、シーケンシングされる核酸テンプレートは、当技術分野で公知の任意の適切な結合方法、例えば共有結合によって固体支持体に結合され得る。特定の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカベースの支持体）に直接付着され得る。しかしながら、本開示の他の実施形態において、固体支持体の表面は、テンプレートポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするか、またはそれ自体が非であり得るヒドロゲルまたは高分子電解質多層を通してテンプレートポリヌクレオチドを固定化するように、何らかの方法で修飾され得る。－固体支持体に共有結合している。

ポリヌクレオチドがシリカベースの支持体に直接付着したアレイは、例えば、ＷＯ００／０６７７０（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものであり、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ基。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２００５／０４７３０１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、硫黄ベースの求核剤と固体支持体との反応によって、固体支持体に結合させることができる。固体に支持されたテンプレートポリヌクレオチドのさらに別の例は、テンプレートポリヌクレオチドが、例えば、ＷＯ００／３１１４８、ＷＯ０１／０１１４３、ＷＯ０２／１２５６６、ＷＯ０３／０１４３９２、米国特許米国特許第６，４６５，１７８号およびＷＯ００／５３８１２を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

テンプレートポリヌクレオチドが固定化され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上で引用した参考文献およびＷＯ２００５／０６５８１４に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。使用できる特定のヒドロゲルには、ＷＯ２００５／０６５８１４およびＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．番号２０１４／００７９９２３。一実施形態では、ヒドロゲルはＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド））である。

ＤＮＡテンプレート分子は、例えば、米国特許第５，２５３，００３号に記載されているように、ビーズまたは微粒子に付着することができる。米国特許第６，１７２，２１８号（参照により本明細書に組み込まれる）。ビーズまたは微粒子への付着は、シーケンシングアプリケーションに役立ちます。ビーズライブラリは、各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含むように準備することができる。ライブラリの例とその作成方法は、Ｎａｔｕｒｅ、４３７、３７６－３８０ （２００５） に記載される。 Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， ５７４１， １７２８－１７３２ （２００５）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のヌクレオチドを使用するそのようなビーズのアレイのシーケンシングは、本開示の範囲内である。

シーケンシングされるテンプレートは、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成することができ、その場合、アレイは任意の便利な形をとることができる。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆるタイプの高密度アレイに適用可能である。本開示の標識ヌクレオチドは、固体支持体上への核酸分子の固定化によって形成されるものを含むがこれらに限定されない、本質的に任意のタイプのアレイ上でテンプレートをシーケンシングするために使用され得る。

しかし、本開示の標識ヌクレオチドは、クラスター化アレイのシーケンシングの文脈において特に有利である。クラスター化されたアレイでは、アレイ上の異なる領域（サイトまたはフィーチャと呼ばれることが多い）が、複数のポリヌクレオチドテンプレート分子を構成する。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は光学的手段によって個別に分解することはできず、代わりに集団として検出される。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の各部位は、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、その部位は特定の一本鎖または二本鎖の核酸種に対して均質である）または少数の複数のコピーを含む場合がある。異なるポリヌクレオチド分子の（例えば、２つの異なる核酸種の複数のコピー）。核酸分子のクラスター化されたアレイは、当技術分野で一般的に知られている技術を使用して生成され得る。例として、ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７（それぞれが本明細書に組み込まれている）は、クラスターからなるアレイを形成するために、テンプレートと増幅産物の両方が固体支持体に固定されたままである核酸の増幅方法を記載している。または固定化された核酸分子の「コロニー」。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識されたヌクレオチドを使用してシーケンシングするための適切なテンプレートである。

本開示の標識ヌクレオチドは、単一分子アレイ上のテンプレートのシーケンシングにも有用である。本明細書で使用される「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」という用語は、固体支持体上に分散（または配列）したポリヌクレオチド分子の集団を指し、個々のポリヌクレオチドと他のすべての集団との間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に分離することが可能である。したがって、固体支持体の表面に固定化された標的核酸分子は、いくつかの実施形態において、光学的手段によって分解することができる。これは、それぞれが１つのポリヌクレオチドを表す１つまたは複数の異なる信号が、使用される特定のイメージングデバイスの分解可能な領域内で発生することを意味する。

アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が少なくとも１００ｎｍ、より詳細には少なくとも２５０ｎｍ、さらにより詳細には少なくとも３００ｎｍ、さらにより詳細には少なくとも３５０ｎｍである単一分子検出を達成することができる。このように、各分子は単一分子の蛍光点として個別に分解および検出可能であり、単一分子の蛍光点からの蛍光も単一段階の光退色を示す。

本明細書では、「個別に分解」および「個別の分解」という用語を使用して、視覚化すると、アレイ上の１つの分子をその隣接する分子から区別できることを指定する。アレイ上の個々の分子間の分離は、部分的に、個々の分子を分解するために使用される特定の技術によって決定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、公開された出願ＷＯ００／０６７７０およびＷＯ０１／５７２４８を参照することによって理解されるであろう。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のヌクレオチドの一用途は、合成反応によるシーケンシングであるが、ヌクレオチドの有用性はそのような方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに付着した蛍光標識の検出を必要とする任意のシーケンシング方法で有利に使用することができる。

特に、本開示の標識ヌクレオチドは、自動蛍光シーケンシングプロトコル、特にサンガーおよび共同研究者の連鎖停止シーケンシング法に基づく蛍光色素ターミネーターサイクルシーケンシングにおいて使用され得る。このような方法は、通常、酵素とサイクルシーケンシングを使用して、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドをプライマー伸長シーケンシング反応に組み込みます。いわゆるサンガーシーケンシング法、および関連プロトコル（サンガータイプ）は、標識されたジデオキシヌクレオチドによるランダム化された連鎖停止を利用する。

したがって、本開示は、３’および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである標識ヌクレオチドも包含し、そのようなジデオキシヌクレオチドは、サンガー型シーケンシング法等での使用に適している。

３’－ブロッキング基を組み込んだ本開示の標識ヌクレオチドは、サンガー法および関連プロトコルにおいても有用であり得る。なぜなら、ジデオキシヌクレオチドを使用することによって達成されるのと同じ効果が、３’－ＯＨブロッキング基を有するヌクレオチドを使用することによって達成され得るからである。：両方が後続のヌクレオチドの取り込みを防ぎます。本開示によるヌクレオチドがサンガー型シーケンシング法で使用される場合、ヌクレオチドに結合した色素化合物または検出可能な標識は、切断可能なリンカーを介して結合する必要がないことが理解されるであろう。本開示の標識ヌクレオチドが組み込まれる各例。ヌクレオチドを後で組み込む必要がないため、ヌクレオチドからラベルを除去する必要はない。

本明細書に開示される追加の実施形態は、複数の異なる核酸を含むサンプルを提供することを含む、複数の核酸配列を決定する方法を提供する。各核酸はテンプレートおよびプライマーを含む。シーケンス反応のサイクルを実行すること、ここでサイクルは、サンプル中の核酸のプライマーを伸長して、本明細書に記載の少なくとも４つの異なる標識ヌクレオチドタイプを有する複数の伸長プライマーを形成し、それにより伸長サンプルを形成することを含み、第１の伸長プライマー中の異なるヌクレオチドタイプの少なくとも２つがシグナル状態にあり、伸長プライマー中の異なるヌクレオチドタイプの少なくとも１つが暗状態にある、伸長サンプルからのシグナルの収集。光源でポリヌクレオチドを照射して、特定のヌクレオチド標識の発光シグナルに変化を生じさせ、サンプルからシグナルの第２のコレクションを取得する。ここで、２つの異なるヌクレオチドタイプは、シグナルの第１コレクションでは異なる状態にある。信号の２番目のコレクション。サイクルからのシグナルの第１のコレクションおよびシグナルの第２のコレクションを評価することにより、複数の異なる核酸の配列を決定する。いくつかの実施形態では、複数の異なる核酸が基板に付着している。いくつかの実施形態において、プライマーの伸長は、異なるヌクレオチドタイプのポリメラーゼ触媒付加を含む。いくつかの実施形態では、異なるヌクレオチドタイプは可逆的ブロッキング部分を含み、それにより、各サイクルで伸長プライマーのそれぞれに単一ヌクレオチドタイプが付加される。いくつかの実施形態において、プライマーの伸長は、異なるヌクレオチドタイプを含むオリゴヌクレオチドのリガーゼ触媒付加を含む。いくつかの実施形態において、伸長プライマー中の異なるヌクレオチドタイプのうちの２つは、伸長サンプルからの信号の最初の収集の取得中に暗状態にある。好ましい実施形態では、前述のシーケンシング反応サイクルが１回以上繰り返される。

追加の実施形態は、特許請求の範囲を限定することを決して意図しない以下の実施例においてさらに詳細に開示される。

（例１）
この例では、変更された光スイッチ可能な赤色発光蛍光体に基づいて組み込まれた色素の識別を取得するための簡略化されたアプローチが説明されており、組み込みの１サイクルのワークフローが図２に示される。

このアプローチに必要な各塩基結合蛍光タグの構造と機能を表１に示す。「Ａ」および「Ｃ」色素は、光スイッチ機能を備えている。「Ｔ」色素は、標準的な赤色発光色素であり得、例えば、「Ａ」ヌクレオチドに対する光スイッチ可能なダイアドの一部である同じ赤色色素であり得る。染料をヌクレオチドに結合するリンカーは、本明細書に記載のＬＮ３リンカーであり、表１および以下の光化学反応スキームに部分的にのみ示されている。本明細書に開示される他のリンカーも使用され得る。これらの色素はすべて、生物学的に関連する媒体で機能することができる。

新しいＡ色素は、青色レーザーまたはＬＥＤ（４０５ｎｍ）を使用して光スイッチできるように設計される。光化学的活性化は、ダイアドの下部をＳｉ含有ローダミン色素からの発光を抑制することができるクエンチャーに変換する開環反応につながる（スキーム１）。

光活性化可能なＣ色素は、Ａ色素がクエンチされた「オフ」状態に変換されると同時に、青色レーザーまたはＬＥＤ照射（４０５ｎｍ）への露出によって「オン」蛍光状態に切り替えることができる。Ｃ色素の場合、同様の開環反応によりオキサジン環が可逆的に開き、５５０～６５０ｎｍ付近に最大吸収が集中する高度な蛍光状態が生成される（スキーム２）。したがって、ここで提案されているすべての染料は、同じ赤色ＬＥＤまたはレーザー（６３３ｎｍ）で励起できる。

図２では、表１による４つの異なる種類のヌクレオチドが、ポリヌクレオチドへの取り込みのためにフローセルにさらされている。最初のイメージングステップ中に、各クラスターからの発光が記録される。この最初のイメージングイベントでは、「Ａ」および「Ｔ」ヌクレオチドの両方から放出された蛍光シグナルが検出される。次に、波長４０５ｎｍの青色レーザーを使用して、「Ａ」色素をクエンチし、「Ｃ」色素を活性化する。次に、２番目の画像化ステップが実行され、各クラスターからの発光が再び記録される。この２番目のイメージングイベントでは、「Ｃ」および「Ｔ」ヌクレオチドから放出された蛍光シグナルが検出される。両方のイメージングイベントで、「Ｇ」ヌクレオチドは暗い（ラベルなし）。ヌクレオチドは、２つの画像全体の各塩基の異なる発光パターンの分析によって識別される。画像１と画像２の組み合わせを画像解析ソフトウェアで処理し、各クラスター位置にどの塩基が組み込まれているかを識別する。２回目の画像化イベントの後、組み込まれたヌクレオチドは、別のヌクレオチドの組み込みを可能にする標準的な手順に従ってブロック解除される。このシーケンスサイクルは、「ｎ」回繰り返されて、「ｎ」塩基の読み取り長が作成される。

この例では、４０５ｎｍの青色レーザーまたはＬＥＤが使用される。これは、「Ｃ」色素のクマリン部分または「Ａ」色素のスピロナフトチオピラン部分に追加の置換基を導入することによってさらに調整できる。これにより、４５０ｎｍレーザーを使用する現在のｉＳｅｑ（商標）システムとの完全な互換性が可能になる。提案された変更は、数回のシーケンシングサイクルにわたって、より高いエネルギー照射に繰り返しさらされる結果として生じる可能性のあるＤＮＡ損傷の可能性も減らすであろう。

Claims (71)

1. 以下を含む、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法：
   （ａ）以下の１回以上のサイクルを含むシーケンシング反応を実施すること：
   （ｉ）４つの異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートを、標的ポリヌクレオチドに相補的な複数のポリヌクレオチドに組み込んで、伸長ポリヌクレオチドを産生することであって、第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは第１の光スイッチ可能な標識を含み、第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは第２の光スイッチ可能なラベルを含み、第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートは第３の標識を含む、組み込んで産生すること；
   （ｉｉ）最初の画像化イベントを介して、各サイクルで伸長ポリヌクレオチドからの信号の最初のコレクションを検出すること；
   （ｉｉｉ）伸長されたポリヌクレオチドを光源で照射して、第１の光スイッチ可能な標識および第２の光スイッチ可能な標識の発光信号に変化を生じさせること；
   （ｉｖ）第２の画像化イベントを介して伸長ポリヌクレオチドからの信号の第２の集合を検出すること；
   （ｂ）連続的に組み込まれたヌクレオチド結合体に基づいて、標的ポリヌクレオチドの配列を決定こと。
2. 第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みが、第１の画像化事象における信号状態および第２の画像化事象における暗状態から決定される、請求項１に記載の方法。
3. 第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みが、第１の画像化事象における暗状態および第２の画像化事象における信号状態から決定される、請求項１または２に記載の方法。
4. 第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みが、第１の画像化事象および第２の画像化事象における信号状態から決定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 第４のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの取り込みが、第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントにおける暗状態から決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. ４つの異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートが同時に存在し、各サイクル中に取り込みについて競合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. ステップ（ａ）が少なくとも５０回繰り返される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. ヌクレオチドコンジュゲートの取り込みがポリメラーゼによって行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 異なるタイプのヌクレオチドコンジュゲートが可逆的ターミネーター部分を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. ステップ（ａ）が、次の取り込みサイクルの前に、取り込まれたヌクレオチド結合体から可逆的ターミネーター部分を切断することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. ヌクレオチドコンジュゲートが、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびそれらの非天然ヌクレオチド類似体からなる群から選択されるヌクレオチドタイプを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲートおよび第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの標識が同じ蛍光部分を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 第１のタイプのヌクレオチドコンジュゲート、第２のタイプのヌクレオチドコンジュゲート、および第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの標識が、異なる蛍光部分を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 異なる蛍光部分が同じ発光フィルターを使用して検出される、請求項１３に記載の方法。
15. 第４のタイプのヌクレオチドコンジュゲートが蛍光部分で標識されていない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射が、第３のタイプのヌクレオチドコンジュゲートの第３の標識から検出された信号を実質的に変化させない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源が、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはそれらの組合せを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源が、第１の画像化イベントで使用される励起波長とは異なる波長を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源が、約３５０ｎｍ～約４５０ｎｍの波長を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ステップ（ａ）（ｉｉｉ）における照射光源が、約４０５ｎｍの波長を有する、請求項１９に記載の方法。
21. 第１の画像化イベントおよび第２の画像化イベントが実質的に同じ励起波長を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第１の画像化事象および前記第２の画像化事象は、約５５０ｎｍ～６５０ｎｍの励起波長を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１の画像化イベントおよび前記第２の画像化イベントは、約６３３ｎｍの励起波長を有する、請求項２２に記載の方法。
24. 第１の光スイッチ可能な標識が、第１のフォトクロミック部分に任意に第１のリンカーを介して共有結合した第１の蛍光部分を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 第１の蛍光部分が、赤色光を発する蛍光部分を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 第１の蛍光部分がシリコンローダミン部分を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 第１のフォトクロミック部分がスピロピラノまたはスピロチオピラノ部分を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 第１のフォトクロミック部分が式（Ｉ）の構造を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    式中：
    Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
    Ｒ^１ａおよびＲ^２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ_１－６ハロアルコキシからなる群から選択され；
    Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１－６アルキル、および－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^４からなる群から選択され；
    Ｒ^４は、Ｃ_６－１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～７員のカルボシクリル、および３～７員ヘテロシクリルからなる群から選択され、各々置換されていてもよく；
    環Ａは、Ｃ_６－１０アリールまたは５～１０員ヘテロアリールであり、各々が少なくとも１つの電子吸引基で置換され；
    ｎは、１～６の整数であり；かつ
    照射工程（ａ）（ｉｉｉ）は、スピロＣ―Ｘ結合の切断を引き起こす。
29. Ｘが、Ｓである、請求項２８記載の方法。
30. 各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａが、Ｃ_１－６アルキルである、請求項２８または２９に記載の方法。
31. 環Ａが、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 電子吸引基が、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキルからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
33. 第１のフォトクロミック部分が式（Ｉａ）の構造を含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    。
34. 第１の光スイッチ可能な標識が構造を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    、ここで、Ｌ１は第１のリンカーである。
35. 第２の光スイッチ可能な標識が、場合により第２のリンカーを介して、第２のフォトクロミック部分に共有結合した第２の蛍光部分を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 第２の蛍光部分が、クマリン部分を含む、請求項３５に記載の方法。
37. 第２のフォトクロミック部分が、オキサジン部分またはチアジン部分を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
38. 第２のフォトクロミック部分が、式（ＩＩ）の構造を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    式中：
    Ｙは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
    Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ_１－６ハロアルコキシからなる群から選択され；
    環ＢはＣ６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり；それぞれが少なくとも１つの電子吸引基で置換され；かつ
    ＊は、蛍光部分への結合点を示し、照射ステップ（ａ）（ｉｉｉ）は、炭素＊－Ｙ結合の切断を引き起こす。
39. Ｙが、Ｏである、請求項３８に記載の方法。
40. Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂが、それぞれＣ_１－６アルキルである、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 環Ｂが、少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 電子吸引基が、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＣＦ３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキルからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 第２のフォトクロミック部分が、式（ＩＩａ）の構造を含む、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    。
44. 第２の光スイッチ可能な標識が構造を含む、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法：
    

    

    、式中、Ｌ２は、第２のリンカーである。
45. 複数のポリヌクレオチドが、基板に付着している、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 信号の第１の集合および信号の第２の集合を検出することが、基板の画像を取得することを含む、請求項４５に記載の方法。
47. 光スイッチ可能な標識を含むヌクレオチドコンジュゲートであって、光スイッチ可能な標識が、任意選択でリンカーを介してフォトクロミック部分に共有結合した蛍光部分を含む、ヌクレオチドコンジュゲート。
48. 蛍光部分が励起時に赤色光を発する、請求項４７記載のヌクレオチドコンジュゲート。
49. 前記蛍光部分がシリコンローダミン部分を含む、請求項４７または４８に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
50. 前記フォトクロミック部分がスピロピラノまたはスピロチオピラノ部分を含む、請求項４８または４９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
51. フォトクロミック部分が式（Ｉ）の構造を含む、請求項４８から５０のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    式中：
    Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
    Ｒ^１ａおよびＲ^２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ_１－６ハロアルコキシからなる群から選択され；
    Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１－６アルキル、および－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ^４からなるグループから選択され、
    Ｒ^４は、Ｃ_６－１０アリール、５から１０員のヘテロアリール、３から７員のカルボシクリル、および３から７員のヘテロシクリルからなる群から選択され、各々置換されていてもよく；
    環Ａは、Ｃ_６－１０アリールまたは５から１０員のヘテロアリールであり、各々が少なくとも１つの電子吸引基で置換され；かつ
    ｎは、１～６の整数である。
52. Ｘが、Ｓである、請求項５１記載のヌクレオチドコンジュゲート。
53. 各Ｒ^１ａおよびＲ^２ａが、Ｃ１～６アルキルである、請求項５１または５２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
54. 環Ａが、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ_２）ＯＨ、Ｓ（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、および１つ以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキルからなる群から選択される少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
55. フォトクロミック部分が式（Ｉａ）の構造を含む、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    。
56. 光スイッチ可能な標識が構造を含む、請求項４９～５５のいずれか一項記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    、式中、Ｌ^１は、リンカーである。
57. 蛍光部分がクマリン部分を含む、請求項４７または４８記載のヌクレオチドコンジュゲート。
58. フォトクロミック部分が、オキサジン部分またはチアジン部分を含む、請求項５７記載のヌクレオチドコンジュゲート。
59. フォトクロミック部分が、式（ＩＩ）の構造を含む、請求項５７または５８に記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    式中：
    Ｙは。Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）であり、
    Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂは、各々独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ_１－６アルキル、任意に置換されたＣ_２－６アルケニル、任意に置換されたＣ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、およびＣ_１－６ハロアルコキシからなる群から選択され；かつ
    環Ｂは、Ｃ_６－１０アリールまたは５～１０員ヘテロアリールであり；各々が少なくとも１つの電子吸引基で置換され；かつ
    ＊は、蛍光部分への結合点を示す。
60. Ｙが、Ｏである、請求項５９記載のヌクレオチドコンジュゲート。
61. 各Ｒ^１ｂおよびＲ^２ｂが、Ｃ_１－６アルキルである、請求項５９または６０に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
62. 環Ｂが、ニトロ、シアノ、フルオロ、ブロモ、－Ｓ（Ｏ_２）ＯＨ、－Ｓ、（Ｏ）_２ＣＦ_３、アンモニウム、アルキルアンモニウム、および１以上のフルオロまたはブロモで置換されたＣ_１－６アルキル。からなる群から選択される少なくとも１つの電子吸引基で置換されたフェニルまたはナフチルである、請求項５９から６１のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
63. フォトクロミック部分が、式（ＩＩａ）の構造を含む、請求項５６～６２のいずれか一項記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    。
64. 光スイッチ可能な標識が、構造を含む、請求項５６～６３のいずれか一項記載のヌクレオチドコンジュゲート：
    

    

    、式中、Ｌ^２は、リンカーである。
65. 光スイッチ可能な標識が、切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合している、請求項４７～６４のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
66. 光スイッチ可能な標識が、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置に結合している、請求項６４記載のヌクレオチドコンジュゲート。
67. 請求項４７～６６のいずれか一項に記載のヌクレオチドコンジュゲートを含むオリゴヌクレオチド。
68. ２種類以上のヌクレオチドを含むキットであって、第１のタイプのヌクレオチドが、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドコンジュゲートであり、第２のタイプのヌクレオチドが、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドコンジュゲートである、キット。
69. ４つのヌクレオチドを含み、第３のタイプのヌクレオチドが、第１のタイプのヌクレオチドと同じ波長で発光する標識を含み、第４のタイプのヌクレオチドが標識されていない、請求項６８に記載のキット。
70. 第１のタイプのヌクレオチド、第２のタイプのヌクレオチド、および第３のタイプのヌクレオチドが、同じ発光波長で検出可能である、請求項６９に記載のキット。
71. 自動シーケンシング装置で使用するための、自動シーケンシング装置が、異なる励起波長で作動する２つのレーザーと、固定発光波長に設定された単一の検出チャネルを有する検出システムとを含む、請求項６８から７１のいずれか一項に記載のキット。
    

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