KR20210144550A - 광전환성 표지를 사용한 핵산 서열분석을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

광전환성 표지를 사용한 핵산 서열분석을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20210144550A
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일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

본 개시의 구현예는 광전환성 화합물로 표지된 뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 서열분석 적용을 위한 상기 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 방법 및 키트가 본원에서 제공된다.

Description

광전환성 표지를 사용한 핵산 서열분석을 위한 방법 및 조성물
본 개시는 일반적으로 광전환성(photoswitchable) 표지로 표지된 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법 및 적용에서의 이의 용도에 관한 것이다.
생물학적 시료에 존재하는 핵산 서열과 같은 분석물의 검출은 미생물 확인 및 분류, 감염성 질환 진단, 유전적 이상 검출 및 특성화, 암과 관련된 유전적 변화 확인, 질환에 대한 유전적 감수성 연구, 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응 측정을 위한 방법으로 사용되었다. 생물학적 시료에서 핵산 서열과 같은 분석물을 검출하기 위한 일반적인 기술은 핵산 서열분석이다.
고-처리량(high-throughput), 소량, 저가의 DNA 서열분석 기술에 대한 필요성이 게놈 서열분석의 보상을 얻는 데 도움이 될 것임이 분명해졌다. 개인화된 헬스케어가 선두를 향해 나아가고 있으며 이러한 기술로부터 혜택을 받을 것이다; 잠재적 돌연변이 및 이상을 확인하기 위한 개체의 게놈 서열분석은 개인이 특정 질환을 갖는지의 여부를 확인한 후에, 그 개체에 맞춘 후속 치료를 하는 데 중요할 것이다. 이러한 적극적인 노력에 부응하기 위해, 서열분석은 이의 고처리량 능력뿐만 아니라 사용 편의성, 시간 및 비용 효율성, 그리고 기기 및 시약에 대한 임상의 접근성 측면에서도 대량신속처리기술(high throughput technology)로 전진하고 수용되어야 한다.
광전환성 형광 탐침(probe)은 초-해상(super-resolution) 형광 현미경 기술에서 중요한 새로운 개발품으로, 이는 개선된 공간 분해능에 접근하기 위해 암(dark) 상태에서 방출 상태로 전환할 수 있는 염료가 필요하다. Vaughan 등, FEBS Letters 588 (2014) 3603-3612 참조. 광전환성 형광 탐침은 광변색성(photochromic) 화합물을 이용하며, 이는 적절한 파장 및 강도의 광으로 조명시 별개의 흡수 스펙트럼을 가진 상태 간에 가역적으로 전환된다. 광(photo) 생성 종(species)은 일반적으로 열적 수단 또는 추가 조명에 의해 다시 시작 종으로 되돌아간다. 예를 들어, Anderson 등은 최근에 광전환성 퀀쳐(quencher)에 공유결합으로 연결된 적색 방출 형광단(fluorophore)으로 구성되는 소분자 다이애드(dyad)의 합성 및 생물학적 이미징에 대한 다이애드의 사용을 보고하였다. Anderson 등, Org. Lett. 2016, 18, 3666-3669 참조. 유사한 연구에서, Bossi 등은 초 해상 이미징용 항체와 접합된 쿠마린 형광단 및 옥사진 광색소(photochrome)를 이용한 다이애드의 합성을 보고하였다. Bossi 등, J. Phys. Chem. C2016, 120, 12860-12870 참조.
차세대 서열분석 적용을 포함하여, 생물학적 이미징 적용에 이용할 수 있는 새로운 광전환성 형광 표지를 개발할 필요가 있다.
본 개시의 일부 구현예는 광전환성 표지를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체에 관한 것으로, 광전환성 표지는 임의로 링커를 통해 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 형광 모이어티를 포함한다. 광원, 예컨대 레이저 또는 LED 광으로 조사시, 광전환성 표지는 "켜짐" 상태에서 "꺼짐" 상태로, 또는 그 반대로 가역적으로 변화될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 접합체의 형광 모이어티는 적색 방출 형광단, 예를 들어 실리콘 로다민일 수 있다. 일부 구현예에서, 광전환성 표지의 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 스피로피라노 또는 스피로티오피라노 모이어티를 포함한다:
Figure pct00001
(I)
여기서, X는 O (산소) 또는 S (황)이고;
R1a 및 R2a 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H, C1-6 알킬, 및 -(CH2)n-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 각각 임의로 치환된 C6-10 아릴, 5 내지 10원 헤테로아릴, 3 내지 7원 카르보시클릴, 및 3 내지 7원 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
고리 A는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고, 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기(electron withdrawing group)로 치환되며;
n은 1 내지 6의 정수이다.
일부 다른 구현예에서, 광전환성 표지의 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
Figure pct00002
(II)
여기서, Y는 O (산소) 또는 S (황)이고;
R1b 및 R2b 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
고리 B는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고; 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며; 여기서 *는 형광 모이어티에 대한 부착점을 나타낸다.
본 개시의 일부 구현예는 본원에 기술된 뉴클레오타이드 접합체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 개시의 일부 추가 구현예는 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 관한 것으로, 하기 사이클 중 하나 이상의 사이클을 포함하는 서열분석 반응을 수행하는 단계:
(i) 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체를 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 폴리뉴클레오타이드로 혼입하여 연장된 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 사이클로, 여기서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제1 광전환성 표지를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제2 광전환성 표지를 포함하며, 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제3 표지를 포함하는 것인 사이클;
(ii) 제1 이미징 이벤트를 통해 각 사이클에서 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제1 신호 수집을 검출하는 사이클;
(iii) 제1 이미징 이벤트 후 연장된 폴리뉴클레오타이드를 광원으로 조사하여 제1 광전환성 표지 및 제2 광전환성 표지의 방출 신호에 변화를 일으키는 사이클;
(iv) 제2 이미징 이벤트를 통해 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제2 신호 수집을 검출하는 사이클; 및
순차적으로 혼입된 뉴클레오타이드 접합체를 기반으로 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체가 동시에 존재하며 각 사이클의 혼입 동안 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드로의 혼입을 위해 경쟁한다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 신호 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 암 상태로부터 결정된다. 일부 이러한 구현예에서, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 암 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정된다. 일부 이러한 구현예에서, 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정된다. 일부 이러한 구현예에서, 제4 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 암 상태로부터 결정된다. 일부 추가 구현예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 화학식 (I)의 광변색성 모이어티를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 화학식 (II)의 광변색성 모이어티를 포함한다.
본 개시의 일부 추가 구현예는 본원에 명시된 바와 같이, 광전환성 표지를 갖는 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 적용분야, 예컨대 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전적 분석, RNA 분석, 세포 분석 (예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 분석 (예를 들어, 단백질 결합 분석 또는 단백질 활성 분석)에 사용될 수 있다. 특정 기술을 수행하기 위한 자동화 장비, 예컨대 자동화 서열분석 장비에 사용할 수 있다. 서열분석 장비는 각각 다른 검출가능한 표지들을 식별하기 위해 하나의 레이저만 포함할 수 있다. 서열분석 장비는 "켜짐" 상태에서 "꺼짐" 상태로, 또는 그 반대로 광전환성 표지를 활성화하기 위해 다른 파장에서 작동하는 추가 레이저 또는 광원을 포함할 수 있다.
도 1a는 표준 일루미나 1-채널 합성에 의한 서열분석(SBS) 화학에 대한 흐름도를 예시한다.
도 1b는 표준 1-채널 SBS로부터의 제1 이미지 및 제2 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 처리하여 혼입된 염기를 확인하는 방법을 예시한다.
도 2는 본원에 개시된 광전환성 염료를 사용한 1-채널 서열분석 프로세스에 대한 흐름도를 예시한다.
일루미나의 차세대 서열분석 시스템인 iSeq 100™은 CMOS-기반 기술을 사용하여, 단순화된 접근가능한 벤치탑 서열분석 솔루션을 제공한다. 표준 서열분석 작업 흐름은 도 1a 및 도 1b에 예시되어 있으며, 이를 1-채널 서열분석이라고도 한다. 각 서열분석 사이클은 두 개의 화학 단계 및 두 개의 이미징 단계를 포함한다. 도 1a에서, 제1 화학 단계는 형광 표지된 아데닌 및 티민이 있는 뉴클레오타이드 혼합물에 플로우 셀을 노출시킨다. 제1 이미징 단계 동안, 각 클러스터로부터의 광 방출은 CMOS 센서에 의해 기록된다. 제2 화학 단계는 아데닌에서 형광 표지를 제거하고 사이토신에 형광 표지를 추가한다. 두 화학 단계 모두에서, 구아닌은 암색이다 (비표지됨). 제2 이미지가 기록된다. 도 1b에서, 제1 이미지 및 제2 이미지의 조합을 이미지 분석 소프트웨어로 처리하여 각 클러스터 위치에 혼입된 염기를 확인한다. 이 서열분석 사이클은 "n" 횟수를 반복하여 "n" 염기의 판독(read) 길이를 생성한다. 시퀀서(sequencer)가 각 뉴클레오타이드에 대해 다른 염료를 사용하는 4-채널 SBS 화학과 달리, iSeq 100 ™ 시스템은 서열분석 사이클 당 하나의 염료를 사용한다. 1-채널 화학에서, 아데닌은 제거가능한 표지를 가지며 제1 이미지에서만 표지된다. 사이토신은 표지와 결합할 수 있는 링커 그룹이 있으며 제2 이미지에서만 표지된다. 티민은 영구적인 형광 표지를 가지며, 따라서 두 이미지 모두에서 표지되고, 구아닌은 영구적으로 암색이다. 뉴클레오타이드는 두 이미지에 걸쳐 각 염기에 대한 상이한 방출 패턴의 분석에 의해 확인된다.
본 개시의 구현예는 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 특히, 이 방법은 광원으로 조사시 광 유도되어 색 변화할 수 있는 광전환성 염료로 표지된 뉴클레오타이드의 사용을 포함한다.
광전환성 형광단의 사용과 관련된 여러 장점이 있다. 광전환성 염료는 단일 이미징 이벤트에만 필요하고 그 직후에 절단되므로 전환 견고성(robustness)을 나타낼 필요가 없다. 이러한 염료는 내피로성(fatigue resistance)의 임의의 나타냄 없이 여러 번 전환할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 접근법은 또한 염료의 방출 상태의 변환이 광 에너지를 통해 "원격"으로 유도되므로, 전용 절단 혼합체 또는 교환 시약을 도입하는 사용을 제거한다. 전환이 플로우셀의 안과 밖으로 시약을 펌핑하는 데 필요한 시간을 상당히 단축하여 1 마이크로 초 미만(sub-microsecond)의 시간 단위로 발생하므로, 총 사이클 시간 또한 최소화해야 한다. 조사를 기반으로 한 변환은 일반적으로 고산출량이며, 혼합된 신호 또는 억제된 방출을 피하기 위한 필수적인 특성이다.
또한, 형광 마커의 방출 상태에 대한 제어를 가하는 능력은 핵산 서열분석 적용분야에서 매우 유용하다. 예를 들어, 많은 유사한 태그(tag)를 사용하여 일반적으로 관찰되는 문제는 태그가 프로세스 단계에서 성공적으로 사용된 후, 잔류 방출이 원치않는 백그라운드 신호에 기여할 수 있다는 것이다. 이성질화, 구조적 변화 또는 가역적 개환 공정을 기반으로, 방출 프로파일의 변화를 원격으로 유도하여 신호 대 잡음비를 개선하기 위한 가능성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 하기 사이클의 반복된 사이클을 포함하는 서열분석 반응을 수행하는 단계:
(i) 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체를 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 폴리뉴클레오타이드로 혼입하여 연장된 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 사이클로, 여기서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제1 광전환성 표지를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제2 광전환성 표지를 포함하며, 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체 각각은 제3 표지를 포함하는 것인 사이클;
(ii) 제1 이미징 이벤트를 통해 각 사이클에서 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제1 신호 수집을 검출하는 사이클;
(iii) 제1 이미징 이벤트 후 연장된 폴리뉴클레오타이드를 광원으로 조사하여 제1 광전환성 표지 및 제2 광전환성 표지의 방출 신호에 변화를 일으키는 사이클;
(iv) 제2 이미징 이벤트를 통해 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제2 신호 수집을 검출하는 사이클;
(b) 순차적으로 혼입된 뉴클레오타이드 접합체를 기반으로 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 신호 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 암 상태로부터 결정되고; 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 암 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정되며; 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정되고; 제4 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 암 상태로부터 결정된다.
검출 이벤트와 관련하여 사용된 경우, "신호 상태"는 특정 신호가 검출 이벤트에서 생성되는 상태를 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서브유닛은 서열분석 방법에서 형광 표지의 여기 및 방출에 의해 형광 검출 단계에서 검출되는 형광 표지에 부착된 경우 신호 상태에 있을 수 있으며 검출가능할 수 있다. 검출 이벤트와 관련하여 사용된 경우, 용어 "암 상태(dark state)"는 특정 신호가 검출 이벤트에서 생성되지 않는 상태를 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서브유닛은 뉴클레오타이드에 형광 표지가 없고/없거나, 서열분석 방법의 형광 검출 단계에서 특이적으로 검출되는 형광을 방출하지 않는 경우 암 상태에 있을 수 있다. 암 상태 검출은 또한 형광 표지없이 존재할 수 있는 임의의 백그라운드 형광을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 반응 성분은 특정 파장에서 여기될 때 최소의 형광을 나타낼 수 있다. 이와 같이, 형광 모이어티가 존재하지 않더라도 이러한 성분으로부터 백그라운드 형광이 있을 수 있다. 또한, 백그라운드 형광은 예를 들어 검출기로 검출될 수 있는 인접한 서열분석 반응으로부터의 광 산란으로 인한 것일 수 있다. 이와 같이, "암 상태"는 형광 모이어티가 특이적으로 포함되지 않은 경우, 예컨대 형광 표지가 없는 뉴클레오타이드가 본원에 기술된 방법에서 이용되는 경우와 같은 백그라운드 형광을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 백그라운드 형광은 신호 상태와 구별될 수 있는 것으로 고려되며, 이와 같이 비표지된 뉴클레오타이드 (또는 "암색" 뉴클레오타이드)의 뉴클레오타이드 혼입은 여전히 식별할 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 단계 (a)는 적어도 50회, 100회, 150회, 200회, 250회, 300회, 350회, 400회, 450회, 또는 500회 반복된다. 일부 구현예에서, 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체가 동시에 존재하며 각 사이클 동안 혼입을 위해 경쟁한다. 일부 추가 구현예에서, 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 폴리머라아제에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 가역적 종결자(terminator) 모이어티를 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 단계 (a)는 다음 혼입 사이클 전에 혼입된 뉴클레오타이드 접합체로부터 가역적 종결자 모이어티를 절단하는 것을 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 뉴클레오타이드 접합체는 dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, 및 이의 비-천연 뉴클레오타이드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 유형을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체 및 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 표지는 동일한 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체 및 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 표지는 동일한 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체, 및 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 표지는 상이한 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 상이한 형광 모이어티는 동일한 방출 필터, 또는 상이한 방출 필터를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 제4 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 형광 모이어티로 표지되지 않는다. 본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사는 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 제3 표지로부터 검출된 신호를 변화 또는 실질적으로 변화시키지 않는다.
일부 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 레이저, 발광 다이오드 (LED), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 제1 이미징 이벤트에서 사용된 여기 파장과 상이한 파장을 갖는다. 일부 이러한 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 약 350 ㎚ 내지 약 450 ㎚의 파장을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 약 405 ㎚의 파장을 갖는다.
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 동일하거나 실질적으로 동일한 여기 파장을 갖는다. 이러한 구현예에서, 제1 표지, 제2 표지 및 제3 표지는 하나의 검출 채널을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 약 550 ㎚ 내지 약 650 ㎚의 여기 파장을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 약 633 ㎚의 여기 파장을 갖는다.
제1 광전환성 표지
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 본원 단계 (a)(iii)에 기술된 광원으로 조사시, 제1 광전환성 표지의 방출 신호는, 예를 들어, 신호 상태에서 암 상태로 변화된다. 즉, 관찰된 방출 신호는 "켜짐"에서 "꺼짐"으로 전환될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 광전환성 표지는 임의로 제1 링커를 통해, 제1 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 제1 형광 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 제1 형광 모이어티의 파이-공액 시스템(pi-conjugation system)의 일부일 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 형광 모이어티는 적색광, 예를 들어, 약 600 ㎚ 내지 약 700 ㎚의 파장을 갖는 적색광을 방출하는 형광단을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 형광 모이어티는 실리콘 로다민 형광단을 포함한다. 일 구현예에서, 로다민 형광단은 구조:
Figure pct00003
를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 광변색성 모이어티는 스피로피라노 또는 스피로티오피라노 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함한다:
Figure pct00004
(I)
여기서, X는 O (산소) 또는 S (황)이고;
R1a 및 R2a 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H, C1-6 알킬, 및 -(CH2)n-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 각각 임의로 치환된 C6-10 아릴, 5 내지 10원 헤테로아릴, 3 내지 7원 카르보시클릴, 및 3 내지 7원 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
고리 A는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고, 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기(electron withdrawing group)로 치환되며; n은 1 내지 6의 정수이다.
일부 이러한 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사는 화학식 (I)에서 스피로 탄소*-X 결합의 절단을 일으키며, 제1 광변색성 모이어티를 제1 형광 모이어티의 방출을 억제할 수 있는 퀀쳐로 전환시키는 개환 반응을 일으킨다. 일부 예에서, 스피로 탄소*-X 결합의 절단은 가역적이다.
화학식 (I)의 제1 광변색성 모이어티의 일부 구현예에서, 5원 피롤리딘에 융합된 페닐 모이어티는 임의로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, X는 S이다. 일부 추가 구현예에서, R1a 및 R2a 각각은 C1-6 알킬이고, 예를 들어, R1a 및 R2a 각각은 메틸이다. 일부 구현예에서, 고리 A는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 전자 끄는 기의 비제한적인 예는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, 트리풀릴 (-S(O)2CF3), -OS(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 설포닐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 제1 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (Ia)의 구조를 포함한다:
Figure pct00005
(Ia).
일 구현예에서, 제1 광전환성 표지는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00006
, 여기서 L1은 제1 링커이다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 링커 L1은 아지도 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 제1 광전환성 표지는 제1 링커를 통해, 또는 제1 광변색성 모이어티 또는 제1 형광 모이어티에 부착된 다른 위치를 통해 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착된다.
대안적으로, 제1 광전환성 표지는 광변색성 모이어티 및 임의로 링커만을 포함할 수 있으며, 상기 광변색성 모이어티는 단계 (a)(iii)에서 기술된 광원으로 조사시 신호 상태에서 암 상태로 전환할 수 있는, 그 자체로 형광단으로서 작용할 수 있다.
제2 광전환성 표지
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 단계 (a)(iii)에 기술된 광원으로 조사시, 제2 광전환성 표지의 방출 신호는, 예를 들어, 비-방출 암 상태에서 신호 상태로 변화된다. 즉, 관찰된 방출 신호는 "꺼짐"에서 "켜짐"으로 전환될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 광전환성 표지는 임의로 제2 링커를 통해, 제2 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 제2 형광 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 제2 형광 모이어티의 파이-공액 시스템의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 형광 모이어티는 적색광, 예를 들어, 약 600 ㎚ 내지 약 700 ㎚의 파장을 갖는 적색광을 방출하는 형광단을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제2 형광 모이어티는 쿠마린 형광단을 포함한다. 일 구현예에서, 쿠마린 형광단은 구조:
Figure pct00007
를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 광변색성 모이어티는 옥사진 모이어티 또는 티아진 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 제2 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
Figure pct00008
(II)
여기서, Y는 O (산소) 또는 S (황)이고;
R1b 및 R2b 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
고리 B는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고; 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며; 여기서 *는 형광 모이어티에 대한 부착점을 나타낸다.
일부 이러한 구현예에서, 단계 (a)(iii)에서의 조사는 화학식 (II)에서 탄소*-Y 결합의 절단을 일으키며, 제2 형광 모이어티를 방출 상태로 활성화하는 개환 반응을 일으킨다. 일부 예에서, 탄소*-Y 결합의 절단은 가역적이다.
화학식 (II)의 제2 광변색성 모이어티의 일부 구현예에서, 5원 피롤리딘 모이어티에 융합된 페닐 모이어티는 임의로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, Y는 O이다. 일부 추가 구현예에서, R1b 및 R2b 각각은 C1-6 알킬이고, 예를 들어, R1b 및 R2b 각각은 메틸이다. 일부 구현예에서, 고리 B는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 다른 구현예에서, 고리 B는 6원 헤테로아릴, 예컨대 피리딜 또는 피리미딜로부터 선택될 수 있다. 전자 끄는 기의 비제한적인 예는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, 트리풀릴 (-S(O)2CF3), -OS(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 설포닐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 제2 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 포함한다:
Figure pct00009
(IIa).
일 구현예에서, 제2 광전환성 표지는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00010
, 여기서 L2는 제2 링커이다. 일부 이러한 구현예에서, 제2 링커 L2는 파이-공액 구조 (예를 들어, 하나 이상의 이중 결합)를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, L2는 쿠마린 및 제2 광변색성 모이어티를 연결하는 이중 결합이다. 일부 구현예에서, 제2 광전환성 표지는 제2 링커를 통해, 또는 구불구불한 선
Figure pct00011
으로 표시된 지점을 통해 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착된다.
대안적으로, 제2 광전환성 표지는 광변색성 모이어티 및 임의로 링커만을 포함할 수 있으며, 상기 광변색성 모이어티는 단계 (a)(iii)에서 기술된 광원으로 조사시 비-방출 암 상태에서 방출 상태로 전환할 수 있는, 그 자체로 형광단으로서 작용할 수 있다.
본 출원에서 사용될 수 있는 광전환성 표지 또는 광변색성 모이어티의 비제한적인 예는 또한 디아릴에텐 (예를 들어, 하기 예시된 비스티에닐에텐 유도체), 아진 (예를 들어, 하기 예시된 아조벤젠), 광변색성 퀴논 (예를 들어, 페녹시나프타센 퀴논), 스피로옥사진, 스피로티아진, 메소알데히드 1-알릴-1-페닐-2-페닐옥사존, 테트라클로로-1,2-케토나프탈레논, 티오인디고이드, 디니트로벤질피리딘, 및 크로멘 등을 포함한다.
Figure pct00012
본원에 기술된 방법의 임의의 구현예에서, 복수의 연장된 폴리뉴클레오타이드는 기판, 예를 들어, 플로우셀의 표면에 부착된다. 추가 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 플로우셀 표면상의 나노웰(nanowell)에 부착된다.
본원에 기술된 방법의 임의의 구현예에서, 제1 신호 수집 및 제2 신호 수집을 검출하는 것은 기판의 이미지를 획득하는 것을 포함한다.
추가의 예시적인 구현예가 하기에 기술된다.
일부 구현예에서, 핵산을 서열분석하는 방법은 3개의 상이한 뉴클레오타이드 유형의 직접 또는 간접 검출을 위한 하나의 형광 표지 및 형광 신호의 존재에 의해 검출되지 않지만 대신 형광 신호의 부족 또는 부재에 의해 검출되는 하나의 뉴클레오타이드 유형의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산을 서열분석하는 방법은 3개의 상이한 뉴클레오타이드 유형의 직접 또는 간접 검출을 위해 동일하거나 유사한 여기/방출 스펙트럼을 포함하는 2개 이상의 상이한 형광 표지 및 형광 신호의 존재에 의해 검출되지 않지만 대신 형광 신호의 부족 또는 부재에 의해 검출되는 하나의 뉴클레오타이드 유형의 사용을 포함한다. 동일하거나 유사한 여기 및 방출 스펙트럼은 레이저가 2개 이상의 상이한 형광 표지를 여기시키고, 광학 필터가 이의 방출된 형광 신호를 포착한 것이다. 핵산 샘플의 서열을 결정하기 위한 형광 검출은 시공간에서, 예를 들어 서열분석 반응 동안 다른 시간(즉, 효소적 절단, 환경적 pH의 변화, 추가 시약의 첨가와 같은 반응 조건의 변화 전과 후)에 수행되며, 형광 패턴, 예컨대 형광 전이 패턴, 핵산 표적의 서열을 결정하는 이의 누적 패턴을 제공한다. 이와 같이, 본원에 기술된 방법은 시간 및 비용 효율적이며, 관련 서열분석 장비의 단순화를 허용한다.
표적 핵산 서열을 결정하기 위해 시공간 형광 패턴 차이를 이용하는 예시적인 적용은 합성에 의한 서열분석(sequence by synthesis, SBS) 방법 및 기술이다. 이와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 구현예는 합성에 의한 서열분석 형광 적용분야에서 특정한 유용성을 밝혀낸다. 본원에 기술된 바와 같은 구현예는 혁신적인 형광 서열분석 방법의 예시이지만, 개시된 구현예는 샘플에서 하나 이상의 분석물 (즉, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 이의 단편)의 검출이 요구되는 다양한 다른 적용분야에 대한 유용성을 또한 밝혀낸다.
최소의 염료 세트를 사용하는 서열분석을 위한 개발 구현예에서, 실험은 단지 1개 또는 2개의 형광 모이어티를 사용하여 뉴클레오타이드 혼입들을 구별하기 위한 대안 전략을 밝혀내었다. 이러한 전략은 4개의 뉴클레오타이드 유형이 모두 서열분석 사이클에 동시에 존재하기 위해, 그리고 최소의 염료 및 광학 필터 세트의 사용을 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 3개 이하의 형광 표지는 1개 또는 2개의 여기 및 방출 필터를 사용하여, 반응 동안 존재하는 4개의 뉴클레오타이드 유형 모두의 혼입을 결정하는 데 이용된다. 바람직한 구현예에서, 2개 이하의 형광 표지 (또는 동일하거나 유사한 여기/방출 스펙트럼 중 2개 또는 3개)는 하나의 여기 범위의 광 및 하나의 검출 방출 필터를 사용하여, 반응 동안 존재하는 4개의 뉴클레오타이드 유형 모두의 혼입을 결정하는 데 이용된다.
일부 구현예에서, 최소의 염료 세트를 사용하는 서열분석은 기판, 예컨대 유리, 플라스틱, 반도체 칩 또는 복합체 파생 기판에서 수행된다. 일부 구현예에서, 하나의 핵산 종은 예를 들어 단일 표적 서열분석을 위해 기판 상에 제공된다. 다른 구현예에서, 서열분석은 또한 다중 형식일 수 있으며, 여기서 다수의 핵산 표적은 예를 들어 플로우 셀 또는 어레이 유형의 형식에서 동시에 검출되고 서열분석된다. 본원에 기술된 구현예는 병렬 서열분석 또는 대량 병렬 서열분석을 실행할 때 특히 유리하다. 형광 병렬 서열분석을 실행하는 플랫폼은, 이에 제한되지는 않으나, Illumina, Inc. (예를 들어, HiSeq, Genome Analyzer, MiSeq, iSeq, iScan 플랫폼), Life Technologies (예를 들어, SOLiD), Helicos Biosciences (예를 들어, Heliscope), 454/Roche Life Sciences (Branford, Conn.) 및 Pacific Biosciences (예를 들어, SMART)에서 제공하는 것을 포함한다. 다수의 핵산 종을 수용할 수 있는 플로우셀, 칩, 및 기타 유형의 표면은 병렬 서열분석에 사용되는 기판의 예시이다. 다수의 핵산 종이 병렬로 서열분석되는 다중 형식에서, (예를 들어, 에멀젼 PCR (emPCR) 또는 브릿지 증폭을 통해) 클론에 의하여 증폭된(clonally amplified) 표적 서열은 일반적으로 기판 상에 공유결합으로 고정된다. 예를 들어, 에멀젼 PCR을 실행할 때 관심 표적은 비드 상에 고정되는 반면, 클론에 의하여 증폭된 표적은 플로우셀의 채널이나 어레이 또는 칩의 특정 위치에 고정된다.
본원에 기술된 바와 같은 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 플로우셀은 여러 방식으로 서열분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 샘플, 예컨대 DNA 라이브러리는 하나 이상의 에칭된 플로우 채널을 포함하는 플로우셀 또는 유체 장치(fluidic device)에 적용될 수 있으며, 상기 플로우셀은 이의 표면에 공유결합으로 부착된 프로브 분자 집단을 추가로 포함할 수 있다. 플로우셀 채널에 부착된 프로브는 채널에서 주소 지정이 가능한 다른 위치에 유리하게 위치하며, DNA 라이브러리 분자는 상보적인 서열이 결합할 수 있는 플로우셀 채널에 추가될 수 있다 (본원에 기술된 바와 같이, 제WO2012/096703호에 추가로 기재된 바와 같이, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 본 출원에서 사용하는 플로우셀의 또 다른 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함된 미국특허번호 제8,906,320호 및 제9,990,381호에 기술된 바와 같이 CMOS 플로우셀을 포함한다. 브릿지 증폭은 본원에 기술된 바와 같이 합성에 의한 서열분석 방법 및 조성물에 따라 본원에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 서열분석을 위한 플로우셀을 생성하고 이용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 본원에 제공되는 참고문헌 및 이들 모두는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본원에 기술된 바와 같은 방법 및 조성물은 플로우셀 직접 서열분석 방법의 임의의 특정 제조 또는 방법에 제한되지 않는 것으로 고려된다.
본원에 기술된 방법 및 조성물을 이용하는 서열분석은 또한 미세적정 플레이트(microtiter plate), 예를 들어 고밀도 반응 플레이트 또는 슬라이드에서 수행될 수 있다 (Margulies 등, 2005, Nature 437 (7057): 376-380, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, 게놈 표적은 emPCR 기술에 의해 제조될 수 있다. 반응 플레이트 또는 슬라이드는 반응으로부터, 예를 들어 형광 또는 발광 반응으로부터 생성된 광을 포착하고 기록할 수 있는 광섬유 재료로 제작될 수 있다. 코어 재료를 에칭하여 적어도 하나의 emPCR 반응 비드를 고정할 수 있는 별개의 반응 웰을 제공할 수 있다. 이러한 슬라이드/플레이트는 160만개 이상의 웰을 포함할 수 있다. 제작된 슬라이드/플레이트는 표적 서열분석 반응 emPCR 비드와 함께 로딩(loading)되고, 서열분석 시약이 제공되며 서열분석을 하는 장비에 장착될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 조성물 및 방법을 이용하여 표적을 서열분석하기 위한 어레이된 기판의 예는 Complete Genomics (Mountain View, Calif.)에 의해 수행된 바와 같이 칩 또는 슬라이드 상에 DNA 나노볼을 포함하는 패턴화된 기판을 실행할 때 제공된다. Drmanac 등, 2010, Science 327(5961): 78-81에 기술된 바와 같이, 실리콘 웨이퍼는 이산화규소 및 티타늄으로 층을 이룬 뒤에 포토리소그래피 및 건식 에칭 기술을 사용하여 패턴화될 수 있다. 웨이퍼는 HMDS로 처리되고 포토레지스트 층으로 코팅되어 실란화(silanization) 및 서열분석을 위한 DNA 나노볼의 후속 공유 부착을 위한 별개의 영역을 정의할 수 있다. 숙련된 기술자는 서열분석 방법에 사용하기 위해 핵산의 고정화를 위한 별개의 위치를 갖는 슬라이드/칩을 제작하는 많은 방법이 존재하며, 본 방법이 서열분석을 위해 기판을 제조하는 방법에 의해 제한되지 않음을 인식할 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 구현예를 제한하려는 것이 아니라 예시의 목적상, 일반적인 전략 서열분석 사이클이 일련의 단계로 기술될 수 있다. 하기 예는 SBS(sequence by synthesis) 서열분석 반응을 기반으로 하나, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 임의의 특정한 서열분석 반응 방법에 제한되지 않는다.
서열분석 반응을 위해 설계된 4개의 뉴클레오타이드 유형 A, C, T 및 G, 일반적으로 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 4개 유형 중 3개 유형이 형광 표지되어 있는 가역적으로 차단된 (reversibly blocked, rb) 뉴클레오타이드 (예를 들어, rbA, rbT, rbC, rbG)는 다른 반응 성분과 함께, 관심있는 주형 서열이 위치하고 서열분석 반응이 일어나는 위치 (예를 들어, 플로우셀, 칩, 슬라이드 등)에 동시에 추가된다. 표적 서열을 기반으로 성장하는 서열 핵산 사슬에 뉴클레오타이드를 혼입한 후에, 반응은 광에 노출되고 형광이 관찰되며 기록된다; 이는 제1 이미징 이벤트 및 제1 형광 검출 패턴을 구성한다. 제1 이미징 이벤트 후에, 샘플은 광원으로 조사되어 제1 및 제2 형광 표지의 방출 신호에서 확인가능하고 측정가능한 변화를 일으킨다. 반응 위치가 다시 한번 조명되며 형광의 임의의 변화가 포착되고 기록된다; 이는 제2 이미징 이벤트 (즉, 제2 형광 검출 패턴)를 구성한다. 혼입된 뉴클레오타이드에 존재하는 차단제(blocker)를 제거하고, 다음 서열분석 사이클을 위한 준비로 제2 이미징 이벤트 후에 존재하는 다른 시약과 함께 세척한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 제1 이미징 이벤트에서 제2 이미징 이벤트로부터 확인가능하고 측정가능한 형광의 변화를 직접적으로 또는 간접적으로 일으킬 수 있는 임의의 화학 시약의 사용을 포함하지 않는다. 두 이미징 이벤트로부터의 형광 패턴은 비교되며, 뉴클레오타이드 혼입 및 따라서 특정한 사이클에 대한 표적 핵산의 서열이 결정된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"의 사용은 제한되지 않는다. 용어 "갖는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "갖다", "가지다", 및 "가진"의 사용은 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 전환 문구이든 또는 청구 범위의 본문이든 간에, 용어 "~를(들을) 포함한다" 및 "포함하는"은 개방된 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"이라는 문구와 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정의 맥락에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계를 포함하지만, 추가 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물, 또는 장치의 맥락에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물, 또는 장치가 적어도 언급된 특징 또는 성분을 포함하지만, 추가 특징 또는 성분도 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 일반적인 유기적 약어는 하기와 같이 정의된다.
℃ 섭씨 온도
dATP 데옥시아데노신 삼인산
dCTP 데옥시시티딘 삼인산
dGTP 데옥시구아노신 삼인산
dTTP 데옥시티미딘 삼인산
ddNTP 디데옥시뉴클레오타이드 삼인산
ffN 완전 기능화된 뉴클레오타이드
LED 발광 다이오드
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "어레이"는 상이한 프로브 분자가 상대적인 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 기판에 부착된 상이한 프로브 분자의 집단을 의미한다. 어레이는 기판 상의 주소 지정이 가능한 다른 위치에 각각 위치한 상이한 프로브 분자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이는 상이한 프로브 분자를 각각 보유하는 별개의 기판을 포함할 수 있으며, 상기 상이한 프로브 분자는 기질이 부착된 표면 상의 기판의 위치에 따라 또는 액체 내 기판의 위치에 따라 확인될 수 있다. 별개의 기판이 표면 상에 위치된 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어, 미국특허번호 제6,355,431 B1호, 제US 2002/0102578호 및 PCT 공개번호 제WO 00/63437호에 기술된 바와 같이, 웰 내 비드를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 미세유체 장치, 예컨대 FACS(fluorescent activated cell sorter)를 사용하여, 액체 어레이 내 비드를 구별하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 형식은, 예를 들어, 미국특허번호 제6,524,793호에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 어레이의 추가 예는, 제한 없이, 미국특허번호 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 제WO 93/17126호; 제WO 95/11995호; 제WO 95/35505호; 제EP 742 287호; 및 제EP 799 897호에 기술된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공유결합으로 부착된" 또는 "공유결합으로 결합된"이란 원자들 간의 전자 쌍의 공유를 특징으로 하는 화학적 결합의 형성을 의미한다. 예를 들어, 공유결합으로 부착된 중합체 코팅은, 기타 수단, 예를 들어, 접착 또는 정전기 상호작용을 통해 표면에 부착하는 것과 비교하여, 기판의 기능화된 표면과 화학적 결합을 형성하는 중합체 코팅을 의미한다. 표면에 공유결합으로 부착된 중합체가 공유 부착에 더하여 수단을 통해 결합될 수도 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 "R"기(들)은 표시된 원자에 부착될 수 있는 치환기를 나타낸다. R기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 2개의 "R"기가 "이들이 부착된 원자와 함께" 고리 또는 고리 시스템을 형성하는 것으로 기술되면, 이는 원자의 집합 단위, 개재 결합 및 2개의 R기가 언급된 고리임을 의미한다. 예를 들어, 하기 하부구조가 존재하고:
Figure pct00013
R1 및 R2가 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로 정의되거나, R1 및 R2가 이들이 부착된 원자와 함께 아릴 또는 카르보시클릴을 형성하는 경우, 이는 R1 및 R2가 수소 또는 알킬로부터 선택될 수 있거나, 대안적으로, 하부구조가 하기 구조를 갖는 것을 의미한다:
Figure pct00014
여기서 A는 표시된 이중 결합을 포함하는 아릴 고리 또는 카르보시클릴이다.
특정 라디칼 명명 규칙은 상황에 따라 모노-라디칼 또는 디-라디칼을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환기가 분자의 나머지에 대한 2개의 부착점을 필요로 하는 경우, 치환기는 디-라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 부착점을 필요로 하는 알킬로서 확인된 치환기는 디-라디칼, 예컨대 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등을 포함한다. 다른 라디칼 명명 규칙은 라디칼이 디-라디칼, 예컨대 "알킬렌" 또는 "알케닐렌" 임을 분명히 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 원소 주기율표의 7열의 방사-안정성 원자 중 임의의 하나, 예를 들어, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미하며, 불소 및 염소가 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된 (즉, 이중 또는 삼중 결합을 포함하지 않는) 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(본원에 언급될 때마다, 수치 범위, 예컨대 "1 내지 20"은 주어진 범위 내의 각 정수를 의미한다; 예를 들어, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 최대 20개의 탄소 원자로 구성될 수 있음을 의미하지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 발생을 포함한다). 알킬기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알킬일 수 있다. 알킬기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 알킬기는 "C1-4 알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬"은 알킬 사슬에 1 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 2차-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "알콕시"는 R이 상기 정의된 바와 같은 알킬인 화학식 -OR을 의미하고, 예컨대, "C1-9 알콕시"이며, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(이소프로폭시), n-부톡시, 이소-부톡시, 2차-부톡시, 및 3차-부톡시 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 알케닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알케닐"의 발생을 포함한다. 알케닐기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알케닐일 수 있다. 알케닐기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 알케닐기는 "C2-6 알케닐" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6 알케닐"은 알케닐 사슬에 2 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내고, 즉, 알케닐 사슬은 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-디에닐, 부타-1,2,-디에닐, 및 부타-1,2-디엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐기는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 및 헥세닐 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 알키닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알키닐"의 발생을 포함한다. 알키닐기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알키닐일 수 있다. 알키닐기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐일 수 있다. 알키닐기는 "C2-6 알키닐" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6 알키닐"은 알키닐 사슬에 2 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내고, 즉, 알키닐 사슬은 에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일, 및 2-부티닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알키닐기는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 및 헥시닐 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "아릴"은 고리 백본 내에 탄소만을 포함하는 방향족 고리 또는 고리 시스템 (즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 의미한다. 아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 아릴기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "아릴"의 발생을 포함한다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴기는 "C6-10 아릴", "C6 또는 C10 아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"아르알킬" 또는 "아릴알킬"은 치환기로서, 알킬렌기를 통해 연결된 아릴기이며, 예컨대, 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 나프틸알킬을 포함하나 이에 제한되지 않는 "C7-14 아르알킬" 등이다. 일부 경우에, 알킬렌기는 저급 알킬렌기 (즉, C1-6 알킬렌기)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하나 이에 제한되지 않는 탄소 이외의 원소를 고리 백본에 포함하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 의미한다. 헤테로아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴기는 5 내지 18개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는, 고리 백본을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 발생을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴기는 5 내지 10개의 고리 구성원 또는 5 내지 7개의 고리 구성원을 갖는다. 헤테로아릴기는 "5-7원 헤테로아릴", "5-10원 헤테로아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예는 푸릴, 티에닐, 프탈라지닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 및 벤조티에닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은 치환기로서, 알킬렌기를 통해 연결된 헤테로아릴기이다. 예는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 이속사졸릴알킬, 및 이미다졸릴알킬을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 알킬렌기는 저급 알킬렌기 (즉, C1-6 알킬렌기)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "카르보시클릴"은 고리 시스템 백본 내에 탄소 원자만을 포함하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카르보시클릴이 고리시스템인 경우, 2개 이상의 고리는 융합, 가교 또는 스피로-연결 방식으로 함께 결합될 수 있다. 카르보시클릴은 고리 시스템의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아닌 경우 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카르보시클릴은 시클로알킬, 시클로알케닐, 및 시클로알키닐을 포함한다. 카르보시클릴기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "카르보시클릴"의 발생을 포함한다. 카르보시클릴기는 또한 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 카르보시클릴일 수 있다. 카르보시클릴기는 또한 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 카르보시클릴일 수 있다. 카르보시클릴기는 "C3-6 카르보시클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 카르보시클릴 고리의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 2,3-디하이드로-인덴, 비사이클[2.2.2]옥타닐, 아다만틸, 및 스피로[4.4]노나닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "시클로알킬"은 완전히 포화된 카르보시클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 및 시클로헥실을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤테로시클릴"은 고리 백본에 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 비방향족 환형 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로시클릴은 융합, 가교, 또는 스피로-연결 방식으로 함께 결합될 수 있다. 헤테로시클릴은 고리 시스템의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아닌 경우 임의의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로원자(들)은 고리 시스템에서 비방향족 또는 방향족 고리에 존재할 수 있다. 헤테로시클릴기는 3 내지 20개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 백본을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로시클릴"의 발생을 포함한다. 헤테로시클릴기는 또한 3 내지 10개의 고리 구성원을 갖는 중간 크기 헤테로시클릴일 수 있다. 헤테로시클릴기는 또한 3 내지 6개의 고리 구성원을 갖는 헤테로시클릴일 수 있다. 헤테로시클릴기는 "3-6원 헤테로시클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 바람직한 6원 모노사이클릭 헤테로시클릴에서, 헤테로원자(들)은 O, N 또는 S 중 하나 내지 최대 3개로부터 선택되고, 바람직한 5원 모노사이클릭 헤테로시클릴에서, 헤테로원자(들)은 O, N 또는 S로부터 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로시클릴 고리의 예는 아제피닐, 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 디옥솔라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 옥시라닐, 옥세파닐, 티에파닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 디옥소피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피롤리디오닐, 4-피페리도닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 1,3-디옥시닐, 1,3-디옥사닐, 1,4-디옥시닐, 1,4-디옥사닐, 1,3-옥사티아닐, 1,4-옥사티이닐, 1,4-옥사티아닐, 2H-1,2-옥사지닐, 트리옥사닐, 헥사하이드로-1,3,5-트리아지닐, 1,3-디옥솔릴, 1,3-디옥솔라닐, 1,3-디티올릴, 1,3-디티올라닐, 이속사졸리닐, 이속사졸리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸리디노닐, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 1,3-옥사티올라닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로-1,4-티아지닐, 티아모르폴리닐, 디하이드로벤조푸라닐, 벤즈이미다졸리디닐, 및 테트라하이드로퀴놀린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"O-카르복시" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-OC(=O)R" 기를 의미한다.
"C-카르복시" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 "-C(=O)OR" 기를 의미한다. 비제한적인 예는 카르복실(즉, -C(=O)OH)을 포함한다.
"설포닐" 기는 본원에 정의된 바와 같이, R이 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-SO2R" 기를 의미한다.
"S-설폰아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-SO2NRARB" 기를 의미한다.
"N-설폰아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-N(RA)SO2RB" 기를 의미한다.
"C-아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-C(=O)NRARB" 기를 의미한다.
"N-아미도" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-N(RA)C(=O)RB" 기를 의미한다.
"아미노" 기는 본원에 정의된 바와 같이, RA 및 RB가 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 3-10원 헤테로시클릴로부터 선택되는 "-NRARB" 기를 의미한다. 비제한적인 예는 유리 아미노 (즉, -NH2)를 포함한다.
"아미노알킬" 기는 알킬렌기를 통해 연결된 아미노기를 의미한다.
"알콕시알킬" 기는 알킬렌기를 통해 연결된 알콕시기를 의미하고, 예컨대, "C2-8 알콕시알킬" 등이다.
본원에 사용된 바와 같이, 치환된 기는 하나 이상의 수소 원자가 다른 원자 또는 기로 교환된 비치환된 부모 기(parent group)로부터 유래된다. 달리 명시되지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주되는 경우, 상기 기는 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카르보시클릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), C3-C7-카르보시클릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3-10원 헤테로시클릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3-10원 헤테로시클릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5-10원 헤테로아릴 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5-10원 헤테로아릴(C1-C6)알킬 (할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 할로, -CN, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬 (즉, 에테르), 아릴옥시, 설프하이드릴(메르캅토), 할로(C1-C6)알킬 (예를 들어, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시 (예를 들어, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 니트로, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카르복시, O-카르복시, 아실, 시아나토, 이소시아나토, 티오시아나토, 이소티오시아나토, 설포닐, -SO3H, -OSO2C1-4알킬, 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 의미한다. 기가 "임의로 치환된"으로 기술되는 경우, 그 기는 상기 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아지도"는 -N3 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 인산기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 유닛이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기가 없는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 사이토신 (C), 티민 (T) 및 유라실 (U), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드와 구조적으로 유사하지만, 인산 모이어티가 없다. 뉴클레오사이드 유사체의 예는 표지가 염기에 연결되고 당 분자에 부착된 인산기가 없는 것일 것이다. 용어 "뉴클레오사이드"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그 통상의 의미로 본원에서 사용된다. 예는 리보스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오사이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 변형된 5탄당 모이어티는 산소 원자가 탄소로 교체되고/되거나 탄소가 황 또는 산소 원자로 교체된 5탄단 모이어티이다. "뉴클레오사이드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다. 추가적으로, 뉴클레오사이드는 더 큰 DNA 및/또는 RNA 중합체 및 올리고머 내로 혼입될 수 있다.
용어 "퓨린 염기"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 통상의 의미로 본원에 사용되며, 그의 호변이성질체(tautomer)를 포함한다. 유사하게, 용어 "피리미딘 염기"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 통상의 의미로 본원에 사용되며, 그의 호변이성질체를 포함한다. 임의로 치환된 퓨린염기의 비제한적인 예는 퓨린, 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 알로잔틴, 7-알킬구아닌 (예를 들어, 7-메틸구아닌), 테오브로민, 카페인, 요산 및 아이소구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기의 예는 사이토신, 티민, 유라실, 5,6-다이하이드로유라실 및 5-알킬사이토신 (예를 들어, 5-메틸사이토신)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "유도체" 또는 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유도체를 의미한다. 이러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어, Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman 등, Chemical Reviews 90:543-584, 1990에서 논의된다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포르포라닐리데이트 및 포스포아미데이트 결합을 포함하는, 변형된 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "유도체", "유사체" 및 "변형된"은, 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 본원에 정의된 용어 "뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오사이드"가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인산(phosphate)"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 통상의 의미로 본원에 사용되며, 그의 양성자화된 형태(예를 들어,
Figure pct00015
및
Figure pct00016
)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일인산", "이인산" 및 "삼인산"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 통상의 의미로 본원에 사용되며, 양성자화된 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보호기" 및 "보호기들"은 분자 내에 존재하는 기들이 원치 않는 화학 반응을 겪는 것을 방지하기 위하여 분자에 첨가되는 임의의 원자 또는 원자들의 그룹을 의미한다. 때때로, "보호기" 및 "차단기"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 접두사 "광"(photo) 또는 "광-"은 광 또는 전자기 방사선에 관련된 것을 의미한다. 이 용어는, 이에 제한되지는 않으나, 스펙트럼의 방사선, 마이크로파, 적외선, 가시광, 자외선, X-선 또는 감마선 부분으로서 통상 공지된 범위의 하나 이상을 포함하는 전자기 스펙트럼의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이 스펙트럼의 일부는 표면의 금속 영역, 예컨대 본원에 제시된 금속에 의해 차단되는 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 스펙트럼의 일부는 표면의 틈 영역(interstitial region), 예컨대 본원에 제시된 유리, 플라스틱, 실리카 또는 기타 물질로 이루어진 영역을 통과하는 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 금속을 통과할 수 있는 방사선이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 제시된 유리, 플라스틱, 실리카 또는 기타 물질에 의해 차폐된 방사선이 사용될 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드
본 개시 내용의 측면에 따르면, 혼입을 위해 기술된 뉴클레오타이드는 검출가능한 표지를 포함하고, 이러한 뉴클레오타이드는 표지된 뉴클레오타이드로 불린다. 표지 (예를 들어, 형광 염료)는 소수성 인력, 이온성 인력, 및 공유 부착을 포함한 다양한 수단에 의해 선택적 링커를 통해 접합될 수 있다. 일부 측면에서, 염료는 공유 부착에 의해 기판에 접합된다. 보다 구체적으로, 공유 부착은 링커기(linker group)에 의해 이루어진다. 일부 경우에, 이러한 표지된 뉴클레오타이드는 "변형된 뉴클레오타이드"로도 지칭된다. 일부 구현예에서, 염료는 절단성 링커를 통해 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착된다. 일부 이러한 구현예에서, 절단성 링커는 아지도 모이어티, 아지도메틸 모이어티, 디설파이드 모이어티, -(CH2CH2O)-, 또는 본원에 기술된 임의의 다른 공유 링커를 포함하는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드는, 예컨대, 비제한적인 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고체상 증폭, 폴리뉴클레오타이드 서열분석 (예를 들어, 고체상 서열분석), 닉(nick) 번역 반응 등에서 효소적 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오타이드를 표지하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 염료는 뉴클레오타이드 염기를 통해 올리고뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 표지를 가질 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 뉴클레오타이드에 대한 언급은 또한 뉴클레오사이드에도 적용할 수 있도록 의도된다. 본 출원은 또한 DNA를 참조하여 더 기술될 것이지만, 그 설명은, 달리 명시되지 않는 한, RNA, PNA, 및 기타 핵산에도 적용할 수 있다.
본 개시의 일부 구현예는 광전환성 표지를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체에 관한 것으로, 광전환성 표지는 임의로 링커를 통해 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 형광 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 광전환성 표지는 절단성 링커를 통해 핵염기(nucleobase)에 부착된다. 일부 추가 구현예에서, 광전환성 표지는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는 광전환성 표지로 표지된다. 광원으로 조사시, 광전환성 표지의 방출 신호는 예를 들어, 신호 상태에서 암 상태로 변화된다. 즉, 관찰된 방출 신호는 "켜짐"에서 "꺼짐"으로 전환될 수 있다. 대안적으로, 광전환성 표지는 비-방출 암 상태에서 신호 상태로 변화될 수 있다. 즉, 관찰된 방출 신호는 "꺼짐"에서 "켜짐"으로 전환될 수 있다.
일부 구현예에서, 광전환성 표지는 임의로 링커를 통해, 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 형광 모이어티를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 형광 모이어티는 적색광, 예를 들어, 약 600 ㎚ 내지 약 700 ㎚의 파장을 갖는 적색광을 방출하는 형광단을 포함한다.
일부 구현예에서, 광전환성 표지의 형광 모이어티는 실리콘 로다민 형광단을 포함한다. 일 구현예에서, 로다민 형광단은 구조:
Figure pct00017
를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 광전환성 표지의 광변색성 모이어티는 스피로피라노 또는 스피로티오피라노 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함한다:
Figure pct00018
(I)
여기서, X, R1a, R2a, R3, R4, 및 고리 A의 정의는 본원에 기술되어 있으며, 별표 *로 표지된 탄소는 적절한 광원으로 조사시 화학적 변형을 겪게 될 스피로 탄소이다.
화학식 (I)의 광변색성 모이어티의 일부 구현예에서, 5원 피롤리딘에 융합된 페닐 모이어티는 임의로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, X는 S이다. 일부 추가 구현예에서, R1a 및 R2a 각각은 C1-6 알킬이고, 예를 들어, R1a 및 R2a 각각은 메틸이다. 일부 구현예에서, 고리 A는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 전자 끄는 기의 비제한적인 예는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, 트리풀릴 (-S(O)2CF3), -OS(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 설포닐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 광변색성 모이어티는 화학식 (Ia)의 구조:
Figure pct00019
(Ia)를 포함한다. 일 구현예에서, 광전환성 표지는 구조:
Figure pct00020
를 포함하며, 여기서 L1은 제1 링커이다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 링커 L1은 아지도 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 제1 광전환성 표지는 제1 링커를 통해, 또는 제1 광변색성 모이어티 또는 제1 형광 모이어티에 부착된 다른 위치를 통해 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착된다.
일부 다른 구현예에서, 광전환성의 형광 모이어티는 쿠마린 형광단을 포함한다. 일 구현예에서, 쿠마린 형광단은 구조:
Figure pct00021
를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 광전환성 표지의 광변색성 모이어티는 옥사진 또는 티아진 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
Figure pct00022
(II)
여기서, Y, R1b, R2b, 및 고리 B의 정의는 본원에 기술되어 있으며, 별표 *로 표지된 탄소는 직접적으로 또는 제2 링커를 통한, 형광 모이어티에 대한 부착점을 나타낸다. 화학식 (II)의 탄소*-Y 결합은 적절한 광원을 조사시 화학적 변형을 겪게 될 것이다.
화학식 (II)의 광변색성 모이어티의 일부 구현예에서, 5원 피롤리딘 모이어티에 융합된 페닐 모이어티는 임의로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, Y는 O이다. 일부 추가 구현예에서, R1b 및 R2b 각각은 C1-6 알킬이고, 예를 들어, R1b 및 R2b 각각은 메틸이다. 일부 구현예에서, 고리 B는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 다른 구현예에서, 고리 B는 6원 헤테로아릴, 예컨대 피리딜 또는 피리미딜로부터 선택될 수 있다. 전자 끄는 기의 비제한적인 예는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, 트리풀릴 (-S(O)2CF3), -OS(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 설포닐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 광변색성 모이어티는 화학식 (IIa)의 구조:
Figure pct00023
(IIa)를 포함한다. 일 구현예에서, 광전환성 표지는 구조:
Figure pct00024
를 포함하며, 여기서 L2는 제2 링커이다. 일부 이러한 구현예에서, 제2 링커 L2는 파이-공액 구조 (예를 들어, 하나 이상의 이중 결합)를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, L2는 쿠마린 및 광변색성 모이어티를 연결하는 이중 결합이다. 일부 구현예에서, 광전환성 표지는 제2 링커 L2를 통해, 또는 구불구불한 선
Figure pct00025
으로 표시된 지점을 통해 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착된다.
대안적으로, 광전환성 표지는 광변색성 모이어티 및 임의로 링커만을 포함할 수 있으며, 상기 광변색성 모이어티는 적절한 광원으로 조사시 비-방출 암 상태에서 방출 상태, 또는 방출 상태에서 암 상태로 전환할 수 있는, 그 자체로 형광단으로서 작용할 수 있다.
본 개시의 일부 추가 구현예는 본원에 기술된 뉴클레오타이드 접합체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
링커
본원에 기술된 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 분자의 퓨린 또는 피리미딘 염기는 전술한 바와 같이 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 사용된 링커는 절단성이다. 절단성 링커의 사용은, 이후에 혼입된 임의의 표지된 뉴클레오타이드와의 임의의 간섭 신호를 피하면서, 필요한 경우, 검출 후 표지가 제거될 수 있도록 한다.
일부 다른 구현예에서, 사용된 링커는 비-절단성이다. 본원에 기술된, 표지된 뉴클레오타이드가 혼입된 각 경우에서, 이후에 뉴클레오타이드를 혼입할 필요가 없으므로, 따라서 표지가 뉴클레오타이드로부터 제거될 필요가 없다.
절단성 링커는 당업계에 공지되어 있고, 통상적인 화학은 뉴클레오타이드 염기 및 표지에 링커를 부착시키기 위하여 적용될 수 있다. 링커는 산, 염기, 친핵체, 친전자체, 라디칼, 금속, 환원제 또는 산화제, 광, 온도, 효소 등에 대한 노출을 포함하는, 임의의 적합한 방법에 의해 절단될 수 있다. 본원에서 논의된 링커는 또한 3'-O-차단기 결합을 절단하는데 사용되는 동일한 촉매로 절단될 수 있다. 적합한 링커는, Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons에 개시된 바와 같이, 표준 화학 보호기로부터 채택될 수 있다. 고상 합성에 사용되는 더 적합한 절단성 링커는 Guillier 등 (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000)에 개시되어 있다.
검출가능한 표지가 염기에 부착된 경우, 링커는 왓슨-크릭 염기짝짓기(base-pairing)가 여전히 수행될 수 있다는 가정하에 뉴클레오타이드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 퓨린 염기의 맥락에서, 링커가 퓨린 또는 바람직한 데아자퓨린 유사체의 7-위치를 통해서, 8-변형된 퓨린을 통해서, N-6 변형된 아데노신 또는 N-2 변형된 구아닌을 통해서 부착되는 것이 바람직하다. 피리미딘 경우, 사이토신, 티미딘 또는 유라실 상의 5-위치 및 사이토신 상의 N-4 위치를 통한 부착이 바람직하다.
일부 구현예에서, 링커는 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 링커의 길이는 중요하지 않지만, 단, 표지는 뉴클레오타이드와 효소, 예를 들어 폴리머라아제 간의 임의의 상호작용을 간섭하지 않도록 뉴클레오타이드로부터 충분한 거리를 유지해야 한다.
일부 구현예에서, 링커는 3'-OH 보호기로서 유사한 작용기로 구성될 수 있다. 이는 표지 및 보호기 둘 다를 제거하는데 단 한번의 처리만 요구될 시, 탈보호 및 탈보호 공정을 더 효율적으로 만들 것이다.
용어 "절단성 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 필요가 있다는 것을 의미하는 것은 아니다. 절단 부위는 링커 상의 한 위치에 위치할 수 있는데, 이는 링커의 일부가 절단 후 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 채로 남아있도록 한다. 절단성 링커는 비제한적 예로서 친전자적 절단성 링커, 친핵적 절단성 링커, 광절단성 링커, 환원 조건(예를 들어, 링커를 포함하는 디설파이드 또는 아자이드), 산화 조건 하의 절단성, 세이프티-캐치(safety-catch) 링커의 사용을 통한 절단성 및 제거 메커니즘에 의한 절단성일 수 있다. 기질 모이어티에 염료 화합물을 부착시키기 위한 절단성 링커의 사용은, 하류 단계에서 임의의 간섭 신호를 피하면서, 필요한 경우, 검출 후 표지가 제거될 수 있도록 한다.
유용한 링커기는 PCT 공개번호 제WO2004/018493호 (본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있으며, 이의 예에는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성된 수용성 포스핀 또는 수용성 전이 금속 촉매, 예를 들어, Pd(II) 착물 및 THP를 사용하여 절단될 수 있는 링커가 포함된다. 수용액에서 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 착물을 형성한다. 이러한 절단성 링커는 표지, 예컨대 본원에 제시된 염료에 뉴클레오타이드의 염기를 연결하는데 사용될 수 있다.
특정 링커는 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들과 같은 PCT 공개번호 제WO2004/018493호(본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함한다:
Figure pct00026
Figure pct00027
(여기서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 C1-10 치환 또는 비치환된 알킬기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되며, T는 수소, 또는 C1-C10 치환 또는 비치환된 알킬기이고, *는 모이어티가 뉴클레오타이드의 나머지 부분과 연결된 곳을 나타냄). 일부 측면에서, 링커는 뉴클레오타이드의 염기를 표지, 예컨대 본원에 기술된 염료 화합물과 연결한다.
링커의 추가적 예는 미국공개번호 제2016/0040225호 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure pct00028
Figure pct00029
(여기서, *는 모이어티가 뉴클레오타이드의 나머지 부분과 연결된 곳을 나타냄). 본원에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드와 표지 간의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 형광 염료 (형광단) 및 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서기를 도입함에 의해 변경될 수 있으며, 이에 따라, 당업계에 공지된 다른 결합을 통해 구아닌 염기에 부착된 동일한 형광단에 비해 형광 강도를 증가시킨다. 예시적인 링커 및 그 특성은 PCT 공개번호 제WO2007020457호 (본원에 참조로 포함됨)에 제시된다. 링커의 설계, 그리고 특히 이들의 증가된 길이는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA에 혼입될 때 구아노신 뉴클레오타이드의 구아닌 염기에 부착된 형광단의 밝기를 향상시킬 수 있다. 따라서, 염료가 구아닌-함유 뉴클레오타이드에 부착된 형광 염료 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 분석 방법에 사용하는 경우, 제WO 2007/020457호에 기술된 바와 같이, 링커가 화학식 -((CH2)2O)n-의 스페이서기를 포함하는 것이 유리하며, 여기서 n은 2에서 50 사이의 정수이다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 또는 핵염기 상의 부위에 표지될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 질소성 염기, 당, 및 하나 이상의 인산기로 구성된다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서 데옥시리보스, 즉, 리보스 상에 존재하는 하이드록시기가 없는 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)이고, 피리미딘은 사이토신 (C) 및 티민 (T)이거나, RNA와 관련하여, 유라실 (U)이다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오사이드의 인산 에스테르이며, 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록시기에서 에스테르화가 발생한다. 뉴클레오타이드는 일반적으로 일, 이- 또는 삼인산이다.
염기는 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘으로 지칭되지만, 당업자는 왓슨-크릭 염기짝짓기를 수행하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 능력을 변경시키지 않는 유도체 및 유사체가 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모 화합물과 동일하거나 매우 유사하지만, 유도체 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드가 다른 분자에 연결되도록 허용하는 화학적 또는 물리적 변형, 예컨대 상이한 또는 추가적인 측기를 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 구현예에서, 유도체는 왓슨-크릭 짝짓기를 수행할 수 있어야 한다. "유도체" 및 "유사체"는 또한 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유도체를 포함한다. 이러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어, Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman 등, Chemical Reviews 90:543-584, 1990에서 논의된다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포르포라닐리데이트, 포스포아미데이트 결합 등을 포함하는 변형된 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다.
염료는 예를 들어, 링커를 통해 뉴클레오타이드 염기의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 왓슨-크릭 염기짝짓기는 생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 전술한 바와 같이, 링커기는 염료를 뉴클레오타이드에 공유결합으로 부착하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서 표지된 뉴클레오타이드는 효소적으로 혼입될 수 있고 효소적으로 연장될 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오타이드의 전반적인 결합 및 인식을 현저하게 방해하지 않도록 뉴클레오타이드를 화합물에 연결하기에 충분한 길이일 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어, 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오타이드 염기가 일정 거리를 가지게 한다.
본원에 기술된 염료로 표지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00030
여기서, 염료는 염료 화합물이고; B는 핵염기, 예컨대 유라실, 티민, 사이토신, 아데닌, 구아닌 등이며; L은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있는 임의의 링커기이고; R'은 H, 일인산, 이인산, 삼인산, 티오인산, 인산 에스테르 유사체, 반응성 인 함유기에 부착된 -O-, 또는 차단기에 의해 보호된 -O-일 수 있으며; R"은 H, OH, 포스포르아미다이트, 또는 3'-OH 차단기일 수 있고, R'''는 H 또는 OH이다. 여기서, R"는 포스포르아미다이트이며, R'는 자동화된 합성 조건 하에서 후속적 단량체 결합을 허용하는 산-절단성 하이드록실 보호기이다.
특정 구현예에서, 차단기는 별개의 그리고 독립적인 염료 화합물이며, 즉, 그에 부착되지 않는다. 대안적으로, 염료는 3'-OH 차단기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R"은 염료 화합물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 3'-OH 차단기일 수 있다.
또 다른 대안적인 구현예에서, 오탄당의 3' 탄소에는 차단기가 없으며, 염기에 부착되는 염료 (또는 염료 및 링커 작제물)는 예를 들어, 추가 뉴클레오타이드의 혼입에 대한 차단으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다. 따라서, 차단은 입체 장애에 기인한 것일 수 있거나, 염료가 당의 3' 위치에 부착되어 있는지의 여부에 관계없이 크기, 전하 및 구조의 조합에 기인한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 구현예에서, 차단기는 오탄당의 2' 또는 4' 탄소에 존재하며, 추가 뉴클레오타이드의 혼입에 대한 차단으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다.
차단기의 사용은 예컨대 뉴클레오타이드가 혼입될 때 연장을 중지시킴에 의해 중합이 제어되도록 허용한다. 차단 효과가 가역적인 경우, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 화학적 조건을 변화시킴에 의해 또는 화학적 차단의 제거에 의해, 연장은 특정 지점에서 중단된 후 계속될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 3'-OH 차단기는 제WO2004/018497호 및 제WO2014/139596호에 개시된 모이어티를 포함할 것이며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 차단기는 아지도메틸 (-CH2N3) 또는 치환된 아지도메틸 (예를 들어, -CH(CHF2)N3 또는 CH(CH2F)N3), 또는 알릴일 수 있다.
특정 구현예에서, 링커 (염료 및 뉴클레오타이드 사이) 및 차단기가 둘 다 존재하며 별개의 모이어티이다. 특정 구현예에서, 링커 및 차단기는 실질적으로 유사한 조건 하에서 둘 다 절단성이다. 따라서, 탈보호 및 탈차단 공정은 염료 화합물과 차단기 둘 다를 제거하는 데 단 한번의 처리만이 요구될 것이기 때문에 더 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서 링커 및 차단기는 유사한 조건 하에서 절단성일 필요가 없고, 대신 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단성일 수 있다.
본 개시는 또한 염료 화합물을 혼입시키는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합으로 연결된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 각각 포함하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 천연 발생 뉴클레오타이드, 본원에 기술된 표지된 뉴클레오타이드 이외의 비-천연 발생 (또는 변형된) 뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합을, 본원에 제시된 바와 같이 적어도 하나의 뉴클레오타이드 (예를 들어, 염료 화합물로 표지됨)와 조합하여 포함할 수 있다. 본 개시에 따른 폴리뉴클레오타이드는 또한 비-천연 골격 결합 및/또는 비-뉴클레오타이드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물로 구성된 키메라 구조도 고려된다.
본원에 기술된 바와 같은 비제한적인 예시적 표지 뉴클레오타이드는 하기를 포함한다:
Figure pct00031
Figure pct00032
여기서, L은 링커를 나타내고, R은 전술한 바와 같은 당 잔기, 또는 1개, 2개 또는 3개의 인산염으로 치환된 5' 위치를 나타낸다.
일부 구현예에서, 비제한적인 예시적 형광 염료 접합체를 하기에 나타낸다:
Figure pct00033
Figure pct00034
, 여기서 PG는 본원에 기술된 3' 하이드록시 차단기를 나타낸다.
키트
본 개시는 또한 본원에 기술된 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가 성분과 함께 염료 (예를 들어, 본원에 기술된 광전환성 염료)로 표지된 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 추가 성분(들)은 본원에 제시된 방법 또는 하기 실시예 섹션에서 확인된 하나 이상의 성분일 수 있다. 본 개시의 키트에 조합될 수 있는 성분의 일부 비제한적인 예는 하기에 제시된다.
특정 구현예에서, 키트는 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드와 함께 적어도 하나의 표지된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 염료로 표지된 뉴클레오타이드는 비표지 또는 천연 뉴클레오타이드, 및/또는 형광 표지된 뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 공급될 수 있다. 뉴클레오타이드의 조합은 별도의 개별 성분 (예를 들어, 용기 또는 튜브 당 하나의 뉴클레오타이드 유형) 또는 뉴클레오타이드 혼합물 (예를 들어, 동일한 용기 또는 튜브 내 혼합된 둘 이상의 뉴클레오타이드)로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 염료는 본원에 개시된 광전환성 염료로부터 선택된다.
키트가 각각 염료 화합물로 표지된 복수개, 특히 2개, 또는 3개, 또는 더욱 특히 4개의 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물 없이 암색일 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드가 상이한 염료 화합물로 표지된 경우, 염료 화합물이 하나 이상의 이미징 이벤트를 통해 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료라는 것이 키트의 특징이다. 형광 염료 화합물로 표지된 2개의 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료가 예를 들어, 동일한 레이저로 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 구현예의 특징이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4개의 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼으로 구별가능한 형광 염료 중 2개는 둘 다 하나의 파장에서 여기될 수 있고, 다른 2개의 스펙트럼으로 구별가능한 염료는 이러한 파장에서 여기되지 않는다는 것이 일부 구현예의 특징이다. 일부 구현예에서, 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 중 하나는 표지되지 않는다.
키트는 상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오타이드를 갖는 구성과 관련하여 본원에서 예시되지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2개, 3개, 4개 이상의 상이한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 키트는 폴리뉴클레오타이드 내로 뉴클레오타이드의 혼입을 촉매할 수 있는 폴리머라아제 효소를 포함할 수 있다. 이러한 키트에 포함될 다른 성분은 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 개시의 뉴클레오타이드, 및 상이한 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 다른 임의의 뉴클레오타이드 성분은 사용 전에 희석될 농축 형태로 키트에 제공될 수 있다. 이러한 구현예에서 적합한 희석 버퍼가 또한 포함될 수 있다. 또한, 본원에 제시된 방법에서 확인된 하나 이상의 성분이 본 개시의 키트에 포함될 수 있다.
본 개시의 일부 구현예는 적어도 하나의 표지된 뉴클레오타이드 유형을 포함하는 키트에 관한 것이며, 상기 뉴클레오타이드는 본원에 기술된 광전환성 염료로 표지된다. 일부 추가 구현예에서, 키트는 2개 이상의 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 제1 유형의 뉴클레오타이드는 본원에 기술된 제1 광전환성 표지로 표지되고, 제2 유형의 뉴클레오타이드는 본원에 기술된 제2 광전환성 표지로 표지된다. 추가 구현예에서, 키트는 제1 광전환성 표지와 동일하거나 실질적으로 동일한 파장에서 방출하는 표지를 포함하는 제3 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 제1 광전환성 표지와 동일하거나 실질적으로 동일한 여기 파장을 사용하여 여기될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 키트는 비표지된 제4 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 유형, 제2 유형, 및 제3 유형의 뉴클레오타이드는 동일한 파장에서의 검출에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기술된 키트의 임의의 구현예에서, 자동화 서열분석 장비에서 사용될 수 있으며, 상기 자동화 서열분석 장비는 상이한 여기 파장에서 작동하는 2개의 레이저, 및 고정된 방출 파장으로 설정된 단일 검출 채널을 갖춘 검출 시스템을 포함한다.
광전환성 표지에 개시된 형광 모이어티 외에, 형광 모이어티로서 사용하기 위한, 다른 예시적인 형광 모이어티, 또는 이의 유도체는 플루오레세인 및 플루오레세인 유도체, 예컨대 카복시플루오레세인, 테트라클로로플루오레세인, 헥사클로로플루오레세인, 카복시나프토플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, NHS-플루오레세인, 요오도아세트아미도플루오레세인, 플루오레세인 말레이미드, SAMSA-플루오레세인, 플루오레세인 티오세미카르바지드, 카보히드라지노메틸티오아세틸-아미노 플루오레세인, 로다민 및 로다민 유도체, 예컨대 TRITC, TMR, 리사민 로다민, 텍사스 레드, 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 10, NHS-로다민, TMR-요오도아세트아미드, 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 리사민 로다민 B 설포닐 하이드라진, 텍사스 레드 설포닐 클로라이드, 텍사스 레드 하이드라지드, 쿠마린 및 쿠마린 유도체, 예컨대 AMCA, AMCA-NHS, AMCA-설포-NHS, AMCA-HPDP, DCIA, AMCE-하이드라지드, BODIPY 및 유도체, 예컨대 BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3 하이드라지드, BODIPY 493/503 C3 하이드라지드, BODIPY FL C3 하이드라지드, BODIPY FL IA, BODIPY 530/551 IA, Br-BODIPY 493/503, 캐스케이드 블루(Cascade Blue) 및 유도체, 예컨대 캐스케이드 블루 아세틸 아자이드, 캐스케이드 블루 카다베린, 캐스케이드 블루 에틸렌디아민, 캐스케이드 블루 하이드라지드, 루시퍼 옐로우 및 유도체, 예컨대 루시퍼 옐로우 요오도아세트아미드, 루시퍼 옐로우 CH, 시아닌 및 유도체, 예컨대 인돌륨 기반 시아닌 염료, 벤조-인돌륨 기반 시아닌 염료, 피리듐 기반 시아닌 염료, 티아졸륨 기반 시아닌 염료, 퀴놀리늄 기반 시아닌 염료, 이미다졸륨 기반 시아닌 염료, Cy3, Cy5, 란탄족 킬레이트 및 유도체, 예컨대, BCPDA, TBP, TMT, BHHCT, BCOT, 유로퓸 킬레이트, 터븀 킬레이트, Alexa Fluor 염료, DyLight 염료, Atto 염료, LightCycler Red 염료, CAL Flour 염료, JOE 및 이의 유도체, Oregon Green 염료, WellRED 염료, IRD 염료, 피코에리트린 및 피코빌린 염료, 말라카이트 그린, 스틸벤, DEG 염료 (예를 들어, 제US2010/0009353호에 기술된 것과 같으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), NR 염료, 근적외선 염료 및 당업계에 공지된 다른 것들, 예컨대 Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 제6판; Synthegen 카탈로그 (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 제2판, Plenum Press New York (1999), Hermanson, Bioconjugate Techniques, 제2판, 제US2010/0009353호 또는 제WO 98/59066호에 기술된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 제3 표지는 또한 본원에 언급된 예시적인 형광 모이어티, 또는 이의 유도체 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
서열분석 적용
본 개시에 따른 표지된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 임의의 분석 방법, 예컨대, 그 자체로 또는 더 큰 분자 구조 또는 접합체에 혼입되거나 결합된, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "폴리뉴클레오타이드에 혼입된"은 5' 인산이 제2 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 3' 하이드록시기에 포스포디에스테르 결합으로 연결되며, 이는 그 자체가 더 긴 폴리뉴클레오타이드 사슬의 일부를 형성할 수 있음을 의미할 수 있다. 본원에 제시된 뉴클레오타이드의 3' 말단은 추가 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 5' 인산에 포스포디에스테르 결합으로 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 하나의 비제한적인 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 뉴클레오타이드를 검출하는 방법을 제공한다: (a) 본 개시의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키는 단계 및 (b) 뉴클레오타이드(들)에 부착된 염료 화합물로부터의 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 뉴클레오타이드(들)을 검출하는 단계.
상기 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 본 개시에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드에 혼입되는 합성 단계 및 (b) 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)이 이들의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출되는 검출 단계.
본 출원의 일부 구현예는 다음을 포함하는 서열분석 방법에 관한 것이다: (a) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 표지된 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키는 단계; 및 (b) 뉴클레오타이드(들)에 부착된 새로운 형광 염료로부터의 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오타이드에 혼입시킨 표지된 뉴클레오타이드(들)을 검출하는 단계.
일 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 폴리머라아제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입된다. 그러나, 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드에 결합시키는 다른 방법, 예컨대 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성 또는 비표지된 올리고뉴클레오타이드에 대한 표지된 올리고뉴클레오타이드의 결찰이 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 용어 "혼입시키는"은 화학적 방법뿐만 아니라 효소적 방법에 의한 폴리뉴클레오타이드 합성을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 합성 단계가 수행되고, 본 개시의 형광 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 인큐베이션하는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 폴리머라아제는 또한 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오타이드 가닥 상의 유리 3' 하이드록시기와 뉴클레오타이드 상의 5' 인산기 사이에 포스포디에스테르 결합의 형성을 허용하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 대한 뉴클레오타이드의 상보적인 염기-짝짓기에 의해 유도된 폴리뉴클레오타이드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
방법의 모든 구현예에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 폴리뉴클레오타이드 가닥이 주형 가닥에 어닐링되는 동안, 또는 두 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오타이드(들)을 혼입시키는 표적 가닥은 단리되거나 정제된 다음 추가로 가공되거나 후속 분석에 사용될 수 있다. 예로서, 합성 단계에서 본원에 기술된 뉴클레오타이드(들)로 표지된 표적 폴리뉴클레오타이드는 후속적으로 표지된 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된 합성 단계의 생성물은 추가 반응 단계의 대상이 될 수 있으며, 원한다면, 이러한 후속 단계의 생성물은 정제되거나 또는 단리된다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기술에 익숙한 자에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 구현예에서, 합성 단계는 적합한 폴리머라아제 효소의 존재 하에 주형 가닥에 상보적인 연장된 표적 가닥을 형성하고자, 본원에 기술된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 전구체를 사용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 다른 구현예에서, 합성 단계는 표적 및 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 복제로부터 유래된 어닐링된 상보성 가닥으로 구성된 표지된 이중 가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 그 자체로 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 틈 번역(nick translation), 가닥 변위 중합(strand displacement polymerization), 무작위 프라이밍 DNA 표지 등을 포함한다. 합성 단계에 대해 특히 유용한 폴리머라아제 효소는 본원에 제시된 뉴클레오타이드의 혼입을 촉매할 수 있는 것이다. 자연적으로 발생하거나 변형된 다양한 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리머라아제는 열순환 조건을 사용하여 수행되는 합성 반응에 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라아제는 등온 프라이머 연장 반응에 바람직하지 않을 수 있다. 본 개시에 따른 뉴클레오타이드를 혼입할 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라아제는 제WO 2005/024010호 또는 제WO06120433호에 기술된 것들을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 더 낮은 온도, 예컨대 37℃에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라아제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라아제일 필요는 없으며, 따라서 폴리머라아제의 선택은 다수의 인자, 예컨대 반응 온도, pH, 가닥-변위 활성 등에 따라 달라질 것이다.
특정 비제한적인 구현예에서, 본 개시는 핵산 서열분석, 재-서열분석, 전체 게놈 서열분석, 단일 뉴클레오타이드 다형성 스코어링, 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입될 때 본원에 제시된 표지된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 검출을 수반하는 임의의 다른 적용 방법을 포함한다. 형광 염료를 포함하는 뉴클레오타이드로 표지된 폴리뉴클레오타이드의 사용이 유리한 임의의 다양한 다른 적용은 본원에 제시된 표지된 뉴클레오타이드 또는 염료를 갖는 뉴클레오사이드를 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시는 폴리뉴클레오타이드 합성에 의한 서열분석 반응에서 본 개시에 따른 표지된 뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. 합성에 의한 서열분석(Sequencing-by-synthesis)은 일반적으로 서열분석되는 주형 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오타이드 사슬을 형성하기 위해 폴리머라아제 또는 리가아제를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 순차적인 첨가를 수반한다. 첨가된 뉴클레오타이드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 동일성은 검출 또는 "이미징" 단계에서 결정될 수 있다. 첨가된 염기의 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 혼입 단계 후에 결정될 수 있다. 이후 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기-짝짓기 규칙(Watson-Crick base-pairing rules)을 사용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 동일성을 결정하기 위해 본원에 제시된 표지된 뉴클레오타이드의 사용은, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형성의 스코어링에 유용할 수 있으며, 이러한 단일 염기 연장 반응은 본 개시의 범위 내에 있다.
본 개시의 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열은 혼입된 뉴클레오타이드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 서열분석되는 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 초기 가닥으로의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 혼입을 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열분석은 적합한 프라이머로 프라이밍될 수 있으며 (또는 헤어핀의 일부로서 프라이머를 포함할 헤어핀 작제물로서 제조될 수 있으며), 초기 사슬은 뉴클레오타이드를 폴리머라아제-촉매화 반응에서 프라이머의 3' 말단에 첨가함으로써 단계적으로 연장된다.
특정 구현예에서, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 삼인산 (A, T, G 및 C)은 고유한 형광단으로 표지될 수 있고, 또한 제어되지 않은 중합반응을 방지하기 위해 3' 위치에 차단기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오타이드 중 하나는 비표지될 수 있다 (암색). 폴리머라아제 효소는 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 초기 사슬에 뉴클레오타이드를 혼입하고, 차단기는 뉴클레오타이드의 추가 혼입을 방지한다. 임의의 비혼입된 뉴클레오타이드는 세척될 수 있으며, 각각의 혼입된 뉴클레오타이드로부터의 형광 신호는 적합한 수단, 예컨대 레이저 여기 및 적합한 방출 필터를 사용하는 전하-커플링된 장치에 의해 광학적으로 "판독"될 수 있다. 이후 3'-차단기 및 형광 염료 화합물을 동시에 또는 순차적으로 제거 (탈보호)하여 추가 뉴클레오타이드 혼입을 위한 초기 사슬을 노출시킬 수 있다. 통상적으로, 혼입된 뉴클레오타이드의 동일성은 각각의 혼입 단계 후에 결정될 것이지만, 이것이 반드시 필수적인 것은 아니다. 유사하게, 미국특허번호 제5,302,509호 (이는 본원에 참조로 포함됨)는 고체 지지체 상에 고정된 폴리 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기 예시된 바와 같이, 상기 방법은 DNA 폴리머라아제의 존재하에, 고정화된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 가닥 내로 형광 표지된 3'-차단된 뉴클레오타이드 A, G, C 및 T의 혼입을 활용한다. 폴리머라아제는 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 혼입하지만, 3'-차단기에 의해 추가 첨가는 방지된다. 이후 혼입된 뉴클레오타이드의 표지를 결정할 수 있으며, 차단기는 추가 중합반응이 일어날 수 있도록 화학적 절단에 의해 제거될 수 있다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석되는 핵산 주형은 서열분석하고자 하는 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가 뉴클레오타이드를 첨가하기 위한 프라이머 또는 개시점으로서 작용하는 유리 3' 하이드록시기를 갖는 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석되는 주형의 영역은 상보적인 가닥 상에 이러한 유리 3' 하이드록시기에 돌출시킬 것이다. 서열분석되는 주형의 돌출 영역은 단일 가닥일 수 있지만, 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH기를 제공하기 위해 서열분석되는 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에 "틈(nick)이 존재"하는 경우, 이중-가닥일 수 있다. 이러한 구현예에서, 서열분석은 가닥 변위에 의해 진행될 수있다. 특정 구현예에서, 자유 3' 하이드록시기를 갖는 프라이머는 서열분석되는 주형의 단일-가닥 영역에 혼성화되는 별도의 성분 (예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오타이드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석되는 주형 가닥은 각각 분자내 듀플렉스(intra-molecular duplex), 예컨대 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있는 부분적으로 자기-상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오타이드 및 이들을 고체 지지체에 부착할 수 있는 방법은 PCT 공개번호 제WO 01/57248호 및 제WO 2005/047301호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 뉴클레오타이드는 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가되어, 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 사슬을 합성할 수 있다. 첨가된 염기의 성질은 특히 각각의 뉴클레오타이드 첨가 후에 결정될 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니며, 따라서 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공한다. 따라서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 5' 인산기와 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 뉴클레오타이드를 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실기에 연결시킴으로써 핵산 가닥 (또는 폴리뉴클레오타이드)에 혼입된다.
서열분석되는 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 데옥시뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드로 구성된 하이브리드 분자(hybrid molecule)일 수도 있다. 핵산 주형은 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오타이드, 및 천연 또는 비-천연 골격 결합을 포함할 수 있으며, 단, 이들은 서열분석 반응에서 주형의 복제를 방해하지 않는다.
특정 구현예에서, 서열분석되는 핵산 주형은 당업계에 공지된 임의의 적합한 결합 방법, 예를 들어 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체 (예를 들어, 실리카 기반 지지체)에 직접적으로 부착될 수 있다. 그러나, 본 개시의 다른 구현예에서, 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오타이드의 직접적 공유 부착을 허용하기 위해, 또는 그 자체가 고체 지지체에 비-공유결합으로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 고분자전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오타이드를 고정화하기 위해 어떤 방식으로든 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드가 실리카 기반 지지체에 직접적으로 부착된 어레이는, 예를 들어 제WO 00/06770호 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들이며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 유리 상의 펜던트 에폭사이드기와 폴리뉴클레오타이드 상의 내부 아미노기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 제WO 2005/047301호 (본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 황 기반 친핵체와 고체 지지체와의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체-지지된 주형 폴리뉴클레오타이드의 또 다른 추가 예는, 예를 들어, 각각이 본원에 참조로 포함되는 제WO 00/31148호, 제WO 01/01143호, 제WO 02/12566호, 제WO 03/014392호, 미국특허번호 제6,465,178호 및 제WO 00/53812호에 기술된 바와 같이, 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착된 것이다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기 인용된 참조문헌 및 본원에 참조로서 포함되는 제WO2005/065814호에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 특정 하이드로겔은 제WO 2005/065814호 및 미국특허번호 제2014/0079923호에 기술된 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 하이드로겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어, 미국특허번호 제6,172,218호 (본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 적용에 유용할 수 있다. 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 비드 라이브러리가 제조될 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이들의 생성을 위한 방법은 Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제시된 뉴클레오타이드를 사용하는 이러한 비드 어레이에 대한 서열분석은 본 개시의 범위 내에 있다.
서열분석되는 주형(들)은 고체 지지체 상에 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 개시의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터형 어레이 및 비드 어레이를 포함하는 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용 가능하다. 본 개시의 표지된 뉴클레오타이드는 본질적으로 임의의 유형의 어레이에서 주형을 서열분석하는데 사용될 수 있으며, 이는 고체 지지체 상에 핵산 분자를 고정시킴으로써 형성된 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
그러나, 본 개시의 표지된 뉴클레오타이드는 클러스터형 어레이의 서열분석과 관련하여 특히 유리하다. 클러스터형 어레이에서, 어레이 상의 별개의 영역 (종종 부위, 또는 부분으로 지칭됨)은 다수의 폴리뉴클레오타이드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 다수의 폴리뉴클레오타이드 분자는 광학적 수단에 의해 개별적으로 분해될 수 없으며, 대신 집합체로서 검출된다. 어레이가 형성되는 방법에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별적인 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 복사체 (예를 들어, 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산 종에 대해 동일함) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 복사체(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 복사체)를 포함할 수도 있다. 핵산 분자의 클러스터형 어레이는 당업계에 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 각각이 본원에 포함되는 제WO 98/44151호 및 제WO00/18957호는 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 주형 및 증폭 산물이 모두 고체 지지체 상에 고정된 채로 유지되는 핵산의 증폭 방법을 기술한다. 이러한 방법에 따라 제조된 클러스터형 어레이 상에 존재하는 핵산 분자는 본 개시의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열분석에 적합한 주형이다.
본 개시의 표지된 뉴클레오타이드는 또한 단일 분자 어레이 상의 주형을 서열분석하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "단일 분자 어레이(single molecule array)" 또는 "SMA"는 고체 지지체 상에 분포된 (또는 어레이된) 폴리뉴클레오타이드 분자의 집단을 의미하며, 여기서 집단의 다른 모든 것으로부터의 임의의 개별적인 폴리뉴클레오타이드의 간격은 상기 개별적인 폴리뉴클레오타이드 분자를 개별적으로 분해할 수 있도록 한다. 따라서, 고체 지지체의 표면 상에 고정된 표적 핵산 분자는 일부 구현예에서 광학 수단에 의해 분해될 수 있다. 이는 각각 하나의 폴리뉴클레오타이드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호가 사용된 특정 이미징 장치의 분해가능한 영역 내에서 발생할 것임을 의미한다.
단일 분자 검출은 어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 분자 사이의 간격이 적어도 100 ㎚, 보다 특히 적어도 250 ㎚, 또한 보다 특히 적어도 300 ㎚, 심지어 보다 특히 적어도 350 ㎚인 경우에 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 분해가능하고 단일 분자 형광점으로서 검출가능하며, 상기 단일 분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광표백(photobleaching)을 나타낸다.
용어 "개별적으로 분해된" 및 "개별 분해능"은 가시화될 때 어레이 상의 하나의 분자를 이의 인접한 분자와 구별할 수 있음을 명시하기 위해 본원에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들 간의 분리는 개별 분자를 분해하는데 사용되는 특정 기술에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 공개 출원 제WO00/06770호 및 제WO 01/57248호를 참조하여 이해될 것이며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시의 뉴클레오타이드의 하나의 용도는 합성에 의한 서열분석 반응에 있지만, 뉴클레오타이드의 유용성은 이러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 뉴클레오타이드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 개시의 표지된 뉴클레오타이드는 자동화 형광 서열분석 프로토콜, 특히 생어(Sanger) 및 동료의 사슬 종결 서열분석 방법에 기반한 형광 염료-종결자 사이클 서열분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 프라이머 연장 서열분석 반응에서 형광 표지된 디데옥시뉴클레오타이드를 혼입하기 위해 효소 및 사이클 서열분석을 사용한다. 소위 생어 서열분석 방법, 및 관련 프로토콜 (생어-타입)은 표지된 디데옥시뉴클레오타이드와 함께 무작위 사슬 종결을 활용한다.
따라서, 본 개시는 또한 3' 및 2' 위치 둘 다에 하이드록실기가 없는 디데옥시뉴클레오타이드인 표지된 뉴클레오타이드를 포함하며, 이러한 디데옥시뉴클레오타이드는 생어 타입 서열분석 방법 등에 사용하기에 적합하다.
3' 차단기를 혼입하는 본 개시의 표지된 뉴클레오타이드는, 디데옥시뉴클레오타이드를 사용함으로써 달성된 동일한 효과가 3'-OH 차단기를 갖는 뉴클레오타이드를 사용함으로써 달성될 수 있으므로, 둘 다 후속 뉴클레오타이드의 혼입을 방해한다. 생어 방법 및 관련 프로토콜에서도 유용할 수 있음이 인식될 것이다. 본 개시에 따른 3' 차단기를 갖는 뉴클레오타이드가 생어-타입 서열분석 방법에 사용되는 경우, 본 개시의 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 각각의 예에서, 뉴클레오타이드는 후속하여 혼입될 필요가 없고, 따라서 표지가 뉴클레오타이드로부터 제거될 필요가 없으므로, 뉴클레오타이드에 부착된 염료 화합물 또는 검출가능한 표지가 절단성 링커를 통해 연결될 필요가 없음이 인식될 것이다.
본원에 개시된 추가 구현예는 복수개의 상이한 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계로, 각각의 핵산은 주형 및 프라이머를 포함하는 단계; 서열분석 반응의 사이클을 수행하는 단계로, 상기 사이클은 샘플에서 핵산에 대한 프라이머를 연장하여 본원에 기술된 바와 같은 적어도 4개의 상이한 표지된 뉴클레오타이드 유형을 갖는 복수개의 연장된 프라이머를 형성하고, 이에 의해 연장된 샘플을 형성하는 것을 포함하는 단계, 상기 연장된 샘플로부터 제1 신호 수집을 획득하는 단계로, 상기 연장된 프라이머에서 적어도 2개의 상이한 뉴클레오타이드 유형이 신호 상태에 있고, 연장된 프라이머에서 적어도 1개의 상이한 뉴클레오타이드 유형이 암색 상태에 있는 것인 단계; 폴리뉴클레오타이드를 광원으로 조사하여 특정 뉴클레오타이드 표지(들)의 방출 신호에 변화를 일으키는 단계, 및 샘플로부터 제2 신호 수집을 획득하는 단계로, 상기 2개의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 제2 신호 수집과 비교하여 제1 신호 수집에서 상이한 상태에 있는 것인 단계; 및 사이클로부터의 제1 신호 수집 및 제2 신호 수집을 평가함으로써 복수개의 상이한 핵산에 대한 서열을 결정하는 단계를 포함하는 복수개의 핵산 서열을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 복수개의 상이한 핵산이 기판에 부착된다. 일부 구현예에서, 프라이머의 연장은 상이한 뉴클레오타이드 유형의 폴리머라아제 촉매 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오타이드 유형은 가역적 차단 모이어티를 포함하며, 이에 의해 단일 뉴클레오타이드 유형이 각 사이클에서 각각 연장된 프라이머에 첨가된다. 일부 구현예에서, 프라이머의 연장은 상이한 뉴클레오타이드 유형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 리가아제 촉매 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 연장된 프라이머에서 2개의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 연장된 샘플로부터 제1 신호 수집을 획득하는 동안 암 상태에 있다. 바람직한 구현예에서, 전술한 바와 같은 서열분석 반응 사이클은 1회 이상 반복된다.
실시예
추가 구현예는 하기 실시예에서 더 상세하게 개시되며, 이는 청구범위의 범위를 제한하려는 의도가 전혀 없다.
실시예 1
이 실시예에서, 변형된 광전환성 적색-방출 형광단을 기반으로 혼입된 염료 식별을 획득하기 위해 단순화된 접근법이 기술되고, 하나의 혼입 사이클(cycle)의 작업 흐름이 도 2에 예시된다.
이 접근법에 필요한 각 염기가 연결된(base-tethered) 형광 태그의 구조와 기능은 표 1에 도시된다. "A" 및 "C" 염료는 광전환되는 기능을 갖는다. "T" 염료는 표준 적색 방출 염료일 수 있으며, 예를 들어, "A" 뉴클레오타이드에 대한 광전환성 다이애드의 일부인 동일한 적색 염료일 수 있다. 염료를 뉴클레오타이드에 연결하는 링커는 본원에 기술된 LN3 링커이며, 표 1 및 하기 광화학 반응식에 부분적으로만 도시된다. 본원에 개시된 다른 링커도 사용될 수 있다. 이 모든 염료는 생물학적으로 관련된 배지에서 기능할 수 있다.
염기 형광 표지 구조 기능
G n/a (비표지) Std 혼입
T
Figure pct00035
 Std 혼입
A
Figure pct00036
 Std 혼입; 청색 LED 조사 후 퀀칭(quenching)된 "꺼짐(off)" 상태로 전환됨.
C
Figure pct00037
 Std 혼입; 청색 LED 조사 후 "켜짐(on)" 상태로 전환됨.
새로운 A 염료는 (405 ㎚에서) 청색 레이저 또는 LED를 사용하여 광전환될 수 있도록 설계하였다. 광화학적 활성화는 다이애드의 하단부를 Si-함유 로다민 염료로부터 방출을 억제할 수 있는 퀀쳐로 전환시키는 개환 반응을 일으킨다(반응식 1).
Figure pct00038
반응식 1. 실리콘-함유 로다민 형광 모이어티(moiety)를 사용한 다이애드의 광화학적 퀀칭.
광활성화성 C 염료는 A 염료가 퀀칭된 "꺼짐" 상태로 전환되는 동시에 (405 ㎚에서) 청색 레이저 또는 LED 조사에 노출되어 "켜짐" 형광 상태로 전환될 수 있다. C 염료에 대해, 유사한 개환 반응은 약 550-650 ㎚를 중심으로 최대 흡광도를 갖는 고형광성 상태를 생성하는 옥사진 고리를 가역적으로 개방한다 (반응식 2). 따라서, 본원에 제안된 모든 염료는 (633 ㎚에서) 동일한 적색 LED 또는 레이저로 여기될 수 있다.
Figure pct00039
반응식 2. 실리콘-함유 로다민 형광 모이어티를 사용한 다이애드의 광화학적 활성화.
도 2에서, 표 1에 따른 4개의 상이한 종류의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드로의 혼입을 위해 플로우셀(flowcell)에 노출된다. 제1 이미징 단계 동안, 각 클러스터로부터의 광 방출이 기록된다. 상기 제1 이미징 이벤트에서, "A" 및 "T" 뉴클레오타이드 둘 다로부터 방출된 형광 신호를 검출한다. 이후, 405 ㎚ 파장을 갖는 청색 레이저를 사용하여 "A" 염료를 퀀칭하고 "C" 염료를 활성화한다. 그 다음 제2 이미징 단계가 수행되고 각 클러스터로부터의 광 방출이 다시 기록된다. 상기 제2 이미징 이벤트에서, "C" 및 "T" 뉴클레오타이드로부터 방출된 형광 신호를 검출한다. 두 이미징 이벤트에서, "G" 뉴클레오타이드는 암색이다 (비표지됨). 뉴클레오타이드는 두 이미지에 걸쳐 각 염기에 대한 상이한 방출 패턴의 분석에 의해 확인된다. 제1 이미지 및 제2 이미지의 조합을 이미지 분석 소프트웨어로 처리하여 각 클러스터 위치에 혼입된 염기를 확인한다. 제2 이미징 이벤트 후, 혼입된 뉴클레오타이드는 다른 뉴클레오타이드의 혼입을 감안하여 표준 절차에 따라 디블록킹(deblocking) 한다. 이 서열분석 사이클은 "n" 횟수를 반복하여 "n" 염기의 판독 길이를 생성한다.
이 실시예에서, 405 ㎚의 청색 레이저 또는 LED가 사용되며, 이는 "C" 염료의 쿠마린 부분 또는 "A" 염료의 스피로나프토티오피란 부분에 부가적 치환기를 도입함으로써 추가 조정될 수 있다. 이는 450 ㎚ 레이저를 갖춘 현재의 iSeq™ 시스템과 완전한 호환성이 허용될 것이다. 또한, 제안된 변형은 여러 서열분석 사이클에 걸쳐 고에너지 조사(irradiation)에 대한 반복된 노출로 인해 발생할 수 있는 가능한 DNA 손상의 가능성을 감소시킬 것이다.

Claims (71)

  1. 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법으로서, 방법은:
    (a) 하기 사이클 중 하나 이상의 사이클을 포함하는 서열분석 반응을 수행하는 단계:
    (i) 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체를 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 폴리뉴클레오타이드로 혼입하여 연장된 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 사이클로, 여기서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 제1 광전환성 표지를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 제2 광전환성 표지를 포함하며, 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 제3 표지를 포함하는 것인 사이클;
    (ii) 제1 이미징 이벤트를 통해 각 사이클에서 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제1 신호 수집을 검출하는 사이클;
    (iii) 연장된 폴리뉴클레오타이드를 광원으로 조사하여 제1 광전환성 표지 및 제2 광전환성 표지의 방출 신호에 변화를 일으키는 사이클;
    (iv) 제2 이미징 이벤트를 통해 연장된 폴리뉴클레오타이드로부터의 제2 신호 수집을 검출하는 사이클;
    (b) 순차적으로 혼입된 뉴클레오타이드 접합체를 기반으로 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 신호 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 암(dark) 상태로부터 결정되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트에서의 암 상태 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 신호 상태로부터 결정되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트에서의 암 상태로부터 결정되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체가 동시에 존재하며 각 사이클 동안 혼입을 위해 경쟁하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 적어도 50회 반복되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 접합체의 혼입은 폴리머라아제에 의해 수행되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (a)는 다음 혼입 사이클 전에 혼입된 뉴클레오타이드 접합체로부터 가역적 종결자 모이어티를 절단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 접합체는 dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, 및 이의 비-천연 뉴클레오타이드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 유형을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체 및 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 표지는 동일한 형광 모이어티를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오타이드 접합체, 제2 유형의 뉴클레오타이드 접합체, 및 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 표지는 상이한 형광 모이어티를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상이한 형광 모이어티는 동일한 방출 필터를 사용하여 검출되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 유형의 뉴클레오타이드 접합체는 형광 모이어티로 표지되지 않는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(iii)에서의 조사는 제3 유형의 뉴클레오타이드 접합체의 제3 표지로부터 검출된 신호를 실질적으로 변화시키지 않는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 레이저, 발광 다이오드 (LED), 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 제1 이미징 이벤트에서 사용된 여기 파장과 상이한 파장을 갖는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 약 350 ㎚ 내지 약 450 ㎚의 파장을 갖는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 (a)(iii)에서의 조사 광원은 약 405 ㎚의 파장을 갖는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 실질적으로 동일한 여기 파장을 갖는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 약 550 ㎚ 내지 650 ㎚의 여기 파장을 갖는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트는 약 633 ㎚의 여기 파장을 갖는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 광전환성 표지는 임의로 제1 링커를 통해, 제1 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 제1 형광 모이어티를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제1 형광 모이어티는 적색광을 방출하는 형광 모이어 티를 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 제1 형광 모이어티는 실리콘 로다민 모이어티를 포함하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 광변색성 모이어티는 스피로피라노 또는 스피로티오피라노 모이어티를 포함하는 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00040
    (I)
    여기서:
    X는 O (산소) 또는 S (황)이고;
    R1a 및 R2a 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 H, C1-6 알킬, 및 -(CH2)n-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 각각 임의로 치환된 C6-10 아릴, 5 내지 10원 헤테로아릴, 3 내지 7원 카르보시클릴, 및 3 내지 7원 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    고리 A는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고, 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며;
    n은 1 내지 6의 정수이고;
    단계 (a)(iii)에서의 조사는 스피로 C-X 결합의 절단을 일으킨다.
  29. 제28항에 있어서, X는 S인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, R1a 및 R2a 각각은 C1-6 알킬인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 A는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 전자 끄는 기는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, -S(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (Ia)의 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00041
    (Ia).
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 광전환성 표지는 하기 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00042
    , 여기서 L1은 제1 링커이다.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 광전환성 표지는 임의로 제2 링커를 통해, 제2 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 제2 형광 모이어티를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제2 형광 모이어티는 쿠마린 모이어티를 포함하는 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제2 광변색성 모이어티는 옥사진 모이어티 또는 티아진 모이어티를 포함하는 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00043
    (II)
    여기서:
    Y는 O (산소) 또는 S (황)이고;
    R1b 및 R2b 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    고리 B는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고; 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며;
    여기서 *는 형광 모이어티에 대한 부착점을 나타내고, 단계 (a)(iii)에서의 조사는 탄소*-Y 결합의 절단을 일으킨다.
  39. 제38항에 있어서, Y는 O인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, R1b 및 R2b 각각은 C1-6 알킬인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 전자 끄는 기는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, -S(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00044
    (IIa).
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 광전환성 표지는 하기 구조를 포함하는 방법:
    Figure pct00045
    , 여기서 L2는 제2 링커이다.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리뉴클레오타이드가 기판(substrate)에 부착되는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제1 신호 수집 및 제2 신호 수집을 검출하는 것은 기판의 이미지를 획득하는 것을 포함하는 방법.
  47. 광전환성 표지를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체로서, 광전환성 표지는 임의로 링커를 통해 광변색성 모이어티에 공유결합으로 결합된 형광 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체.
  48. 제47항에 있어서, 형광 모이어티는 여기시 적색광을 방출하는 것인 뉴클레오타이드 접합체.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 형광 모이어티는 실리콘 로다민 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 광변색성 모이어티는 스피로피라노 또는 스피로티오피라노 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00046
    (I)
    여기서:
    X는 O (산소) 또는 S (황)이고;
    R1a 및 R2a 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 H, C1-6 알킬, 및 -(CH2)n-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 각각 임의로 치환된 C6-10 아릴, 5 내지 10원 헤테로아릴, 3 내지 7원 카르보시클릴, 및 3 내지 7원 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    고리 A는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고, 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며;
    n은 1 내지 6의 정수이다.
  52. 제51항에 있어서, X는 S인 뉴클레오타이드 접합체.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, R1a 및 R2a 각각은 C1-6 알킬인 뉴클레오타이드 접합체.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 A는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, -S(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸인 뉴클레오타이드 접합체.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (Ia)의 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00047
    (Ia).
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 광전환성 표지는 하기 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00048
    , 여기서 L1은 링커이다.
  57. 제47항 또는 제48항에 있어서, 형광 모이어티는 쿠마린 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체.
  58. 제57항에 있어서, 광변색성 모이어티는 옥사진 모이어티 또는 티아진 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00049
    (II)
    여기서:
    Y는 O (산소) 또는 S (황)이고;
    R1b 및 R2b 각각은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C2-6 알케닐, 임의로 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, 및 C1-6 할로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    고리 B는 C6-10 아릴 또는 5 내지 10원 헤테로아릴이고; 각각 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환되며;
    여기서 *는 형광 모이어티에 대한 부착점을 나타낸다.
  60. 제59항에 있어서, Y는 O인 뉴클레오타이드 접합체.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, R1b 및 R2b 각각은 C1-6 알킬인 뉴클레오타이드 접합체.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 고리 B는 니트로, 시아노, 플루오로, 브로모, -S(O)2OH, -S(O)2CF3, 암모늄, 알킬 암모늄, 및 하나 이상의 플루오로 또는 브로모로 치환된 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전자 끄는 기로 치환된 페닐 또는 나프틸인 뉴클레오타이드 접합체.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 광변색성 모이어티는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00050
    (IIa).
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 광전환성 표지는 하기 구조를 포함하는 뉴클레오타이드 접합체:
    Figure pct00051
    , 여기서 L2는 링커이다.
  65. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 광전환성 표지는 절단성 링커를 통해 핵염기에 부착되는 뉴클레오타이드 접합체.
  66. 제64항에 있어서, 광전환성 표지는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는 뉴클레오타이드 접합체.
  67. 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 접합체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  68. 둘 이상 유형의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트로서, 여기서 제1 유형의 뉴클레오타이드는 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오타이드 접합체이고, 제2 유형의 뉴클레오타이드는 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 표지된 뉴클레오타이드 접합체인 키트.
  69. 제68항에 있어서, 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트로서, 여기서 제3 유형의 뉴클레오타이드는 제1 유형의 뉴클레오타이드와 동일한 파장에서 방출되는 표지를 포함하며, 제4 유형의 뉴클레오타이드는 비표지된 것인 키트.
  70. 제69항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오타이드, 제2 유형의 뉴클레오타이드, 및 제3 유형의 뉴클레오타이드는 동일한 방출 파장에서 검출될 수 있는 키트.
  71. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 자동화 서열분석 장비에 사용하기 위한 것으로, 자동화 서열분석 장비는 상이한 여기 파장에서 작동하는 두 개의 레이저, 및 고정된 방출 파장으로 설정된 단일 검출 채널을 갖는 검출 시스템을 포함하는 키트.
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