CN101868286A - 采用磁性传感器进行的分析物检测 - Google Patents

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CN101868286A CN200880116933A CN200880116933A CN101868286A CN 101868286 A CN101868286 A CN 101868286A CN 200880116933 A CN200880116933 A CN 200880116933A CN 200880116933 A CN200880116933 A CN 200880116933A CN 101868286 A CN101868286 A CN 101868286A
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王善祥
塞巴斯蒂安·J·奥斯特菲尔德
余珩
纳德·波曼德
罗伯特·L·怀特
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Abstract

本发明提供了利用磁性传感器检测分析物的方法。所述方法的各方面包括：制备具有来自样品(诸如血清样品)的磁性标记分析物的磁性传感器装置，所述磁性标记分析物与该装置的磁性传感器表面相结合；以及从所述磁性传感器获得信号(例如，实时信号)以确定所述分析物是否存在于该样品中。本发明还提供了可用于实践本发明方法的装置、系统和试剂盒。本发明的方法、装置、系统和试剂盒可用于包括如疾病标记物等生物标记物的检测的各种不同应用中。

Description

采用磁性传感器进行的分析物检测
对政府支持的致谢
本发明在由NIH授予的第1U54CA119367-01、PO1-HG000205、N43C0-2007-00030和R43AI072800号基金、DARPA/海军基金第N00014-02-1-0807号和美国国防局基金第HDTRA1-07-1-0030-P-1号的政府支持下进行。政府具有本发明的一定权利。
相关申请的交叉引用
遵循35U.S.C.§119(e)，本申请涉及提交于2007年9月20日的美国临时申请第60/973,973号和提交于2008年8月5日的美国临时申请第61/086,411号；上述申请的公开内容通过引用并入本文。
背景技术
现在正在出现这样一种共识：即，基于约4～20个生物标记物的遗传学和蛋白质组分布(genetic and proteomic profiles)在临床中进行早期检测和个性化治疗是改善患有如癌症等复杂疾病的患者的存活率的关键。尽管存在可用的用于进行具有成百上千的生物标记物的大规模生物标记物发现的工具，但几乎没有能够对能在临床设定中容易地用于进行生物标记物验证及用于个性化诊断和治疗的生物标记物进行多重和灵敏的检测的生物分子检测工具。
发明内容
本发明提供了采用磁性传感器进行分析物检测的方法。本发明的各方面包括：制备具有来自样品(如血清样品)的磁性标记分析物的磁性传感器装置，所述磁性分析物与该装置的磁性传感器表面相结合；以及从所述磁性传感器获得信号(例如，实时信号)以确定所述分析物是否存在于该样品中。在某些实施方式中，该方法包括同时对样品中的一种或多种分析物进行定量。本发明还提供了可用于实践本发明方法的装置、系统和试剂盒。本发明的方法、装置、系统和试剂盒可用于包括检测生物标记物(如疾病标记物)的各种不同应用中。
附图说明
图1显示了基于磁性纳米标签(magnetic nanotag-based)的蛋白检测测试的示意图。
图2显示了来自基于多重MNT的测试的结果的曲线图。
图3显示了四倍蛋白测试的结果。
图4显示了基于磁性纳米标签的蛋白测试芯片。
图5显示了磁性纳米标签的SEM图像。
图6显示了PBS中的直接结合抗IFN-γ测试的示意图。
图7显示了对传感器几何形状及其对灵敏度的效果的测试。图7a显示了宽传感器与窄传感器的几何形状。图7b显示了信号发生与传感器尺寸的图。
图8显示了具有纳米标签放大的多重蛋白测试的图。
图9显示了反相测试芯片(reverse phase assay chip)的示意图和图像。图9a显示了反相蛋白芯片的示意图，其中分析物被直接点在芯片上然后使检测抗体与点进行位点特异性温育。图9b显示了点在磁性纳米芯片上的64个样品的图像。
图10显示了在反相蛋白检测实验中阳性和对照传感器的磁信号与时间的图。
定义
本文所用术语“探针(probe)”是指与所关注的靶标分析物互补的部分。在某些情况中，靶标分析物(target analyte)的检测需要将探针与靶标相关联。在某些实施方式中，可将探针固定于基质表面上，其中所述基质可具有诸如但不限于板、珠或其它结构的各种构造。在某些实施方式中，探针可存在于例如阵列形式的平面支持体上。
“阵列(array)”包括可寻址区域的二维或基本二维(以及三维)的排列，例如，可寻址区域，例如，带有探针(特别是对于所关注的靶标分析物具有特异性的探针)的空间可寻址区域或光学可寻址区域。当阵列为核酸或蛋白阵列时，所述核酸或蛋白可在沿核酸链的任何一点或多点处吸附、物理吸附、化学吸附或共价连接于所述阵列。
当阵列具有多个不同部分(例如，不同探针)的区域从而使该阵列上的特定预定位置(即“地址”)处的区域(即阵列的“特征点”或“点”)含有特定探针时，该阵列是“可寻址”的。阵列特征点通常但不一定被介入空间分隔开。如果阵列的特征点各自具有能确定该特征点处存在的部分的可检测特征(例如，磁场特征)，则该阵列也是“可寻址”的。
本文所用术语“核酸(nucleic acid)”描述了由核苷酸组成的长度为例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于约1000个碱基、乃至约10,000个或更多个碱基的聚合物(例如，脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)并且可通过酶或合成而制备(例如，如美国专利第5,948,902号及其中所引用的参考文献所述的PNA)，所述聚合物可与天然存在的核酸以类似于两个天然存在核酸的序列特异性方式(例如，能参与沃森-克里克碱基配对相互作用)的序列特异性方式来进行杂交。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。
本文所用术语“生物标记物(biomarker)”是指特定疾病状态或特定生物体状态的指示物。在某些情况下，生物标记物的特征在于其被作为正常生物过程、致病过程或对于治疗性干预的药理学响应的指示物而测定和评估。在某些情况下，生物标记物可以是诸如但不限于血压或心率等生理学指标。在某些情况下，生物标记物可以是分子生物标记物，例如但不限于蛋白、核酸、糖类和小分子等。例如，分子生物标记物的实例包括但不限于升高的前列腺特异性抗原(其可用作前列腺癌分子生物标记物)或使用酶测试作为肝功能测试。在某些实施方式中，生物标记物可指示蛋白表达或状态的改变，所述蛋白表达或状态的改变与疾病的风险或进展相关或者与疾病对于给定治疗的易感性相关。
在某些情况下，疾病可以是增殖性疾病。如本文所用，术语“增殖性疾病(proliferative disease)”是指其特征为组织或细胞的尺寸或数目的增长或快速增加的疾病。实例包括但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤和癌性瘤等。
如本文所用，术语“处理器(processor)”、“中央处理单元(centralprocessing unit)”或“CPU”是指进行数据处理的计算机部件(即微处理器芯片)。在某些实施方式中，处理器可处于软件程序的控制下并因而被适当地编程以执行其所需的所有步骤或功能，并且还可包括将执行该所需功能的任何硬件或软件组合。例如，在某些情况下，处理器可输入数据(例如，数据信号)、处理该数据以获得结果并将该结果以用户可读格式输出至计算机可读介质上。在某些实施方式中，处理器可设置为获取实时信号。如本文所用，术语“实时(real time)”是指在其发生时或在其发生后尽可能快地检测或获取的事件或信号。
具体实施方式
本发明提供了采用磁性传感器进行分析物检测的方法。本发明的各方面包括：制备具有来自样品(如血清样品)的磁性标记分析物(magnetically labeled analyte)的磁性传感器装置，所述磁性标记分析物与该装置的磁性传感器表面相结合；以及从所述磁性传感器获得信号(例如，实时信号)以确定所述分析物是否存在于样品中，并且在某些实施方式中同时对样品中的一种或多种分析物进行定量。本发明还提供了可用于实践本发明方法的装置、系统和试剂盒。本发明的方法、装置、系统和试剂盒可用于包括检测如疾病标记物等生物标记物的各种不同应用中。
在对本发明进行更详细的描述之前，应理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方式，因为这些实施方式当然可进行改变。还应理解，本文所用术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不是旨在进行限定，这是因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
当提供了数值范围时，应理解的是，除非上下文另外明确指明，在该范围的上限与下限之间的每个介入值(interventing value)(以下限的单位的十分之一计)以及所述范围内的任何其它陈述值(stated vaue)或介入值都涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在所述较小范围内并且也涵盖在本发明之内，受制于所述范围中的任何具体排除的极值。当所述范围包括极值(limit)中的一个或两者时，排除了这些所包括的极值中的任一个或两者的范围也包括于本发明中。
某些范围以由术语“大约”开头的数值而呈现于本文中。本文中将术语“大约”用来提供对于其后的确切数字以及靠近或接近该术语之后的数字的数字提供文字支持。在确定一个数字是否靠近或接近具体记录的数字时，该靠近或接近的未记录数字可能是在其出现的上下文中提供与所述具体记录的数字基本相当的数字的数字。
除非另外限定，本文所用的所用科技术语具有本发明所属领域内普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明时也可使用与本文所述方法和材料相似或等价的方法和材料，现仍对代表性的说明性方法和材料进行描述。
通过引用将本说明书中引用的所有出版物和专利并入本文，其如同通过引用将每个单独的出版物或专利具体且分别地指定并入并通过引用并入本文中以公开和描述与所引用的出版物相关联的方法和/或材料。对于任何出版物的引用是用于其提交日期之前的公开，而不应视为承认本发明没有权利凭借在先发明而提前于所述出版物。此外，所提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，后者需要独立确认。
应注意，如本文和所附权利要求中所用的，除非上下文另外明确指明，单数形式“一/一个/一种(a或an)”和“该/所述(the)”包括了复数的指代物。还应注意，权利要求可撰写为排除任何可选的要素。同样，这一陈述旨在充当将如“唯一”和“仅仅”等排他性术语与权利要求要素的叙述联合使用或者使用“负面性”限制的前体基础。
对于本领域技术人员在阅读本公开后显而易见，本文所描述和说明的每个个体实施方式具有分立的成分和特点，这些特点可在不背离本发明的范围或主旨的情况下与其它数个实施方式中任何一个的特点相分离或合并。所叙述的任何方法可以以所叙述的事件顺序进行或者以任何其它在逻辑上可行的顺序进行。
在进一步描述本发明的实施方式时，将首先对所述方法的各方面进行更详细的描述。接着，对可以用于实践本发明方法的系统和试剂盒的实施方式进行综述。另外，还提供了其中可使用本发明的方法、系统和试剂盒的不同应用的实施方式的综述。
方法
如上文所总结的，本发明的实施方式涉及确定样品中是否存在分析物(即确定样品中分析物的存在或不存在)的方法，以及在某些实施方式中同时对样品中的一种或多种分析物进行定量的方法。所述方法的各方面包括制备具有与其磁性传感器表面相结合的磁性标记分析物的磁性传感器装置。下文对可用于本发明方法中的磁性传感器装置进行了更详细的描述。与所述装置的传感器表面相结合的磁性标记分析物可使用多种不同方案来制备。例如，可将分析物首先与传感器表面上的特异性受体相结合，随后进行磁性标记。或者可选地，可将样品与磁性标记在与传感器接触之前混合，然后让所得的标记分析物(labeled analyte)与该传感器结合。在其它实施方式中，将所关注的样品首先定位在传感器上，然后与对于所关注的样品分析物具有特异性的磁性标记试剂相接触。
在某些实施方式中，所采用的方法学是使用“实时”信号的方法学。在某些实施方式中，所关注的测试是多重蛋白测试，其中对复合样品(如血清样品)进行测试以确定样品中是否存在两种或更多种不同蛋白。在后一类实施方式中，所采用的信号可以是也可以不是实时信号。
实时信号
在某些实施方式中，本文所公开的方法采用“实时”信号。包括从装置获取实时信号和利用该信号来确定样品中至少给定的关注分析物(analyte of interest)的存在或不存在的本发明实施方式也是如此。于是，本发明的实施方式观测了随着靶标标记的进展与关注分析物、事实上是多个分析物的存在相关的信号的实时进展。实时信号由在给定的关注时段中获得的两个或更多个数据点构成，其中在某些实施方式中获取的信号是在给定的关注时段中连续获取的连续数据点组。
在某些实施方式中，在测试系统处于“湿”条件下时(即包括所有未知物的溶液仍与测试检测系统接触时)观测信号。同样地，没有必要洗去所有非结合分子或无关分子。该“湿”检测可能是由于由磁性标签纳米颗粒(例如，如其它部分所述的100nm以下的磁性标签纳米颗粒)所产生的磁场随着与纳米颗粒的距离的增加而快速降低实现的。因此，与捕获的靶标分子结合的纳米颗粒传感器处的磁场超过了来自溶液中未经结合的磁性纳米颗粒的磁场，两者都处在离检测器较远的距离并且处于布朗运动中。本文所用术语“近感检测(proximity detection)”是指在结合纳米颗粒(bound nanoparticle)的传感器处的这种优势。在“近感检测”方案下，可在不洗去溶液中的非特异性磁性纳米标签的情况下对传感器表面特异性吸附的分析物-纳米标签偶联物进行定量。此外，在某些实施方式中，利用适当的表面化学和捕获探针，对于蛋白或核酸测试可采用相同的磁性纳米生物传感器。
磁性纳米标签结合动力学可以由以下等式近似描述：
n = n o ( e k on C o t - 1 ) e k on C o t = n 0 ( 1 - e - k on C 0 t ) ,
其中，n(cm-2)是所捕获的经链霉素抗生物素蛋白涂布的纳米标签，no是在涂覆纳米标签之前传感器表面上的生物素化连接子抗体的原始密度，kon(cm3s-1)是传感器表面上纳米标签的特异性吸附的结合速率常数，且C0是远离传感器表面的本体溶液中的纳米标签浓度。涂覆纳米标签时的实时信号轨迹的起始斜率由以下等式描述：
dn dt | t = 0 = k on C 0 n 0 .
由于konC0对于给定的纳米标签溶液是常数，起始斜率与生物素化连接子抗体密度n0直接成正比，而n0相应地与传感器表面上捕获的分析物密度直接成正比。因此，在某些实施方式中，除了使用来自磁性纳米传感器的电压信号以外，也可使用实时信号轨迹的起始斜率来对分析物浓度进行定量。此外，可推导出在任何时刻t时的实时信号轨迹的斜率如下：
dn dt | t = 0 = k on C 0 n 0 e - k on C 0 t .
因此，在适当时刻t时的斜率可用于对分析物进行定量，只要时刻t和常数konC0对于标准曲线和实际测试保持相同即可。
在某些情况下，磁测试中的磁性纳米颗粒可沉淀，尤其是在粒径大于约100nm时或该纳米颗粒的生物功能化不够坚固时。在这些情况下，纳米标签动力学可以描述如下：
n = n 0 ( 1 - e - k on C 0 t ) + k ns C 0 t .
其中kns是表征因沉淀造成的磁性纳米标签非特异性吸附的常数。在某些实施方式中，在沉淀纳米颗粒的存在下的读数可通过同时记录探针传感器(阳性传感器(positive sensor))和对照传感器(阴性传感器(negative sensor))的实时信号轨迹来获得。在这些情况下，阳性和阴性传感器配对(matched pair)的实时信号轨迹因纳米标签的沉淀而具有相似的线性斜率，该斜率基本等于常数knsC0。因此，通过以阳性传感器的实时信号轨迹减去匹配的阴性传感器的实时信号轨迹，可获得代表传感器表面上捕获的纳米标签密度(和由此代表的分析物密度)的特异性结合信号轨迹。
纳米颗粒的沉淀往往是由磁性纳米颗粒之间的吸引所引起的场造成的。在某些实施方式中，可通过改进的磁性纳米颗粒表面修饰或者通过在测试期间使用较小的场来避免纳米颗粒聚集以减少纳米颗粒的沉淀。如果纳米标签确实沉淀，它们易于因重力而沉降至流动通道的底部。因此，在某些实施方式中，将传感器定位于携带样品和纳米标签溶液的流通池或微流体通道的顶部可有助于减少因沉淀造成的非特异性信号。
在某些实施方式中，在磁性测试中使用间接标记法，即在用磁性纳米芯片温育分析物之后进行纳米标签标记。在其它实施方式中，可用直接标记法，其中将分析物首先用磁性纳米标签标记然后用带有固定捕获探针的磁性纳米芯片温育。间接标记法与直接标记法的一个方面在于，磁性纳米传感器的近感检测能力保持基本相同。在采用直接标记法的实施方式中，实时信号轨迹包括有关带有捕获探针的磁性纳米标签-分析物偶联物的结合动力学的信息。
复合样品的多重蛋白测试
本发明的各方面包括对复合样品中的所关注的蛋白、核酸和其它分析物的存在或不存在的多重检测。例如，“多重检测(multiplex detection)”是指对彼此不同且具有不同氨基酸序列的两种或更多种不同蛋白进行检测，例如，4种或更多种、6种或更多种、8种或更多种等、乃至20种或更多种(例如，50种或更多种，包括100种或更多种)的不同蛋白。同样地，在某些情况下，磁性传感器装置可以包括各自特异性地检测不同分析物的两个或更多个不同磁性传感器，如4个或更多个、6个或更多个、8个或更多个等、乃至20个或更多个(例如，50个或更多个，包括100个或更多个)不同磁性传感器。在某些实施方式中，所关注的是对2～20种不同蛋白(例如，4～20种不同蛋白)的多重检测。因此，在这些实施方式中，磁性传感器装置可包括各自特异性地检测不同分析物的2～20个不同磁性传感器，例如，4～20个不同磁性传感器。在其它情况下，磁性传感器装置可包括各自特异性地检测不同分析物的20个或更少个不同磁性传感器，例如，10个或更少个(包括4个或更少个)不同磁性传感器。
“复合样品(complex sample)”是指可能具有也可能没有所关注的蛋白但包括不受关注的许多不同蛋白和其它分子的样品。在某些实施方式中，复合样品是血液样品，其为血液或其部分(例如，血清)。在某些实施方式中，复合样品是血清样品。在某些实施方式中，在本发明方法中测试的复合样品是包括在分子结构方面彼此不同的10种或更多种[如20种或更多种，包括100种或更多种，例如103种或更多、104种或更多(如15,000种、20,000种、乃至25,000种或更多种))]的不同(即差异性)分子实体的样品。
系统
本发明的系统构造为实践分析物检测方法，并且包括磁性传感器装置和纳米标签。本发明方法中采用的磁性传感器装置和纳米标签可以是在任何数量的磁性检测系统中采用的那些，所述磁性检测系统包括基于以下检测器的那些：自旋阀检测器(spin value detector)(也称作自旋阀膜检测器)、磁性隧道结(magnetic tunnel junction，MTJ)检测器及美国专利申请序列号第10/829,505号(本文通过引用并入其公开内容)中所述的那些检测器。
在某些实施方式中，主体磁性传感器装置包括在基质表面显示磁性传感器的基质表面。在某些情况下，磁性传感器具有可吸附、物理吸附、化学吸附或共价连接于磁性传感器的分析物特异性探针。在某些实施方式中，磁性传感器装置包括带有磁性传感器阵列的基质表面。
任何给定基质可携带设置于基质前表面上的1个、2个、4个或更多个阵列。根据用途，任何或所有阵列可彼此相同或不同并且可包括多个不同磁性传感器。阵列可包括1个或更多个、包括2个或更多个、4个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、乃至100个或更多个磁性传感器。例如，可将64个磁性传感器安置于8×8阵列内。在某些实施方式中，可将磁性传感器安置于面积小于10cm2、甚至小于5cm2(例如，小于1cm2)、包括小于约50cm2、小于约20cm2(例如小于约10cm2)或更小的阵列内。例如，磁性传感器的尺寸可为约10μm×10μm～约200μm×200μm，包括约100μm×100μm或更小，例如，约90μm×90μm或更小(例如，50μm×50μm或更小)。
在某些实施方式中，磁性传感器可包括串联的多个线性磁阻片段。例如，磁性传感器可包括4个或更多个、如8个或更多个、包括16个或更多个、如32个或更多个(例如，64个或更多个)、或者128个或更多个线性磁阻片段。磁阻片段的宽度可为约5μm或更小，例如，约3μm或更小、包括约1.5μm或更小。
在某些实施方式中，至少某些或全部的磁性传感器(magnetic sensor)在其表面具有不同的分析物特异性探针，从而每个显示分析物特异性探针的磁性传感器各自特异性地检测不同分析物。磁性传感器之间可存在不带任何分析物特异性探针的区域。这类传感器间区域当存在时能具有各种尺寸和设置。
在某些实施方式中，通常将携带一个或更多个阵列的基质成形为矩形固体(但也可有其它形状)，其长度为大于4mm且小于150mm，例如，大于4mm且小于80mm，如小于20mm；宽度为大于4mm且小于150mm，例如，小于80mm，包括小于20mm；且厚度为大于0.01mm且小于5.0mm，例如，大于0.1mm且小于2mm，包括大于0.2mm且小于1.5mm，如大于约0.8mm且小于约1.2mm。
纳米颗粒
可用于实践本发明实施方式的纳米颗粒是磁性(例如，铁磁性)胶体材料和颗粒。磁性纳米颗粒可以是尺寸较小的以便成为超顺磁性的高磁矩磁性纳米颗粒，或者是含有至少两层经反铁磁性耦合的高磁矩铁磁体的合成反铁磁性纳米颗粒。两类纳米颗粒在不存在磁场时均呈现“非磁性”，并且一般不会聚集。根据本发明，适合使用的可磁化纳米颗粒包括一种或多种的选自顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料和亚铁磁性材料及其组合的材料。
在某些实施方式中，磁性纳米颗粒拥有以下性质：(1)其剩余磁化尽可能小从而使其不会在溶液中聚集(超顺磁性颗粒或反铁磁性颗粒都能满足此要求)；(2)在约100Oe的中强磁场下显示出高磁矩的标签以使其能被容易地检测；(3)标签的尺寸与靶标生物分子相当从而使其不会干扰结合相互作用；(4)标签在生物环境中是均匀且化学稳定的；和/或(5)标签是生物相容性的(即水溶性的)且经功能化以使其易于连接到所关注的生物分子(例如，与靶标分析物特异性结合的受体)上。
在某些实施方式中，纳米颗粒是高磁矩磁性纳米颗粒，例如，在室温为超顺磁性的Co、Fe或CoFe纳米晶体。它们可通过诸如但不限于在适当溶液中的盐还原或化合物分解的化学途径来制造。这类磁性纳米颗粒的实例已发表于文献中(S.Sun和C.B.Murray，J.Appl.Phys.，85：4325(1999)；C.B.Murray等，MRS Bulletin，26：985(2001)；S.Sun，H.Zeng，D.B.Robinson，S.Raoux，P.M.Rice，S.X.Wang和G.Li，J.Am.Chem.Soc，126，273-279(2004))。在某些实施方式中，可制备具有受控尺寸(例如，约5nm～12nm)的这些颗粒，并将其单分散并用油酸稳定。适用于本发明的磁性纳米颗粒和纳米粉末包括但不限于Co、Co合金、铁素体、氮化钴、氧化钴、Co-Pd、Co-Pt、铁、铁合金、Fe-Au、Fe-Cr、Fe-N、Fe3O4、Fe-Pd、Fe-Pt、Fe-Zr-Nb-B、Mn-N、Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni和Ni合金。在其它实施方式中，可在磁性芯体上镀上金薄层，或可将经聚L-赖氨酸涂布的玻璃表面附着于磁性芯体。合适的纳米颗粒可以商购自例如Nanoprobes，Inc.(Northbrook，IL)和Reade Advanced Materials(Providence，RI)。
在某些情况下，通过物理方法(W.Hu，R.J.Wilson，A.Koh，A.Fu，A.Z.Faranesh，CM.Earhart，S.J.Osterfeld，S.-J.Han，L.Xu，S.Guccione，R.Sinclair和S.X.Wang，Advanced Materials，20，1479-1483(2008))而非化学途径来制造磁性纳米颗粒标签，且其适于标记待检测的靶标生物分子。所述标签包括至少两层铁磁性薄层，优选为FexCoi-x(其中x为0.5～0.7)或基于FexCo1-x的合金。FexCo1-x在已知的铁磁性材料当中具有最高的饱和磁化(约24.5千高斯)(R.M.Bozorth，Ferromagnetism，D.Van NostrandCompany(1951)。这些铁磁层由如Ru、Cr、Au等或其合金的非磁性间隔层分隔开。在某些情况下，间隔层被适当地设计以使铁磁层反铁磁性地耦合从而使所得颗粒的净剩余磁化为零或接近于零。在某些实施方式中，可通过RKKY交换相互作用(参见例如，S.S.P.Parkin等，Phys.Rev.Lett.，64(19)：2304(1990))和静磁相互作用(J.C.Slonczewski等，IEEE Trans.Magn.，24(3)：2045(1988))来实现反铁磁性耦合。在某些情况下，反铁磁性耦合的强度为中等以使颗粒能被约100Oe的外部磁场饱和(即，所有层的磁化变得平行)。在某些情况下，这可通过调节层厚度和通过使间隔层合金化来实现。
在特定实施方式中，为有助于纳米颗粒的生物偶联，将金帽(或功能上类似或等价的材料的帽)添加于反铁磁性堆叠物(stack)顶部从而可通过金-硫键使纳米颗粒与生物分子偶联。此外，还可将适当的表面活性剂容易地赋予纳米颗粒从而使其可溶于水。还可以用Au或其它惰性薄层使纳米颗粒的边缘钝化以获得化学稳定性。
可采用任何常规方案来制造上述纳米颗粒。例如，在某些实施方式中，堆叠膜(film stack)可由沉积于超光滑基质(或释放层)上的纳米级铁磁层和间隔层构成。在某些情况下，可通过印记、蚀刻、自组装等来形成掩膜层。随后，将掩膜层和不需要的堆叠膜除去并彻底洗掉。然后将释放层除去，揭起作为掩膜的负像的纳米颗粒。最后对这些颗粒赋予表面活性剂和生物分子。在某些情形中，超光滑基质可在彻底清洗和化学机械抛光(CMP)后再度使用。
在其它实施方式中，用消减制造法来制造纳米颗粒。在该情形中，将堆叠膜和掩膜层先后直接沉积于释放层上。透过掩膜层将堆叠膜蚀刻并最终从基质释放。与添加制造法中的情形相反，这些纳米颗粒从掩膜层的正像产生。
在某些实施方式中，适用于本发明的磁性纳米颗粒的尺寸与待操作的靶标生物分子的尺寸相当，从而使纳米颗粒不会干扰如DNA杂交等生物过程。结果，在某些实施方式中，磁性纳米颗粒的尺寸为约5nm～约250nm(平均直径)，例如约5nm～约150nm，包括约5nm～约20nm。例如，平均直径为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm和150nm的磁性纳米颗粒以及平均直径在上述值的任意两个之间的纳米颗粒适用于本发明。此外，除球形以外，适用于本发明的磁性纳米颗粒可为盘形、杆形、螺旋形或纤维形。
在某些实施方式中，合成的反铁磁性纳米颗粒可大于普通铁磁性纳米颗粒。这是由于为防止团集(clumping)，纳米颗粒必须在零外加场中没有任何净磁矩(或具有极小磁矩)。反铁磁性颗粒必须在任何尺寸下在零磁场中都具有零磁矩。相反，对于铁磁性颗粒，其尺寸可以低于“超顺磁性极值”，在某些情况下为约20nm以下，例如约15nm以下，包括约10nm以下。
在某些实施方式中，可使用大型晶片和标准真空薄膜沉积法来大量制备上述合成纳米颗粒。例如，假设每个颗粒占据晶片上60nm×60nm的正方形，使用6英寸圆晶片可以以约5×1012颗粒/轮的速度制备直径30nm的纳米颗粒。
高灵敏度自旋阀检测器
自旋阀检测器是由如铜等非磁性层间隔开的两层铁磁层的金属多层薄膜结构。被称为扎层(pinned layer)的一层铁磁层的磁化被固定于特定方向上，而被称为自由层(free layer)的另一层铁磁层的磁化能在外加磁场下自由旋转。自旋阀的电阻取决于自由层磁化相对于扎层磁化的取向。当两种磁化平行时，电阻最低；当其反平行(antiparallel)时，电阻最高。电阻的相对变化称为磁电阻(magnetoresistancem，MR)比。在某些情况下，自旋阀的MR比在小磁场(例如，100Oe)中能达到高于约10％。因此，自旋阀能充当用于对与作为标记的DNA片段相连并固定于传感器表面上的小磁性颗粒进行检测的传感元件。由于所述颗粒是磁性的(在DC偏压场或AC反馈场(tickling field)下)，其会产生磁场。然后该磁场可影响自由层磁化的取向，从而导致自旋阀电阻的变化。
在某些实施方式中，自旋阀检测器的操作描述如下：1)DC偏压场(Hb)下的磁性纳米颗粒在其周围产生磁场。2)该磁场会影响紧靠其下方的自旋阀的电阻。3)施加AC反馈场(Ht)将会迫使颗粒的磁矩振荡，从而产生来自自旋阀的振荡MR信号。在某些实施方式中，在面内模式中，因磁性纳米颗粒产生的自旋阀检测器信号具有与AC反馈场Ht相同的频率f，而在垂直模式中该信号具有Ht频率的两倍频率。4)使用锁定放大器或频谱分析仪来选取具有高信噪比的振荡信号。
在某些实施方式中，自旋阀的磁电阻(MR)比为约1％～约20％，例如约3％～约15％，包括约5％～约12％。因此，在某些实施方式中，自旋阀能在狭窄带宽(即约1Hz或更低)中或利用锁定检测来检测尺寸为约10nm的单个磁性纳米颗粒。在这些情况下，通过缩窄噪声带宽，即使对于单个纳米颗粒检测也能获得足够的信噪比(SNR)。
自旋阀检测可采用面内模式进行(参见例如，Li等，J.Appl.Phys.Vol.93(10)：7557(2003))。在其它实施方式中，当因检测系统中的AC反馈场而产生的电磁干扰(EMI)信号显著时，可使用垂直模式，尽管垂直模式会给出稍小的信号幅度。EMI信号易于处在AC反馈场的频率f的中心，因此如果通过于频率2f进行锁定检测则可将其消除或极大地减少。此外，在某些情况下，可使用二桥电路来消除任何剩余EMI。甚至已经发表了更复杂的采用AC调制传感电路和于两个不同频率的AC反馈场的信号采集和处理方法(例如，S-J Han，H.Yu，B.Murmann，N.Pourmand和S.X.Wang，IEEE International Solid-State Circuits Conference(ISSCC)Dig.Tech.Papers，San Francisco Marriott，CA，USA，2007年2月11日～15日)。
在某些实施方式中，除自旋阀自身的几何形状和偏压场以外，因磁性标签而产生的来自自旋阀检测器的信号还取决于磁性标签和自旋阀自由层之间的距离。随着从颗粒中心至自旋阀自由层中间平面的距离增加，来自单个磁性颗粒的检测器电压信号减小。
在某些实施方式中，自旋阀中的自由层处在扎层顶部以便协助检测磁性纳米颗粒，这是因为来自磁性颗粒的传感磁场随传感器与颗粒之间的距离而单调地下降。此外，对磁性颗粒与自由层顶表面之间的距离(包括保护自旋阀的钝化层的厚度)的最小化有助于磁性颗粒的检测。
在某些情况下，在检测器测试的操作期间，DNA(或蛋白)溶液流经传感器表面上以使得所关注的分析物可与传感器上的相应捕获试剂进行亲和性结合。因此，传感器表面的腐蚀是一个顾虑，因为检测器表面的降解可通过减少来自生物结合事件的信号或通过降解检测器自身而降低灵敏度。
在某些实施方式中，为减少传感器表面的腐蚀，磁性检测方案可包括向检测器表面添加相对厚的钝化层。在保持高灵敏度和充分保护以对抗降解之间存在折衷。因此，在某些实施方式中，检测器将超薄(即约10nm或更薄)钝化层与极小的磁性纳米颗粒标签(即，其平均直径为约20nm或更小)结合，由此获得小于约30nm的颗粒中心至检测器的距离(包括约10nm的介入DNA片段长度)，该距离对于提供单个标签检测所必需的灵敏度来书已足够近。在某些实施方式中，适用于本发明公开的检测器的超薄钝化层(例如，Ta、Au或氧化物)的厚度可为约1nm～约10nm，例如约1nm～约5nm，包括约1nm～约3nm。在某些实施方式中，适用于本发明公开的检测器的超薄钝化层(例如，Ta、Au或氧化物)的厚度可以为约10nm～约50nm，例如约20nm～约40nm，包括约25nm～约35nm。
高灵敏度磁性隧道结(MTJ)检测器
MTJ检测器的构造与自旋阀检测器相似，不同之处在于用诸如氧化铝或MgO的薄绝缘通道屏障(insulating tunnel barrier)来替代非磁性间隔体，且传感电流垂直于膜平面流动。两个铁磁性电极之间的电子穿透(electron tunneling)通过两个铁磁性电极的相对磁化进行控制，即，穿透电流(tunneling current)在两个电极平行时较高，而在两者反平行时较低。在某些实施方式中，MTJ检测器由底部电极、包括通道屏障的磁性多层和顶部电极构成。在某些情况下，MTJ检测器具有超过200％的磁电阻比(S.Ikeda，J.Hayakawa，Y.M.Lee，F.Matsukura，Y.Ohno，T.Hanyu和H.Ohno，IEEE TRANSACTIONS ON ELECTRON DEVICES，第54卷，第5期，991-1001(2007))和固有较大装置电阻，从而产生较高的输出电压信号。
在某些实施方式中，MTJ检测器具有双层顶部电极。第一层可以是有助于结合DNA或蛋白捕获探针的金薄层(约10nm以下)。第二层可以是不与生物分子探针结合的铝、铜或其它导电金属，包括但不限于钯、钯合金、钯氧化物、铂、铂合金、铂氧化物、钌、钌合金、钌氧化物、银、银合金、银氧化物、锡、锡合金、锡氧化物、钛、钛合金、钛氧化物及其组合。在某些情况下，通过剥离(lift-off)法或通过蚀刻均匀的第二层来在第二层中创建尺寸稍小于MTJ的孔隙。在这些实施方式中，纳米颗粒标签与自由磁性层的顶部表面之间的距离可为约6nm～约100nm，例如约6nm～约40nm，包括约6nm～约30nm(例如，约6nm～约20nm，包括约6nm～约10nm)。此外，这一设置可有助于减少或避免顶部电阻内的电流拥挤(current crowding)(参见例如，van de Veerdonk，R.J.M.等，Appl.Phys.Lett.，71：2839(1997))，除非使用非常薄的金电极否则就可能发生上述电流拥挤。除了传感电流垂直于膜平面流动之外，MTJ检测器可与自旋阀检测器相似地以面内模式或垂直模式进行运作。如上文有关自旋阀检测器的讨论那样，在某些实施方式中，可将垂直模式用于EMI排斥，而类似地，也可以对MTJ检测器应用超薄钝化。另外，MTJ检测器上的第一顶部薄金电极还能适合导电、超薄钝化及特异性生物分子探针连接的三重目的。
在某些实施方式中，于相同的检测器宽度和颗粒-检测器距离，MTJ检测器可给出比自旋阀检测器更大的信号。例如，对于运行于在250mV偏压下MR为250％且Hb＝35Oe和Ht＝100Oe rms的具有0.2μm×0.2μm的结面积(junction area)和1kOhm-μm2的电阻-面积乘积的MTJ检测器，来自其中心与自由层中间平面相距35nm的单个直径11nm的Co纳米颗粒的电压信号约为200μV，这在某些情况下比相似尺寸的自旋阀检测器的信号高出超过一个数量级。
实用性
本发明的方法、系统和试剂盒可用于其中需要确定样品中一种或多种分析物的存在或不存在和/或对其进行定量的各种不同应用中。在某些实施方式中，所述方法针对检测样品中的一组生物标记物，例如，2种或更多种的不同蛋白生物标记物。例如，可将本发明的方法用于血清样品中的2种或更多种疾病生物标记物的快速临床检测中，例如，可将其用于诊断受试对象的疾病状况、用于正在进行的对受试对象的疾病状况的管理或治疗等。
在某些实施方式中，本发明的方法、系统和试剂盒可用于检测生物标记物。在某些情况下，本发明的方法、系统和试剂盒可用于检测特定生物标记物的存在或不存在以及特定生物标记物在血液、血浆、血清或其它体液或分泌物中的浓度的增加或减小，所述其它体液或分泌物诸如但不限于唾液、尿液、脑脊液、泪液、汗液、胃肠道液、羊膜液、粘膜液、胸膜液、皮脂腺油和呼出气等。
生物标记物的存在或不存在或生物标记物的浓度的显著变化可用于诊断疾病风险、个体中疾病的存在或者为个体的疾病设计治疗。例如，特定生物标记物或生物标记物组的存在可影响给予个体的药物治疗或施用方案的选择。在评价潜在药物疗法时，可使用生物标记物作为自然终点(例如，存活或不可逆地发病)的替代物。如果治疗改变了与改善的健康直接关联的生物标记物，则该生物标记物可充当用于评估特定治疗或施用方案的临床益处的替代物。因此，本发明的方法和系统有助于基于在个体中检测到的特定生物标记或生物标记组进行个性化诊断和治疗。此外，本发明的方法和系统的皮摩尔(picomolar)和/或飞摩尔(femtomolar)灵敏度有助于与疾病相关的生物标记物的早期检测。由于能够检测单个芯片上的多个生物标记物及其灵敏度、可扩展性和使用容易性，本发明公开的测试方法和系统可用于便携的和医护现场或病人身边的多重分子诊断。在某些实施方式中，本发明的方法、系统和试剂盒可用于检测疾病或疾病状态的生物标记物。在某些情况下，所述疾病是细胞增殖性疾病，诸如但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤或癌性瘤等。因此，本发明的方法、系统和试剂盒可用于检测如细胞增殖性疾病等疾病(例如，诸如但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤或癌性瘤等)的存在。在某些情形中，用于检测癌症或细胞增殖性疾病的指示物的具体的所关注的生物标记物包括但不限于以下物质：C-反应蛋白，其是炎症的指示物；促进细胞周期和凋亡控制的转录因子，如p53；多胺浓缩物，其是光化性角化病和鳞状细胞癌的指示物；增殖性细胞核抗原(PCNA)，其是在处于增殖性生长期内的细胞核中表达的与细胞周期相关的蛋白；生长因子，如IGF-I；生长因子结合蛋白，如IGFBP-3；微-RNA，其是调节基因表达的长度为约21～23个核苷酸的单链RNA分子；糖抗原CA19.9，其是胰腺癌和结肠癌生物标记物；前列腺特异性抗原，其是前列腺癌生物标记物；细胞周期蛋白依赖性激酶；上皮生长因子(EGF)；血管内皮生长因子(VEGF)；蛋白酪氨酸激酶；雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的过表达；等等。
在某些实施方式中，本发明的方法、系统和试剂盒可用于检测传染病或疾病状态的生物标记物。在某些情况下，所述生物标记物可以是分子标记物，诸如但不限于蛋白、核酸、糖和小分子等。可由本发明的方法、系统和试剂盒检测的具体疾病或疾病状态包括但不限于细菌感染、病毒感染、基因表达的增加或减少、以及染色体异常(例如，缺失或插入)等。例如，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测胃肠道感染，诸如但不限于无菌性脑膜炎、肉毒中毒、霍乱、大肠杆菌感染、手足口病、螺旋菌感染、出血性结膜炎、疱疹性咽峡炎、心肌炎、副伤寒、脊髓灰质炎、细菌性痢疾、伤寒、弧菌性败血症和病毒性腹泻等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测呼吸道感染，诸如但不限于腺病毒感染、非典型肺炎、禽流感、鼠疫、白喉、流感、麻疹、流行性脑脊髓膜炎、腮腺炎、副流感、百日咳、肺炎、肺鼠疫、呼吸道合胞病毒感染、风疹、猩红热、败血症性鼠疫、严重急性呼吸综合征(SARS)和结核等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测神经系统疾病，诸如但不限于克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、牛海绵状脑病(即疯牛病)、帕金森病、阿尔茨海默病和狂犬病等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测泌尿生殖系统疾病，诸如但不限于AIDS、软下疳、尖锐湿疣、生殖器疱疹，淋病、性病性淋巴肉芽肿、非淋菌性尿道炎和梅毒等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测病毒性肝炎疾病，诸如但不限于甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测出血热疾病，诸如但不限于埃博拉出血热、肾综合征出血热(HFRS)、拉沙出血热和马尔堡出血热等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测人畜共患疾病，诸如但不限于炭疽、禽流感、布鲁氏菌病、克雅氏病、牛海绵状脑病(即疯牛病)、肠病原性大肠杆菌感染、日本脑炎、钩端螺旋体病、Q热、狂犬病和严重急性呼吸综合征(SARS)等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测虫媒病毒感染，诸如但不限于登革出血热、日本脑炎、蜱传播脑炎、西尼罗热和黄热病等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测耐抗生素感染，诸如但不限于鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、肠球菌属、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等。另外，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测媒介传播感染，诸如但不限于猫抓病、地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、人艾利希氏体病、日本斑疹热、虱传回归热、莱姆病、疟疾、战壕热和恙虫病等。
类似地，可将本发明的方法、系统和试剂盒用于检测心血管疾病、中枢神经系统疾病、肾衰竭、糖尿病、自身免疫疾病和许多其它疾病。
试剂盒
本发明还提供了用于实践上述方法的一个或多个实施方式的试剂盒。本发明的试剂盒可能变化极大，并且可包括各种装置和试剂。所关注的试剂和装置包括本文所述的那些与磁性传感器装置、磁性纳米颗粒、结合剂和缓冲剂等有关的试剂和装置。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒包括磁性传感器装置和磁性标记。在这些实施方式中，磁性传感器装置包括显示分析物特异性探针的磁性传感器(analyte specific proe displaying magnetic sensor)和处理器，所述磁性传感器显示了与其表面上的分析物特异性地结合的探针，所述处理器构造为从磁性传感器获取实时信号以确定样品中是否存在该分析物。在某些实施方式中，磁性传感器包括超薄钝化层，而在某些情形中，该钝化层的厚度为约40μm或更小，例如约30μm或更小，包括约20μm或更小。在本发明试剂盒的另外的实施方式中，传感器为自旋阀传感器，而在本发明试剂盒的其它实施方式中，传感器为磁性隧道结传感器(magnetic tunnel junction sensor。在某些情况下，本发明试剂盒的磁性标记是磁性纳米标签。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒包括磁性传感器装置，该磁性传感器装置包括各自特异性地检测不同分析物的两个或更多个不同磁性传感器，例如，4个或更多个、6个或更多个、8个或更多个等、乃至20个或更多个(例如，50个或更多个，包括100个或更多个)的不同磁性传感器。因此，本发明的试剂盒可用于复合样品中的蛋白、核酸或其它所关注的分析物的存在或不存在的多重检测和/或定量。
除上述成分以外，本发明的试剂盒还可包括用于实践本发明方法的使用说明。这些使用说明可以以多种形式存在于本发明的试剂盒中，其中的一个或更多个可存在于试剂盒中。这些使用说明可以以之存在的一种形式是作为试剂盒包装中、包装添入物中等的打印于合适介质或基质上的信息(例如，其上打印有信息的一页或多页纸)。另一种方式可以是其上已记录有信息的计算机可读介质(例如，磁盘、CD等)。再一种可以以之存在的方式是可用来通过互联网获取远程站点信息的网址。任何方便的方式均可存在于试剂盒中。
通过说明性而非限制性方式提供以下实施例。
实验
I.方法
A.芯片制造——在带有150μm热氧化物的硅晶片上，通过粒子刻蚀(ion milling)将具有类似于硬盘驱动器读取头的层序列的自旋阀膜图案化于各个传感器中(S.X.Wang和G.Li，IEEE Trans.Magn.，vol.44，no.7，1687-1702(2008))，所述传感器各由串联的32个1.5μm×100μm且排列为覆盖100μm2×100μm2区域的线性部分构成(见图4)。每个传感器具有40kω的标称电阻和12％的最大磁电阻。将耐腐蚀引线(Ta 5/Au 300/Ta 5)nm溅射沉积并通过提离而图案化。如文献中所建议(Schmitt，G.等，Passivation and corrosion of microelectrode arrays.Electrochim Acta 44，3865-3883(1999))，用通过离子束溅射沉积在室温沉积的三层氧化物(SiO210/Si3N410/SiO210nm)使传感器钝化。用额外的三层氧化物(SiO2100/Si3N4100/SiO2100nm)使引线钝化。用双组份环氧树脂(EP5340，Eager Plastics，Chicago，IL)将芯片和试剂池(
Figure GPA00001139613200221
管，1/4″ID×3/8″OD，长6mm)组装于陶瓷84针芯片载器上(LCC08423，SpectrumSemiconductor Materials，San Jose，CA)。使用约0.5mm的相同环氧树脂层来掩蔽某些传感器(见图4)，从而创建两个相邻但却分离的位点以用于后续生物功能化。被掩蔽的传感器不再能检测纳米标签结合并充当电信号参照(参见下文G部分)。
B.表面准备——将组装后的芯片用丙酮、甲醇、异丙醇和去离子水彻底洗涤。使用10分钟紫外臭氧处理(42型UVO清洁器，Jelight，Irvine，CA)来除去有机残留物。为形成生物功能化的基层，将聚乙烯亚胺(PEI，CAS 9002-98-6，Sigma-Aldrich)的2％去离子水溶液应用于芯片表面2分钟。然后用去离子水清洗芯片并在150℃烘烤5分钟以使吸附的PEI固化。
C.多重蛋白测试——将含有浓度为500μg/mL的抗体(抗IL-10、抗IL-1α、抗TNF-α和抗VEGF)的至多4个不同探针以1μL液滴的形式手动沉积于芯片的不同区域上以使传感器阵列功能化。用1μL的BSA 100mg/mL液滴将其它对照传感器功能化。将传感器功能化体在4℃和95％的相对湿度温育30分钟。然后用封闭缓冲液(1％BSA，0.2％Tween 20，PBS中)将芯片清洗两次以封闭任何剩余非特异性表面相结合位点。通过将蛋白分析物(TNF-α，17.5kDa；IL-10，18.5kDa；IL-1α，18kDa)在PBS缓冲液或50％人血清(其余为PBS)中稀释至所需浓度来制备样品。将100μL样品溶液移取至芯片的试剂池内并在室温温育1小时。随后，将芯片用封闭缓冲液(0.1％BSA，0.2％Tween 20，PBS中)清洗两次。制备由浓度为在PBS中2μg/mL的4种生物素化抗体组成的多重连接子抗体溶液，所述4种抗体各针对一种潜在分析物。将100μL连接子抗体溶液在芯片的试剂池中于室温温育1小时。然后在连接子溶液还在原位时，将芯片转移至测定站点以进行基于MNT的分析物定量。
D.hCG测试——用单一捕获探针(1mg/mL的抗人hCG)将所有芯片均匀功能化，在4℃温育过夜，然后用封闭缓冲液清洗两次。用hCG突加至2.5IU/L、25IU/L、250IU/L和2,500IU/L的纯血清样品由美国国家癌症研究所提供并用PBS缓冲液进行1∶1稀释。分析物温育时间为1小时，而连接子抗体(在PBS中5μg/mL)温育90分钟。然后在连接子溶液还在原位时，将芯片转移至测定站点以进行基于MNT的分析物定量。使用1IU/L＝1.9pM来转化用PBS稀释后的hCG浓度(Birken，S.等，Preparation and characterization of new WHO Reference Reagents forhuman chorionic gonadotropin and metabolites.Clin.Chem.49，144-154(2003)；Sturgeon，C.M.&Ellis，A.R.Standardization of FSH，LH and hCG-Current position and future prospects.Mol.Cell.Endocrinol.260，301-309(2007))。
E.基于MNT的分析物定量——为除去连接子抗体溶液并确认信号基线的稳定性，用无MNT的PBS缓冲液将芯片清洗数次。尽管相关的湿性/干性转移的确偶尔使基线略有偏移，但这些偏移是可逆的，并且与所关注的信号相比其通常是可忽略的。将与无MNT缓冲液接触的绝对信号水平取为0。然后将无MNT缓冲溶液从池中吸出并代以50μL的经链霉素抗生物素蛋白涂布的MNT储备溶液(MACS 130-048-102，MiltenyiBiotec)。不进行搅拌而将纳米标签溶液在接下来的20分钟于室温温育。将该20分钟纳米标签温育时间结束时的信号水平取作测试的最终结果。
F.可选的纳米标签放大——在初始20分钟MNT温育期结束时，将池用PBS清洗5次，然后再加入50μL生物素化连接子抗体溶液。将该溶液温育5分钟，从而将生物素化抗体与已被吸附的MNT相连。由于这些连接子抗体可以具有多个生物素位点，因而如此在现有MNT上创建了对于额外MNT的新结合位点。5分钟后，将溶液吸出，用PBS清洗池5次，添加50μLMNT储备溶液，从而导致额外的MNT结合信号的产生。每次重复将使信号水平放大约2×的因子。
G.电子学——将500Hz的7μArms交流电施加于每个传感器。将208Hz的80Oerms交变面内反馈场垂直施加于传感器片段以建立磁信号基线，该基线在任何纳米标签附近受到最小扰动。基线信号的该扰动是本文中的净信号。此外，将50Oe的稳定偏压场沿传感器片段的纵向方向施加以促使传感器的磁畴响应于208Hz的反馈场而相干(低噪声)转动。通过对每2秒穿过每个传感器一次的电压进行快速傅里叶变换和记录(调幅产生的)708Hz频谱组分的幅度来测定信号水平，这在本设定中主要是测定传感器的临近区域内的交变磁反馈场强度。为减少共模和传感器漂移，将每个功能化传感器差异性地针对参比传感器(即针对覆盖有厚度足以主动避免任何MNT检测的环氧树脂层的传感器)进行测定。该测量设定的其它细节在其它文献中进行了描述(Han，S.J.，Xu，L.，Wilson，R.J.&Wang，S.X.A novel zero-drift detection method for highly sensitiveGMR biochips.IEEE Trans.Magn.42，3560-3562(2006))。
II.结果和讨论
在某些实施方式中，基于磁性纳米标签(MNT)的生物分子测试能够进行涉及血清样品的快速和灵敏的多重蛋白检测。
微米尺寸的标记可缓慢扩散、易于受到磁性相互作用并随后沉淀并且相对于纳米尺寸的分析物分子而言体积较大。相反，在某些实施方式中，可使用纳米尺寸的MNT，如具有极小磁场特征但展现出长期悬浮稳定性和优异的结合选择性的商购50nm MACS MNT。在某些情形中，为提高测试的灵敏度，可将SV传感器的钝化减薄至约30nm以下。所得的灵敏度使得能够可靠地检测如来自MACS MNT的微小磁场特征，条件是其处在传感器的附近。通过将小磁矩MNT与非常灵敏的近感检测组合，本文公开的传感器主要检测与传感器表面相结合的MNT。如果未结合的MNT在悬浮液中稳定，则这些外来的未结合MNT所贡献的信号可被忽略，且可省略通常作为除去产生信号的未结合标记所必需的洗涤步骤。在实际中，这种对未结合标记的抑制意味着可实时观测到当前结合的纳米标签的真实量，且负对照传感器在纳米标签应用和除去期间不经历任何信号偏移。因此，在某些实施方式中，提供了简单的不带洗涤步骤的一步均相测试，其可用于临床应用中。
还提供了用于通过对癌症相关细胞因子进行定量的早期癌症检测的方法。基于MNT的蛋白测试中的待检测分析物包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素1α(IL-1α)。图1显示了其中将分析物捕获于传感器表面上并用经链霉素抗生物素蛋白涂布的MNT对其进行定量的检测方案的示意图。用对所选分析物特异性的捕获抗体对探针传感器进行功能化，而用10重量％BSA溶液封闭对照传感器(图1a)。在分析物温育期间，探针传感器捕获了一部分分析物分子(图1b)。随后将生物素化连接子抗体温育，其与捕获的分析物结合(图1c)并且为经链霉素抗生物素蛋白涂布的磁性纳米标签提供结合位点。然后将经链霉素抗生物素蛋白涂布的磁性纳米标签温育(图1d)，并将在分析物浓度依赖性水平饱和的纳米标签结合信号用于对分析物浓度进行定量。
在某些情况下，分析物和连接子抗体温育时间(图1b、1c)为1小时或更少，而基于MNT的定量(图1d)需要少于15分钟。在某些实施方式中，总测试时间可被降低至少于30分钟(例如，通过在微流体通道内进行分析物温育)，由此所述方法可适用于在医师办公实验室或医护地点的应用。在某些情况下，MNT检测方案可在具有64SV传感器阵列和置于其上方的200μL反应池的芯片上进行(见图4)，从而可容易地加入和吸出试剂。在某些情况下，电子仪器能够实时记录和显示16个传感器信号/芯片，刷新率为0.5Hz/传感器。在某些情况下，将16个所测定的传感器中的2个用环氧树脂覆盖并用于记录电参比信号，从而可将每个芯片上的14个传感器用于记录测试信号。
来自采用多个探针的基于MNT的免疫测试的实际结合曲线(信号对时间)数据显示于图2中。所示为平均信号±1S.D.(标准偏差)。时间t＝0限定了测试的最终步骤中的MNT纳米标签的应用时刻。从t＝0开始，信号上升实时反映MNT与SV传感器表面的结合。作为此处所用的间接标记方法的结果，实时数据包括有关MNT结合动力学而不是分析物结合动力学的信息，但MNT结合曲线的饱和水平被当作对传感器表面上的结合位点的丰度的直接量度，后者反过来由此前应用的分析物的浓度确定。除分析物定量以外，实时MNT结合曲线还被用于鉴定和消除误差源，这是因为它们有助于对正确的(即，连续的、稳定的、饱和的)和不正确的(即，不连续的、噪声大的、漂移的)传感器操作进行区分。例如，在某些情况下，尽管溶液中有过量的纳米标签，信号仍快速稳定，这表明在不存在合适的结合位点时，纳米标签不会自发沉淀或结合。这有助于进行准确的分析物定量。MNT结合曲线还给出达到信号饱和(即MNT结合平衡)所需时间。在某些实施方式中，报告了时间t＝15分钟时的净信号增益以与不同的测试运行进行比较，但在可利用的MNT结合位点极少时(即由于分析物浓度较低)，MNT定量可在少至60秒内达到平衡。
这种快速MNT定量的实例可见于图2a中。在该实验中(图2a)，将芯片上的14个传感器进行如下功能化：4个传感器抗IL-1α、8个传感器抗TNF-α和2个传感器BSA。然后将由PBS中的5.6pM IL-1α和0.6pMTNF-α组成的样品温育1小时。所得结合信号在应用MNT后约1分钟趋于平稳，且TNF-α(8个传感器)的1.9μV信号和IL-1α(4个传感器)的4.1μV信号的水平明显更大，并且不同于BSA功能化的对照传感器上的0.6μV的非特异性信号。
在另一个实验中(图2b)，将芯片类似地功能化：5个传感器抗TNF-α、2个传感器抗IL-1α和2个传感器BSA。然而，在该实验中，样品由50％血清(其余为PBS)中的5.7pM TNF-α组成。用BSA封闭的传感器和IL-1α传感器均为负对照。所得平均信号在约2分钟后于3.2μV饱和。由用BSA封闭的传感器和IL-1α传感器两者组成的负对照显示出0.1μV(范围为+0.3μV～-0.3μV)的平均值，这指示出在该浓度下平均32∶1的信号与背景比。
为了确定在分析物浓度变化较大时50％血清中的分析物的信号对浓度换算关系，进行了一系列基于MNT的免疫测试以检测突加至50％血清中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。在该实验中，用抗hCG对5个芯片进行功能化，然后使其暴露于50％血清中不同浓度的hCG中。对每个芯片测定14个传感器(见图2c)。在此情形中，将hCG选作模型分析物，这是由于参照hCG样品、高品质抗体和相当的市售hCG测试可以容易地获得。结果显示于图2c中。最低hCG浓度(50％血清中2.4pM)产生了13.6μV的14-传感器中值信号(最大值＝27μV，最小值＝8.2μV，SD＝4.6μV)。另外，hCG浓度的每增加10倍，信号大致翻倍。结果显示出在低至血清基线水平(约1pM)的至少4个数量级上的hCG浓度检测。
在无分析物的PBS中进行相同测试和标记放大(参见图2b对照测试)显示，对照信号为约2.5μVrms～约3.5μVrms，这明显低于对于血清中的1pM hCG所预期的信号。将该缩放趋势向下外推至背景水平表明，基于MNT的测试可检测血清中约10飞摩尔浓度的hCG，这比市售ELISA试剂盒(即，其灵敏度为约4pM)更灵敏。在某些实施方式中，通过原位纳米标签放大而进行两层以上纳米标签(例如，3层纳米标签)的连续吸附可获得更高的信号水平。纳米标签放大均匀地提高包括对照信号的所有信号水平，由此纳米标签放大有助于检测初始过低而不能被准确定量的信号。在某些情况下，通过纳米标签放大，相对信号对浓度的换算关系保持不变。
图3显示在单个芯片上进行的多分析物多探针测试的结果。在该实验中，对芯片的4个区域进行功能化，每个区域使用4种捕获抗体(抗TNF-α、抗IL-10、抗VEGF和抗IL-1α)中的一种。然后将芯片暴露于4种可能被识别的分析物的亚组中，即在PBS中的TNF-α58pM和浓度为54pM的IL-10。因此，VEGF传感器和IL-1α传感器充当负对照。随后从传感器阵列中选择14个传感器以便以一定的冗余度(从两倍至四倍)测定来自4个区域的每一个的信号。用一轮纳米标签放大来增强初始MNT定量。如图3中可见，仅具有匹配分析物的传感器(在该情形中为TNF-α和IL-10)给出如同预期的较大信号。具有相同功能化的传感器之间的信号变动较小。在某些实施方式中，芯片的灵敏度似乎随功能化的类型而变化，这是因为据观察在相似浓度时IL-10给出比TNF-α更大的信号。这在某些情况下表明，每种功能化的分析物亲和力可能不同。在某些情况下，VEGF和IL-1α传感器上较小但是非零的信号可能是由于较小量的交叉反应性造成的，后者取决于测试抗体的匹配和品质。
在某些实施方式中，采用仔细筛选的抗体，可将基于MNT的分析物定量方法用于现实血清样品中的相关蛋白的临床检测，并且采用该方法可以容易地进行多重蛋白检测。在某些情况下，可以容纳并同时测定多达256种不同探针(包括多达128种不同探针，例如，多达64种不同探针)。在某些情况下，如上所述，传感器可以是自旋阀传感器或磁性隧道结传感器。另外，如下文所更详细讨论，通过使用具有更窄片段的传感器可以增加灵敏度(见图7)。而且，可以以更高的亲和力以及类似地以较小但更高的磁矩MNT来进一步提高基于MNT的测试捕获剂的分析灵敏度。由于其能够检测单个芯片上的多个生物标记物以及灵敏度、可扩展性和使用容易性，本文公开的蛋白测试方法可用于便携的和医护现场和患者身边的多重分子诊断。另外，在某些实施方式中，SV传感器是pH不敏感的，没有MNT“漂白”且没有来自生物体系的磁性背景。在某些情况下，基于MNT的测试产生即使在改变实验条件期间(例如，湿性至干性转变)仍然稳定的信号。在其它实施方式中，还可将基于MNT的分析物定量与磁分离技术组合。例如，可将分析物提取和第一轮分子放大与单个磁分离步骤组合以获得超灵敏的蛋白检测。还可使用磁力来将MNT标记的分析物吸引至传感器，由此减少扩散距离和测试时间并提高灵敏度。
图4显示了基于磁性纳米标签的蛋白测试芯片。该芯片具有200μL反应池并且由84针陶瓷基体所支撑(见图4a)。在反应池的底部嵌入有处于8×8阵列中的64个传感器(见图4b)。每个传感器具有大约90μm2×90μm2的活性区域并且由串联的32个各宽1.5μm的线性磁电阻性片段组成(见图4c)。图4d显示了采用扫描电子显微镜成像的一个这种传感器片段与所结合的纳米标签的边缘。
图5显示了磁性纳米标签的SEM图像。在进行基于MNT的分析物定量之后，将MNT溶液吸出并将芯片用去离子水清洗两次以除去盐残留物(否则其将掩盖结合的MNT)。然后通过DC溅射(Hummer V)用1nm的AuPd将芯片金属化以提高图像对比度。用FEI Sirion XL30扫描电子显微镜获取图像。
磁性纳米标签的平均直径约为50nm(商购自Miltenyi MACS 130-048-102)。在金属化和在SEM中检验之后，这些颗粒呈如图5中所示的约35nm的不规则球形，且带有频繁的多颗粒团簇。MACS纳米标签似乎仅含分散于整个结合有功能化体(链霉素抗生物素蛋白)的非磁性有机基质中的磁性材料的一小部分。在某些实施方式中，通过将MACS储备溶液应用于已经用生物素化牛血清白蛋白(BSA)进行功能化的测试芯片来获得高覆盖密度。
图6显示了PBS中的直接结合抗IFN-γ测试的示意图。在该测试中，分析物是生物素化的抗IFN-γ，后者由IFN-γ功能化传感器捕获并用经链霉素抗生物素蛋白涂布的磁性纳米标签定量。在某些情况下，这些芯片在湿-干转换期间显示出可逆的信号基线偏移，如图6d中时间-2分钟＜t＜0分钟时可见。在某些实施方式中，可通过如上所述的钝化来减少可逆基线偏移。
在图6a中，将探针传感器用1μL(在PBS缓冲液中100μg/mL)的IFN-γ液滴在4℃进行30分钟功能化。将对照传感器用1μL(在PBS缓冲液中100μg/mL)的IL6-sR液滴功能化。然后将功能化的芯片用1％BSA的1×PBS缓冲液溶液清洗以封闭非特异性吸附位点。
在图6b中，将100μL分析物(例如，PBS缓冲液中的670pM(100ng/mL)抗IFN-γ)加入芯片池中。在30℃将分析物在芯片的整个池中温育约1.5小时。然后将芯片用0.1％BSA的TPBS溶液清洗并转移至测定站点以进行后续分析物定量。
在图6c中，将100μL Miltenyi MACS储备溶液加入芯片池中，并记录产生的MNT结合信号(见图6d)。将温育20分钟后的MNT结合信号当作分析物浓度的量度(见图6e)。较小的误差条指示出测定的电噪声，其比在该实验中来自相同功能化的传感器的信号变化小得多。
图7显示了传感器几何形状及其对灵敏度的效果的测试。图7说明了在保持传感器的其它参数相同的同时对传感器片段的效果的评估。图7显示了对具有较宽几何形状或较窄几何形状的简化传感器的示意性说明。图7a左侧的示意性说明显示了带有3个各宽3μm的片段的宽传感器。图7a右侧的示意性说明显示了带有6个各宽1.5μm的片段的窄传感器。因此，这两种传感器的总传感电流、电阻、传感面积和传感电流密度都可以相同。
为确保宽和窄两种传感器类型的实验条件相同，将芯片制造成在同一反应池内部携带两种传感器变体。将整个反应池用100μL的200μg/mL生物素化BSA均匀功能化，在室温温育30分钟。由于MNT能与生物素化BSA直接结合，故无需分析物。将芯片用PBS清洗两次并转移至测定站点以进行MNT定量。
结果(见图7b)表明，如图7a右侧的窄传感器几何形状所示更精细地图案化传感器会导致更好的灵敏度。显示了对于每种类型的传感器的中值曲线(对于每种传感器类型N＝4条曲线)，而误差条指示出±1的标准偏差(见图7b)。来自1.5μm传感器的信号一贯地比来自3.0μm传感器的信号更强(见图7b)。结果显示，使用具有亚微米线宽的更精细图案化的传感器可以有助于增加灵敏度。
图8显示了采用纳米标签放大的多重蛋白测试的图，其显示出多重测试中的可选的磁性纳米标签(MNT)放大步骤的效果。用两个探针(抗TNF-α和抗IL-1α)和一个对照(BSA)对芯片进行功能化，且所应用的样品含有5.7pM TNF-α的PBS溶液。在0＜t＜4.5分钟时进行初始的基于MNT的分析物定量。在4.5分钟＜t＜6.5分钟时，先将芯片洗涤，然后与生物素化连接子分子短暂温育，所述生物素化连接子分子与已吸附的经链霉素抗生物素蛋白涂布的MNT连接。由此，已吸附的MNT能捕获额外的MNT。然后从t＞6.5分钟起温育第二次量MNT。如从TNF-α传感器可见，额外的MNT被捕获，并且观测到在几乎是原始MNT结合曲线的信号水平的两倍处趋于平稳的第二结合曲线。
III.反相
在反相蛋白(RPP)微阵列中，以高通量和多重模式将来自不同患者的样品点样到芯片上然后与检测剂温育。制备用人细胞裂解物或血清样品点样的磁性纳米芯片，然后与由选定生物标记物制成的检测剂温育以对人外周血样品进行测定(见图9)。图9a中显示了反相蛋白(RPP)芯片的示意图，图9b显示了点样于磁性纳米芯片上的64个样品的图像。图10中显示了使用磁性纳米标签传感来检测点样的EpCam抗原(一种癌症生物标记物)的蛋白测试的结果的图。
在一个实施方式中，将含有抗原(例如，EpCam抗原)的样品点样至选定传感器上(阳性传感器)，而在同一芯片上的对照传感器上不进行抗原点样。其后，将经EpCam抗体功能化的MACS纳米颗粒溶液应用于该芯片，并实时记录来自传感器的磁信号(见图10)，其中将MACS溶液稍早于时间t＝500秒时应用。通过对磁信号对时间曲线的拟合，可以提取出EpCam抗体和抗原之间的动力学常数。如果将溶液在某个时间点(例如，t＝2500秒)稀释，则发生EpCam抗体从抗原脱附，且可通过对磁信号对时间曲线进行拟合来提取脱离速率(数据未显示)。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和实施例的方式对上述发明进行了较详细的描述，但对于本领域普通技术人员显而易见的是，可在不背离所附权利要求的主旨或范围的情况下根据本发明的教导对本发明进行一定的变化和修改。
于是，上述内容仅仅对本发明的原理进行说明。可以理解，本领域技术人员将能设计出尽管未在本文明确描述或显示但体现本发明的原理并且包括于其主旨和范围内的各种设置方案。此外，本文所述的所有实施例和条件性语言原则上旨在协助读者理解本发明的原理和本发明人所提供的概念以便促进现有技术发展，且应被视为不受这些具体叙述的实施例和条件的限制。而且，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方式及其具体实施例的所有陈述均旨在涵盖其结构性和功能性等价物。另外，这些等价物应该包括目前已知的等价物和未来开发的等价物，即开发的不论结构如何但执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围不应受本文显示和描述的示例性实施方式的限制。相反，本发明的范围和主旨由所附权利要求体现。

Claims (42)

1.一种确定样品中是否存在分析物的方法，所述方法包括：
制备具有磁性标记分析物的磁性传感器装置，所述磁性标记分析物与所述装置的磁性传感器表面相结合；和
从所述磁性传感器获取实时信号以确定所述分析物是否存在于所述样品中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述制备包括：
(a)提供具有显示分析物特异性探针的磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器显示了与其表面上的所述分析物特异性结合的探针；和
(b)使所述显示分析物特异性探针的磁性传感器与所述样品接触以产生接触过样品的传感器。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述样品在所述接触步骤之前已进行了磁性标记。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述方法包括在所述接触步骤(b)之后对所述接触过样品的传感器进行磁性标记。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述制备包括：
(a)将所述样品置于所述磁性传感器的所述表面上以制备显示样品的传感器表面；和
(b)对所述显示样品的传感器表面进行磁性标记。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器装置包括2个或更多个各自特异性地检测不同分析物的不同磁性传感器。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述磁性传感器装置包括4个或更多个各自特异性地检测不同分析物的不同磁性传感器。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述磁性传感器装置包括各自特异性地检测不同分析物的20个或更少个不同磁性传感器。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器是自旋阀传感器。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器是磁性隧道结传感器。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是核酸。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是复合样品。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述复合样品是血清样品。
15.一种确定在血清样品中是否存在两种或更多种不同蛋白分析物的方法，所述方法包括：
使所述血清样品与磁性传感器装置的表面相接触，所述磁性传感器装置具有针对所述两种或更多种蛋白分析物中每一种的显示分析物特异性探针的磁性传感器，所述磁性传感器显示了与其表面上的分析物特异性结合的探针；和
从所述装置的每个磁性传感器获取信号以确定所述样品中是否存在所述两种或更多种不同蛋白分析物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述信号是实时信号。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述方法包括在所述样品与所述传感器表面接触之后对所述样品进行磁性标记。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述方法包括在所述样品与所述传感器表面接触之前对所述样品进行磁性标记。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述传感器是自旋阀传感器。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述传感器是磁性隧道结传感器。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述两种或更多种不同蛋白分析物是生物标记物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物标记物是用于疾病的生物标记物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病是细胞增殖性疾病。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述方法提供了皮摩尔量级的检测灵敏度和所关注的分析物的定量。
25.如权利要求15所述的方法，其中所述方法提供了飞摩尔量级的检测灵敏度和所关注的分析物的定量。
26.一种磁性传感器装置，包括：
显示分析物特异性探针的磁性传感器，所述磁性传感器显示了与其表面上的分析物特异性结合的探针；和
构造为从所述磁性传感器获取实时信号以确定样品种是否存在所述分析物的处理器。
27.如权利要求26所述的磁性传感器装置，其中所述磁性传感器包括超薄钝化层。
28.如权利要求27所述的磁性传感器装置，其中所述钝化层的厚度为约30μm或更小。
29.如权利要求26所述的磁性传感器装置，其中所述传感器是自旋阀传感器。
30.如权利要求26所述的磁性传感器装置，其中所述传感器是磁性隧道结传感器。
31.一种系统，包括：
(a)磁性传感器装置，其包括：
(i)显示分析物特异性探针的磁性传感器，所述磁性传感器显示与其表面上的分析物特异性结合的探针；和
(ii)构造为从所述磁性传感器获取实时信号以确定样品中是否存在所述分析物和/或对所述分析物进行定量的处理器；和
(b)磁性标记。
32.如权利要求31所述的系统，其中所述磁性传感器包括超薄钝化层。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述钝化层的厚度为约30μm或更小。
34.如权利要求31所述的系统，其中所述传感器是自旋阀传感器。
35.如权利要求31所述的系统，其中所述传感器是磁性隧道结传感器。
36.如权利要求31所述的系统，其中所述磁性标记是磁性纳米标签。
37.一种试剂盒，包括：
(a)磁性传感器装置，其包括：
(i)显示分析物特异性探针的磁性传感器，所述磁性传感器显示与其表面上的分析物特异性结合的探针；和
(ii)构造为从所述磁性传感器获取实时信号以确定样品中是否存在所述分析物和/或对所述分析物进行定量的处理器；和
(b)磁性标记。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述磁性传感器包括超薄钝化层。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述钝化层的厚度为约30μm或更小。
40.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述传感器是自旋阀传感器。
41.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述传感器是磁性隧道结传感器。
42.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述磁性标记是磁性纳米标签。
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