CN110343612B - 基于多色荧光可逆终止核苷酸的dna单分子测序系统与装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统及装置，所述测序系统包括引物、待测DNA模板、多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；所述引物固定在流通池反应器表面；将待测DNA模板与测序引物进行杂交，然后用多色荧光可逆终止核苷酸延伸引物后，检测延伸引物的荧光信号即可得到待测DNA序列信息；所述待测DNA模板的3’端不需要标记定位荧光。本发明通过利用测序循环过程中，延伸反应物的荧光作为下一次延伸的定位荧光，或采用固定在流通池反应器表面的定位荧光标记物作为定位荧光，无需对待测DNA模板的3’端标记定位荧光，从而有效避免了由于淬灭而导致定位信息丢失的问题，可进一步大幅延长测序读长并降低错误率。

Description

基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统与装置

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序方法与装置。

背景技术

人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing) 是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟 嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具 有重要意义。

DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也是显而易见 的。比如测序时间长、DNA扩增可能引入一定的错误率等。因此，基于单分子的三代测 序技术近年来得到了高度重视和发展，以弥补现行的二代测序技术的不足。

目前，单分子测序技术主要基于两种不同的原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合成延 伸，结合单分子荧光测量来获取DNA分子中的碱基信息(Helicos与PacificBio)。虽然 通过5′-标记荧光技术(PacificBio)可以实现较长的一次性读取，但其检测方式复杂，准 确度有所不足。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有较高的准确性。 读取系统相对简单，实现高通量、低成本的单分子直接测序而不需通过放大等步骤。而 这样方法的关键是实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的长期循环延伸，从而实现准 确和较长的序列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有尤其独特的优势， 对临床检测和基础研究都具有重要意义。

目前文献已经公开的单分子测序方法，最引人注目的是，文献(Nat.Methods2009， 6,593-595.)报道的Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing，在 该文献中，为了在单分子测序中实现一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂的目的，设 计合成了结构非常复杂的虚拟终止剂，而这样的结构导致在聚合酶作用下，延伸反应很 慢，并且延伸的错误率较高。而在此之前，文献(Science,2008,320,106-109.)报道一 次测序循环可延伸一个、两个甚至三个二硫键可逆终止剂，但不能做到一次测序循环只 能延伸一个可逆终止剂。

在单分子测序中，通过可连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂， 其电子效应与空间位阻在DNA延伸、断裂可连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键指标。基于二硫键连接单 元的可逆终止剂在单分子测序中已得到应用，然而文献(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸， Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止 剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸或者二膦酸的inhibitor，该类可 逆终止剂的确能够做到一次测序循环只延伸一个，然而其合成路线繁杂，同时大的位阻 造成参与DNA链延伸时延伸速度慢、错配率高(Michael L.Metzker；Nature Reviews Genetics2010,11,31.)。

且现有技术中，为进行定位，往往需要在待测模板的3’端标记特定的定位荧光信息，然后在对参与延伸反应后的引物/模板复合物进行测序的荧光检测之前,均需要对标记在待测模板3'端的荧光素进行照射激发以便对引物/模板复合物进行定位,该定位荧 光信息因为在每次延伸反应过程中均需要对其照射激发,而多次反复激发容易导致其荧 光淬灭,致使定位信息丢失,从而最终导致单分子测序读长短。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的 DNA单分子测序方法与装置。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统， 包括引物、待测DNA模板、多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；所述引物固定在流通池反应器表面；将待测DNA模板与引物进行杂交，然后用多色荧光可逆终止核苷酸延伸引 物后，检测延伸引物的荧光信号即可得到待测DNA序列信息；

所述待测DNA模板的3’端不标记定位荧光，可使用前一次延伸反应产物的荧光信息作为下一次延伸产物的定位荧光。

优选地，所述引物通过水溶性双功能连接单元固定于流通池反应器表面。

优选地，所述引物为5′为-N3或5′-炔基修饰的引物；所述流通池反应器表面还通过水溶性双功能连接单元连接定位标记物；所述定位标记物选自荧光量子点、纳米碳点 和荧光微球中的一种。

更优选地，所述荧光标记物的发光波长在可见光波段；所述的荧光量子点表面带有 能与流通池反应器表面的基团或物质相互反应或者以非共价键结合的官能团，所述荧光 量子点优选硫化镉量子点、硒化镉量子点、硒化锌量子点；所述荧光微球为直径20-100nm的聚苯乙烯荧光微球，聚苯乙烯荧光微球表面带有能与流通池反应器表面的基团或 物质相互反应或者以非共价键结合的官能团。

优选地，所述引物的固定方法具体为：

A1、对流通池反应器表面进行活化和修饰，使流通池反应器表面带有反应活性的基 团或物质；

A2、采用水溶性双功能连接单元将引物与修饰后的流通池反应器表面连接。

所述定位标记物的固定方法具体为：

在固定引物后，在未连接引物的水溶性双功能连接单元一端连接荧光标记物，使荧 光标记物与修饰后的流通池反应器表面连接。

更优选地，步骤A1中，所述带有反应活性的基团或物质包括氨基、羧基、炔基、 叠氮、酸酐、活性酯、酰亚胺、生物素、蛋白质中的至少一种，但不限于此。

优选地，所述流通池反应器为石英玻片或高硼硅玻片中的任一种。

优选地，所述DNA单分子测序系统包括对DNA单分子进行单端测序或双端测序。

优选地，所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下结构式中的任意四种不同 荧光素标记、不同碱基的可逆终止核苷酸：

优选地，所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下试剂a1-a4、b1-b4中的任一种：

三色荧光系统：试剂a1：

无荧光标记碱基G的3′-OH保护核苷酸选自式IV或者VIII化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a2：

无荧光标记碱基U的3′-OH保护核苷酸选自式I或者V化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a3：

无荧光标记碱基C的3′-OH保护核苷酸选自式II或者VI化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a4：

无荧光标记碱基A的3′-OH保护核苷酸选自式III或者VII化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

所述四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下组合中的一种：

四色荧光系统：试剂b1:

荧光标记的碱基U核苷酸选自式XXVI，XXVII，XVIII，XIX化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XXIX化合物；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XXXI或者XXXII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XXXV或者XXXVI化合物中的一种；

试剂b2:由式X,XI,XII和XIII化合物组成；

试剂b3:由式XIV,XVI,XVII,XV化合物组成；

试剂b4:

荧光标记的碱基U核苷酸选自式XX化合物；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种。

第二方面，本发明提供了一种DNA分子测序装置，包括流通池反应器、储液装置、液流输送装置、照明装置、检测装置和计算机；所述流通池反应器设置在检测装置上， 液流输送装置一端与流通池反应器连接，另一端与储液装置连接，所述液流输送装置与 储液装置之间设置有阀门；所述计算机与检测装置、液流输送装置通过电连接；所述照 明装置设置在流通池反应器上方或下方；

所述流通池反应器表面固定有引物。

优选地，所述流通池反应器的表面还固定有定位标记物；所述定位标记物选自荧光 量子点、纳米碳点和荧光微球中的一种。

优选地，所述检测装置包括底座、可移动平台和物镜，所述可移动平台设置在底座上，所述物镜与可移动平台通过支架连接；所述流通池反应器设置在移动平台上，物镜 设置在流通池反应器上方；棱镜设置在流通池反应器的下方,激发光以一定的角度照射, 光先经过棱镜再到达流通池反应器下表面,以便实现全内反射，可大大降低流通池反应 器表面成像的背景噪声；所述流通池反应器与温控装置连接；

所述与照明装置平行的位置设置有第一反射镜，第一反射镜设置在流通池反应器的 正上方或正下方；

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜 的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有聚光镜，聚光镜的上方设置有相机；或

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜 的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有第二反射镜，与第二反射镜平行的位置依次设置有聚光镜和相机；

所述二向色镜和第二反射镜的倾斜方向相同，可以使特定波长的光透过或发生反射。

所述的二向色镜与聚焦器配合使用可以在成像时精确聚焦。

所述的相机为电子倍增CCD(EMCCD)相机。

所述置于底座上的可移动平台可以精确控制流通池反应器的移动和位置，保证成像 时的准确聚焦和对整个流通池反应器的完整成像。

第三方面，本发明提供了一种DNA分子测序装置的使用方法，包括以下步骤：

A、通过液流输送装置从储液装置中抽取测序所需的各种试剂、酶和缓冲液，经过阀门进入流通池反应器中，由温控装置控制流通池反应器的温度，进行测序过程中的各 种反应；

B、反应结束后，每一个循环的反应产物被照明装置发出的不同波长的光利用全内反射技术激发，产生的荧光依次通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入EMCCD相机成像， 最后由计算机分析处理，即得待测模板的测序结果。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提出的四色或者三色荧光单分子测序系统，一次测序循环就能够测一个碱基的读长，而单色单分子测序系统，四次测序循环才能测得一个碱基的读长。所以本 发明所述单分子测序系统能够使测序效率至少提高四倍。并且避免了在长时间的测序循 环过程中，固定于芯片表面的引物在反复多次的测序循环中，可能有部分引物脱落或者 受酶的污染而导致固定的引物降解等实际问题。所以本发明的单分子测序系统的读长大 幅度提高。

2、本发明提出的四色或者三色荧光单分子测序系统，由于在延伸反应中，四个不同碱基的荧光素标记核苷酸全部一次加入反应体系，降低了碱基相互识别时发生错配的概率，有助于提高测序的准确率或者说可有效降低测序的错误率。并且单分子测序不需 要表面放大扩增步骤，可降低由扩增带来的GC偏好等测序误差。所以本发明提出的单 分子测序系统错误率大幅降低。

3、本发明提供的单分子测序系统，不需要在待测模板的3′端标记定位荧光素，而是利用测序循环过程中，延伸反应物的荧光可作为下一次延伸的定位荧光，不需要再加 一个额外的定位荧光。所以在本发明所述体系中，不存在由于定位荧光的淬灭而导致定 位信息丢失，从而导致传统的单分子平均读长只有25-30。因此本发明有效地避免了定 位信息的丢失，所以测序读长可进一步有效大幅延长；另外本发明所述体系不需要加入 抗荧光淬灭剂以及成像试剂，使整个测序体系变得更加简单、高效。这是因为在本发明 的测序体系中不存在因为定位荧光的反复多次激发而淬灭的问题。

4、本发明提供单分子测序系统，除了可用前一次延伸的荧光信息作为下一次延伸的定位荧光之外，还可以将聚苯乙烯荧光微球或者量子点等作为定位荧光固定于芯片表面，而聚苯乙烯荧光微球或者量子点的荧光寿命很长，从而进一步避免了在测序过程中，由于定位荧光的淬灭而导致测序读长短。所以本发明的单分子测序系统可获得更长的测序读长。

5、本发明所述单分子测序系统，不但可以进行单端测序，而且可以进行双端测序，而之前的单分子测序系统，只能进行单端测序。

6、本发明所述的单分子测序系统是在所述特有的仪器装置中完成的，该仪器装置的特有性能参数能够保证所述单分子测序体系的顺利进行，促使其创新性得以顺利完成、体现。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目 的和优点将会变得更明显：

图1为本发明中单分子测序装置；

图2为本发明中单分子测序中的两种光路示意图；

图1和图2中，1-储液装置；2-液流输送装置；3-阀门；4-相机；5-物镜；6-流通 池反应器；7-可移动平台；8-底座；9-温控装置；10-计算机；11-照明装置；12-棱镜； 13-二向色镜；14-聚焦器；15-聚光镜；16-第一反射镜；17-第二反射镜；

图3单分子测序芯片表面修饰示意图；

图4三色荧光标记核苷酸单分子测序芯片上的引物不同延伸次数后的单分子荧光照 片；图4a-4g分别为第1次延伸、第2次延伸、第5次延伸、第8次延伸、第11次延伸、 第13次延伸、第15次延伸；

图5四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次延伸四色合并的荧光图；

图6四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次延伸四种不同波长激发下的荧光图；图 6a为FITC；图6b为Cy3；图6c为Cy3.5；图6d为Cy5；

图7四色荧光标记核苷酸单分子测序第二次延伸四种不同波长激发下的荧光图；图 7a为Cy2；图7b为Cy3；图7c为Cy3.5；图7d为Cy5；

图8四色荧光标记核苷酸单分子测序第18次延伸四种不同波长激发下的荧光图；图8a为FITC；图8b为Cy3；图8c为Cy3.5；图8d为Cy5；

图9单分子双端测序系统示意图,图中1为固定引物；2为光交联剂；3为待测模板；4为测序引物1；5为测序引物2；

图10为四条待测模板且双端测序的情况下，单分子测序芯片上的引物第51次延伸反应的荧光照片；

图11为本发明实施例1采用的单分子测序芯片的横向剖面结构示意图；

图12为本发明实施例1采用的单分子测序芯片的分解结构示意图；

其中，图11-图12中：18-盖板；19-流道板；20-基板21-流道；22-第一流体入口；23-第一流体出口；24-第二流体入口；25-第二流体出口；26-定位标记物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于 本发明的保护范围。

以下实施例提供了一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，包括 引物、待测DNA模板、多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；所述引物固定在流通池反应器表面；将待测DNA模板与引物进行杂交，然后用多色荧光可逆终止核苷酸延伸引物后， 检测延伸引物的荧光信号即可得到待测DNA序列信息；

所述待测DNA模板的3’端不标记定位荧光，可使用前一次延伸反应产物的荧光信息作为下一次延伸产物的定位荧光。

所述引物通过水溶性双功能连接单元固定于流通池反应器表面。

所述引物为5′为-N3或5′-炔基修饰的引物；所述流通池反应器表面还通过水溶性双功能连接单元连接定位标记物；所述定位标记物选自荧光量子点、纳米碳点和荧光微 球中的一种。所述定位标记物的发光波长不同于标记在测序试剂上的荧光波长(即多色 荧光可逆终止核苷酸的荧光波长)即可。

所述引物的固定方法具体为：

A1、对流通池反应器表面进行活化和修饰，使流通池反应器表面带有反应活性的基 团或物质；

A2、采用水溶性双功能连接单元将引物与修饰后的流通池反应器表面连接。

所述定位标记物的固定方法具体为：

在固定引物后，还包括：

步骤A3、在未连接引物的水溶性双功能连接单元一端连接荧光标记物，使荧光标记 物与修饰后的流通池反应器表面连接。

步骤A1中，所述活化步骤具体为：将干净的流通池反应器置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使流通池反应器表面羟基化；

所述的修饰步骤具体为：将经活化步骤后的流通池反应器在溶剂中与氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加热反应2小时，得到表面带有氨基的流通池反应器；

所述带有反应活性的基团或物质包括氨基、羧基、炔基、叠氮、酸酐、活性酯、酰 亚胺、生物素、蛋白质中的至少一种，但不限于此。

步骤A2中，所述水溶性双功能连接单元与流通池反应器连接的一端的反应活 性官能团为羧基活性酯，与引物连接的一端的反应活性官能团为炔基或叠氮基。

具体地，所述水溶性双功能连接单元包括以下结构式中的至少一种：

步骤A2具体包括以下步骤：

将流通池反应器置于含有水溶性双功能连接单元的溶液中，室温下反应以酰胺键连接于流通池反应器表面；

将表面修饰了合适官能团的引物加入经步骤A1处理后的流通池反应器表面，室温下进行点击化学反应9h，即可。

步骤A3具体包括以下步骤：

将修饰了叠氮官能团或者炔基的定位用荧光标记物滴加在流通池反应器表面,室温下经click反应9h，所述定位用荧光标记物即可通过共价键连接于流通池反应 器表面。

所述流通池反应器为石英玻片或高硼硅玻片中的任一种。

所述DNA单分子测序系统包括对DNA单分子进行单端测序或双端测序。

所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自前述结构式I-式XXXVIII中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止核苷酸。

以下实施例采用的DNA单分子测序装置如图1和图2所示，包括流通池反应器、储液装置、液流输送装置、照明装置、检测装置和计算机；所述流通池反应器设置在检测 装置上，液流输送装置一端与流通池反应器连接，另一端与储液装置连接，所述液流输 送装置与储液装置之间设置有阀门；所述计算机与检测装置、液流输送装置通过电连接； 所述照明装置设置在流通池反应器上方或下方；

所述流通池反应器表面固定有引物。

所述流通池反应器的表面还固定有荧光标记物；所述定位标记物选自荧光量子点、 纳米碳点和荧光微球中的一种。

所述检测装置包括底座、可移动平台和物镜，所述可移动平台设置在底座上，所述物镜与可移动平台通过支架连接；所述流通池反应器设置在移动平台上，物镜设置在流 通池反应器上方；棱镜设置在流通池反应器的下方,照明装置发出的光以一定的角度照 射,光先经过棱镜再到达流通池反应器下表面,以便实现全内反射，可大大降低流通池反 应器表面成像的背景噪声；所述流通池反应器与温控装置连接；

所述与照明装置平行的位置设置有第一反射镜，第一反射镜设置在流通池反应器的 正上方或正下方；

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜 的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有聚光镜，聚光镜的上方设置有相机；或

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜 的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有第二反射镜，与第二反射镜平行的位置依次设置有聚光镜和相机；

所述二向色镜和第二反射镜的倾斜方向相同，可以使特定波长的光透过或发生反射。

所述的二向色镜与聚焦器配合使用可以在成像时精确聚焦。

所述的相机为电子倍增CCD(EMCCD)相机。

该DNA分子测序装置的使用方法包括以下步骤：

A、通过液流输送装置从储液装置中抽取测序所需的各种试剂、酶和缓冲液，经过阀门进入流通池反应器中，由温控装置控制流通池反应器的温度，进行测序过程中的各 种反应；

B、反应结束后，每一个循环的反应产物被照明装置发出的不同波长的光利用全内反射技术激发，产生的荧光依次通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入EMCCD相机成像， 最后由计算机分析处理，即得待测模板的测序结果。

实施例1：三色荧光标记可逆终止核苷酸DNA单分子测序系统

本实施例所述三色荧光单分子测序系统a1组成如下：对于无荧光标记碱基G的3′-OH保护核苷酸，由化合物IV或者VIII组成,相应的荧光标记的碱基U核苷酸由化 合物X,XIV,XX其中之一组成；相应的荧光标记碱基C核苷酸由化合物XI,XVI,XXI, XXXVII之一组成，相应的荧光标记碱基A的核苷酸由XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII 之一组成；四个不同碱基的修饰核苷酸共同组成本实施例的测序试剂系统1；

三色荧光标记单分子测序系统试剂系统a2组成如下：对于无荧光标记碱基U的3′-OH保护核苷酸，由化合物I或者V，其中之一组成,相应的荧光标记碱基G核苷酸 由化合物XIII,XV,XXIV,XXV其中之一组成；相应的荧光标记碱基C核苷酸由XI,XVI, XXI,XXXVII之一组成，相应的荧光标记碱基A核苷酸由XII,XVII,XXII,XXIII, XXXVIII之一组成；

三色荧光标记单分子测序系统试剂系统a3组成如下：对于无荧光标记碱基C的3′-OH保护核苷酸，由II或者VI其中之一组成,相应的荧光标记碱基G核苷酸由化合 物XIII,XV,XXIV,XXV其中之一组成；相应的荧光标记碱基U核苷酸由化合物X,XIV, XX其中之一组成，相应的荧光标记碱基A核苷酸由化合物XII,XVII,XXII,XXIII, XXXVIII其中之一组成；

三色荧光标记单分子测序系统试剂系统a4组成如下：对于无荧光标记的碱基A的3′-OH保护核苷酸，由III或者VII其中之一组成,相应的荧光标记碱基G核苷酸，由化 合物XIII,XV,XXIV,XXV其中之一组成；相应的荧光标记碱基U核苷酸，由X,XIV,XX 其中之一组成，相应的荧光标记碱基C核苷酸，由化合物XI,XVI,XXI,XXXVII其中 之一组成。

采用a1-a4任一种试剂系统对DNA待测模板序列(序列1)

5’-CTACGTTCGAACTACTAACTTGATGTAGCTTCGTAGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3’进行单分子测序。

本实施例中采用的单分子测序芯片如图11-图12所示，包括流道板、基板和盖板，所述流道板设置在基板和盖板之间；所述流道板上设置流通池，所述流通池包括多个平 行设置的流道；所述流通池的上方设置盖板、流通池的下方设置基板；所述流道与基板 表面连通。与流道板接触的所述基板的表面固定了引物和定位标记物(图3)。

所述流道的中部为长方体型，两端部为锥型，两端部分别设置第一流体入口和第一 流体出口；

所述盖板上与第一流体入口和第一流体出口相应的位置分别设置有第二流体入口 和第二流体出口，所述第一流体入口与第二流体入口连通，第二流体出口与第二流体出口连通。

所述单分子测序芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)取一块厚度为80-500μm的流道板，采用光刻法在其表面形成流道，光刻法步骤如下：

1.1根据预先设计好的流通池流道图样将光刻胶均匀涂覆于流道板表面，形成厚度 为200-600μm的掩膜；

1.2用波长为248nm或365nm的紫外光照射上述覆盖了掩膜的基片，光照功率为15-30J/cm²，光照时间为60-180秒；

1.3去除掩膜，将上述流道板加热至500-600℃进行5-10分钟的热处理；

1.4待流道板自然冷却到室温后，用氢氟酸溶液进行刻蚀，最后清洗掉残留物，得到流道层。

(2)取一块厚度为500-1000μm的基板，对基板表面进行修饰，使表面带有大量活性酯基团，并进而与双功能连接单元(一端为氨基，另一端为叠氮)反应，并进一步通 过在其上通过“click”反应固定5’端修饰有炔基的引物，再用同样的化学反应click反 应将表面带有炔基的荧光定位标记物固定在芯片表面(通过click反应将定位标记物与 基板表面连接起来)；如图3所示；

(3)取一块厚度为100-500μm的盖板，在其上打大小、位置与流道两端小孔相同 的小孔；

(4)将上述流道层、基板、盖板用氧等离子体进行清洗，然后利用聚氨酯的粘接 作用压合组装在一起，形成单分子测序芯片。

该单分子测序芯片由三层组合而成，形成的流通池包含2-16个流道，相邻流道的间距为2-5mm，每个流道的宽度为2-8mm，长度为5-10cm，两端分别设有一个小孔， 其中一个为流体入口，另一个为流体出口。芯片上负载的荧光定位标记物在测序过程中 可以对目标DNA单分子进行定位。

所述流道板的材质为硅片、玻璃(即玻片)或陶瓷中的一种；所述基板和盖板的材质为石英玻片或高硼硅玻片；所述荧光标记物选自荧光微球或者荧光量子点，具体可以 是硫化镉量子点、硒化镉量子点、硒化锌量子点、聚苯乙烯荧光微球的任一种。

所述测序具体步骤为：

先将该序列待测模板与固定在基体表面的引物在65℃下温育5分钟进行杂交，并用 合适波长的激光对其照射激发，以便对荧光标记物作为定位荧信息光进行初次定位，然后在DNA聚合酶的作用下用不同荧光标记的四种可逆终止核苷酸进行延伸反应，延伸 反应时间为15分钟，温度为37℃。第一次延伸反应结束后通过检测延伸产物的荧光信 号(即四种不同荧光标记的可逆终止剂核苷酸的荧光信号)即可得到待测序列的信息， 完成第一次延伸。需要说明的是，每次延伸反应对引物/模板复合物进行荧光检测之前， 均需要对定位荧光信息进行确认，以便获得定位信息。然后将标记在可逆终止核苷酸上 的荧光素去除，并进行第二次延伸反应，通过检测延伸产物的荧光信号得到参与延伸碱 基的信息，同样需要注意的是在第二次得到延伸信息之前，需要对定位荧光信息进行再 次激发，然后将可裂解连接单元断裂，去除标记的荧光素，从而完成第二次测序循环。 以此类推，共进行100次延伸，且每次延伸反应之前均需要使用固定于芯片表面的定位 荧光进行定位。图4是测序芯片上的引物第一次延伸、第二次延伸、第五次延伸、第八 次延伸、第11次延伸、第13次延伸、第15次延伸后的单分子荧光照片，根据荧光信 号可以读出待测序列上相应的所有碱基序列。由图4可知每次延伸反应均能获得正确的 待测序列信息，且前20次没有观察到错误的待测序列信息，即错误率为0。在该实施例 中，由于使用了固定于芯片表面的荧光微球或者量子点作为定位荧光，所以不需要在待 测模板的3′端标记特定的定位荧光信息。并且在我们初步的实验过程中，我们发现三色 荧光单分子测序系统由于定位信息的荧光寿命大幅度延长，不易淬灭，从而有效解决了 导致单分子测序的读长短的问题，可大大延长单分子测序的读长。采用本实施例的单分 子测序系统对单分子序列检测的读长可达100，准确率为99.8％。

实施例2：四色荧光标记可逆终止核苷酸DNA单分子测序系统

本实施例所述四色荧光单分子测序系统，在本实施例中选择可逆终止核苷酸对于碱 基U选择XXVI，XXVII，XVIII,或者XIX,对于碱基C选择XXIX,对于碱基G选择 XXXI或者XXXII,对于碱基A选择XXXV或者XXXVI，四个不同碱基的修饰核苷酸 共同组成本实施例的测序试剂系统1；

本发明四色荧光可逆终止核苷酸测序系统试剂系统2：化合物X,XI,XII,XIII；

本发明四色荧光可逆终止核苷酸测序系统试剂系统3：化合物XIV,XVI,XVII,XV；

本发明四色荧光可逆终止核苷酸测序系统试剂系统4：对于U可选XX,对于C可 选XXI,XXXVII其中之一；对于A可选XXII,XXIII,XXXVIII其中之一，对于G可选 XXIV,XXV其中之一。

采用b1-b4任一试剂系统对四条不同的待测模板序列

5’-CTACGTTCGAACTACTAACTTGATGTAGCTTCGTAGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3’(序列1)，

5’-CTACGTTCGAACTACTAATGGCCAACTTTAGGTACAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列2)，

5’-CTACGTTCGAACTACTAAGCAATCCGGCAGATCGTCACTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列3)，

5’-CTACGTTCGAACTACTAAAACTGGTACAGCCAACGTCTGTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列4)

同时进行单分子测序。

先将四条不同序列的模板与固定在流通池反应器(石英玻片或高硼硅玻片)表面的 引物在65℃下温育5分钟进行杂交，然后在聚合酶的作用下用四种不同荧光标记的可逆终止核苷酸第一次延伸引物，延伸反应时间为15分钟，温度为37℃。第一次延伸反 应结束后通过检测延伸产物的荧光信号即可得到待测序列的信息。以第一次延伸的后的 荧光信号成像作为定位标记，采用相同的步骤进行第二次延伸引物，以此类推，进行多 次延伸。图5是测序芯片上的引物在第一次延伸后的单分子荧光照片，根据荧光信号可 以通过第一次延伸反应读出四条待测序列上相应的碱基分别为A(序列1)，C(序列2)， T(序列3)，G(序列4)。本实施例可以在逐个读取碱基序列的过程中追踪同一批DNA 单分子的荧光信号。在该实施例中，使用前一次延伸产物的荧光信息作为下一次延伸产 物的定位信息，不需要在待测模板的3′端标记特定的定位荧光信息。并且在我们初步的 实验过程中，我们发现四色荧光单分子测序系统在不需要特意在待测模板上标记定位信 息的前提下，也就不存在由于定位信息的荧光淬灭，从而导致单分子测序的读长短的问 题，所以可大大延长单分子测序的读长。图5为四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次 延伸反应的四色合并的单分子荧光图，由图5可知，四种不同颜色的延伸反应图合并在 一起，四个不同的待测序列均显示正确的测序结果。图6为四色荧光标记核苷酸单分子 测序第一次延伸四种不同波长激发下的荧光图，图6的四个图叠加后即为图5，该图说 明四个不同序列的模板均得到正确的测序结果，所有待测序列均正确无误。图7为四色 荧光标记核苷酸单分子测序第二次延伸四种不同波长激发下的荧光图，由图7可知，第 二次延伸反应对于四个不同待测模板均同样得到正确的序列信息。图8为四色荧光标记 核苷酸单分子测序第18次延伸四种不同波长激发下的荧光图，由图8可知，第18次延 伸反应结果表明，对于四个不同的待测模板，均得到正确的序列信息,测序结果正确无 误。图5-8的实验中四个不同序列的模板在反应体系中同时存在。而事实上在我们的实 验中，经过20次测序循环，延伸了20个碱基的读长，每一次延伸后的荧光图像均显示 正确的序列，并且没有观察到一个单分子序列缺失或者错配，也就是说前20次测序循 环中没有观察到错误的序列信息，即错误率为0。初步的实验结果表明，我们发展的单 分子测序系统的错误率在前20次测序中，错误率为0。当然在本实施例中我们只进行了 80次测序循环，单分子测序读长达80个碱基，而错误率为0.2％。如果进一步优化实 验条件，在更优化的条件下再次实验，其结果预计会更加完善。所以本发明所述单分子测序系统能够获得读长更长、错误率更低的低成本、高通量的单分子测序系统。而所有 这些实验结果都是在我们自己设计的测序芯片以及装置中完成的。

综上所述，本发明所述四色荧光标记可逆终止核苷酸以及三色荧光标记可逆终止核 苷酸的具体结构式，在本发明所述核心试剂是这些结构式的不同组合，每一种组合均包含四个不同碱基核苷酸，并且这四个核苷酸应该具有相同性质的连接单元，比如四个可 逆终止核苷酸全部选择酸敏感的，或者全部选择基于二硫键的，从而共同构成酸敏感四 色荧光单分子测序系统，或者二硫键四色荧光单分子测序系统。在我们的实验过程中， 我们发现虽然二硫键荧光标记核苷酸很早就用于单分子测序或者合成测序，但是将四色 荧光标记的可逆终止核苷酸，用于单分子测序，并且待测模板的3′端不再需要标记定位 荧光素，而将延伸反应之后的四色荧光作为下一次延伸反应的定位荧光，或者采用实施 例3所述的将长寿命定位荧光固定于芯片表面，并且这样的四色荧光单分子系统，无论 是酸敏感的还是二硫键的，均能够做到读长更长，错误率更低的单分子测序效果。总之， 本发明所述四色单分子测序系统具有测序读长更长，错误率更低的特定，并且测序效率 高，一次测序循环就可测定一个碱基的读长。而单色单分子测序系统四次测序循环才能 测得一个碱基的读长，测序效率至少提高了四倍。

与此同时三色荧光荧光单分子测序系统应至少包含化合物I-VIII中的一种，而相应 地选择另外三个碱基的荧光标记核苷酸，共同构成四个不同碱基的核苷酸作为定位单分 子测序系统，该类组成的三色荧光单分子测序系统，为单分子测序领域中首次提出，并且同样的道理，使用实施例3所述芯片，从而避免了在待测模板的3′端标记定位荧光的 步骤。相比单色单分子测序系统，最本发明所述三色荧光单分子测序系统具有测序读长 更长，错误率更低的特点。相比单色荧光测序系统，多色系统测序效率高，一次测序循 环就可测定一个碱基的读长。而单色单分子测序系统四次测序循环才能测得一个碱基的 读长，测序效率至少提高了四倍。

采用本发明实施例1和2的测序系统进行DNA单分子测序，其测序读长可达100nt，错误率仅0.2％。

实施例3：单分子双端测序系统的构建与应用

采用实施例1的测序芯片对DNA待测模板序列(序列5)

5’-GTTGTTGTTGTTGTTGTTCTACGTTCGAACTACTAAGCAATCCGGCAGATCGTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’进行双端单分子测序。具体步骤如下：

(1)所述基体表面固定的引物为5’-(CNVC)TTUTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(序列 6)，其中CNVC是一种DNA链间的可逆光交联剂，然后将待测序模板列与该固定引物 在65℃下温育5分钟并缓慢降温至37℃进行第一次杂交；杂交结束后，加入四种天然 核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，在37℃、DNA聚合酶的作用下延伸固定引物， 合成一条与待测模板序列互补的DNA链。然后升温至65℃保持3分钟解链，将待测模 板去除，加入测序引物1(5’-GTTGTTGTTGTTGTTGTT-3’)(序列7)，在65℃下温育 5分钟并缓慢降温至37℃进行第二次杂交；第二次杂交后，用实施例1中所述的a1-a4 试剂系统(不同荧光标记的可逆终止核苷酸)在聚合酶作用下延伸测序引物1，进行正 向测序，延伸反应时间为15分钟，温度为37℃。每延伸一个可逆终止核苷酸，检测延 伸产物的荧光信号即可识别相应的碱基。

(2)正向测序结束后，升温至65℃保持3分钟解链，将已经延伸的测序引物1去 除，然后再加入新的测序引物1，在65℃下温育5分钟并缓慢降温至37℃进行第三次 杂交；第三次杂交后再加入四种天然核苷酸，在37℃、DNA聚合酶的作用下延伸测序 引物1，合成一条与待测模板序列相同的DNA链。然后用365nm的紫外光照射20秒， 使新合成的DNA链与固定引物上的CNVC连接在一起，从而固定在芯片表面。再加入 USER酶，在碱基U的位置切断已经延伸的固定引物。然后，加入测序引物2 (5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)(序列8)，在65℃下温育5分钟并缓慢降温至37℃ 进行第四次杂交；第四次杂交后再用实施例1中所述的a1-a4试剂系统(不同荧光标记 的可逆终止核苷酸)在聚合酶作用下延伸测序引物2，进行反向测序，延伸反应时间为 15分钟，温度为37℃。每延伸一个可逆终止核苷酸，检测延伸产物的荧光信号即可识 别相应的碱基。

按照以上步骤，即可完成对待测模板的单分子双端测序(如图9所示)。同时需要说明的是本实施例所述单分子双端测序所使用的芯片为实施例1所述的测序系统；并且 在本实施例中我们也尝试了前一次延伸反应的荧光信息作为下一次延伸的定位荧光(即 实施例2的测序系统)，同样可得到双端测序的实验结果，本实施例所述双端单分子测 序的读长可达150，错误率为0.15％。所以实际测序结果证明无论是测序读长还是错误 率均大幅度改善。

采用本实施例的双端测序系统对实施例2中所述的四条待测DNA序列进行测序，其单分子测序循环第51次延伸反应的荧光照片如图10所示，其实验结果说明本实施例 所述单分子测序实验结果表明，单端测序前51次单分子测序的错误率为0.12％。

需要说明的是，本发明提供的四色荧光或者三色荧光单分子测序系统与装置，并不 限于目前提出的几类可逆终止剂，也同样适用于其他类型的可逆终止剂。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改， 这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的 特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统与装置

<130> DAG36029

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacgttcga actactaact tgatgtagct tcgtagtaat tttttttttt ttttttttt 59

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacgttcga actactaatg gccaacttta ggtacaggct tttttttttt ttttttttt 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacgttcga actactaagc aatccggcag atcgtcactt tttttttttt ttttttttt 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctacgttcga actactaaaa ctggtacagc caacgtctgt tttttttttt ttttttttt 59

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttgttgttg ttgttgttct acgttcgaac tactaagcaa tccggcagat cgtcacaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaa 76

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttuttttttt tttttttttt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgttgttg ttgttgtt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttttttttt tttttttt 18

Claims (8)

1.一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，包括引物、待测DNA模板、多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；所述引物固定在流通池反应器表面；将待测DNA模板与测序引物进行杂交，然后用多色荧光可逆终止核苷酸参与延伸反应后，检测延伸后引物/模板复合物的荧光信号即可得到待测DNA序列信息；

所述待测DNA模板不标记定位荧光；使用前一次延伸反应产物的荧光信息作为下一次延伸产物的定位荧光；

所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂为三色或四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；

所述引物为5′为-N3或5′-炔基修饰的引物；所述引物通过水溶性双功能连接单元固定于流通池反应器表面；

所述流通池反应器表面还通过水溶性双功能连接单元连接定位标记物；所述定位标记物选自荧光量子点、纳米碳点和荧光微球中的一种。

2.根据权利要求1所述的基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述DNA单分子测序系统包括对DNA单分子进行单端测序或双端测序。

3.根据权利要求1所述的基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下结构式中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止核苷酸：

4.根据权利要求3所述的基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下试剂a1-a4、b1-b4中的任一种：

三色荧光系统：试剂a1：

无荧光标记碱基G的3′-OH保护核苷酸选自式IV或者VIII化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a2：

无荧光标记碱基U的3′-OH保护核苷酸选自式I或者V化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a3：

无荧光标记碱基C的3′-OH保护核苷酸选自式II或者VI化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XII,XVII,XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种；

试剂a4：

无荧光标记碱基A的3′-OH保护核苷酸选自式III或者VII化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XI,XVI,XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XIII,XV,XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基U核苷酸选自式X,XIV,XX化合物中的一种；

所述四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂选自以下组合中的一种：

四色荧光系统：试剂b1：

荧光标记的碱基U核苷酸选自式XXVI，XXVII，XVIII，XIX化合物中的一种；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XXIX化合物；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XXXI或者XXXII化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XXXV或者XXXVI化合物中的一种；

试剂b2：由式X,XI,XII和XIII化合物组成；

试剂b3：由式XIV,XVI,XVII,XV化合物组成；

试剂b4：

荧光标记的碱基U核苷酸选自式XX化合物；

荧光标记的碱基C核苷酸选自式XXI,XXXVII化合物中的一种；

荧光标记的碱基G核苷酸选自式XXIV,XXV化合物中的一种；

荧光标记的碱基A核苷酸选自式XXII,XXIII,XXXVIII化合物中的一种。

5.一种基于权利要求1所述测序系统的DNA单分子测序装置，其特征在于，包括流通池反应器、储液装置、液流输送装置、照明装置、检测装置和计算机；所述流通池反应器设置在检测装置上，液流输送装置一端与流通池反应器连接，另一端与储液装置连接，所述液流输送装置与储液装置之间设置有阀门；所述计算机与检测装置、液流输送装置通过电连接；所述照明装置设置在流通池反应器上方或下方；

所述流通池反应器表面固定有引物。

6.根据权利要求5所述的DNA单分子测序装置，其特征在于，所述流通池反应器的表面还固定有荧光标记物；所述定位标记物选自荧光量子点、纳米碳点和荧光微球中的一种。

7.根据权利要求5或6所述的DNA单分子测序装置，其特征在于，所述检测装置包括底座、可移动平台和物镜，所述可移动平台设置在底座上，所述物镜与可移动平台通过支架连接；所述流通池反应器设置在移动平台上，物镜设置在流通池反应器上方；棱镜设置在流通池反应器的下方,所述流通池反应器与温控装置连接；

所述与照明装置平行的位置设置有第一反射镜，第一反射镜设置在流通池反应器的正上方或正下方；

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有聚光镜，聚光镜的上方设置有相机；或

所述物镜上方设置有二向色镜，与二向色镜同一水平线上设置有聚焦器，二向色镜的一端连接聚焦器；二向色镜的上方设置有第二反射镜，与第二反射镜平行的位置依次设置有聚光镜和相机；

所述二向色镜和第二反射镜的倾斜方向相同。

8.一种根据权利要求5所述的DNA单分子测序装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、通过液流输送装置从储液装置中抽取测序所需的各种试剂、酶和缓冲液，经过阀门进入流通池反应器中，由温控装置控制流通池反应器的温度，进行测序过程中的各种反应；

B、反应结束后，每一个循环的反应产物被照明装置发出的不同波长的光利用全内反射技术激发，产生的荧光依次通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入相机成像，最后由计算机分析处理，即得待测模板的测序结果。

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