CN108251516B - Dna单分子测序方法与测序系统 - Google Patents

Dna单分子测序方法与测序系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种DNA单分子测序方法与测序系统，所述DNA单分子测序方法包括如下步骤：S1对基体表面进行修饰，将水溶性双功能连接单元连接于基体表面；然后将引物P1与水溶性双功能连接单元连接，即得固定有引物的基体；S2、将含待测DNA模板、聚合酶、四色荧光标记可逆终止剂的混合溶液置于固定有引物P1的基体上，进行延伸，形成含荧光素的引物/模板复合物；S3、对延伸后的引物/模板复合物进行成像，确定参与延伸的核苷酸碱基种类；S4、将参与延伸的核苷酸的可裂解连接单元断裂，进行下一次延伸；S5、重复上述步骤S2至步骤S4，获得待测DNA模板的碱基序列。本发明能够完美地做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂的效果。

Description

DNA单分子测序方法与测序系统
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种DNA单分子测序方法与测序系统。
背景技术
人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。
DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也是显而易见的。比如测序时间长、DNA扩增可能引入一定的错误率，定量测量相对复杂等。因此，基于单分子的三代测序技术近年来得到了高度重视和发展，以弥补现行的二代测序技术的局限。
目前，单分子测序技术主要基于两种不同的原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合成延伸，结合单分子荧光测量来获取DNA分子中的碱基信息(Helicos与PacificBio)。虽然通过5′-标记荧光技术(PacificBio)可以实现较长的一次性读取，但其检测方式复杂，准确度有所不足。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有较高的准确性。读取系统相对简单，可充分利用半导体技术的跳跃式发展，实现高通量、低成本的单分子直接测序而不需通过放大等步骤。而这样方法的关键是实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的长期循环延伸，从而实现准确和较长的序列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有尤其独特的优势，对临床检测和基础研究都具有现实意义和重要性。
目前文献已经公开的单分子测序方法，最引人注目的是，文献(Nat.Methods2009，6,593-595.)报道的Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing，在该文献中，为了在单分子测序中实现一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂的目的，设计合成了结构非常复杂的虚拟终止剂，而这样的结构导致在聚合酶作用下，延伸反应很慢，并且延伸的错误率较高。而在此之前，文献(Science,2008,320,106-109.)报道一次测序循环可延伸一个、两个甚至三个二硫键可逆终止剂，但不能做到一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂。
在单分子测序测序中，通过可连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂，其电子效应与空间位阻在DNA延伸、断裂可连接连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键指标。基于二硫键连接单元的可逆终止剂在单分子测序中已得到应用，然而文献(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸，Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸以及二膦酸，空间位阻如此大的可逆终止剂的确能够做到一次只延伸一个，然而其合成路线极为繁杂，过大的位阻同时也造成参与DNA链延伸时酶不好识别且速度慢、错配率高(Michael L.Metzker；Nature ReviewsGenetics 2010,11,31.)。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种DNA单分子测序系统与测序方法。本发明提供的测序系统与方法也适用于任何DNA、RNA和基因组测序。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种DNA单分子测序方法，包括如下步骤：
S1、对基体表面进行修饰，然后将所述水溶性双功能连接单元连接于基体表面；再将引物P1与水溶性双功能所述连接单元连接，即得固定有引物P1的基体；所述水溶性双功能连接单元用于将基体表面与引物P1连接起来；
S2、将含待测DNA模板、聚合酶、四色荧光标记可逆终止剂(含荧光素标记的核苷酸)的混合溶液置于所述固定有引物P1的基体上，进行延伸，形成含荧光素的引物/模板复合物；
S3、对延伸后的引物/模板复合物进行成像，确定参与延伸的核苷酸碱基种类；
S4、将参与延伸的核苷酸的可裂解连接单元断裂，进行下一次延伸；
S5、重复上述步骤S2至步骤S4，获得待测DNA模板的碱基序列。
优选地，步骤S4中，所述断裂用化学试剂选自酸性溶液、连二亚硫酸钠或DTT。对于酸敏感，需要加入酸性溶液；对于偶氮连接单元，需要加入连二亚硫酸钠；对于二硫键，需要加入DTT。且对于二硫键断裂后，还需要将新生成的巯基用碘乙酰胺保护。
优选地，所述四色荧光标记可逆终止剂包括3′-OH未保护的酸敏感可逆终止剂、基于偶氮连接单元的可逆终止剂和基于二硫键连接单元的可逆终止剂。
优选地，所述四色荧光标记可逆终止剂中，采用的连接单元选自：酸敏感
Figure BDA0001497347210000031
或二硫键SS或偶氮键
Figure BDA0001497347210000032
所用的荧光素选自：
Figure BDA0001497347210000033
Figure BDA0001497347210000041
形成的可逆终止剂为以下结构中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂：dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII，dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX，dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX，dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI，具体结构如下所示：
Figure BDA0001497347210000042
Figure BDA0001497347210000051
Figure BDA0001497347210000061
Figure BDA0001497347210000071
我们设计合成的系列3′-OH未保护荧光标记核苷酸，该类修饰核苷酸作为测序用试剂，面临的最大挑战为当模板为连续多个相同碱基时，一次是否只能延伸一个可逆终止剂。我们的实验结果表明，我们发展的可逆终止剂具有延伸反应快、DNA聚合酶识别选择性高，不易发生错配且一次延伸反应只延伸一个可逆终止剂。
本发明所述的可逆终止剂在文献基础上进行结构调整和优化，能够很好地做到在DNA聚合酶作用下，当模板为连续多个相同碱基时一次只延伸一个可逆终止剂，并且可实现100％断裂，反应干净、彻底，完美解决了3′-OH未保护核苷酸用于DNA测序时可能遇到的最大问题。
可逆终止剂已经引起广泛重视，然而不论是在二代合成测序还是三代测序中，均很难做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，而我们经过结构调整以及DNA聚合酶的优化组合，做到了一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，这一点对于DNA测序是非常重要的发现。
优选地，所述水溶性双功能连接单元的一端连接有炔基或者叠氮基，另一端连接有羧基活性酯(这样基底表面通过双功能连接单元连接了大量的炔基或者叠氮)；所述水溶性双功能连接单元的一端以酰胺键与基体表面相连，而另一端通过点击化学反应与引物P1连接。
优选地，所述水溶性双功能连接单元包括以下结构式中的至少一种：
Figure BDA0001497347210000081
优选地，所述引物P1为5’-N3修饰的引物或5’-炔基修饰的引物。
更优选地，所述连接单元的一端连接有炔基时，所述引物P1为5’-N3修饰的引物；当所述连接单元的一端连接有叠氮基时，所述引物P1为5’-炔基修饰的引物。
更优选地，所述引物P1的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，步骤S1中，所述修饰步骤包括：
A1、基体表面羟基化：将干净的基体置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使基体表面羟基化；
A2、基体表面氨基化：将经步骤A1处理的基体置于溶剂中与氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加热反应2小时，得到表面带有氨基的基体。
更优选地，步骤S1中，所述修饰步骤具体包括：
A1、玻璃片表面羟基化：将玻璃片采用乙醇和水洗涤、吹干后，置于双氧水和浓硫酸的混合液中80-90℃加热1h，冷却后用水冲洗、吹干；
A2、玻璃片表面氨基化：将经步骤A1处理的玻璃片置于乙醇和氨基硅烷的混合液中60℃下加热反应2小时，氨基硅烷与乙醇的质量比为1:100～1:30，冷却后分别用乙醇、纯水冲洗，得到表面带有氨基的玻璃片；将表面带有氨基的玻璃片浸入DMF与三乙胺的混合液中清洗，DMF与三乙胺的体积比为5:1～10:1，然后分别用DMF、乙醇冲洗，室温干燥，即得。将已经带有氨基的玻璃片使用碱性溶液清洗，有助于将玻片表面彻底清洗干净。
更优选地，步骤A2中，所述氨基硅烷为APTES。
优选地，步骤S1中，将所述连接单元连接于基体表面的步骤包括：将基体片置于含连接单元的DMF/吡啶溶液中，其中DMF与吡啶的体积比为5:1-10:1，所述连接单元在整个溶液体系中的浓度为10mM～50mM，室温浸泡后进行超声处理，真空干燥。
优选地，步骤S1中，将引物P1与所述连接单元连接的步骤包括：将引物P1溶于DMSO/H2O中，DMSO与H2O的体积比为1:3～1:1；取引物P1溶液滴加于基体表面，然后分别滴加碘化亚铜和二异丙基乙胺，两者的摩尔比为1:1，室温反应将引物P1连接在基体表面。
优选地，所述DNA聚合酶为9° N,klenow或Therminator。
优选地，所述基体为玻璃或高分子材料基体。如玻璃片。
第二方面，本发明提供一种基于DNA单分子测序方法的DNA单分子测序系统，包括流通池反应器，流路系统，控制系统，光学系统、检测系统和图像数据处理系统；所述流通池反应器与流路系统、控制系统和光学系统分别连接，所述检测系统一端与光学系统连接，另一端与图像数据处理系统连接；
所述流通池反应器包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物的基体；
所述控制系统包括pH控制系统、温度控制系统。
上述流通池反应器，包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物的基体；所述基体材料可以是玻璃、高分子材料等，用于固定多条DNA链并形成一个适合合成测序用的反应容器；
流路系统，用于可控地操控各种试剂在流通池腔室内的进出；
所述控制系统包括温度控制系统和pH控制系统；温度控制系统，用于调节和维持流通池腔室内的温度；
pH值控制系统，用于调节测序过程中体系的酸碱度；
光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；
检测器系统，用于检测和记录荧光信号；
图像数据处理系统，用于对延伸反应前后的荧光图像进行比对。
所述测序系统为自动化装置并由计算机控制。该系统所述的流通池反应器，通过温度控制系统可在精确的温度等反应条件下固定大量引物DNA序列；然后通过流路系统将延伸反应体系各组份加入流通池反应器，从而进行DNA链延伸、断裂等测序循环，流通池的温度等性能通过设置在计算机内的控制系统可以精确控制，当DNA链延伸之后通过全内反射显微镜光学系统检测参与延伸的具体碱基，确定碱基之后除去荧光素，然后进行下一次延伸，完成多次测序循环。通过光学系统得到的数据采用计算机中的图像数据处理系统进行处理，最终得到待测DNA链的序列信息。
总之，DNA单分子测序系统主要由以下部分组成:
(1)流通池反应器，用于在既定的玻片表面制备固定的DNA引物。
(2)光学系统及自动化数据读取系统，该系统用于准确读取DNA链的循环延伸信息。在相应的仪器中配置了一个单增强型CMOS传感器并配合自动化滤光轮以覆盖四色光的波长范围，从而可检测四种不同荧光素标记的核苷酸。通过程序化的流路控制系统来控制多次循环测序反应中每一步所需的溶液交换。所需的所有试剂都预先封装于特定的试剂盒中，使用者只需要将这些试剂盒塞进仪器相关部位即可。因为光学传感器尺寸小，所以需要一个由光学解码器控制的移动平台，可实现整个样品区域的扫描，以得到足够的数据量从而达到设计的通量。此外还需要一个性能稳定可靠的多波长LED光源用于照明。
(3)计算机工作站(控制系统和图像数据处理系统)，用于原始数据的质量评价和每个单分子的碱基序列读取。该系统包括所有的控制程序、数据获取软件、图像和数据分析等软件，以及其它预先安装的软件包。
第三面，本发明提供一种基于上述DNA单分子测序方法的DNA单分子测序试剂盒，包括基体、引物、水溶性双功能连接单元、固定引物用反应试剂、延伸反应试剂、酶和pH控制试剂。所述单分子测序试剂盒还包括缓冲液或其他必要的测序试剂。
本发明将引物的5′端连接于玻璃表面，然后在DNA聚合酶作用下加入荧光素标记的核苷酸，开始DNA延伸，形成含荧光素的引物/模板复合物，检测荧光素的种类以确定参与延伸的核苷酸，断裂可裂解连接单元以除去荧光素，然后进行第二次延伸，重复此循环，得到大量含模板信息的DNA链固定在玻璃表面。
涉及的实验过程具体包括：玻璃表面的活化使之羟基化、与APTES反应使玻璃表面氨基化，然后与双功能连接单元的活性酯反应，该连接单元的一端为炔基或者叠氮基，另一端为活性酯，这样玻璃表面通过双功能连接单元连接了大量的炔基或者叠氮，进一步炔基(或N3)与5’-N3(或炔基)修饰的引物(P1)通过点击化学反应使引物P1固定于玻璃片上.然后将待测DNA模板在DNA聚合酶作用下，加入延伸反应混合液，合成的四色荧光标记可逆终止剂将参与DNA链延伸，形成含荧光的模板/引物核酸复合物。对延伸后的模板/引物核酸复合物进行成像，以确定参与延伸的DNA碱基种类。将可裂解连接单元断裂即可进行第二次延伸。重复上述步骤，以获得待测模板核苷酸的碱基序列。
本发明通过水溶性双功能连接单元将引物固定于玻璃表面，然后在DNA聚合酶作用下通过延伸、成像、断裂等步骤重复多次以获得待测DNA碱基序列。
我们设计合成的可逆终止剂采用四色荧光标记四个不同碱基核苷酸，相比单色可逆终止剂，具有显而易见的测序快、在延伸体系中同时加入四种可逆终止剂可有效减少错配、增大碱基之间相互准确识别等优势。当然相比Helicos公司的二硫键可逆终止剂，我们的可逆终止剂结构简单、合成容易且较延伸位阻小，更为重要的是经过结构优化，当模板为连续多个碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂，延伸效率为100％，用断裂用化学试剂断裂后可再次延伸，并且断裂与再次延伸的效率均为100％。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提供的双功能连接单元水溶性良好，可以与反应体系各组分相互溶解，形成一个均相体系，有利于提高可逆终止剂延伸、可裂解连接单元的断裂等步骤的效率；同时该连接单元为双功能连接单元，其一端的羧基活性酯与玻璃表面的氨基生成酰胺键而连接，另一端的炔基或者叠氮只能与引物P1的叠氮或者炔基发生点击化学反应而连接，从而避免了使用两端为相同官能团的连接单元(比如两端均为羧基活性酯)时，部分连接单元的两端均可能与玻璃表面连接的问题。
2、本发明提供了一种DNA单分子测序试剂，该类试剂为3′-OH未阻断的修饰核苷酸，即可逆终止剂(reversible terminators)，其共同特点为连接单元与荧光素共同构成一个大小合适的空间位阻，从而有效地保证了在实际测序循环中当模板存在连续多个相同碱基时一次只延伸一个可逆终止剂，解决了在合成测序中为了确保一次只延伸一个可逆终止剂的关键问题。到目前为止，3′-OH未阻断的可逆终止剂很难做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，而我们通过结构调整与优化，实现了精确的一次只延伸一个可逆终止剂的效果。相比之下目前二代测序，即合成测序广泛使用的是3′-OH阻断的可逆终止剂。而Helicos发展的基于二硫键的可逆终止剂，虽然的确能够很好地做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，但是其结构过于复杂、空间位阻太大，导致延伸反应慢，DNA聚合酶不好识别，以及合成路线复杂等问题。
3、本发明提供的测序试剂连同测序方法与系统，能够很好地做到3′-OH未保护的可逆终止剂，一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂。这一点在单分子测序中非常重要。另外，我们发展的3′-OH未保护的可逆终止剂，结构简单，合成容易，制备成本低，非常适合大规模制备。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中引物连接于玻璃片上的示意图；
图2为本发明中DNA单分子测序方法的示意图；
图3为第一次延伸-断裂过程中延伸和断裂的荧光照片；其中，图(3a)为延伸的荧光照片；图(3b)为断裂的荧光照片；
图4为用dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX延伸的荧光信号变化照片；其中：图(4a)为用dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX延伸的荧光照片；图(4b)为用断裂试剂处理后的荧光照片；图(4c)为未采用断裂试剂处理，仅用荧光淬灭试剂处理再加dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX观察到的荧光信号；
图5为在玻璃表面单分子DNA延伸结果的荧光照片；
图6为本发明的DNA合成测序系统示意图；
图7为实施例4中可逆终止剂dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII的延伸结果；
图8为实施例4中各可逆终止剂dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX，dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX和dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI的延伸结果；
图9为实施例4中可逆终止剂dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX的多次延伸断-裂结果；其中，图9(a)为1-4次延伸-断裂结果；图9(b)为第4-6次延伸-断裂结果；
图10为实施例4中四种可逆终止剂同时延伸-断裂结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：水溶性双功能连接单元的合成
一、连接单元1(Linker 1)，直接购买使用.
Figure BDA0001497347210000131
二、连接单元2(Linker 2)的合成路线：
Figure BDA0001497347210000132
连接单元2的制备步骤如下：
1.Dicyclohexylcarbodiimide(DCC)(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min，然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯。
2.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min。逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5。
3.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物5(140mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物6。
4.丙炔胺(化合物7)(55mg，1mmol)和化合物6(174mg,0.5mmol)加入15mL的乙腈中，50度反应20小时。冷却至室温，7500rpm离心5分钟。沉淀用乙腈和水洗涤3次，离心得到连接单元2。
三、连接单元3(Linker 3)的合成：
Figure BDA0001497347210000141
连接单元3的制备步骤如下：
1.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min，然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯。
2.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5。
4.丙炔胺(化合物7)(55mg，1mmol)和化合物5(140mg,0.5mmol)加入15mL的乙腈中，50度反应20小时。冷却至室温，7500rpm离心5分钟。沉淀用乙腈和水洗涤3次，离心得到连接单元3。
四、连接单元4(Linker 4)的合成：
Figure BDA0001497347210000151
连接单元4的制备步骤如下：
1.叠氮化钠(1.3g，20mmol)和化合物4(3.1g，25mmol)加到50mL丙酮和水(1:1)的混合试剂中，加热回流4h.乙醚萃取两次，食盐水洗涤，干燥，减压蒸馏，得到化合物10。
2.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min，然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯。
3.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5。
4.化合物10(87mg，1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物5(140mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到连接单元4。
五、连接单元5(Linker 5)的合成：
Figure BDA0001497347210000161
连接单元5的制备步骤如下：
1.叠氮化钠(1.3g，20mmol)和化合物4(3.1g，25mmol)加到50mL丙酮和水(1:1)的混合试剂中，加热回流4h.乙醚萃取两次，食盐水洗涤，干燥，减压蒸馏，得到化合物10。
2.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min,然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯。
3.化合物10(87mg，1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到连接单元5。
实施例2：连接单元与可逆终止剂的合成
连接单元
Figure BDA0001497347210000162
的合成路线如下：
Figure BDA0001497347210000171
具体合成步骤如下所示：
1)称取乙二醇(6.7ml，120mmol)和乙酸(2.4g，40mmol)于100mL单口瓶中搅拌，滴加0.112mL浓硫酸于反应液中，在25℃下搅拌24h。然后加入17mL饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，再向反应混合液中加入12mL水，用二氯甲烷(50mL*8)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，残余物使用30:1CH2Cl2/MeOH为淋洗剂进行柱层析，得化合物1(2.52g)，产率61％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm4.20(t,2H,J＝4.8Hz),3.82(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,3H),1.93(s,1H).
2)称取2-溴乙醇(9.96g,80mmol)和叠氮化钠(5.72g,88mmol)于100mL的双口瓶中，随后分别加入12mL的水和12mL的丙酮，在回流条件下搅拌6h。然后加入适量的氯化钠使反应液过饱和，滤去氯化钠固体，再用乙醚萃取滤液两次(50mL*2)，收集有机相，旋去溶剂得到淡黄色油状粗品2(8.92g)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):2.82(s,1H),3.45(t,2H,),3.75(t,2H).
3)将化合物1(4.16g,40mmol)和粗品化合物2(5.22g，60mmol)置于250mL双口瓶中，加入80mL无水THF溶解，然后加入PPTS(1.005g，4mmol)搅拌15min，再加入30g
Figure BDA0001497347210000172
分子筛搅拌15min，最后加入呋喃醛(40mmol)，在室温下搅拌48h。停止反应，加入碳酸钾粉末使反应液呈中性，滤去固体，滤液浓缩后，以3:1PE/EtOAc为淋洗剂进行柱层析分离，得预期化合物，产率21％。
4)取上述产物(2.76mmol)置于100mL单口瓶中，加入20mL甲醇溶解，然后加入碳酸钾(8.28mmol)及1mL水，25℃下搅拌过夜。向反应液加入适量的水，用二氯甲烷萃取，干燥后后再旋干溶剂，得到预期产物，产率80％。
5)将化合物4(0.243mmol)溶于3mL甲醇中，再加入5mg Pd/C(10％)，抽真空换气，然后充入氢气于25℃下搅拌过夜。反应混合液过滤，滤液旋干溶剂后得预期连接单元，产率67％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.41(s,1H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),5.60(s,1H),3.73(m,2H),3.60-3.57(m,4H),2.89(m,2H).
相应地，合成了四个基于呋喃缩醛的酸敏感可逆终止剂，其结构如下所示。其合成方法参考专利201410186697.6。
Figure BDA0001497347210000181
其他用于本发明的可逆终止剂采用常规方法合成即可。
实施例3：引物P1固定于玻璃表面
1、玻片表面活化(羟基化)
将玻片(4×4mm)分别用乙醇和水洗涤三次，吹干，置于双氧水(H2O2，30％)和浓硫酸(H2SO4，98％)的混合液(V(H2O2):V(H2SO4)＝7:3)中，在80-90℃下加热1h，自然冷却至室温，用大量水冲洗，吹干。
2、玻片表面修饰
将上述处理过的玻片置于无水乙醇中；加入APTES(氨丙基三乙氧基硅烷)，使体系中APTES与无水乙醇的质量比为1:49，升温至60℃，加热2h，然后冷却至室温；APTES通过硅氧硅键连接在玻璃表面，然后分别用乙醇、纯水冲洗，得到表面带有氨基的玻片；将表面带有氨基的玻片浸入二甲基甲酰胺(DMF)与三乙胺(Et3N)的混合液中，[DMF/Et3N,9:1(v/v)]，浸泡1h后超声5min，然后分别用DMF和乙醇清洗一遍，室温干燥；将上述清洗并干燥的玻片置于连接单元(结构如下图所示)的溶液中{20mM Linker in[DMF/pyridine,9:1(v/v)]}，室温浸泡5h，超声5min，真空干燥。连接单元中的活性酯与玻璃表面的氨基反应，Linker通过酰胺键连接在玻璃表面。
本发明使用的连接单元2-5均自行合成，具有良好的水溶性，在测序体系中可以很好地与其他物质相容，为均相体系，有利于提高反应效率。而连接单元1为直接购买使用。
Figure BDA0001497347210000191
3、5’-N3修饰的引物(P1)固定于玻片上
将5’-N3修饰的primer(P1)溶于DMSO/H2O[1:2(vol/vol)]中，配成30μM的溶液；取该引物溶液10μL滴加于玻片表面，分别滴加1nmol碘化亚铜(CuI)和1nmol二异丙基乙胺(DIPEA)，在室温下反应9h；通过click反应将5’-N3修饰的primer连接在玻璃表面。将连接了primer的玻片用去离子水洗涤，再用SPSC buffer(0.25M磷酸钠/2.5M氯化钠，pH 6.5)浸泡1h，室温晾干。
图1展示连接单元的一端为炔基，引物为5′-叠氮修饰P1，将引物与连接单元连接在玻片的示意图。当连接单元为4和5时，连接单元的一端为叠氮，相应的引物为5′-炔基修饰的P1，同样以点击化学反应将引物连接于玻璃表面。
例如引物P1为如下序列，DNA模板待测序列为如下T1-T4四种序列：
P1(SEQ ID No.1):5’N3–AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
T1(SEQ ID No.2)：
5‘-CAACAACAACAACAACAACAACAACAATTACTACGAAGCTACATCAAGTTAGTAGTTTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
T2(SEQ ID No.3)：
5‘-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAGCCTGTACCTAAAGTTGGCCAGACACCGCATTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
T3(SEQ ID No.4)：
5‘-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAAGTGACGATCTGCCGGATTGCCGTTGGTACTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
T4(SEQ ID No.5)：
5‘-CAACAACAACAACAACAACAACAACAACAGACGTTGGCTGTACCAGTTACGCATCGGTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
本发明中引物固定技术具如下优势：
连接单元为水溶性双功能连接单元，首先连接单元的羧基活性酯一端与玻璃片表面的氨基反应，以酰胺键连接于玻璃表面，而另一端炔基通过点击化学反应与5′-N3修饰的引物相连(或者另一端的叠氮基团通过点击化学反应与5′-炔基修饰的引物相连)，避免了两端均为相同反应官能团时(比如两端均为羧基活性酯)，部分连接单元的两端均可与玻璃相连；另外当良好水溶性的连接单元固定于玻璃片表面时，能够与体系相溶，有利于后续测序过程。
实施例4：测序胶结果证明本发明的可逆终止剂完全可以做到一次只延伸一个可 逆终止剂
我们设计合成的可逆终止剂采用四色荧光标记四个不同碱基核苷酸，相比单色可逆终止剂，具有显而易见的测序快、在延伸体系中同时加入四种可逆终止剂可有效减少错配、增大碱基之间相互准确识别等优势。我们的可逆终止剂结构简单、合成容易且较延伸位阻小，更为重要的是当模板为连续多个碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂，延伸效率几乎为100％，用断裂试剂将连接单元断裂后可再次延伸，并且断裂与再次延伸的效率均为100％。在本实施例中，我们用合成的dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII为例，用测序胶验证其延伸结果，发现当模板为连续多个相同碱基时，dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII一次均只延伸一个，且延伸效率均为100％。图7为dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII的DNA链延伸胶图，从左至右依次为Lane 1、Lane 2、Lane3、Lane4、Lane5。
Lane 1:24nt；
Lane 2:25nt；
Lane 3：oligo 2-3,dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII,延伸产物；(模板一个A)；
Lane 4：oligo 2-4,dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII,延伸产物；(模板2个A)；
Lane 5：oligo 2-5,dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII,延伸产物；(模板4个A)。
在此基础上，我们进一步合成了采用不同荧光素标记的其它三个碱基的可逆终止剂，dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX、dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX和dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI。
用测序胶验证其延伸结果，如图8所示，各泳道如下：
Lane 1:24nt；
Lane 2:25nt；
Lane 3:dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX,延伸产物；(模板一个G)
Lane 4：dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX,延伸产物；(模板二个G)
Lane 5：dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX,延伸产物；(模板一个T)
Lane 6:dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX,延伸产物；(模板二个T)
Lane 7：dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI,延伸产物；(模板一个C)
Lane 8：dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI,延伸产物；(模板三个C)
模板序列如下：
Templates:3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGTCGA(SEQ ID No.7)
3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGGCGA(SEQ ID No.8)
3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCTACGA(SEQ ID No.9)
3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCTTCGA(SEQ ID No.10)
3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCTCGA(SEQ ID No.11)
3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCCCGA(SEQ ID No.12)
Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.6)
上述测序胶实验结果表明，dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX，dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX和dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI当模板为连续多个相同碱基时，一次均只能延伸一个可逆终止剂，且延伸效率几乎为100％。
为了进一步验证此类可逆终止剂参与DNA延伸、断裂以及参与多次测序循环的可行性，我们选用连续六个G的模板以dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX为模型化合物，相应的测序胶实验结果如图9所示，其中，图9(a)的1-9泳道分别表示：24nt，25nt，第一次延伸，第一次断裂，第二次延伸，第二次断裂，第三次延伸，第三次断裂，第四次延伸；使用dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX顺利地进行到第四次延伸，每次只延伸一个，延伸完全，每次均可完全断裂。图9(b)的1-7泳道分别表示：24nt，25nt，第四次延伸，第四次断裂，第五次延伸，第五次断裂，第六次延伸。在连续6个G的模板上，dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX一次只延伸一个，可延伸6次，每次延伸和断裂的产率都很高。
模板序列如下：
Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.6)
Template:3′-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGGGGGGCGCCATGTGC(SEQ ID No.13)
该结果证明，该可逆终止剂一次只延伸一个，其效率为100％，以100％效率断裂后，可再次延伸，共进行6次延伸。每次延伸、断裂效率均接近100％。
进一步的，本实施例还验证了当选用模板为ATCG四个碱基时，将四种可逆终止剂混合均匀全部加入延伸体系，我们发现四个可逆终止剂依次参与DNA链延伸、断裂，一次只延伸一个可逆终止剂，实验测出的模板序列与实际序列完全一致。结果如图10所示，其中各泳道1-9分别为：24nt,25nt，dUTP延(A)，断，dATP延(T),断，dGTP延(C),断，dCTP延(G)。
模板序列如下：
Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.6)
Template:3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGTTCGCCATGTGC(SEQ ID No.14)
在本发明特定选择的可逆终止剂中，采用任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂用于上述实验，其结果均与上述实验结果一致，均能实现一次只延伸一个，延伸效率100％的效果。
实施例5：可逆终止剂参与DNA延伸-断裂等循环测序验证
1、延伸
将连接了引物P1的玻片用TE冲洗一遍，晾干后滴加1μL待测模板T3(30μM)，60℃下保持5min；将用于延伸反应的混合溶液(具体组成及浓度如下所述)(20μL)滴加于玻片表面；并升温至75℃下保持5min，使四个不同碱基的可逆终止剂在该体系中发生延伸反应，然后用TE缓冲液(10mM Tris-HCl and 1mM EDTA,pH＝8.0)冲洗三遍。
用于延伸反应的混合溶液成分如下：
9°N buffer7μL；NaCl(1M)1μL；9°N酶1μL；dUTP可逆终止剂XIV、XIII、VI或XVII(0.5mM)0.8μL；dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX(0.5mM)0.8μL；dCTP可逆终止剂XII、VII、XVI或XX(0.1mM)4μL；dGTP可逆终止剂VIII、X、XVIII或XXI(0.2mM)2μL；ddH2O 3.4μL(每一种可逆终止剂在延伸体系中的浓度均为0.02mM)。
在此延伸过程中，我们比较了不同连接单元1-5，发现其最终单分子测序结果没有明显差别。在此我们选择以连接单元1为例来说明实验结果，其他几种连接单元与之相比，最终实验结果都极为类似。图3为第一次延伸-断裂过程中延伸(左图)和断裂(右图)荧光照片，图中每一个亮点代表一个DNA分子。
2、可裂解连接单元断裂：
将延伸反应之后残余的液体吸干，加入弱酸溶液调节pH值至7.5-8.5，加入断裂用化学试剂(酸敏感连接单元用酸性溶液；二硫键用DTT；偶氮键用连二亚硫酸钠)溶液，37℃下保持3min使可裂解连接单元完全断裂，从而除去标记在碱基上的荧光素，然后用TE缓冲液(10mM Tris-HCl and 1mM EDTA，pH＝8.0)冲洗两遍；重复上述延伸、断裂步骤，从而完成多次测序循环。
图4从左到右依次为：用dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX延伸的荧光信号；用断裂试剂处理后的荧光信号；未采用断裂试剂处理，仅用荧光淬灭试剂处理再加入dATP可逆终止剂XI、IX、XV或XIX后观察到的荧光信号。图4的实验结果表明，延伸后用荧光淬灭试剂处理可有效淬灭荧光，并且再次加入延伸反应的试剂，发现荧光信号几乎没有变化，说明延伸反应后如果可裂解连接单元不断裂，第二个可逆终止剂将不能再次延伸。
图5为在玻璃表面单分子DNA延伸结果图，显示了四色荧光标记核苷酸在玻璃表面的延伸实验结果。
本实施例再次证明，当模板为连续多个相同碱基时，本发明所述可逆终止剂在一次测序循环中只能延伸一个可逆终止剂。
本发明比较了5种水溶性双功能连接单元用于本发明所述的DNA单分子测序方法，它们均能够很好地将DNA链固定于玻璃表面，并有效地实现后续的多次延伸断裂测序循环。并且本实施例再次证明经过优化的可逆终止剂完全可以做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，完美解决了3′-OH未保护可逆终止剂当模板为连续多个相同碱基时，很难做到一次只延伸一个核苷酸的效果。而如Science 2008,320,106-109.报道的二硫键可逆终止剂当模板为连续多个相同碱基时，一次会延伸一个、两个甚至三个可逆终止剂。
采用本发明的DNA单分子测序方法进行验证，结果显示准确率均可达到98.9％。
需要说明的是，本发明提供的单分子测序方法与系统，并不限于目前提出的几类可逆终止剂，也同样适用于其他类型的可逆终止剂。
以上实施例采用了一种DNA单分子测序系统，如图6所示，包括流通池反应器，流路系统，控制系统，检测系统和图像数据处理系统；
所述流通池反应器，流通池反应器包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物的基体；所述基体材料可以是玻璃、高分子材料等，用于固定多条DNA链并形成一个适合合成测序用的反应容器；
流路系统，用于可控地操控各种试剂在流通池腔室内的进出；
所述控制系统包括温度控制系统和pH控制系统；温度控制系统，用于调节和维持流通池腔室内的温度；
pH值控制系统，用于调节测序过程中体系的酸碱度；
光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；
检测器系统，用于检测和记录荧光信号；
图像数据处理系统，用于对延伸反应前后的荧光图像进行比对。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学
<120> DNA单分子测序方法与测序系统
<130> DAG33003
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 2
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 2
caacaacaac aacaacaaca acaacaatta ctacgaagct acatcaagtt agtagttttc 60
gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115
<210> 3
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 3
caacaacaac aacaacaaca acaacaagcc tgtacctaaa gttggccaga caccgcattc 60
gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115
<210> 4
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
caacaacaac aacaacaaca acaacaaagt gacgatctgc cggattgccg ttggtacttc 60
gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115
<210> 5
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 5
caacaacaac aacaacaaca acaacaacag acgttggctg taccagttac gcatcggttc 60
gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 6
gaggaaaggg aagggaaagg aagg 24
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
ctcctttccc ttccctttcc ttccgtcga 29
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<211> 29
<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
ctcctttccc ttccctttcc ttccggcga 29
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
ctcctttccc ttccctttcc ttcctacga 29
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 10
ctcctttccc ttccctttcc ttccttcga 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 11
ctcctttccc ttccctttcc ttccctcga 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 12
ctcctttccc ttccctttcc ttcccccga 29
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<220>
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<400> 13
ctcctttccc ttccctttcc ttccgggggg cgccatgtgc 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 14
ctcctttccc ttccctttcc ttccatcgtt cgccatgtgc 40

Claims (7)

1.一种DNA单分子测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对基体表面进行修饰，然后将水溶性双功能连接单元连接于基体表面；再将引物P1与所述水溶性双功能连接单元连接，即得固定有引物P1的基体；
S2、将含待测DNA模板、聚合酶、四色荧光标记可逆终止剂的混合溶液置于所述固定有引物P1的基体上，进行延伸，形成含荧光素的引物/模板复合物；
S3、对延伸后的引物/模板复合物进行成像，确定参与延伸的核苷酸碱基种类；
S4、将参与延伸的核苷酸的可裂解连接单元断裂，进行下一次延伸；
S5、重复上述步骤S2至步骤S4，获得待测DNA模板的碱基序列；
所述的四色荧光标记可逆终止剂为以下结构中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂：
Figure FDA0002752632910000011
Figure FDA0002752632910000021
所述水溶性双功能连接单元的一端连接有炔基或者叠氮基，另一端为羧基活性酯；所述水溶性双功能连接单元的一端以酰胺键与基体表面相连，而另一端通过点击化学反应与引物P1连接；
所述水溶性双功能连接单元包括以下结构式中的至少一种：
Figure FDA0002752632910000031
2.根据权利要求1所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，所述引物P1为5’-N3修饰的引物或5’-炔基修饰的引物。
3.根据权利要求1所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤S1中，所述修饰步骤包括：
A1、基体表面羟基化：将干净的基体置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使基体表面羟基化；
A2、基体表面氨基化：将经步骤A1处理的基体置于溶剂中与氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加热反应2小时，得到表面带有氨基的基体。
4.根据权利要求1所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤S1中，将所述连接单元连接于基体表面的步骤包括：将基体片置于连接单元的DMF/吡啶溶液中，其中DMF与吡啶的体积比为5:1-10:1，所述连接单元在整个溶液体系中的浓度为10mM～50mM，室温浸泡后进行超声处理，真空干燥。
5.根据权利要求1所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤S1中，将引物P1与所述连接单元连接的步骤包括：将引物P1溶于DMSO/H2O中，DMSO与H2O的体积比为1:3～1:1；取引物P1溶液滴加于基体表面，然后分别滴加碘化亚铜和二异丙基乙胺，两者的摩尔比为1:1，室温反应将引物P1连接在基体表面。
6.一种基于权利要求1所述的DNA单分子测序方法的DNA单分子测序系统，其特征在于，包括流通池反应器、流路系统、控制系统、光学系统、检测系统和图像数据处理系统；所述流通池反应器与流路系统、控制系统和光学系统分别连接，所述检测系统一端与光学系统连接，另一端与图像数据处理系统连接；
所述流通池反应器包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物的基体；
所述控制系统包括pH控制系统、温度控制系统。
7.一种基于权利要求1所述的DNA单分子测序方法的DNA单分子测序试剂盒，其特征在于，包括基体、引物、水溶性双功能连接单元、固定引物用反应试剂、延伸反应试剂、酶和pH控制试剂。
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