CN110055318A - 一种基于点击化学的三维dna微阵列表面的制备方法 - Google Patents

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吕华
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Abstract

本发明提供了一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，包括：在固体表面上利用图案化裂解方式形成图案化反应基团微阵列；对反应基团于图案化反应基团微阵列上进行固定得到反应基团微阵列；将反应性功能高分子于反应基团微阵列上共价固定形成三维反应性高分子微阵列；对带反应基团的DNA引物于三维反应性高分子微阵列上进行共价固定形成三维DNA引物微阵列表面，其中，共价固定反应性功能高分子和DNA引物至少一种采用点击化学法固定。本发明基于点击化学法利用三维表面反应性高分子来形成三维反应性高分子微阵列流动池表面，进一步可构建DNA引物三维表面结构，制备方法简单快捷，且制备效率高。

Description

一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法。
背景技术
DNA测序正在推动基因组学研究和发现，将要广泛应用的精准医疗，个人医学也要依靠DNA测序来实现。长达10多年(1990-2003)的人类基因组计划的不朽业绩是由全世界很多基因中心的很多科学家用第一代Sanger DNA测序技术来完成的，中国科学家参与了大约1％的工作。第一代基因测序至今还是重要的基因测序方法，是基于Sanger的双脱氧终止剂的DNA测序技术，用荧光标记的双脱氧终止剂来进行DNA测序。
测序用流动池的表面化学是高通量基因测序仪的关键，图案化流动池可以大大提供测序通量。基于荧光检测的高通量基因测序仪的流动池是用高透明性的材料(比如玻片等等)作为基底组成。透明基底要用化学方法或/和物理方法进行表面活化，然后在基底表面上就地形成或共价固定住反应性高分子形成三维反应性高分子表面。随后再在反应性高分子上共价固定反应性DNA引物形成DNA引物三维表面。利用三维表面高分子来形成DNA引物三维表面结构可以形成高密度的DNA引物结构，这样的表面可以产生高信噪比的测序信息来进行高通量DNA测序。
现有的三维表面化学的制备方法中，存在固定方法繁琐，固定效率低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法以解决现有技术的不足。
为解决上述问题，本发明提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，包括：
在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化反应基团微阵列；
对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列；
将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列；
对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面；
其中，共价固定反应性功能高分子和共价固定带反应基团的DNA引物的方法中，至少一种采用点击化学法固定。
优选地，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化反应基团微阵列”包括：
利用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，于所述固体表面上形成NH2基团，得到具NH2基团表面；
在所述具NH2基团表面上共价固定可光裂解反应化合物，构建包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面；
对所述可光裂解基团表面进行图案化光解，形成所述图案化基团微阵列。
优选地，所述“对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列”包括：
取含有反应基团的化合物置于作为反应试剂的无水二甲基甲酰胺中；
加入三乙胺，得到第一混合溶液；
将所述第一混合溶液加入所述图案化基团微阵列中，静置、冲洗并干燥后，得到所述反应基团微阵列。
优选地，所述反应基团为N3基团和/或炔烃基团；
所述含有反应基团的化合物为包含有N3基团的叠氮基团化合物和/或包含有炔烃基团的炔烃基团化合物。
优选地，所述功能高分子为带炔烃基团的高分子化合物或带叠氮基团的高分子化合物；并且，
在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带炔烃基团的高分子化合物；
在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带叠氮基团的高分子化合物。
优选地，在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为N3反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带炔烃基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第二混合溶液；
将所述第二混合溶液点样于所述N3反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维反应性高分子微阵列表面。
优选地，在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为炔烃反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带叠氮基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第三混合溶液；
将所述第三混合溶液点样于所述炔烃反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维高分子微阵列表面。
优选地，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化基团微阵列”之前，还包括：
对所述固体表面进行活化处理，包括：
对所述固体表面在水溶液中进行超声清洗；
取氨水、双氧水和去离子水以1:1:5比例混合，得到第四混合溶液；并将所述固体表面置入所述第四混合溶液中超声清洗；
将所述固体表面于去离子水中清洗，取出后用氩气干燥，并烘烤，即得到活化处理后的所述固体表面。
优选地，在所述三维反应性高分子微阵列为带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带叠氮基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带叠氮基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
优选地，在所述三维反应性高分子微阵列为带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带炔烃基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带炔烃基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
所述反应基团为N3基团和/或炔烃基团
本发明提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，通过在固体表面上进行图案化裂解形成图案化基团微阵列，并将反应基团固定在该微阵列上，得到反应基团微阵列，进而再对功能高分子于得到的反应基团微阵列上进行共价固定，从而得到三维反应性高分子微阵列，最后于三维反应性高分子微阵列上共价固定DNA引物得到DNA引物微阵列表面，其中共价固定反应性功能高分子和共价固定DNA引物的步骤中至少其中一个为点击化学法。本发明基于点击化学法利用三维表面高分子来形成三维高分子微阵列流动池表面，进一步可构建DNA引物三维表面结构，形成高密度的DNA引物结构，可产生高信噪比的测序信息来进行DNA测序，采用点击化学法实现共价固定从而得到三维高分子微阵列及DNA引物三维微阵列表面，制备方法简单，快捷，且制备效率高。
附图说明
图1为本发明基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法的链接关系示意图；
图2为本发明基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法中，将含炔烃基团的高分子化合物进行点击化学法固定形成DNA引物三维微阵列的反应过程示意图；
图3为本发明基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法中，将含叠氮基团的高分子化合物进行点击化学法固定形成DNA引物三维微阵列的反应过程示意图；
图4为本发明基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法中炔烃基团标记的固体表面与环状炔烃基团标记的固体表面示意图；
图5为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中Cu(I)催化点击固定带N3基团的功能高分子，于带炔烃基团标记的反应基团微阵列形成带N3基团的三维高分子微阵列流动池表面示意图；
图6为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中Cu(I)催化点击固定带炔烃基团的功能高分子于带N3基团标记的反应基团微阵列形成带炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面示意图；
图7为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中Cu(I)催化点击固定炔烃引物于带N3基团的三维高分子微阵列流动池表面上形成三维DNA引物微阵列。
图8为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中Cu(I)催化点击固定叠氮引物于带炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面上形成三维DNA引物微阵列。
图9为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法实施例3中的1-(溴甲基)-2-硝基苯与固体平面的共价链接反应示意图；
图10为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法实施例4的1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯与固体平面的共价链接反应示意图；
图11为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法实施例5的1-(1-溴乙基)-2-硝基苯与固体平面的共价链接反应示意图；
图12为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法实施例6的1-(溴甲基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯与固体平面的共价链接反应示意图；
图13为本发明基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法实施例7的图案化光解反应示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
参考图1-8，本实施例提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，包括：
在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化反应基团微阵列；
对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列；
将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列；
对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面；
其中，共价固定反应性功能高分子和共价固定带反应基团的DNA引物的方法中，至少一种采用点击化学法固定。
上述，固体表面，可以为透明的带有反应基团的固体基底表面。其规格可以为25毫米x75毫米x 0.5毫米玻片，或任何其他规格的透明固体表面。
需要说明的是，目前市场主流测序仪是Illumina的各类测序仪，Illumina的各种测序仪的中心部分是流动池。早期的Illumina流动池是在活化玻片表面是铺上一层带反应基团的高分子后再共价固定反应性引物(reactive primers)；然后在流动池内进行就地桥式PCR扩增形成有几千或上万同一种DNA分子的超大量单克隆簇和两种以上DNA分子的多克隆簇。最后在流动池里进行SBS(Sequencing by Synthesis)得到DNA测序信息，但只有单克隆的簇才会产生有用的测序信息。
表面生物微阵列(比如DNA，蛋白质，抗体，半抗原，适体，碳水化合物微阵列)广泛用于即时检测(POCT)技术中定性和定量检测生物样品中某种生物分子。DNA微阵列广泛用于基因表达和基因分型，很多种基因测序技术也有用到DNA微阵列，这样可以实现同时高通量监测基因。
图案化裂解，即为通过掩模曝光脱去保护基团，选择性活化。在本实施例中，即为让固体基底表面形成图案化的反应基团微阵列。具体的，图案化裂解，可以基于一种裂解装置，该装置的大部分区域是封闭的，置于表面上时只有点阵部分可以透光(或透化学试剂)来裂解点阵上的点。
上述，反应基团即为，用于在图案化基团微阵列上进行加载，形成反应基团微阵列的基团，在本实施例中，其中反应基团在本实施例中可以设为D1。
上述，功能高分子，即为反应性功能高分子，其与反应基团可发生共价反应并进行共价固定，从而实现功能高分子固定于反应基团微阵列上，实现共价链接，最终得到三维高分子微阵列流动池表面。其中，功能高分子在本实施例中可以设为D2。
上述，将DNA引物，设为D3。
其中，作为D1的反应基团与图案化基团微阵列之间，作为D2的功能高分子与反应基团微阵列之间，均需要可进行共价反应，从而形成共价固定。共价固定的步骤，可以为通过点击化学法实现点击反应，从而实现固定，也可以通过用常规共价固定的步骤来实现固定。此外，D1与固体表面之间的固定，可以为非点击固定法的固定。
需要说明的是，点击化学，又译为“链接化学”、“动态组合化学”、“速配接合组合式化学”，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。点击化学的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应。
图案化反应基团微阵列上可以共价固定形成N3基团微阵列，合成反应性功能高分子带有炔烃基团，再采用带N3基团的DNA引物，用双点击化学的方法来制作三维DNA引物微阵列。高分子可以是含炔烃基团的单体的均聚物，也可以是含炔烃基团的单体和一种或两种以上的没有反应基团的单体的共聚物或多聚物，从而固定带N3基团的DNA引物形成三维DNA引物微阵列，可进一步进行DNA高通量测序应用。这种用点击化学法形成的三维DNA引物微阵列可以用于基因检测和测序。
其中，炔烃基团，在为环状结构时，点击化学法中不必须要用Cu做催化剂。
本实施例提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，通过在固体表面上进行图案化裂解形成图案化基团微阵列，并将反应基团共价固定在该微阵列上，得到反应基团微阵列，进而再对反应性功能高分子于得到的反应基团微阵列上进行共价固定，从而得到反应性三维高分子微阵列，在反应性三维高分子微阵列上固定带反应基团的DNA引物形成三维DNA引物微阵列，其中固定反应性功能高分子和固定带反应基团的DNA引物的两个共价固定步骤中至少其中一个为点击化学法。本实施例基于点击化学法利用三维表面高分子来形成三维高分子微阵列流动池表面，进一步可构建DNA引物三维表面结构，形成高密度的DNA引物结构，可产生高信噪比的测序信息来进行DNA测序，采用点击化学法实现共价固定从而得到三维高分子微阵列流动池表面及三维DNA引物微阵列，制备方法简单，快捷，且制备效率高。
进一步的，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化基团微阵列”包括：
利用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，于所述固体表面上形成NH2基团，得到具NH2基团表面；
在所述具NH2基团表面上共价固定可光裂解反应化合物，构建包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面；
对所述可光裂解基团表面进行图案化光解，形成所述图案化基团微阵列。
上述，3-氨丙基三甲氧基硅烷是一种有机化合物，分子式为C6H17NO3Si。通过3-氨丙基三甲氧基硅烷，可实现让玻片表面上形成NH2基团。制备好的玻片(具NH2基团表面)用于下一步共价固定一层可光解链接链于基底表面上。
上述，可光裂解反应化合物，可以为通过与NH2基团表面发生反应后，生成包含可光裂解小分子化合物或官能团的可光裂解基团表面。进一步的，可对得到的可光裂解基团表面进行光解反应，从而得到图案化基团微阵列。其中，可光裂解反应化合物，可以包括但不限于1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯、1-(1-溴乙基)-2-硝基苯、1-(溴甲基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯等。
上述，对所述可光裂解基团表面进行图案化光解，形成所述图案化基团微阵列，具体可以为，对可光裂解基团表面进行光照，通过光照目标区域，时间可以为1分钟或更长或更短，在光照后，目标区域的圆圈内发生光解，产生NH2基团，从而得到图案化基团微阵列。
进一步的，所述“对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列”包括：
取含有反应基团的化合物置于作为反应试剂的无水二甲基甲酰胺中；
加入三乙胺，得到第一混合溶液；
将所述第一混合溶液加入所述图案化基团微阵列中，静置、冲洗并干燥后，得到所述反应基团微阵列。
上述，对反应基团与所述图案化基团微阵列进行固定，一般是用常规共价化学反应实现固定，此外，也可以在此利用点击化学法实现固定。
上述，例如，利用共价反应，让图案化反应基团微阵列的表面上负载作为反应基团的N3基团，形成N3基团微阵列。或者，让图案化基团微阵列的表面上负载炔烃基团，形成炔烃基团微阵列。再例如，不采用点击化学法固定反应性功能高分子，让图案化基团微阵列的表面上共价反应带上-COOH基团和其活化酯，然后活化形成-COOH基团的五氟苯基活化酯或NHS活化酯微阵列。
上述，无水二甲基甲酰胺即为无水DMF。第一混合溶液中，包含有溶解于无水二甲基甲酰胺的含有反应基团的共价化合物，以及滴加的三乙胺。进一步的，将第一混合溶液滴加到该图案化基团微阵列中，并且在静置后，通过冲洗和干燥后，即得到反应基团微阵列。
其中，优选地，静置的时间可以为6个小时，冲洗的溶剂可以为乙醇，并且干燥可以为通过氩气进行吹干。
进一步的，所述反应基团为N3基团和/或炔烃基团；
所述含有反应基团的化合物为包含有N3基团的叠氮基团化合物和/或包含有炔烃基团的炔烃基团化合物。
上述，进行点击化学反应的反应物，需要含有N3基团和/或炔烃基团。所以在本实施例中，其反应基团为N3基团和炔烃基团。进而含有反应基团的化合物可以为包含有N3基团的叠氮基团化合物和包含有炔烃基团的炔烃基团化合物。例如，含有反应基团的化合物，可以为包含N3基团的5-叠氮戊酸NHS活化酯、包含炔烃基团的丁基-3-炔酸NHS活化酯。
此外，包含N3基团的5-叠氮戊酸NHS酯、包含炔烃基团的丁基-3-炔酸NHS酯均为进行点击化学法进行固定的化合物，如果采取非点击化学法的固定反应性功能高分子的方法，此化合物则可以为不包含N3基团和炔烃基团的反应基团的化合物，例如，琥珀酸酐，通过反应可使图案化表面上负载上-COOH基团和其活化酯，从而活化形成-COOH基团的五氟苯基活化酯或NHS活化酯微阵列。
进一步的，所述功能高分子为带炔烃基团的高分子化合物或带叠氮基团的高分子化合物；并且，在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带炔烃基团的高分子化合物；
在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带叠氮基团的高分子化合物。
上述，基于点击化学法，反应性功能高分子和反应基团微阵列上的反应基团是相对应的，才能进行点击化学反应。如果反应基团微阵列表面上的为叠氮基团，则功能高分子需要为含炔烃高分子化合物；如果反应基团微阵列表面上的基团为炔烃基团，则功能高分子为含叠氮高分子化合物。
进一步的，在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为N3反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带炔烃基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第二混合溶液；
将所述第二混合溶液点样于所述N3反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维反应性高分子微阵列表面。
上述，基于点击化学法，在表面上化合物为含叠氮基团化合物(例如由5-叠氮戊酸NHS活化酯共价固定而成)，得到的反应基团微阵列即为包含有N3的反应基团微阵列。则进行进一步反应的高分子化合物，为含炔烃基团的高分子化合物【例如，N，N-二甲基丙烯酰胺-N-(炔丙基)丙烯酰胺共聚物】，才可与反应基团微阵列的N3反应基团进行点击化学反应实现固定。其中，炔烃高分子化合物可以包括但不限于N，N-二甲基丙烯酰胺-N-(炔丙基)丙烯酰胺Poly(DMA-co-PAA)等。
优选地，点击化学反应可以在室温下进行，并且由N，N-二甲基丙烯酰胺-N-(炔丙基)丙烯酰胺Poly(DMA-co-PAA)的炔烃高分子化合物无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶液组成混合溶液，并将该混合溶液点样至N3反应基团微阵列中，进行反应，从而形成三维高分子微阵列流动池表面。
进一步的，在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为炔烃反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带叠氮基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第三混合溶液；
将所述第三混合溶液点样于所述炔烃反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维高分子微阵列表面。
上述，基于点击化学法，在固体表面上化合物为含炔烃基团化合物(例如由丁基-3-炔酸NHS活化酯共价固定而成)时，得到的反应基团微阵列即为包含有炔烃基团的反应基团微阵列。则进行进一步反应的高分子化合物，为叠氮高分子化合物【例如N，N-二甲基丙烯酰胺-N-(3-叠氮丙基)丙烯酰胺共聚物】，才可与反应基团微阵列的炔烃反应基团进行点击化学反应实现固定。所述含叠氮基团的高分子化合物可以包括但不限于N，N-二甲基丙烯酰胺-N-(3-叠氮丙基)丙烯酰胺共聚物Poly(DMA-PAAA)等。
此外，如果此处的共价固定采用非点击化学法，则其中进行反应的即为活化基团，非点击化学基团。
进一步的，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化基团微阵列”之前，还包括：
对所述固体表面进行活化处理，包括：
对所述固体表面在水溶液中进行超声清洗；
取氨水、双氧水和去离子水以1:1:5比例混合，得到第四混合溶液；并将所述固体表面置入所述第四混合溶液中超声清洗；
将所述固体表面于去离子水中清洗，取出后用氩气干燥，并烘烤，即得到活化处理后的所述固体表面。
在需要使用时，用氩气吹干，并烘烤干燥即可。这种预先处理过的玻片(固体表面)水接触角应该是小于10度。处理好的基底可以用于形成一层NH2基团，然后再固定一层可光解链接链于基底表面上。
进一步的，在所述三维反应性高分子微阵列为带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带叠氮基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带叠氮基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
进一步的，在所述三维反应性高分子微阵列为带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带炔烃基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带炔烃基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
上述，在得到三维高分子微阵列流动池表面后，可将DNA引物与该表面进行反应链接固定，从而得到DNA引物三维微阵列，以便于进一步的用该DNA引物三维微阵列进行基因测序。
上述，基于点击化学法，点击固定N3-DNA引物于带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列上形成三维DNA引物微阵列。或者，点击固定炔烃-DNA引物于带N3基团的三维反应性高分子微阵列上形成三维DNA引物微阵列。具体的，其反应条件优选的为室温，配置中性混合溶液，其pH可以为7。并且，将混合中性溶液点样于该三维高分子微阵列流动池表面上，可反应得到DNA引物三维微阵列。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，固定表面的活化处理方法，包括：
1、取25毫米x75毫米x 0.5毫米玻片，在0.5wt％SDS水溶液里超声处理20分钟，并用去离子水彻底清洗干净；
2、置于29％氨水、30％过氧化氢(H2O2)、去离子水的体积比为1:1:5混合溶液中超声处理20分钟后，用去离子水彻底清洗干净；
3、置于38％HCl、30％过氧化氢、去离子水的体积比为1:1:6的混合溶液里超声处理20分钟后，用去离子水彻底清洗干净；
4、处理好的固体表面放置于去离子水里盖紧保存，使用时取出用氩气吹干后在110℃烘烤5分钟。
其中，经过活化的固体表面的水接触角需小于10度。活化处理后的固体表面的基底可以用于形成一层NH2基团，然后再固定一层可光解链接链于基底表面上。
实施例2：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，用3-氨基丙基三甲氧基硅烷让固体表面上形成NH2基团、得到具NH2基团表面的方法，包括：
1、取带螺旋盖的聚丙烯芯片管，加入30mL无水乙醇、500μL3-氨基丙基三甲氧基硅烷和20μL三乙胺，并且放入5片预先处理过(活化过，如实施例1所活化的固体表面)的固体表面后摇动3小时；
2、把该固体表面取出来后用足量95％乙醇清洗，用氩气吹干后放于110℃烘箱里退火处理5分钟；
需要说明的是，制备好的固体表面即为具NH2基团表面，用于进一步共价固定一层可光裂解小分子官能团于基底表面上。
实施例3：
参考图9，本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，于具NH2基团表面上共价固定1-(溴甲基)-2-硝基苯(光裂解反应化合物)的方法，包括：
取2.16mg 1-(溴甲基)-2-硝基苯，在2mL无水乙醇(FW 214.96，0.01mmol，5mM)溶解；
加入2μL DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，d＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到如实施例2所制备的具NH2基团表面上；
静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面，其中所述可光裂解基团表面不带有反应基团。
实施例4：
参考图10，本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，于具NH2基团表面上共价固定1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯(光裂解反应化合物)的方法，包括：
取2.30mg 1-(1-溴乙基)-2-硝基苯于2mL无水乙醇(FW 230.06，0.01mmol，5mM)溶解；
加入2μL DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，d＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到如实施例2所制备的具NH2基团表面上；
静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面，其中所述可光裂解基团表面不带有反应基团。
实施例5：
参考图11，本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，于具NH2基团表面上共价固定1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(光裂解反应化合物)的方法，包括：
取2.30mg 1-(1-溴乙基)-2-硝基苯在2mL无水乙醇(FW 230.06，0.01mmol，5mM)溶解；
加入2μLDIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，d＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到如实施例2所制备的具NH2基团表面上；
静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面，其中所述可光裂解基团表面不带有反应基团。
实施例6：
参考图12，本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，于具NH2基团表面上共价固定1-(溴甲基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯(光裂解反应化合物)的方法，包括：
取2.76mg 1-(溴甲基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯在2mL无水乙醇(FW276.09，0.01mmol，5mM)溶解；
加入2μLDIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，d＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到如实施例2所制备的具NH2基团表面上；
静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面，其中所述可光裂解基团表面不带有反应基团。
实施例7：
参考图13，本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，图案化光解可光裂解基团表面，得到图案化基团微阵列的方法，包括：
取所述可光裂解基团表面，光照目标区域内1分钟，光照后在所述目标区域内产生NH2基团，即得到图案化基团微阵列。
实施例8：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，对反应基团(N3基团)与所述图案化基团微阵列进行固定，得到反应基团微阵列的方法，包括：
1、取5-叠氮戊酸NHS活化酯(固定于表面的化合物，FW 240.22，2.40mg，0.01mmol)在5mL无水DMF里(2mM)溶解；
2、加三乙胺(反应试剂，FW 101.19，d＝0.73,0.42μL，0.03mmol，6mM)，滴加到图案化NH2基团微阵列上；
3、静置6小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到叠氮反应基团微阵列。
实施例8：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，对反应基团(炔烃基团)与所述图案化基团微阵列进行固定，得到反应基团微阵列的方法，包括：
1、取丁基-3-炔酸NHS活化酯(固定于表面的化合物，FW 181.15,1.81mg,0.01mmol)在5mL无水DMF里(2mM)溶解；
2、加三乙胺(反应试剂，FW 101.19，d＝0.73,4.16μL，0.03mmol，6mM)，滴加到图案化NH2基团微阵列上；
3、静置6小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到炔烃反应基团微阵列。
实施例9：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，对反应基团(羧基基团及其活化酯)与所述图案化基团微阵列进行固定，得到羧基活化酯的反应基团微阵列的方法，包括：
1、取琥珀酸酐(共价化合物，FW 100.01,2mg，0.02mmol)在5mL无水DMF里(4mM)溶解；
2、加三乙胺(反应试剂，FW 101.19，d＝0.73,8.32μL，0.03mmol，6mM)，滴加到图案化基团微阵列上；
3、静置6小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到反应基团微阵列。
三氟乙酸五氟苯酯(FW 280.07,2.8mg,0.01mmol)5mL无水DMF里(2mM)，加吡啶(FW79.10,d＝0.982,0.89μL,0.011mmol,2.2mM),静置6小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干，即得到包含-COOH基团的五氟苯基活化酯微阵列，即为反应基团微阵列。
实施例10：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，形成含炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，取5mgN，N-二甲基丙烯酰胺-N-(炔丙基)丙烯酰胺共聚物Poly(DMA-PAA)、50％DMA和50％PAA、5mg CuSO4.5H2O、1mg抗坏血酸钠、60mgNaCl溶解于10mL水里得到第二混合溶液；
2、将所述第二混合溶液的pH调到7.0；
3、点样于N3反应基团微阵列上，静置6小时，用水冲洗多次，得到所述含炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面。
实施例11：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，形成含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，取5mgN，N-二甲基丙烯酰胺-N-(3-叠氮丙基)丙烯酰胺共聚物Poly(DMA-PAAA)，50％DMA和50％PAAA，5mg CuSO4.5H2O，1mg抗坏血酸钠，60mgNaCl溶解于10mL水里，得到第二混合溶液；
2、将第二混合溶液的pH调到7.0；
3、点样于炔烃反应基团微阵列上，静置6小时，用水冲洗多次，得到所述含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面。
实施例12：
本实施例提供一种基于点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，形成含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，取5mgN，N-二甲基丙烯酰胺-N-(3-叠氮丙基)丙烯酰胺共聚物Poly(DMA-PAAA)，80％DMA和20％PAAA，5mg CuSO4.5H2O，1mg抗坏血酸钠，60mgNaCl溶解于10mL水里，得到第二混合溶液；
2、将第二混合溶液的pH调到7.0；
3、点样于炔烃微阵列玻片基底表面上，静置6小时，用水冲洗多次，得到所述含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面。
实施例13：
本实施例提供一种基于非点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，形成含炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，取NH2微阵列基底玻片做成的流动池中加入0.5mLN-(炔丙基)丙烯酰胺-2-乙烯基-4，4’-二甲基阿扎内酯共聚物Poly(PAA-co-VAL)，50％PAA和50％VAL无水乙腈溶液：25mL；其中，乙腈溶液里加有15μL三乙胺，87.0mg的Poly(PAA-co-VAL)，50％PAA和50％VAL；
2、轻轻翻滚摇动19小时后取出流动池，用足量的乙腈冲洗后吹干，得到所述含炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面。
实施例14：
本实施例提供一种基于非点击化学的三维高分子微阵列流动池表面的制备方法中，形成含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，NH2微阵列基底玻片做成的流动池中加入0.5mLN-(3-叠氮丙基)丙烯酰胺-2-乙烯基-4，4’-二甲基阿扎内酯共聚物Poly(PAAA-co-VAL)，50％PAAA和50％VAL无水乙腈溶液：25mL；其中，乙腈溶液里加有15μL三乙胺，87.0mg的Poly(PAA-co-VAL)，50％PAAA和50％VAL；
2、轻轻翻滚摇动19小时后取出流动池，用足量的乙腈冲洗后吹干，得到所述含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面。
实施例15：
本实施例提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法中，点击固定N3-DNA引物于带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列上形成三维DNA引物微阵列，即形成三维DNA引物微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，用1μM N3-DNA引物(叠氮引物)浓度，5mg CuSO4.5H2O，1mg抗坏血酸钠，60mgNaCl在10mL水里，pH调到7.0得到中性溶液；
2、点样中性溶液于带炔烃基团的三维高分子微阵列流动池表面上，静置6小时，用水冲洗多次，得到所述DNA引物三维微阵列。
实施例16：
本实施例提供一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法中，点击固定炔烃引物于带N3基团的三维反应性高分子微阵列上形成三维DNA引物微阵列，即形成三维DNA引物微阵列流动池表面的方法，包括：
1、室温下，用1μM浓度的炔烃-DNA引物(炔烃引物)，5mg CuSO4.5H2O，1mg抗坏血酸钠，60mgNaCl在10mL水里，pH调到7.0得到中性溶液；
2、点样中性溶液于含叠氮基团的三维高分子微阵列流动池表面表面上，静置6小时，用水冲洗多次，得到所述DNA引物三维微阵列。

Claims (10)

1.一种基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，包括：
在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化反应基团微阵列；
对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列；
将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列；
对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面；
其中，共价固定反应性功能高分子和共价固定带反应基团的DNA引物的方法中，至少一种采用点击化学法固定。
2.如权利要求1所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化反应基团微阵列”包括：
利用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，于所述固体表面上形成NH2基团，得到具NH2基团表面；
在所述具NH2基团表面上共价固定可光裂解反应化合物，构建包含反应后生成的可光裂解小分子官能团的可光裂解基团表面；
对所述可光裂解基团表面进行图案化光解，形成所述图案化基团微阵列。
3.如权利要求1所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，所述“对反应基团于所述图案化反应基团微阵列上进行固定，得到反应基团微阵列”包括：
取含有反应基团的化合物置于作为反应试剂的无水二甲基甲酰胺中；
加入三乙胺，得到第一混合溶液；
将所述第一混合溶液加入所述图案化基团微阵列中，静置、冲洗并干燥后，得到所述反应基团微阵列。
4.如权利要求3所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，
所述反应基团为N3基团和/或炔烃基团；
所述含有反应基团的化合物为包含有N3基团的叠氮基团化合物和/或包含有炔烃基团的炔烃基团化合物。
5.如权利要求4所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，
所述功能高分子为带炔烃基团的高分子化合物或带叠氮基团的高分子化合物；并且，
在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带炔烃基团的高分子化合物；
在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，所述功能高分子为对应的所述带叠氮基团的高分子化合物。
6.如权利要求5所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，
在所述含有反应基团的化合物为所述叠氮基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为N3反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带炔烃基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第二混合溶液；
将所述第二混合溶液点样于所述N3反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维反应性高分子微阵列表面。
7.如权利要求5所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，
在所述含有反应基团的化合物为所述炔烃基团化合物时，得到的所述反应基团微阵列为炔烃反应基团微阵列；
所述“将反应性功能高分子于所述反应基团微阵列上共价固定，形成三维反应性高分子微阵列”包括：
室温下，取所述带叠氮基团的高分子化合物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水中，得到第三混合溶液；
将所述第三混合溶液点样于所述炔烃反应基团微阵列中，静置、冲洗后，得到所述三维高分子微阵列表面。
8.如权利要求1所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，所述“在固体表面上，利用图案化裂解方式，形成图案化基团微阵列”之前，还包括：
对所述固体表面进行活化处理，包括：
对所述固体表面在水溶液中进行超声清洗；
取氨水、双氧水和去离子水以1:1:5比例混合，得到第四混合溶液；并将所述固体表面置入所述第四混合溶液中超声清洗；
将所述固体表面于去离子水中清洗，取出后用氩气干燥，并烘烤，即得到活化处理后的所述固体表面。
9.如权利要求8所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，在所述三维反应性高分子微阵列为带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带叠氮基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带叠氮基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带炔烃基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
10.如权利要求9所述基于点击化学的三维DNA微阵列表面的制备方法，其特征在于，在所述三维反应性高分子微阵列为带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列时，对应的DNA引物为带炔烃基的DNA引物；
所述“对带反应基团的DNA引物于所述三维反应性高分子微阵列上进行共价固定，形成三维DNA引物微阵列表面”包括：
室温下，取所述带炔烃基的DNA引物、无水硫酸铜、抗坏血酸钠、氯化钠溶解于水溶液中，调节pH得到中性溶液；
将所述中性溶液点样于所述带叠氮基团的三维反应性高分子微阵列上，得到所述DNA引物三维微阵列。
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