CN109563500A - 用于缀合生物分子的吖内酯官能化的基底 - Google Patents

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Abstract

双官能聚合物在一端用吖内酯端基官能化以缀合所需生物分子，并在另一端用叠氮化物锚固基团官能化以将聚合物连接到基底上。还提供了制备所述双官能聚合物的方法。经涂覆的基底包含在基底表面上的双官能化的聚合物。还提供了制备所述经涂覆的基底的方法。微阵列包括多个离散区域，每个区域包括所述经涂覆的基底。

Description

用于缀合生物分子的吖内酯官能化的基底
发明领域
本发明的方面涉及双官能聚合物和制备该双官能聚合物的方法，其中所述双官能聚合物在一端用吖内酯基团官能化以缀合所需生物分子，并在另一端用叠氮化物锚固基团官能化以将该聚合物连接到基底上，以使得吖内酯官能在叠氮基团呈反应性的条件下保持完好。本发明的方面还涉及在基底表面上包含这种双官能化聚合物的经涂覆的基底，以及制备该经涂覆的基底的方法。本发明的方面还涉及包括多个离散点的微阵列，每个点包括在微阵列表面上的经涂覆的基底。
背景
在测量测定或平台，例如蛋白质和抗体微阵列中，实现靶分子的高保真度（例如灵敏性和特异性）是非常重要的。测定中的样本可以是生物分子，如核酸、蛋白质、生物细胞和小分子，以及其它的人类体液，如血液、血清、唾液和尿液，以及消耗品如牛奶、婴儿食品或水。无论样品如何，测定中的靶分子与基底的有效缀合可有助于在这些测定中实现更高的保真度。
活化的酯（N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、马来酰亚胺、氟苯基）、氨基甲酸酯、碳酸酯、环氧化物和醛是通常用于缀合生物分子的测定的官能团。然而，这些官能团具有低水解稳定性。由于竞争性水解反应，低水解稳定性可导致生物分子缀合的次优效率，这导致较少量的缀合生物分子和缀合生物分子的不均匀性。
已知吖内酯基团通过开环加成反应与强亲核试剂如伯胺、醇和硫醇反应，同时在中性pH下显示出良好的抗水解性（参见Carter, H.E., 第5章: "Azlactones," OrganicReactions, John Wiley & Sons, 3: 198-239 (1946)）。除了更高的稳定性外，吖内酯官能化的表面可以在环境条件下储存更久，而含有活化的酯、环氧化物和醛的表面必须在无水分的条件（真空密封包装，冷冻库）下储存并在暴露于环境条件下立即使用。
“吖内酯”可以用6元环表示：
其中R1和R2独立地可以是氢、具有1至14个碳原子的烷基、具有3至14个碳原子的环烷基、具有5至12个环原子的芳基、具有6至26个碳原子和0 至3个硫、氮和非过氧化物型氧杂原子的芳烃基（arenyl），或R1和R2与它们所连接的碳一起可以形成含有4至12个环原子的碳环状环；且n是整数0或1。
如果n为0，那么吖内酯可以用5元环表示：
其中R1和R2如上定义。
由于它们有利和独特的性质，制备用于蛋白质缀合的吖内酯官能化聚合物的方法是已知的。美国专利号5,321,095公开了制备吖内酯活化的聚氧化烯（包括聚乙二醇（PEG））的方法，其用于制备蛋白质-PEG缀合物。美国专利号4,485,236和5,013,795也公开了通过自由基方法制备含吖内酯的聚合物的方法及其在蛋白质缀合中的用途。
吖内酯基团已用于色谱法。Rasmussen等人, "Crosslinked, hydrophilic,azlactone-functional polymeric beads: A two-step approach," ReactivePolymers, 16(2): 199-212 (1991)公开了吖内酯官能化聚合物微珠用于色谱法的应用，其中通过自由基聚合来制备基于丙烯酰胺的聚合物微珠，并且使用乙酸酐通过侧链酰基氨基酸基团的环化脱水而引入吖内酯基团。Coleman等人, "Immobilization of Protein Aat High Density on azlactone-functional Polymeric Beads and Their Use inAffinity Chromatography," Journal of Chromatography, 512:345-63 (1990)公开了具有固定在其表面上的蛋白质的高度交联的共聚物微珠，其通过反相聚合方法由亚甲基-双丙烯酰胺和乙烯基二甲基吖内酯制备，且用于亲和色谱法。
吖内酯基团也已用于细胞和酶固定基底中。Buck等人, "Chemical Modificationof Reactive Multilayered Films Fabricated from Poly(2-alkenyl azlactone)s:Design of Surfaces That Prevent or Promote Mammalian Cell Adhesion andBacterial Biofilm Growth," Biomacromolecules, 10(6): 1564-74 (2009)公开了反应性聚合物薄膜，其可以被官能化以通过多胺和聚(2-乙烯基-4,4'-二甲基吖内酯) （PVDMA）的逐层组装来防止或促进细胞的粘附和生长。多胺的氨基与PVDMA的吖内酯官能之间的反应导致薄膜的共价交联。PVDMA的未反应的吖内酯基团进一步用于连接亲水或疏水部分，因此促进细胞粘附或从表面的细胞排斥。Cullen等人, "Surface-Anchored Poly(2-vinyl-4,4-dimethyl azlactone) Brushes as Templates for Enzyme Immobilization,"Langmuir, 24(23): 13701-09 (2008)公开了通过原子转移自由基聚合的来自锚固在玻璃表面上的引发剂的生长PVDMA刷子。
吖内酯基团也用于医疗植入物。美国专利号5,292,514公开了通过自由基聚合来制备聚合和低聚的乙烯基二甲基吖内酯及其作为哺乳动物体植入物的涂层的用途。
美国专利号4,981,933公开了由不饱和的可聚合的吖内酯聚合物（如乙烯基吖内酯）和乙烯基苄基卤制备吖内酯共聚物，因此其具有这两个部分的各自的反应官能。
美国专利号5,344,701公开了几种将吖内酯官能引入到用于偶联生物试剂的现有载体上的方法。这些方法包括高能辐射以产生随后与乙烯基-吖内酯反应的自由基、吖内酯单体的化学交联以在表面上形成薄膜，以及分散聚合以在载体的孔内产生功能性颗粒。
概述
下面阐述本发明的某些示例实施方案的概述。应当理解，呈现这些方面仅仅是为了向读者提供这些特定实施方案的简要概述，并且这些方面不旨在限制本发明的范围。实际上，本发明可以包括可能未在下面阐述的各种方面。
在测量平台或测定中，吖内酯官能化的表面可能可以产生具有优异亮度和均匀性的点。由于吖内酯官能化的表面对水解的稳定性较高，点样的再现性也可能可以得到改善。但是为了在测量平台或测定中使用吖内酯基团，应该将吖内酯官能化的聚合物固定在表面或基底上，而不破坏吖内酯基团的官能。换句话说，第二个官能团必须将吖内酯官能化的聚合物连接到表面或基底上，但不应干扰吖内酯基团缀合所需生物分子的能力。
因此，本发明的示例实施方案提供了通过用于缀合生物分子的吖内酯基团和用于将吖内酯官能化的聚合物固定到基底上以产生生物相容性表面的连接基团两者官能化的聚合物，其中吖内酯官能在使连接基团呈反应性的条件下保持完好。根据示例实施方案，PEG通过用于缀合生物分子的吖内酯基团和用于连接到基底上的叠氮基团官能化。叠氮和吖内酯基团是化学正交的，以使得吖内酯官能在使叠氮基团呈反应性的条件下保持完好。本发明的示例实施方案还提供了制备此类生物相容性表面和将此类生物相容性表面作为基底并入测量平台，例如蛋白质和抗体微阵列中的方法。
本发明的示例实施方案提供了可以锚固到表面或基底上的吖内酯官能化的聚合物，其中所得的吖内酯官能化的表面或基底可以用于测量测定，例如蛋白质和抗体微阵列以更有效地缀合生物分子。此类官能化的表面可以用于如美国专利申请系列号14/792,553、14/792,576、14/792,541、14/792,569和14/792,530中所述的生物传感器系统中，其全部内容在此通过引入而并入本文。
根据示例实施方案，双官能聚合物包含：(a) 选自叠氮化物、羧酸、硫醇、胺、羟基、肼、甲硅烷基、膦酸盐/酯、炔烃、儿茶酚和赖氨酸的锚固基团；(b) 包含一种或多种第一聚合物的聚合物嵌段，所述一种或多种第一聚合物包括PEG或多糖；(c)选自苯基、乙烯基、苄基和烷基的接头基团；和(d) 含有R1和R2的吖内酯端基，其中R1和R2各自独立地选自氢、烷基和芳基。
在一些示例实施方案中，所述一种或多种第一聚合物是与第二聚合物的共聚物，其中第二聚合物选自聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃和N-取代的甘氨酸聚合物。
根据示例实施方案，经涂覆的基底包括：(a)基底；和(b) 连接在基底上的聚合物层，其中该聚合物层包含一种或多种第一聚合物、连接到所述一种或多种第一聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团，和连接到所述一种或多种第一聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，所述一个或多个叠氮基团将聚合物层连接到基底上。
在一些示例实施方案中，所述基底选自玻璃、二氧化硅、塑料、碳、金属和金属氧化物。
在一些示例实施方案中，所述聚合物层是线性聚合物、多臂聚合物、刷状聚合物或纳米颗粒。
在一些示例实施方案中，所述一种或多种第一聚合物是PEG或多糖。
在一些示例实施方式中，所述一种或多种第一聚合物是与第二聚合物的共聚物，其中第二聚合物选自聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃和N-取代的甘氨酸聚合物。
根据示例实施方案，微阵列包括多个离散区域，其中每个离散区域包括经涂覆的基底，所述经涂覆的基底包括：(a)基底；和(b) 连接在该基底上的聚合物层，其包含一种或多种聚合物、连接到所述一种或多种聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团，和连接到所述一种或多种聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，其中所述一个或多个叠氮基团将聚合物层连接到基底上。
根据示例实施方案，制备双官能聚合物的方法包括：(a) 提供聚合物，其具有连接在该聚合物的第一末端的一个或多个羧酸基团或活化的酯基团和连接在该聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团；(b) 将至少一个羧酸基团或活化的酯基团转化为芳基卤或乙烯基卤基团；并(c) 将乙烯基二烷基吖内酯连接到所述芳基卤或乙烯基卤基团上。
在一些示例实施方案中，聚合物是PEG。
在一些示例实施方案中，使用钯催化剂、一种或多种溶剂和碱通过偶联反应来连接乙烯基二烷基吖内酯。
在一些示例实施方案中，所述钯催化剂选自喹啉-8-甲酸钯(II)、氯化钯(II)、溴化钯(II)、乙酸钯(II)、乙酰乙酸钯(II)、双(二亚苄基丙酮)钯(0)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、三氟乙酸钯(II)、氯化烯丙基钯(II)二聚物、双(三苯基膦)二氯化钯(II)、二氯双(三环己基膦)钯(II)和[1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)。
在一些示例实施方案中，所述一种或多种溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、二氯甲烷、乙腈和醇。
在一些示例实施方案中，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、叔丁醇钾和叔丁醇钠。
根据示例实施方案，提供了将双官能聚合物连接到基底上的方法，该双官能聚合物包含聚合物、连接到所述聚合物的第一末端的一个或多个吖内酯官能团、和连接到所述聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团，所述方法包括：(a) 提供含有炔烃官能团的基底；(b) 提供包含所述双官能聚合物、一种或多种溶剂、催化剂、碱和还原剂的混合物；并(c) 使基底与该混合物接触。
在一些示例实施方案中，所述聚合物是PEG。
在一些示例实施方案中，所述一种或多种溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙腈和水。
在一些示例实施方案中，所述催化剂是铜(II)盐或铜(I)盐。
在一些示例实施方案中，所述催化剂选自硫酸铜、溴化铜和碘化铜。
在一些示例实施方案中，所述催化剂是钌催化剂。
在一些示例实施方案中，所述催化剂选自五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)、五甲基环戊二烯基(环辛二烯基)氯化钌(II)和五甲基环戊二烯基(降冰片二烯)氯化钌(II)。
在一些示例实施方案中，所述碱选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、吡啶、喹诺酮、菲咯啉和咪唑。
在一些示例实施方案中，所述还原剂选自抗坏血酸钠、三(三唑)胺和氢醌。
根据示例实施方案，分离所需生物分子的方法包括：(a) 提供官能化的基底，所述官能化的基底包含基底、一种或多种聚合物、连接到所述一种或多种聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯基团、和连接到所述一种或多种聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，由此所述一个或多个叠氮基团将所述一种或多种聚合物中的每种连接到所述基底上；(b) 提供水溶液，其中该水溶液含有所需生物分子；并(c) 使官能化的基底与水溶液接触一段时间，其中在所述一段时间期间，所需生物分子连接到基底的吖内酯基团上。
在一些示例实施方案中，所述水溶液还包含添加剂，其中所述添加剂选自甘油、低聚乙二醇、聚乙二醇、表面活性剂、聚乙烯醇、糖、有机溶剂和无机盐。
在一些示例实施方案中，所述水溶液的pH水平为约2至约10。
在一些示例实施方案中，所述基底与水溶液的接触通过喷印、针印、羽毛管印刷（quill printing）、生物激光印刷、基于毛细管的流体技术或浸渍来实现。
当参考附图阅读某些示例性实施方案的以下详细描述时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中附图中相同的字符在所有附图中表示相同的部分。
附图简述
图1说明了根据本发明的示例实施方案的双官能聚合物。
图2说明了根据本发明的示例实施方案的经涂覆的基底。
图3说明了根据本发明的示例实施方案的微阵列。
图4比较了NHS官能化和吖内酯官能化的基底上的绿色荧光蛋白（GFP）点的荧光强度（10个点的平均）。
图5A说明了在NHS官能化的基底上获得的GFP点形态的代表性实例。图5B说明了在吖内酯官能化的基底上获得的GFP点形态的代表性实例。
图6比较了缀合到用吖内酯基团和NHS基团官能化的经PEG涂覆的载玻片的表面上的免疫球蛋白G（IgG）的荧光强度。
图7说明了NHS官能化的表面转化为吖内酯官能化的表面。
图8说明了醛官能化的表面转化为吖内酯官能化的表面。
详述
本发明的示例实施方案提供了双官能聚合物，例如PEG，其在一端用吖内酯端基官能化以缀合所需生物分子，并在另一端用叠氮化物锚固基团官能化以将聚合物连接到基底上。聚合物用化学正交的两个基团，如吖内酯和叠氮化物的官能化使得用于缀合生物分子的吖内酯官能在叠氮基团对于将聚合物连接到基底上而言呈反应性的条件下保持完好。本发明的示例实施方案提供了经涂覆的基底，其在基底的表面上并入此类双官能化的聚合物，其中叠氮基团将聚合物连接到基底上，这使吖内酯基团保持游离并活性以缀合生物分子。本发明的示例实施方案提供了微阵列，其在该微阵列的表面上并入此类经涂覆的基底，其中所述微阵列含有多个离散点，每个点含有所述双官能化的聚合物。
图1显示了根据一个示例实施方案的双官能聚合物，其包含选自叠氮化物、羧酸、硫醇、胺、羟基、肼、甲硅烷基、膦酸盐/酯、炔烃、儿茶酚和赖氨酸的锚固基团110；聚合物嵌段106，其包含一种或多种可以是PEG或多糖的第一聚合物；接头基团112，其选自苯基、乙烯基、苄基和烷基；和包含R1和R2的吖内酯端基108，其中R1和R2各自独立地选自氢、烷基和芳基。在另一个示例实施方案中，所述一种或多种第一聚合物可以是与第二聚合物的共聚物，其中第二聚合物选自聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃和N-取代的甘氨酸聚合物。
图2显示了根据一个示例实施方案的经涂覆的基底200，经涂覆的基底200包括基底202和连接到基底202上的聚合物层204，其中聚合物层204包含一种或多种第一聚合物206、通过接头基团212连接到所述一种或多种第一聚合物206中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团208、和连接到所述一种或多种第一聚合物206中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团210，其中所述一个或多个叠氮基团 210将聚合物层204连接到基底202。
在示例性实施方案中，基底202可以是玻璃、二氧化硅、塑料、碳、金属或金属氧化物。如图2所示，聚合物层204可由线性聚合物制成，但在其它示例实施方案中，聚合物层204也可以由多臂聚合物、刷状聚合物或纳米颗粒制成。在一些示例实施方案中，所述一种或多种第一聚合物206可以是PEG或多糖，并且在其它示例实施方案中，所述一种或多种第一聚合物206可以是与第二聚合物的共聚物，其中第二聚合物可以是聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃或N-取代的甘氨酸聚合物。
图3显示了根据一个示例实施例的微阵列300，微阵列300包括多个离散区域314，其中离散区域314中的每个包括经涂覆的基底，该经涂覆的基底包括基底302和连接到基底302上的聚合物层304，其中聚合物层304包含一种或多种聚合物306、通过接头基团312连接到所述一种或多种聚合物306中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团308、和连接到所述一种或多种聚合物306中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团310，其中所述一个或多个叠氮基团310将聚合物层304连接到基底302上。
本发明的示例实施方案还提供了制备双官能聚合物的方法，其中聚合物如PEG用吖内酯和叠氮基团官能化。
根据例如如下文关于实施例1和2所述的本发明的示例实施方案，制备双官能聚合物的方法包括：(a) 提供聚合物，其中该聚合物含有连接在该聚合物的第一末端的一个或多个羧酸基团或活化的酯基团和连接在该聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团；(b)将至少一个羧酸基团或活化的酯基团转化为芳基卤或乙烯基卤基团；并(c) 将乙烯基二烷基吖内酯连接到所述芳基卤或乙烯基卤基团上。该聚合物可以是PEG。所述乙烯基二烷基吖内酯可以通过使用钯催化剂、一种或多种溶剂和碱通过偶联反应来连接到芳基卤或乙烯基卤基团上。该钯催化剂可以选自喹啉-8-甲酸钯(II)、氯化钯(II)、溴化钯(II)、乙酸钯(II)、乙酰乙酸钯(II)、双(二亚苄基丙酮)钯(0)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、三氟乙酸钯(II)、氯化烯丙基钯(II)二聚物、双(三苯基膦)二氯化钯(II)、二氯双(三环己基膦)钯(II)和[1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)。所述一种或多种溶剂可以选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、二氯甲烷、乙腈和醇。所述碱可以选自碳酸钾、碳酸钠、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、叔丁醇钾和叔丁醇钠。
本发明的示例实施方案还提供了用吖内酯官能化的聚合物，例如PEG将表面官能化的方法。根据例如如下文关于实施例3所述的本发明的一个示例实施方案，提供了“自上向下”方法，其中将包含聚合物、连接到该聚合物的第一末端的一个或多个吖内酯官能团、和连接到该聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团的双官能聚合物连接到基底上，所述方法包括：(a) 提供含有炔烃官能团的基底；(b) 提供包含所述双官能聚合物、一种或多种溶剂、催化剂、碱和还原剂的混合物；并(c) 使基底与该混合物接触。
在所述自上向下的方法中，首先将吖内酯基团和叠氮基团引入聚合物链的末端，然后通过“点击”反应将聚合物连接到含有炔基的表面上。这种自上向下的方法允许更好地控制官能化程度，从而确保每个聚合物链具有吖内酯官能。所述基底可以是金属、金属氧化物、二氧化硅、玻璃、碳或塑料。将炔烃官能引入到此类表面上的方法是已知的。例如，Achatz等人, "Colloidal silica nanoparticles for use in click chemistry-basedconjugations and fluorescent affinity assays," Sensors and Actuators B:Chemistry, 150(1):211-19 (2010)公开了用O-(炔丙基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)氨基甲酸酯装饰二氧化硅纳米颗粒的方法。所述聚合物可以是PEG或多糖。所述一种或多种溶剂可以选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙腈和水。所述催化剂可以是铜(II)盐或铜(I)盐（包括硫酸铜、溴化铜和碘化铜）或钌催化剂（包括五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)、五甲基环戊二烯基(环辛二烯基)氯化钌(II)和五甲基环戊二烯基(降冰片二烯)氯化钌(II)）。所述碱可以选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、吡啶、喹诺酮、菲咯啉和咪唑。所述还原剂可以选自抗坏血酸钠、三(三唑)胺和氢醌。基底与混合物的接触可以在室温或升高的温度下，例如在约23至150℃下进行，并且允许使基底与混合物接触的反应时间量与所得PEG涂层的密度相关。
根据本发明的另一个示例实施方案，用吖内酯使表面官能化的“自下向上”方法包括提供聚合物，其中该聚合物含有连接到该聚合物的第一末端的一个或多个羧酸基团和连接到该聚合物的第二末端的一个或多个连接基团；通过连接基团将该聚合物连接到表面上；然后将羧酸基团转化为吖内酯。该聚合物可以是PEG。这种自下向上的方法允许使用更多的替代化学以将聚合物连接到表面上，因为表面连接不再需要与吖内酯化学呈正交。在自下向上的方法中，该聚合物的连接基团可以是叠氮化物、膦酸、羧酸、硅烷、硫醇、胺、肼、炔烃或儿茶酚。
根据如图7所示的本发明的示例实施方案，NHS官能化的表面(16)通过固相合成而转化为吖内酯官能化的表面(18)。NHS-官能化的表面在碱（例如三甲胺（TEA））和溶剂（例如二甲基甲酰胺（DMF））的存在下与2-甲基丙氨酸反应，得到中间结构(17)。中间结构(17)在偶联剂（例如碳二亚胺，例如N,Ν'-二环己基碳二亚胺（DCC））和溶剂（例如二氯甲烷（DCM））的存在下进行环化反应，得到吖内酯官能化的表面(18)。
根据如图8所示的本发明的另一示例实施方案，醛官能化的表面(19)通过固相合成而转化为吖内酯官能化的表面(20)。醛官能化的表面(19)在催化剂（例如，3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物）、碱（例如TEA）和溶剂（例如四氢呋喃（THF））的存在下与乙烯基二烷基吖内酯反应，得到吖内酯官能化的表面(20)。
具有吖内酯官能团的基底提供某些优点，包括与基底相容的更宽范围的反应条件。由于吖内酯基团的水解稳定性，基底将耐受各种缓冲液、pH值和其它环境条件（包括温度和湿度），从而使用户更容易地优化生物分子连接化学并实现改善的信号强度和均匀度。
例如，当使用点样方法在固体基底上产生蛋白质阵列时，将一滴蛋白质溶液分配到基底上并使其干燥。该干燥过程影响信号强度和均匀性，其中较慢的干燥过程应改善缀合效率（因为有更多的时间发生反应）以及使咖啡环效应最小化，在该咖啡环效应的情况下圆形外周含有比中心更高的蛋白质浓度。然而，对于诸如NHS、活化的酯、环氧化物和醛之类的基团，水解与缀合反应竞争，因此优选是更快的干燥，但以更好的强度和均匀性为代价。吖内酯基团在水溶液中的稳健性允许较慢的干燥过程以实现最佳信号强度和均匀性两者。
作为另一个实例，连续流微印刷是另一种产生蛋白质阵列的方法。连续流微印刷提供官能性基底与蛋白质溶液的更长接触而不干燥，并且如果基底在表面上具有水解稳定的官能团，则可发挥其全部潜力。
本发明的示例实施方案还提供了使用吖内酯官能化的基底来缀合所需生物分子的方法。
根据本发明的一个示例实施方案，分离所需生物分子的方法包括：(a) 提供官能化的基底，所述官能化的基底包含基底、一种或多种聚合物、连接到所述一种或多种聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯基团、和连接到所述一种或多种聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，其中所述一个或多个叠氮基团将所述一种或多种聚合物中的每种连接到所述基底上；(b) 提供水溶液，其含有所需生物分子；并(c) 使官能化的基底与水溶液接触一段时间，其中在所述一段时间期间，所需生物分子连接到吖内酯基团上。所述水溶液可以包含添加剂（例如甘油、低聚乙二醇、聚乙二醇、表面活性剂、聚乙烯醇、糖、有机溶剂和无机盐），并且可以具有约2至约10的pH水平。所述官能化的基底与水溶液的接触可以通过喷印、针印、羽毛管印刷、生物激光印刷、基于毛细管的流体技术或浸渍来实现。这段时间可以是几秒到几小时。另外，可以使用体外转录和翻译技术在基底上原位表达和捕获生物分子。
以上描述旨在是说明性的而非限制性的。本领域技术人员可以从前面的描述中理解，本发明可以以各种形式实现，并且各种实施方案可以单独地或组合着实现。因此，虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明的实施方案，但是本发明的实施方案和/或方法的真实范围不应受此限制，因为其它修改对于本领域技术人员而言在研究附图、说明书以及以下实施例和权利要求时将变得显而易见。
以下是说明具体方法的实施例，而无意以任何方式进行限制。如从现行知识中可以理解的，可以在说明书的范围内修改这些实施例。
实施例
实施例1 - 叠氮基-PEG-吖内酯的合成，将羧酸基团转化为芳基卤基团
将N3-PEG1k-CO2H（200mg，0.20mmol，1.0当量）、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）（37mg，0.24mmol，1.2当量）和碘苯胺（52mg，0.24mmol，1.2当量）在干燥二氯甲烷（DCM）中的混合物在室温下在氩气下搅拌12小时。用水淬灭反应，分离有机层。将水层用DCM萃取三次，并将合并的有机部分用硫酸镁（MgSO4）干燥。将溶液在减压下浓缩成粗油，其通过硅胶柱色谱法（0-10％甲醇/ DCM）纯化，得到软白色固体（225mg，82％）。
使用质子核磁共振（NMR）波谱测定所得产物的结构，其中得到的NMR光谱：1H NMR(600 MHz, CDC13) δ = 8.82 (bs, 1H), 7.58 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.39 (d, J =9.1 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.70-3.59 (m, 96H), 3.38 (t, J = 5.4Hz, 2H), 2.63 (t, J = 5.4 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (125 MHz, CDC13) δ = 186.8,137.8, 136.2, 123.2, 122.2, 82.9, 70.7, 38.1 ppm。薄层色谱（TLC）中产物的滞留因子（Rf）如下：TLC Rf = 0.5（10％MeOH / DCM）。
实施例2 - 叠氮基-PEG-吖内酯的合成，将乙烯基二烷基吖内酯连接到芳基卤基 团上
钯催化剂“Quin2Pd”根据例如Cui等人, "Pd(quinoline-8-carboxylate)2 as a Low-Priced, Phosphine-Free Catalyst for Heck and Suzuki Reactions," Journal ofOrganic Chemistry, 72:9342 (2007)所述的方法合成。
向10mL火焰干燥的Schlenk瓶中加入N3-PEG1k-碘苯胺（200mg，0.152mmol，1.0当量）和Quin-Pd（3.2mg，0.0072mmol，0.05当量）并用氩气吹扫。加入干燥二甲基甲酰胺（DMF）（0.2M，0.8mL）、三乙胺（100μL，0.076mmol，5.0当量，干燥并在CaH2上新鲜蒸馏）和乙烯基吖内酯（58μL，0.456mmol，3.0当量），并且密封该体系。将反应混合物在130℃下加热3小时，其变为深棕色。然后将其冷却至室温并在减压下浓缩。将粗残余物溶于DCM中并干燥加载到C盐上，将其施加到二氧化硅柱上。通过柱色谱（0-20％甲醇/ DCM）纯化，得到156mg。
使用质子NMR波谱测定所得产物的结构，其中得到的NMR光谱：1H NMR (600 MHz)δ = 9.10 (bs, 1H), 7.67 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.41(d, J = 15.4 Hz, 1 H), 6.47 (d, J = 16.5 Hz, 1 H), 3.81 (t, J = 6.0 Hz, 2H),3.64-3.57 (m, ~107 H), 2.67 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.46 (s, 6H) ppm; 13C NMR(125 MHz) δ = 181.0, 170.5, 159.6, 142.3, 140.7, 128.6, 120.1, 112.0, 70.5,67.2, 46.4, 38.0, 24.9 ppm。薄层色谱中产物的滞留因子如下：TLC Rf = 0.4（10％MeOH/ DCM）。
实施例3 - 通过“点击”反应将叠氮基-PEG-吖内酯连接到炔烃官能化的表面上
向5mL二甲亚砜（DMSO）和5mL去离子（DI）水中的叠氮化物-PEG-吖内酯溶液（3mg / mL）中加入0.52mL的1.0mM点击化学储备溶液（1.5mg CuSO4 -5H2O、6mg抗坏血酸钠、4μL三乙胺、3mL DMSO和3mL DI水）。将用炔基官能化的载玻片浸入该溶液中，在室温下温和摇动12小时。用DI水冲洗聚乙二醇化的载玻片并旋转干燥。
或者，通过用叠氮基团将表面预官能化、然后经“点击”反应将表面与炔烃-PEG-吖内酯偶联，将PEG-吖内酯引入到表面上。
实施例4 - 用吖内酯和叠氮官能团改性的多糖的合成
如下所示，多糖被氧化以产生适于用吖内酯进一步官能化的羧酸基团。多糖链（结构7）上的伯醇的一些使用氧气在铂上或使用TEMPO（(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧自由基或(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氮氧自由基）作为催化剂和次氯酸钠（NaOCl）在碱性pH下转化为羧酸基团，得到结构(8)（参见Cumpstey, I., ISRN Organic Chemistry, Article ID417672 (2013)）。然后将羧酸基团转化为芳基或乙烯基卤（溴化物或碘化物）官能，得到结构9，然后通过钯催化的偶联来连接乙烯基二烷基吖内酯，以产生所需的吖内酯官能化的材料（结构10）。
或者，如下所示，使用高碘酸盐来实现多糖链（结构7）的1,2二醇的裂解，并将羧酸官能引入聚合物链中，得到结构11。然后将结构11与碘苯胺反应，得到结构12，其然后与乙烯基二烷基吖内酯反应，以产生所需的吖内酯官能化的材料（结构13）。
如下所示，通过将多糖链的伯醇的一些转化为溴化物（例如使用N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）和三苯基膦（PPh））或甲苯磺酰基，将叠氮官能引入多糖链（结构7）中，得到结构14（通过使其与甲苯磺酰氯（TsCl）反应），然后与叠氮化钠（NaN3）反应，以产生结构15（参见Cumpstey）。该方法可以与合成吖内酯官能化的多糖的两种现有方法之一组合，得到含有吖内酯和叠氮基团两者的多糖链。由于多糖链上的伯醇仅一些被改性成吖内酯，其它醇可用于转化为叠氮化物。
实施例5 - 通过针印将蛋白质连接到用叠氮基-PEG-吖内酯涂覆的基底上
使用针印法在室温和55％的相对湿度下将在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中含有0.1％聚乙烯醇的200mg/mL绿色荧光蛋白（GFP）溶液点样在基底上。使这些点在干燥器中干燥12小时，然后用PBS-Tween和PBS冲洗载玻片以除去未结合的蛋白质。通过测量表面上的蛋白质的荧光强度来确定共价连接到基底上的GFP的相对量。相对于NHS酯官能化的载玻片而言，吖内酯官能化的载玻片的荧光强度是2.5倍（参见图4）。通过观察这些点上的荧光强度来比较载玻片的形态。吖内酯官能化的表面上的蛋白质点是均匀的（图5B），而NHS官能化的表面上的点显示出特征性咖啡环形态（参见图5A）。
实施例6 - 通过浸渍的蛋白质缀合
将用叠氮化物-PEG-吖内酯和叠氮化物-PEG-NHS官能化并在表面上含有相同密度的官能团的玻璃基底暴露于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的免疫球蛋白G（IgG）溶液中最多6小时。在除去溶液并用PBS-Tween和PBS冲洗载玻片后，通过测量表面上的蛋白质的荧光强度来确定共价连接到基底上的IgG的相对量。温育6小时后，相对于NHS酯官能化的载玻片而言，吖内酯官能化的载玻片的荧光强度是5倍（参见图6）。

Claims (27)

1.双官能聚合物，其包含：
(a) 选自叠氮化物、羧酸、硫醇、胺、羟基、肼、甲硅烷基、膦酸盐/酯、炔烃、儿茶酚和赖氨酸的锚固基团；
(b) 包含一种或多种第一聚合物的聚合物嵌段，所述一种或多种第一聚合物包括聚乙二醇或多糖；
(c) 接头基团，其选自苯基、乙烯基、苄基和烷基；和
(d) 含有R1和R2的吖内酯端基，其中R1和R2各自独立地选自氢、烷基和芳基。
2.权利要求1的双官能聚合物，其中所述一种或多种第一聚合物是与第二聚合物的共聚物，所述第二聚合物选自聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃和N-取代的甘氨酸聚合物。
3.经涂覆的基底，其包括：
(a) 基底；和
(b) 聚合物层，其包含一种或多种第一聚合物、连接到所述一种或多种第一聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团，和连接到所述一种或多种第一聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，其中所述一个或多个叠氮基团将聚合物层连接到基底上。
4.权利要求3的经涂覆的基底，其中所述基底选自玻璃、二氧化硅、塑料、碳、金属和金属氧化物。
5.权利要求3的经涂覆的基底，其中所述聚合物层包含线性聚合物、多臂聚合物、刷状聚合物或纳米颗粒。
6.权利要求3的经涂覆的基底，其中所述一种或多种第一聚合物包括聚乙二醇或多糖。
7.权利要求6的经涂覆的基底，其中所述一种或多种第一聚合物是与第二聚合物的共聚物，所述第二聚合物选自聚赖氨酸、聚噁唑啉、聚甲基丙烯酸甲酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚多巴胺、聚烷烃和N-取代的甘氨酸聚合物。
8.微阵列，其包括：
多个离散区域，所述离散区域的每个包括经涂覆的基底，所述经涂覆的基底包括：
(a) 基底；和
(b) 聚合物层，其包含一种或多种聚合物、连接到所述一种或多种聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯官能团，和连接到所述一种或多种聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，其中所述一个或多个叠氮基团将聚合物层连接到基底上。
9.制备双官能聚合物的方法，所述方法包括：
(a) 提供聚合物，其中所述聚合物含有连接在所述聚合物的第一末端的一个或多个羧酸基团或活化的酯基团和连接在所述聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团；
(b) 将至少一个羧酸基团或活化的酯基团转化为芳基卤或乙烯基卤基团；并
(c) 将乙烯基二烷基吖内酯连接到所述芳基卤或乙烯基卤基团上。
10.权利要求9的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇。
11.权利要求9的方法，其中使用钯催化剂、一种或多种溶剂和碱通过偶联反应来连接乙烯基二烷基吖内酯。
12.权利要求11的方法，其中所述钯催化剂选自喹啉-8-甲酸钯(II)、氯化钯(II)、溴化钯(II)、乙酸钯(II)、乙酰乙酸钯(II)、双(二亚苄基丙酮)钯(0)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、三氟乙酸钯(II)、氯化烯丙基钯(II)二聚物、双(三苯基膦)二氯化钯(II)、二氯双(三环己基膦)钯(II)和[1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)。
13.权利要求11的方法，其中所述一种或多种溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、二氯甲烷、乙腈和醇。
14.权利要求11的方法，其中所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、叔丁醇钾和叔丁醇钠。
15.将双官能聚合物连接到基底上的方法，所述方法包括：
(a) 提供含有炔烃官能团的基底；
(b) 提供包含双官能聚合物、一种或多种溶剂、催化剂、碱和还原剂的混合物；并
(c) 使基底与所述混合物接触；
其中所述双官能聚合物包含聚合物、连接到所述聚合物的第一末端的一个或多个吖内酯官能团、和连接到所述聚合物的第二末端的一个或多个叠氮基团。
16.权利要求15的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇。
17.权利要求15的方法，其中所述一种或多种溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙腈和水。
18.权利要求15的方法，其中所述催化剂包含铜(II)盐或铜(I)盐。
19.权利要求18的方法，其中所述催化剂选自硫酸铜、溴化铜和碘化铜。
20.权利要求15的方法，其中所述催化剂包含钌催化剂。
21.权利要求20的方法，其中所述催化剂选自五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)、五甲基环戊二烯基(环辛二烯基)氯化钌(II)和五甲基环戊二烯基(降冰片二烯)氯化钌(II)。
22.权利要求15的方法，其中所述碱选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶、吡啶、喹诺酮、菲咯啉和咪唑。
23.权利要求15的方法，其中所述还原剂选自抗坏血酸钠、三(三唑)胺和氢醌。
24.分离所需生物分子的方法，所述方法包括：
(a) 提供官能化的基底，所述官能化的基底包含基底、一种或多种聚合物、连接到所述一种或多种聚合物中每种的第一末端的一个或多个吖内酯基团、和连接到所述一种或多种聚合物中每种的第二末端的一个或多个叠氮基团，其中所述一个或多个叠氮基团将所述一种或多种聚合物中的每种连接到所述基底上；
(b) 提供水溶液，其中水溶液含有所需生物分子；并
(c) 使官能化的基底与水溶液接触一段时间，其中在所述一段时间期间，所需生物分子连接到吖内酯基团上。
25.权利要求24的方法，其中所述水溶液还包含添加剂，其中所述添加剂选自甘油、低聚乙二醇、聚乙二醇、表面活性剂、聚乙烯醇、糖、有机溶剂和无机盐。
26.权利要求24的方法，其中所述水溶液的pH水平为约2至约10。
27.权利要求24的方法，其中所述官能化的基底与所述水溶液的接触通过喷印、针印、羽毛管印刷、生物激光印刷、基于毛细管的流体技术或浸渍来实现。
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