CN1809752B - 在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法 - Google Patents

在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1809752B
CN1809752B CN038263947A CN03826394A CN1809752B CN 1809752 B CN1809752 B CN 1809752B CN 038263947 A CN038263947 A CN 038263947A CN 03826394 A CN03826394 A CN 03826394A CN 1809752 B CN1809752 B CN 1809752B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymkeric substance
molecule
enzyme
light
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN038263947A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1809752A (zh
Inventor
普拉蒂普·纳哈尔
阿兹米·纳克维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Original Assignee
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Council of Scientific and Industrial Research CSIR filed Critical Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Publication of CN1809752A publication Critical patent/CN1809752A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1809752B publication Critical patent/CN1809752B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及制备光反应性聚合物和在其上固化生物分子的快速方法。本发明特别涉及微波介导的制备光反应性聚合物的快速和有效的方法，该光反应性聚合物至少含有一个能在光化学反应中和生物分子形成共价键的官能团。本发明的方法可以改性任何含亲核基团的有机或无机基质，所述亲核基团优选为氨基、羟基或巯基。通过紫外辐射在光反应性聚合物上固化生物分子。本方法应用于分子生物学、蛋白质组学、基因组学、诊断学、化学或生化工业以及其他相关领域的生物分子的固化，且不用考虑该生物分子的官能团。

Description

在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法
技术领域
本发明涉及制备光反应性聚合物以及在这些聚合物上固化生物分子的快速方法。光反应性聚合物是聚合物，当暴露于特定波长的光线下及与生物分子共价结合时，其变得具有高度反应性。该固化的方法温和、简单且不依赖pH和温度。本发明的优点在于可以轻易的操纵和控制该光固化技术。
发明背景
近年来，特别是在后基因组时代，对于在有机或无机聚合物上固化生物分子的需求增长显著。固化的生物分子在临床实验室、生物传感器、膜生物反应器、诊断学、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、亲和层析和许多其它相关领域有多种多样的应用。有不同的方法可将生物分子固定在惰性表面上，例如(i)聚合物表面活化，(ii)生物分子活化，或(iii)在固定前两者都活化。从可行性的角度而言，方法(i)是更好的选择，因为在大多数情况下生物分子是珍贵的并且对化学药品敏感，在活化过程中有些可能会丢失。
固定在聚合物上的生物分子广泛应用于诊断学、生物传感器、膜生物反应器、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、亲和层析和许多其它相关领域[克里斯迪瓦等(Krysteva，et.al.)，利用甲醛将酶共价固定于含丙烯酰胺的合成膜上(Covalent binding of enzymes to synthetic membranecontaining acrylamide units，using formaldehyde)，Biotechnol Appl.Biochem.13：106-111(1991)；潘迪等(Pandey，et.al.)，基于石墨膏改性电极的对葡萄糖的电流酶传感器(Amperometric enzyme sensor for glucose based ongraphite paste-modified electrodes)，Appl.Biochem.Biotechnol.33：139-144(1992)]。，
在后基因组时代，对于在聚合物表面上固化生物分子的简单和快速的方法的需求一直在增长。
有很多方法可将生物分子固定在聚合物表面上。共价键固化可产生更好的生物分子活性、降低的非特异性吸附和更高的稳定性[提勒J等(Tiller，J.et.al.)，通过左旋维生素C酸在NH2聚合物上的新型有效的酶固定化反应(A novel efficient enzyme-immobilization reaction on NH2polymers by means of L-ascorbic acid)，Biotechnol.Appl.Biochem.30，155-162(1992)]。
有多种途径可将生物分子以共价键固化在不同聚合物支持物上。通过戊二醛偶合方法，可将葡萄糖氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶和青霉素酰基转移酶固化在烷基胺玻璃或硅胶上。[郭等(Guo，et.al.)，葡糖氧化酶和过氧化酶的固化及其在血清葡萄糖流动注射分析中的应用(Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application inflow injection analysis for glucose in serum)，Appl.Biochem.Biotechnol.23(1)：15-24(1990)；纳卡姆拉等(Nakamura，et.al.)，尿酸酶在玻璃珠上的鱼精蛋白上的固化及其在尿酸检测中的应用(Immobilization of uricaseon protamine bound to glass beads and its application to determination ofuric acid)，Anal.Biochem.152(2)：386-390(1986)；塔瓦等(Tawa，et.al.)，在控制性的多孔玻璃上固化黄嘌呤氧化酶，在高效液相层析中的应用(Immobilization of xanthine oxidase to controlled pore-glass.Application tohigh-performance liquid chromatography)，Nucleic Acids Symp.Ser.12：107-110(1983)]。在控制性的多孔玻璃上固定的葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和尿酸酶分别应用于检测血清中的葡萄糖、胆固醇和尿素。
亚硫酰氯活化的丙基琥珀酰胺控制的多孔玻璃用于共价键固定兔抗牛IgG[斯塔博尔等(Stabel，et.al.)，固化抗-IgG控制的多孔玻璃，作为共价固化基质的亚硫酰氯活化的丙基琥珀酰胺玻璃(Anti-IgG immobilizedcontrolled pore glass.Thionyl chloride-activated succinamidopropyl glass asa covalent immobilization matrix)，Appl.Biotechnol.36(2)：87-96(1992)]，诸如乙酰辅酶的酶。
可将合成酶固化在CNBr-活化的控制性的多孔玻璃上。已报导通过辐射接支聚合或气相等离子技术来活化诸如聚苯乙烯、聚丙烯或聚乙烯的惰性有机聚合物表面。[德曲爱罗兹等(de Queiroz，et.al.)，固定于PE和PVC薄膜上的白蛋白的表面研究(Surface studies of albuminimmobilized onto PE and PVC films)，J.Biomater.Sci.Polym.8：667-681(1997)；索非亚等(Siephia，et.al.)，通过无水amnonia气相等离子技术在聚丙烯珠表面上对酶的固化(Immobilization of enzymes onpolypropylene bead surfaces by anhydrous amnonia gaseous plasmatechnique)，J Biomed.Mater.Res.22(5)：417-22(1988)]。
但是，所有这些方法存在一个或多个缺点，例如(i)冗长，(ii)耗时，(iii)需要有害化学药品，或(iv)需要苛刻的反应条件。
光联剂介导技术允许生物分子在温和的反应条件下以共价键结合到固体表面上。这个方法通常基于含至少两个官能团的光联剂，其中一个基本上是光可活化的基团。
对于通过光联剂将生物分子固化有不同的方法。埃尔斯呢(Elsner)等在美国专利第5,427,799号中描述了利用诸如补骨脂素的双环杂环的光联剂通过光化学反应活化惰性表面的方法。
翟考波森(Jacobsen)等在美国专利第6,033,784号中公开了利用醌的光化学活化聚合物表面的方法。利用含伯胺的醌的衍生物将氨基引入到聚苯乙烯表面上。但是，这些基团若不加入一种或多种活化试剂就不能轻易地与蛋白质结合。
近来纳哈尔(Nahar)等和博拉(Bora)等[纳哈尔等(Nahar，et.al.)，光诱导活化惰性表面来共价固定蛋白配体(Light-induced activation of an inertsurface for covalent immobilization of a protein ligand)；Anal.Biochem.294：148-153(2001)；纳哈尔P.(Nahar，P)，待审美国专利申请，聚合物表面光化学活化及在活化的表面上固定化生物分子的方法(Method forphotochemical activation of polymer surface and immobilization ofbiomolecules onto activated surface)；博拉等(Bora，et.al.)，在光活化的聚苯乙烯微滴定板上共价固化蛋白质以用于酶联免疫吸收分析方法(Covalent immobilization of proteins onto photoactivated polystyrenemicrotiter plates for enzyme-linked immunosorbent assay procedures)，J.Immunol.Methods.268：171-177(2002)]，及后来纳克维(Naqvi)等[纳克维等，在聚丙烯和聚乙烯表面上引入官能团以用于酶的固化(Introductionof functional groups onto polypropylene and polyethylene surfaces forimmobilization of enzymes)，Anal.Biochem.306：74-78(2002)]发表了用1-氟-2-硝基-4-叠氮苯来光诱导活化诸如聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯的惰性聚合物的简单、快速和温和的方法。
但是，在大多数这些光联剂介导的方法中，通过光化学反应来活化表面而通过热化学反应来固定生物分子。因此，生物分子必须有一个或多个功能团与活化的表面反应产生共价键链接。相反，光化学固化技术能够固化生物分子而考虑其官能团。关于光化学固化生物分子的报道非常少。
斯格里斯特(Sigrist)等利用光联聚合物将生物分子固定在惰性表面上，此光联聚合物通过BSA与3-(三乙胺)-3-(间异硫氰苯二嗪(m-isothiocyanophenyldiazirine))反应来制备。然后暴露于光下利用光联聚合物来同时结合抗生蛋白链菌素及聚苯乙烯表面[斯格里斯特等(Sigrist，et.al.)，生物分子在惰性表面上的依赖于光的共价固化(Light dependent，Covalent immobilization of biomolecules on inert surface)，Biotechnology 10：1026-1028(1992)]。但是，制备此光联剂本身是费时的多步骤的过程。
贵勒(Guire)在美国专利第3,959,078号中公布了利用光联剂1-氟-2-硝基-4-叠氮苯将酶固定化的方法。在此方法中，通过1-氟-2-硝基-4-叠氮苯在37℃下热化学反应20小时活化含氨基的基质。在随后的步骤中通过光化学反应16小时将酶固化在活化的表面上。此方法的缺点在于两个步骤都需要长的反应时间。所有上述方法都不能简单快速地制备光反应性表面及在此光反应性表面上快速地固化生物分子。
下表给出了现有技术方法的缺点。
表I
编号 现有技术 缺点
1 通过1-氟-2-硝基-4-叠氮苯来光化学活化含C-H基质，随后通过热化学反应与酶链接(纳哈尔(Nahar)等，2001) 可选择的生物分子有限，即，希望的生物分子必须有氨基或其它亲核基团以与活化的表面反应。
2 兆戈提勒(Jorg Tiller)[提勒(Tiller)等，1999]描述了活化NH2聚合物薄膜的方法，通过(i)将薄膜浸入浓L-抗坏血酸溶液中直到薄膜明显膨胀。然后将酶在16小时内固化在该活化的薄膜上。(ii)或将薄膜在双甲基乙酰胺中膨胀，而后放入10ml冰冷的0.5M HCl中，逐滴滴加1ml的1M NaNO2溶液。然后将酶在4℃固化12小时。 氨基聚合物薄膜的活化过程繁琐。固定化步骤费时。
3 利用光联聚合物将生物分子固定在惰性表面上，此光联聚合物通过BSA与3-(三乙胺)-3-(间异氰硫基苯二重氮甲烷)反应来制备。当暴露于光下时此光联聚合物用来同时结合抗生蛋白链菌素及聚苯乙烯表面 此光联剂制备的本身是冗长和费时的多步骤过程
4 贵勒(Guir)等在美国专利第5,002,582号中描述了在黑暗环境下用光联剂在16小时内在室温下改性含醇聚合物的方法。 活化过程费时。
美国专利第3,959,078号描述了通过含叠氮基的光联剂在20小时内改性含氨基聚合物的方法。此聚合物上的固化反应是以0℃-15℃使用40瓦特的钨灯在16小时内通过光化学反应进行的。 活化和固化过程都费时。
发明目的
本发明的主要目的是提供制备光反应性聚合物和在此聚合物上快速固化生物分子的简单和快速的方法。
本发明的另一个目的是通过微波介导的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯与所述聚合物反应来提供光反应性聚合物。本发明的另一个目的是提供通过光化学反应来固定生物分子而不用考虑其官能团的简单、温和及快速的方法。
本发明的另一个目的是提供用来有效和快速地通过紫外光来固定生物分子的光化学反应性聚合物表面。
本发明的另一个目的是使光反应性聚合物表面用于化学工业、制药工业、诊断学、分离技术和许多其它相关领域所需的光诱导的生物分子的固化。
本发明的新颖性在于光反应性聚合物的快速制备，根据聚合物不同所述制备需要一到十分钟。
发明概述
为实现本发明的目的和克服已知现有技术方法的不足，本发明公开了优选微波介导的光反应性聚合物制备的以及在所述聚合物上快速光诱导的生物分子固化的快速、简单和有效的方法。
据此，本发明提供了分子固化在其上的光反应性聚合物的制备方法，所述方法包括：
(a)将含亲核基团的聚合物与溶解在适合溶剂中的光联剂反应，
(b)用适合的溶剂洗涤所述聚合物，随后在室温下干燥所述洗过的聚合物以得到光反应性聚合物，
(c)将溶解在适合的缓冲液中的分子加到所述光反应性聚合物上，
(d)将所述混合物置于光源下2分钟到2小时以将所述分子固化在所述光反应性聚合物上，及
(e)用适合的缓冲液洗涤含有固化分子的所述聚合物，随后在室温下干燥所述聚合物以得到分子固化在其上的光反应性聚合物。
在本发明的一个实施方案中，所述光联剂含有热化学基团，所述热化学基团选自能和所述聚合物的亲核基团形成共价键的基团。
在本发明进一步的实施方案中，所述光联剂的热化学基团选自醛基、羰基、异硫氰酸基、卤素和异氰酸基。
在本发明的另一个实施方案中，所述光联剂具有光化学基团，该光化学基团具有光反应性，且能在光化学反应中不需添加任何其它的试剂即可与所述分子形成共价键。
在本发明进一步的实施方案中，所述光联剂的光化学基团选自碳烯前体、氮烯前体和氧自由基。
在本发明的另一个实施方案中，所述光联剂是1-氟-2-硝基-4-叠氮苯(FNAB)。
在本发明的另一个实施方案中，所述聚合物包括任何有氨基、羟基、巯基或任何其它反应性亲核基团的聚合物，例如，硅胶、长链烷基胺控制的多孔玻璃、聚乙烯醇、氨基聚苯乙烯和烷氨基硅胶。
在本发明的另一个实施方案中，所述反应步骤(a)通过将所述光联剂、聚合物和溶剂的混合物暴露于微波辐射或37℃热孵育中进行。所述微波辐射优选为2000Hz到2600Hz的频率，能量输出从100瓦特到1000瓦特，时间从10秒到20分钟。
在本发明的另一个实施方案中，用于洗涤所述步骤(a)所得到的聚合物的溶剂包括能够溶解所述光联剂及其降解产物且不改变(distort)所述聚合物的溶剂，例如甲醇或乙醇。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(a)所用的溶剂选自二甲基甲酰胺和甲苯。
优选地，所述步骤(a)的反应在诸如30％KOH的催化剂存在下进行。
在本发明的另一个实施方案中，所述聚合物选自小珠、小孔(井)、薄片、粉末、小棒、盘、小条或小管。
在本发明的另一个实施方案中，固定在所述光反应性聚合物上的所述分子选自有机分子、有机聚合物、生物分子和任何有C-H键的分子。
在本发明进一步的实施方案中，生物分子选自蛋白质、核酸、碳水化合物、寡核苷酸、酶、抗原、抗体和肽。
所述的酶优选为辣根过氧化物酶。
在本发明的另一个实施方案中，所述光源选自紫外(UV)光、阳光、激发光(flush light)和激光束。
在本发明进一步的实施方案中，用作光源的紫外光波长为300nm到400nm，且固化所述分子所用的暴露时间为2分钟到2小时。
步骤(a)的所述聚合物的亲核基团与所述光联剂的反应优选为在溶剂存在下在微波炉中进行。
本发明还涉及有分子固化在其上的光反应性聚合物在诊断学、亲和层析、蛋白质组学、基因组学和药物筛选中的用途。
附图简要说明
图1.制备光反应性硅胶的FNAB含量优化(实施例1)
在50mg烷氨基硅胶的每个反应中，加入不同量的FNAB(0、6.25、12.5、25、50、75和100mg)，并将它们暴露在微波辐射中60秒钟，以确定制备反应性硅胶的最适宜的FNAB的含量。
通过光化学反应将HRP(1μg)固化在所述支持物(50mg)上来检测每个反应由此所制备的烷氨基硅胶。比色测定固化酶后记录吸光度。
图2：制备光反应性LCAA-CPG的FNAB含量优化(实施例2)
在50mgLCAA-CPG的每个反应中，改变FNAB的浓度(0、6.25、12.5、25和50mg)，并将它们暴露在微波辐射中60秒钟，以确定制备光反应性LCAA-CPG的最适宜的FNAB的含量。通过光辐射HRP(1μg)及50mg支持物并比色测定固化酶来检测每个反应由此所制备的LCAA-CPG。
图3：制备光反应性PVA的FNAB含量优化(实施例3)
加入不同量的FNAB(12.5、25、50和75mg)到50mg PVA、6.5μl 30％的KOH和5ml甲苯的反应混合物中，以确定制备光反应性PVA的最适宜的FNAB的含量。该反应混合物在室温下保存一小时。通过辐射HRP(16μg)及50mg所述支持物来检测每个反应由此所制备的光反应性PVA。将基质加入到所述固化酶后记录吸光度。
图4：制备烷氨基硅胶的微波辐射暴露时间的优化(实施例4)
在50mg烷氨基硅胶和50mg FNAB的反应中改变微波暴露时间(30、50、60和70秒)，以确定制备光反应性烷氨基硅胶的最适宜的微波暴露时间。通过辐射1μg的HRP及50mg支持物并比色分析固化酶来检测每个反应由此所制备的光反应性表面。
图5：活化氨基聚苯乙烯的微波暴露时间的优化(实施例5)
在每个20mg氨基聚苯乙烯和20mg FNAB的反应中改变微波暴露时间(40、50和60秒)，以优化制备光反应性氨基聚苯乙烯的微波暴露时间。通过辐射HRP(35μg)及20mg支持物来检测每个反应由此所制备的光反应性表面。将基质加入到所述固化的酶后记录吸光度。
图6：制备光反应性PVA的KOH的浓度的优化(实施例6)
在5ml甲苯中的50mg PVA和50mg FNAB的反应混合物中加入不同量的30％KOH溶液(1.62、3.25、6.5、13和20μl)，以优化制备光反应性PVA的KOH浓度。通过辐射HRP(16μg)及50mg所述支持物并比色分析固化酶来检测每个反应由此所制备的光反应性表面。
图7：室温下PVA活化时间的优化(实施例7)
对每个含有5ml甲苯中50mg PVA与50mg FNAB、以及6.5μl 30％KOH的反应混合物施以不同孵育时间(5、10、60、180和300分钟)，以优化制备光反应性PVA的活化时间。通过辐射HRP(16μg)及50mg所述支持物并比色分析固化酶来检测每个反应由此所制备的光反应性表面。
图8：在烷氨基硅胶上固化酶的辐射时间的优化(实施例8)
混合HRP(1μg)和50mg光反应性烷氨基硅胶并对每个反应改变紫外辐射时间(2、5、10、20、40、60和80分钟)，以优化固化时间。基质加入到所述固化酶后记录吸光度。
图9：在光反应性LCAA-CPG上固化酶的辐射时间的优化(实施例9)
混合50mg光反应性LCAA-CPG和HRP(1μg)并对每个反应用紫外辐射不同的时间(2、10、20、40、和60分钟)，以优化固定化时间。加入基质后比色分析所述固化酶。
图10：在微波活化的光反应性PVA上固化酶的UV辐射时间的优化(实施例10)
混合50mg光反应性PVA和HRP(16μg)并对每个反应用UV辐射不同的时间(5、20、30、60、120和180分钟)，以优化固定化时间。将基质-染料缓冲液加入到所述固化酶后记录吸光度。
图11：将酶固化在光反应性的PVA上的酶浓度的优化(实施例11)
对每个50mg光反应性PVA采用不同量的酶(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μg)并用UV辐射30分钟，以优化HRP浓度。加入基质后比色分析固化酶。
图12：将酶固化在微波活化的光反应性LCAA-CPG上的酶浓度优的化(实施例12)
对每个50mg光反应性LCAA-CPG采用不同量的酶(0.2、0.5、1.0、2.0和4μg)并用UV辐射20分钟，以优化HRP浓度。将基质-染料缓冲液加入到所述固化酶后记录吸光度。
图13：将酶固化在微波活化的烷氨基硅胶上酶浓度的优化(实施例13)
对每个50mg光反应性烷氨基硅胶，在每个反应里采用不同量的酶(0.5、1.0、2.0、4.0和6.0μg)并用UV辐射20分钟，以优化HRP浓度。加入基质后比色分析固化的酶。
本发明的详细描述
本发明包括聚合物表面改性以在其上引入潜伏反应基团以及通过光能在所述改性后的聚合物表面上将生物分子固化的快速和有效的方法。更具体而言，通过微波介导的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯和有反应性亲核基团的聚合物反应来制备有潜伏光反应性基团的聚合物表面。由此制备的改性聚合物(光反应性聚合物)具有光反应性叠氮基，其在UV光下产生能够与生物分子结合的有高度反应性的氮烯。
光联剂的浓度在制备光反应性聚合物中起到关键的作用。当光联剂(FNAB)与聚合物的比例是1∶1(w/w)时效果最佳。FNAB的进一步增加不会增加所述聚合物中的光反应性基团。光反应表面的功效通过在其上固定HRP然后分析固化的酶来确定。当使用未处理的表面(FNAB：0mg)时，几乎没有生物分子固化在上面(图1、图2和图3)。
发现微波是制备光反应性表面的优良手段。因此用70微波辐射制备的光反应性LCAA-CPG比用现有技术，即37℃下20小时(表1)，得到的光反应性表面效果更好。
也发现60秒微波辐射产生的光反应性的氨基二氧化硅有良好的效果(图4)。对于氨基聚苯乙烯，60秒微波辐射对于制备光反应性氨基聚苯乙烯的聚合物与FNAB的反应也是足够的(图5)。与氨基聚合物相比，含羟基的聚合物需要碱性催化剂以和FNAB反应。所用KOH(催化剂)的量的优化是这样进行的：在甲苯存在下且使用不同量的KOH水溶液，通过搅拌在室温下将PVA与FNAB反应1小时。发现6.6μl的30％KOH对于在5ml甲苯存在下PVA与FNAB(各50mg)的反应最佳。申请人也优化了使用KOH在室温下制备光反应性的PVA所需的时间。最适宜的时间是60分钟(图7)。但是，微波辐射10分钟得到了相当的结果。
在光活化步骤中，将FNAB涂敷的PVA暴露在UV光下来活化PVA。然后将光活化的PVA用于在37℃下1小时固化辣根过氧化酶。在本发明的步骤中，通过微波辐射(或通过37℃热孵育)使PVA和FNAB反应来制备光反应性的PVA。通过将它们暴露于紫外光下来在该光反应性的PVA上固化辣根过氧化酶。表2的结果显示光反应性的聚合物(表面热活化)比热反应性表面(表面光活化)产生更好的生物分子固化效果。因此，本发明的步骤所述的光化学固化步骤(热化学活化和光化学固定化)是比热化学固化步骤(光化学活化和热化学固定化)是更优的选择。
申请人优化了用于制备光反应性聚合物的联接剂(FNAB)的浓度及其与聚合物(PVA)的孵育时间。在第二步中，利用光能将酶(HRP)通过其光反应性基团固化在所述聚合物上。因此，通过在不同时间用UV交联仪的紫外光将酶在烷氨基硅胶上固定化。酶在光反应性的烷氨基硅胶上固定化的最适宜时间是10分钟。但是，提高紫外辐射时间到10分钟以上并不提高固化(图8)。HRP固化在光反应性LCAA-CPG上的最适宜时间是20分钟(图9)。但是，光反应性PVA需要60分钟的UV辐射以使HRP在其上的固化最优化。进一步增加紫外辐射的时间降低了吸光度，可能是因为一些已固化的酶失活(图10)。酶的浓度也是固定化的重要因素。2μgHRP/50mg光反应性PVA对于在PVA上的固化是最适宜的，进一步增加酶的浓度并不明显提高其固化(图11)。但是对于在光反应性LCAA-CPG(图12)上和在烷氨基硅胶上(图13)的固化最适宜的HRP的量是4μg/50mg支持物。固化在20mg LCAA-CPG和20mg烷氨基硅胶上的活性酶的总量分别是160U和120U。
因此，在本发明中，光反应性支持物的所述制备方法简单快速，且克服了已报导的方法的缺点。同时，生物分子在光反应表面上的固化也简单快速。
下表给出了本发明方法的优点：
表II
本发明及其优点
编号 本发明 优点
1 本发明提供了能和生物分子形成共价键而不用考虑此生物分子官能团的光反应性聚合物的快速、微波介导的制备方法。 所发明的方法能通过微波辐射在约50秒内活化含氨基的聚合物，在约10分钟内活化含醇的聚合物。因此克服了制备光反应性聚合物的冗长的过程。
2 本发明也提供了固化生物分子在光反应性聚合物上的快速技术，时间从10-70分钟不等。 在本发明中，最适宜的生物分子固化时间是10-70分钟，比使用光联剂的现有技术(12-16小时)短得多。2)活化的表面有潜力应用于需要固化分子的色谱分离、基因组学和蛋白质组学。3)作为光联剂的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯可容易地制备。
辣根过氧化物酶、长链烷基胺控制的多孔玻璃(正常直径
Figure S03826394719950403D000121
，目大小：80-120)、对苯二胺从美国Sigma购得。硅胶LR(100-200目)从S.D精细化学购得。H2O2、甲醇、二甲基甲酰胺、甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸是分析纯，从印度Merck购得。FNAB通过如以往报导的偶氮反应从4-氟-3-硝基苯胺制备[15]。微波介导的反应在BPL Sanyo微波炉中进行，该微波炉在2450Hz频率运行，输出功率为700瓦特。光固化在UV交联仪中在365nm波长下进行，该UV交联仪型号2400(Stratagene，USA)，配有五个1 5瓦特的管。在用前用三重过滤的水新鲜配制所有的溶液。通过将0.85％NaCl与0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合制备磷酸盐缓冲盐液(PBS)。通过加入(在PBS中加入0.1％Tween 20)制备洗涤缓冲液。新鲜配制的基质染料缓冲液含12ml的柠檬酸缓冲液(0.025M的柠檬酸和0.5M Na2HPO4·2H2O，pH5)、5μl的H2O2(30％w/v)和4mg的对苯二胺。
实施例1：制备光反应性硅胶1-氟-2-硝基-4-叠氮苯含量的优化(图1)
将5g干燥(无湿度)的硅胶与10ml的3-氨基丙基三乙氧基硅烷和80ml的甲苯混合并在28℃搅拌3小时。然后过滤并分别用甲醇、水、甲醇∶水(1∶1)和甲醇洗涤。干燥支持物并通过茚三酮实验来分析氨基。茚三酮实验呈阳性证实氨基联到了硅胶上。将含50mg烷氨基硅胶、6.25mgFNAB和10ml DMF的锥形瓶暴露于微波中60秒。之后用甲醇洗涤锥形瓶中的支持物，干燥并保存在皮氏培养皿中。以不同含量的FNAB(分别为12.5、25、50、75和100mg)进行同样的实验来优化FNAB的浓度。将HRP(1μg/80μl的PBS)加入到50mg的光反应性硅胶中并在UV交联仪中在365nm的条件下辐射20分钟。所述支持物用洗涤缓冲液洗涤，随后加入300μl的基质染料缓冲液。将有色的溶液转移到相对的聚苯乙烯混合滴定孔中并用ELISA记录仪在490nm处记录吸光度。以相似的方式用未处理的烷氨基硅胶(FNAB：0mg)进行对照实验。
实施例2：制备光反应性长链烷基胺控制的多孔玻璃的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯浓度的优化(图2)
将50mg烷氨基硅胶、6.25mg FNAB和10ml DMF置于锥形瓶中并暴露于微波中60秒。以不同含量的FNAB(分别为12.5、25和50mg)进行同样的实验来优化FNAB的浓度。
以实施例1相似的方式来进行酶的固化和测定。用未处理的LCAA-CPG(FNAB：0mg)进行对照实验。
实施例3：制备光反应性PVA的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯的浓度优化(图3)
将含50mg PVA、50mg FNAB、6.5μl 30％的KOH和5ml甲苯的锥形瓶在室温(28℃)黑暗的环境下持续搅拌1小时。另取三个锥形瓶，以相似方法制备反应混合物，但是FNAB的浓度分别是12.5、25和75mg。1小时后，用甲醇洗涤锥形瓶中的支持物，干燥并保存在皮氏培养皿中。将HRP(1μg/80μl的PBS)加入到每个光反应性PVA(50mg)中并在UV交联仪中在365 nm的条件下辐射30分钟。以类似实施例1所述的方法分析酶。类似的，用未处理的PVA小珠(FNAB：0mg)进行对照实验。实施例4：活化烷氨基硅胶的微波暴露时间的优化(图4)
将每个都含有50mg PVA、50mg FNAB、6.5μl 30％的KOH和5ml甲苯的四个锥形瓶，分别暴露于微波中30、50、60和70秒。规定的时间后，用甲醇分别洗涤每个锥形瓶中的支持物，干燥并保存在四个皮氏培养皿中。以类似实施例1所述的方法固化HRP。类似的，用未处理的烷氨基硅胶小珠进行对照实验。
实施例5：活化氨基聚苯乙烯的微波暴露时间的优化(图5)
将氨基聚苯乙烯和乙醇加入到锥形瓶中并暴露于微波中40秒。以相同的方式进行另外两个实验，但微波暴露时间分别是50和60秒。规定的微波暴露时间后，用乙醇洗涤锥形瓶中的支持物，干燥并保存在皮氏培养皿中。将HRP(35μg/80μl的PBS)加入到每个光反应性的聚苯乙烯(50mg)中并在UV交联仪中在365nm的条件下辐射20分钟。以类似实施例1所述的方法分析酶。类似的，用未处理的氨基聚苯乙烯进行对照实验。
实施例6：PVA热活化的KOH浓度的优化(图6)
将含有50mg PVA、50mg FNAB、6.5μl 30％KOH和5ml甲苯的锥形瓶在室温黑暗的环境下连续搅拌1小时。以相同的方式但以不同含量的30％KOH(分别是3.25、6.5、13和20μl)进行另外四个实验。1小时后，用甲醇分别洗涤锥形瓶中的支持物，干燥并保存在皮氏培养皿中。将HRP(16μg/80μl的PBS)加入到每个光活性的PVA(50mg)中并在UV交联仪中在365nm的条件下辐射30分钟。用洗涤缓冲液洗涤所述支持物，随后加入300μl的基质染料缓冲液。将有色的溶液转移到相对的聚苯乙烯混合滴定孔中并用ELISA记录仪在490nm处记录吸光度。类似的，用未处理的PVA小珠进行对照实验。
实施例7：PVA热活化所需时间的优化(图7)
将每个都含有50mg PVA、50mg FNAB、6.5μl 30％的KOH和5ml甲苯的四个锥形瓶在室温黑暗的环境下分别持续搅拌5、10、60、180和300分钟。如实施例6所述将HRP固化在光反应性的PVA上并进行分析。类似的，用未处理的PVA小珠进行对照实验。
实施例8：在微波活化光反应性烷氨基硅胶上固化酶的紫外辐射时间的优化(图8)
利用10ml DMF中的300mg FNAB通过70秒微波辐射将300mg烷氨基硅胶活化。将六个皮氏平皿(petri plate)，其中每个都含有50mg光反应性烷氨基硅胶和HRP(16μg/80μl的PBS)，在UV交联仪中在365nm的条件下分别辐射2、5、10、20、40、60和80分钟。用洗涤缓冲液洗涤支持物，随后加入300μl的基质染料缓冲液。将有色的溶液转移到相对的聚苯乙烯混合滴定孔中并用ELISA记录仪在490nm处记录吸光度。类似的，用未处理的烷氨基硅胶进行对照实验。
实施例9：在微波活化的光反应性LCAA-CPG上固化酶的辐射时间的优化(图9)
利用10ml DMF中的300mg FNAB通过70秒微波辐射将300mgLCAA-CPG活化。将六个皮氏平皿，其中每个都含有50mg光反应性LCAA-CPG和HRP(16μg/80μl的PBS)，在UV交联仪中在365nm的条件下分别辐射2、10、20、40、和60分钟。如实施例8所述分析固化的酶。类似的，用末处理的LCAA-CPG进行对照实验。
实施例10：在微波活化的光反应性PVA上固定酶的紫外辐射时间的优化(图10)
利用10ml DMF中的300mg FNAB通过70秒微波辐射将300mg PVA活化。将六个皮氏平皿，其中每个都含有50mg光反应性PVA和HRP(16μg/80μl的PBS)，在UV交联仪中在365nm的条件下分别辐射2、5、20、30、60、120和180分钟。用洗涤缓冲液洗涤所述支持物，随后加入300μl的基质染料缓冲液。将有色的溶液转移到相对的聚苯乙烯混合滴定孔中并用ELISA记录仪在490nm处记录吸光度。类似的，用未处理的PVA进行对照实验。
实施例11：在光反应性的PVA上固化酶的酶浓度的优化(图11)
在100ml PBS中加入1mg HRP以配制储备溶液。将七个皮氏平皿，其中每个分别含有50mg光反应性PVA和不同浓度的HRP(即2.5、5、10、20、40、80和160μl相当于0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μg的HRP)，在UV交联仪中在365nm的条件下辐射30分钟。用洗涤缓冲液洗涤所述支持物，随后加入300μl的基质染料缓冲液。以类似实施例1所述的方法分析酶。类似的，用未处理的PVA进行对照实验。
实施例12：在微波活化的LCAA-CPG上固化酶的酶浓度的优化(图12)
将五个皮氏平皿，其中每个分别含有50mg光反应性LCAA-CPG和10、25、50、100或200μl的HRP溶液(相当于0.2、0.5、1.0、2.0或4.0μg的HRP)，在UV交联仪中在365 nm的条件下辐射20分钟。如实施例8所述分析固化在光反应性LCAA-CPG上的酶。用未处理的LCAA-CPG进行对照实验。
实施例13：在微波活化的光反应性烷氨基硅胶上固化酶的酶浓度的优化(图13)
将五个皮氏平皿，其中每个分别含有50mg微波活化的光反应性烷氨基硅胶和0.5、1.0、2.0、4.0或6.0μg的HRP，在UV交联仪中在365nm的条件下辐射20分钟。如实施例8所述分析固化的酶。用未处理的光反应性烷氨基硅胶进行对照实验。
实施例14：将光联剂附加到LCAA-CPG上的微波暴露时间的优化(表1)
将四个锥形瓶，其中每个都含有50mg LCAA-CPG、50mg FNAB和10ml DMF，分别暴露于微波中30、50、60和70秒。规定的时间后，用甲醇分别洗涤每个锥形瓶中的支持物，干燥并保存在四个皮氏培养皿中。以类似实施例1所述的方法固化HRP。类似的，用未处理的LCAA-CPG小珠进行对照实验。
实施例15：在37℃下LCAA-CPG活化时间的优化(表1)
将四个锥形瓶，其中每个都含有50mg LCAA-CPG、50mg FNAB和10ml DMF，在37℃下分别搅拌5、10、15和20小时。规定的时间后，用甲醇分别洗涤每个锥形瓶中的支持物，干燥并保存在皮氏培养皿中。以类似实施例1所述的方法固化和分析HRP。类似的，用未处理的LCAA-CPG小珠进行对照实验。
实施例16：PVA的光化学活化与热化学活化的比较(表2)
PVA的光化学活化-在皮氏培养皿中将250mg PVA和2500μl甲醇中的250mg FNAB混合。蒸发甲醇后，在UV交联仪中在365nm的条件下将反应混合物辐射60分钟。然后用甲醇洗涤支持物并干燥。将四个皮氏平皿，其中每个均含有50mg热反应性的PVA，分别与2、4、8和16μgHRP混合并在37℃条件下孵育60分钟。如实施例1所述分析酶。类似的，用未处理的PVA进行对照实验。
PVA的热化学活化-利用上述同等量的PVA、FNAB和HRP并根据实施例3所述的步骤进行PVA的热活化和在该光反应性PVA上固化HRP。
实施例17：确定光反应性LCAA-CPG和烷氨基硅胶上固化的HRP的活性
用UV交联仪将反应混合物(1μg HRP/50μl PBS和50mg光反应性LCAA-CPG)辐射20分钟来把HRP固化在光活性的LCAA-CPG上。用联茴香胺作为供氢体和过氧化氢作为底物，通过检测490nm处颜色的发展比值来确定固化的HRP的活性。用不同含量的HRP(0.5、1、2、4、8、16、32和64ng)做出标准曲线。在10分钟内每间隔1分钟记录吸光度并确定每分钟吸光度的变化率。如上所述确定光反应性烷氨基硅胶上固定的HRP的活性。
实施例18：PVA的微波与热活化的比较
将PVA(50mg)与FNAB(50mg)、甲苯(5ml)和6.5μl 30％KOH混合并在室温下持续搅拌1小时。将类似的反应混合物暴露于微波辐射中10分钟。所述反应后，用甲醇洗涤所述支持物并干燥。在皮氏培养皿中将室温下制备的50mg光反应性烷氨基硅胶与1μl的HRP混合并在UV交联仪中在365nm的条件下辐射30分钟。用微波制备的光反应性的PVA进行类似的实验。如上所述分析固化的HRP。类似的，用未处理的PVA进行对照实验。
表1
时间(秒/小时) 活化方式 +FNAB -FNAB
 30秒 微波 0.823  0.215
 50秒 微波 1.021  0.311
 60秒 微波 1.722  0.320
 70秒 微波 1.960  0.415
 5小时 37℃ 0.885  0.337
 10小时 37℃ 0.966  0.321
 15小时 37℃ 0.998  0.331
 20小时 37℃ 1.368  0.320
表2
Figure S03826394719950403D000191
表1.微波辐射和37℃下不同孵育时间制备的光反应性LCAA-CPG的效率研究(实施例14、15)
通过不同的微波暴露时间(30、50、60和70秒)和37℃不同的孵育时间(5、10、15和20小时)来制备光反应性LCAA-CPG。通过光辐射1μg的HRP及50mg支持物并比色分析固化的酶来检查光反应性表面。
表2.热化学活化和光化学活化的PVA上的固化效率比较(实施例16)
通过热化学和光化学反应分别制备光化学反应性的和热化学反应性的PVA。通过在其上固化不同含量的HRP(2、4、8和16μg)而后测定固化的酶来比较固化的效率。
优点
1.发明了制备光反应性聚合物和在其表面用紫外光快速固化生物分子的简单、快速和有效的方法。
2.通过本发明的方法都能活化任何有亲核基团的聚合物。
3.通过本发明的方法，对于含氨基的聚合物在50秒内完成聚合物的活化，对于含羟基醇的聚合物在10分钟内完成聚合物的活化。
4.在本发明的方法中，通过微波辐射进行活化。
5.本发明的光反应性表面有潜力应用于使用的生物分子的固化的诊断学、亲和层析、蛋白质组学、基因组学、药物筛选以及其他相关领域中。
参考文献
1.克里斯迪瓦等(Krysteva，et.al.)，利用甲醛将酶共价固化于含丙烯酰胺单位的合成膜上(Covalent binding of enzymes to synthetic membrane containing acrylamide units，using formaldehyde)，Biotechnol Appl.Biochem.13：106-111(1991)
2.潘迪等(Pandey，et.al.)，基于石墨膏改性电极的对葡萄糖的电流酶传感器(Amperometric enzyme sensor for glucose based on graphite paste-modified electrodes)，Appl.Biochem.Biotechnol.33：139-144(1992)
3.提勒J等(Tiller，J.et.al.)，通过左旋维生素C酸在NH2聚合物上的新的有效的酶固化反应(A novel efficient enzyme-immobilization reaction on NH2 polymers by meansofL-ascorbic acid)，Biotechnol.Appl.Biochem.30，155-162(1992)
4.郭等(Guo，et.al.)，葡糖氧化酶和过氧化酶的固化及其在血清葡萄糖流动注射分析中的应用(Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application inflow injection analysis for glucose in serum)，Appl.Biochem.Biotechnol.23(1)：15-24(1990)
5.纳卡姆拉等(Nakamura，et.al.)，尿酸酶在玻璃珠上的鱼精蛋白上的固化及其在尿酸检测中的应用(Immobilization of uricase on protamine bound to glass beads and itsapplication to determination ofuric acid)，Anal.Biochem.152(2)：386-390(1986)
6.塔瓦等(Tawa，et.al.)，在控制性的多孔玻璃上固化黄嘌呤氧化酶，在高效液相层析中的应用(Immobilization of xanthine oxidase to controlled pore-glass.Application tohigh-performance liquid chromatography)，Nucleic Acids Symp.Ser.12：107-110(1983)
7.斯塔博尔等(Stabel，et.al.)，固化抗-IgG控制的多孔玻璃，作为共价固化基质的亚硫酰氯活化的丙基琥珀酰胺玻璃(Anti-IgG immobilized controlled pore glass.Thionylchloride-activated succinamidopropyl glass as a covalent immobilization matrix)，Appl.Biotechnol.36(2)：87-96(1992)
8.德曲爱罗兹等(de Queiroz，et.al.)，固定于PE和PVC薄膜上的白蛋白的表面研究(Surface studies of albumin immobilized onto PE and PVC films)，J.Biomater.Sci.Polym.8：667-681(1997)
9.索非亚等(Siephia，et.al.)，通过无水amnonia气相等离子技术在聚丙烯珠表面上对酶的固化(Immobilization of enzymes on polypropylene bead surfaces by anhydrousamnonia gaseous plasma technique)，J Biomed.Mater.Res.22(5)：417-22(1988)
10.纳哈尔等(Nahar，et.al.)，光诱导活化惰性表面来共价固定蛋白配体(Light-inducedactivation of an inert surface for covalent immobilization of a protein ligand)；Anal.Biochem.294：148-153(2001)
11.纳克维等(Naqvi，et.al.)，在聚丙烯和聚乙烯表面上引入官能团以用于酶的固定化(Introduction of functional groups onto polypropylene and polyethylene surfaces forimmobilization of enzymes)，Anal.Biochem.306：74-78(2002)
12.博拉等(Bora，et.al.)，在光活化的聚苯乙烯微量滴定板上共价固定蛋白质以用于酶联免疫吸收分析方法(Covalent immobilization of proteins onto photoactivatedpolystyrene microtiter plates for enzyme-linked immunosorbent assay procedures)，J.Immunol.Methods.268：171-177(2002)
13.纳哈尔P.(Nahar，P)，光化学活化聚合物表面及在活化的表面上固化生物分子(Method for photochemical activation of polymer surface and immobilization ofbiomolecules onto activated surface)，美国专利待审
14.斯格里斯特等(Sigrist，et.al.)，生物分子在惰性表面上的依赖于光的共价固定(Light dependent，Covalent immobilization of biomolecules on inert surface)，Biotechnology 10：1026-1028(1992)
其它文献
美国专利文件
5,427,799 1995  埃尔斯呢等(Elsner，et.al.)
6,033,784.2000  翟考波森等(Jacobsen，et.al.)
3,959,078 1976  贵勒(Guire)
5,002,582 1991 贵勒等(Guire，et.al.)

Claims (21)

1.分子固化其上的光反应性聚合物的制备方法，所述方法包括：
(a)将光联剂、含亲核基团的聚合物和溶剂的混合物暴露于微波辐射，使得含亲核基团的聚合物与溶解在适合溶剂中的光联剂分子反应，
(b)用适合的溶剂洗涤所述聚合物，随后在室温下干燥所述洗过的聚合物以得到光反应性聚合物，
(c)将溶解在适合缓冲溶液中的分子加到所述光反应性聚合物上，
(d)将含有所述分子和所述光反应性聚合物的混合物置于光源下2分钟到2小时以在所述光反应性聚合物上固化所述分子，及
(e)用适合的缓冲溶液洗涤所述含有固化分子的聚合物，随后在室温下干燥所述聚合物以得到分子固化在其上的光反应性聚合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的光联剂具有热化学基团，所述热化学基团选自能与所述聚合物的亲核基团形成共价键的基团。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的光联剂的热化学基团选自醛基、羰基、异硫氰酸根、卤素和异氰酸根。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的光联剂具有光化学基团，所述光化学基团具有光反应性，且能在光化学反应中不需添加任何其它的试剂即可与所述分子形成共价键。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的光联剂的光化学基团选自碳烯前体、氮烯前体和氧自由基。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的光联剂是1-氟-2-硝基-4-叠氮苯(FNAB)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的聚合物包括任何有氨基、羟基、巯基或任何其它反应性亲核基团的聚合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述的聚合物选自硅胶、长链烷基胺控制的多孔玻璃、聚乙烯醇、氨基聚苯乙烯和烷氨基硅胶。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述的步骤(a)所用的溶剂选自二甲基甲酰胺和甲苯。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述的步骤(a)在催化剂存在的条件下进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述的催化剂包括30％KOH。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述的微波辐射暴露在2000Hz到2600Hz的频率，功率输出从100瓦特到1000瓦特，时间从10秒到20分钟条件下进行。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述的用于洗涤步骤(a)所得到的聚合物的溶剂包括能够溶解所述光联剂及其降解产物而不改变所述聚合物的溶剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的溶剂选自甲醇和乙醇。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述的聚合物选自小珠、小孔、薄片、粉末、小棒、盘、小条或小管的形式。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述的在光反应性聚合物上固化的分子选自有机分子、生物分子和任何有C-H键的分子。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的生物分子选自蛋白质、核酸、碳水化合物、寡核苷酸、酶、抗原、抗体和肽。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述的酶是辣根过氧化物酶。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述的光能来源选自紫外光、阳光、激发光和激光束。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述的用作光源的紫外光波长为300nm到400nm，且固化所述分子所用的暴露时间为2分钟到2小时。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述的聚合物表面的所述亲核基团与所述光联剂的反应在溶剂存在下在微波炉中进行。
CN038263947A 2003-03-31 2003-03-31 在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法 Expired - Fee Related CN1809752B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IN2003/000104 WO2004088316A1 (en) 2003-03-31 2003-03-31 Method for preparing photoreactive polymers for immobilizing biomolecules thereon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1809752A CN1809752A (zh) 2006-07-26
CN1809752B true CN1809752B (zh) 2011-08-10

Family

ID=33104953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN038263947A Expired - Fee Related CN1809752B (zh) 2003-03-31 2003-03-31 在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1608972B1 (zh)
CN (1) CN1809752B (zh)
AT (1) ATE378599T1 (zh)
AU (1) AU2003226633A1 (zh)
DE (1) DE60317571T2 (zh)
IL (1) IL171177A (zh)
WO (1) WO2004088316A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101140256B (zh) * 2007-10-19 2010-08-25 江南大学 光固定化辣根过氧化物酶电极的制备方法及其应用
EP2982698A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-10 Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives Method for photo-immobilizing biomolecules on substantially non-porous carriers
WO2017136187A2 (en) * 2016-02-01 2017-08-10 Micro Detect, Inc. Uv solid state detection and methods therefor
CN106118403A (zh) * 2016-07-28 2016-11-16 江苏昌悦重工科技有限公司 光伏逆变器型箱
CN113233860B (zh) * 2021-06-07 2023-08-01 林西金易来砷业有限公司 一种砷滤饼固化处理工艺

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3959078A (en) * 1973-05-18 1976-05-25 Midwest Research Institute Enzyme immobilization with a thermochemical-photochemical bifunctional agent
US5858653A (en) * 1997-09-30 1999-01-12 Surmodics, Inc. Reagent and method for attaching target molecules to a surface

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2098960C (en) * 1992-07-10 2004-11-02 Richard Barner Bio specifically recognizing surfaces on solid supports and method for their preparation
DE19818360C2 (de) * 1998-04-24 2000-05-31 Suisse Electronique Microtech Dextranbeschichtete Oberfläche
EP1309864B1 (en) * 2000-08-16 2005-12-28 Council of Scientific and Industrial Research A rapid method for microwave mediated enzyme-linked immunosorbent assay

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3959078A (en) * 1973-05-18 1976-05-25 Midwest Research Institute Enzyme immobilization with a thermochemical-photochemical bifunctional agent
US5858653A (en) * 1997-09-30 1999-01-12 Surmodics, Inc. Reagent and method for attaching target molecules to a surface

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pradip Nahar 等.light-induced activation of an inert surface for covalentimmobilization of a protein ligand.analytical biochemistry 294.2001,(294),148-153.
Pradip Nahar 等.light-induced activation of an inert surface for covalentimmobilization of a protein ligand.analytical biochemistry 294.2001,(294),148-153. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004088316A1 (en) 2004-10-14
DE60317571D1 (de) 2007-12-27
EP1608972B1 (en) 2007-11-14
AU2003226633A1 (en) 2004-10-25
EP1608972A1 (en) 2005-12-28
IL171177A (en) 2011-12-29
DE60317571T2 (de) 2008-09-25
CN1809752A (zh) 2006-07-26
ATE378599T1 (de) 2007-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nakanishi et al. A novel method of immobilizing antibodies on a quartz crystal microbalance using plasma-polymerized films for immunosensors
Kim et al. Protein immobilization techniques for microfluidic assays
Singh et al. Development of sensors for direct detection of organophosphates. Part I: immobilization, characterization and stabilization of acetylcholinesterase and organophosphate hydrolase on silica supports
Křenková et al. Immobilized microfluidic enzymatic reactors
US8168399B2 (en) Supports for assaying analytes and methods of making and using thereof
Hengsakul et al. Protein patterning with a photoactivatable derivative of biotin
US7348182B2 (en) Directed microwave chemistry
JP4608107B2 (ja) 未修飾生体高分子のフッ化アシル活性化基質への固定化
Nahar et al. Light-induced activation of an inert surface for covalent immobilization of a protein ligand
US20060286682A1 (en) Surface treatment
JP5588430B2 (ja) 標識独立検出のための表面及びその方法
CN101363870A (zh) 生物传感芯片及其制备方法
Sung et al. Toward immunoassay chips: Facile immobilization of antibodies on cyclic olefin copolymer substrates through pre-activated polymer adlayers
Bora et al. Photoreactive cellulose membrane—A novel matrix for covalent immobilization of biomolecules
Naqvi et al. Photochemical immobilization of proteins on microwave–synthesized photoreactive polymers
Naqvi et al. Introduction of functional groups onto polypropylene and polyethylene surfaces for immobilization of enzymes
CN1809752B (zh) 在其上固化生物分子的光反应性聚合物的制备方法
Ghéczy et al. Controllable Enzyme Immobilization via Simple and Quantitative Adsorption of Dendronized Polymer–Enzyme Conjugates Inside a Silica Monolith for Enzymatic Flow-Through Reactor Applications
US20090171052A1 (en) Polyelectrolyte Monolayers and Multilayers for Optical Signal Transducers
US20040192842A1 (en) Method for preparing photoreactive polymers and immobilization of biomolecules onto these polymers
US20050019828A1 (en) Gelatin coated receiver as protein microarray substrate
RU2309180C2 (ru) Способ получения фотореактивных полимеров для иммобилизации на них биомолекул
WO2006088192A1 (ja) 分析用担体及びそれを用いる測定方法
KR20030005652A (ko) 실리케이트의 코팅 방법
Sola et al. A Bifunctional Polymeric Coating for the Co-Immobilization of Proteins and Peptides on Microarray Substrates

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110810

Termination date: 20130331