DE60317571T2

DE60317571T2 - Verfahren zur herstellung von photoreaktiven polymeren zur immobilisierung von biomolekülen

Info

Publication number: DE60317571T2
Application number: DE60317571T
Authority: DE
Inventors: Pradip Nahar; Azmi Naqvi
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2023-04-01
Also published as: DE60317571D1; AU2003226633A1; EP1608972A1; IL171177A; EP1608972B1; CN1809752A; CN1809752B; WO2004088316A1; ATE378599T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein schnelles Verfahren zum Herstellen von fotoreaktiven Polymeren und zum Immobilisieren von Biomolekülen auf diesen Polymeren. Fotoreaktive Polymere sind Polymere, welche hoch reaktionsfähig werden, wenn sie dem Licht von einer spezifischen Wellenlänge ausgesetzt werden, und welche sich auf kovalente Weise mit den Biomolekülen verbinden. Dieses Verfahren zum Immobilisieren ist sanft, einfach und unabhängig von dem pH-Wert und der Temperatur. Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Foto-Immobilisierungstechnik leicht beeinflusst und gesteuert werden kann.
TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Nachfrage nach einer Immobilisierung von Biomolekülen auf einem organischen oder anorganischen Polymer hat sich in den jüngsten Jahren dramatisch erhöht, insbesondere in der Post-Genomära. Immobilisierte Biomoleküle finden vielseitige Anwendungen in klinischen Laboratorien, bei Biosensoren, bei Membranbioreaktoren, in der Diagnostik, in der Genomik, in der Proteomik, bei der Klassierung von Arzneimitteln, in der Affinitätschromatographie und auf vielen anderen damit zusammenhängenden Gebieten. Es gibt verschiedene Ansätze, um ein Biomolekül auf einer inerten Oberfläche zu immobilisieren um etwa (i) die Polymeroberfläche zu aktivieren, (ii) das Biomolekül zu aktivieren oder (iii) beides vor dem Immobilisieren zu aktivieren. Vom praktischen Standpunkt aus ist der Ansatz (i) eine bessere Wahl, weil in den meisten der Fälle die Biomoleküle wertvoll und empfindlich gegenüber von Chemikalien sind und weil während der Aktivierung ein Teil derselben verloren gehen kann.
Biomoleküle, die auf den Polymeroberflächen immobilisiert sind, finden vielseitige Anwendungen in der Diagnostik, als Biosensoren, als Membranbioreaktoren, in der Genomik, in der Proteomik, bei Verfahren zum Klassieren von Arzneimitteln, in der Affinitätschromatographie und auf vielen anderen damit zusammenhängenden Gebieten [Krysteva, et al., Covalent binding of enzymes to synthetic membrane containing acrylamide units, using formaldehyde, Biotechnol. Appl. Biochem. 13: 106–111 (1991); Pandey, et al., Amperometric enzyme sensor for glucose based an graphite Paste-modified electrodes, Appl. Biochem. Biotechnol. 33: 139–144 (1992)].
Die Nachfrage nach einfachen und schnellen Verfahren zum Immobilisieren von Biomolekülen auf Polymeroberflächen wächst weiterhin in der Post-Genomära.
Es sind verschiedene Verfahren verfügbar für das Immobilisieren von Biomolekülen auf den Polymeroberflächen. Eine kovalente Immobilisierung kann zu einer besseren Biomolekülaktivität, zu einer verminderten nicht spezifischen Adsorption und zu einer größeren Stabilität führen [Tiller, J. et al., A novel efficient enzyme-immobilization Reaktion an NH₂ polymers by means of L-ascorbic acid, Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 155–162 (1992)]
Es gibt eine Anzahl von Wegen für die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen auf verschiedenen Polymerträgern. Glukoseoxydase, Uricase, Xanthinoxydase und Penicillinazylase werden immobilisiert auf Alkylaminglas oder auf Kieselgel durch das Kopplungsverfahren mit Glutaraldehyd [Guo, et al., Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application in flow injection analysis for glucose in serum, Appl. Biochem. Biotechnol. 23(1): 15–24 (1990); Nakamura, et al., Immobilization of uricase an protamin bound to glass beads and its application to determination of mit acid, Anal. Biochem. 152(2): 386–390 (1986); Tawa, et al., Immobilization of xanthine oxidase to controlled pore-glass. Application to high-performance liquid chromatography, Nucleic Acids Symp. Ser. 12: 107–110 (1983)]. Auf Glas mit kontrollierten Poren immobilisierte Glukoseoxydase, Cholesteroloxydase und Uricase werden angewendet für die Bestimmung von Glukose, Cholesterol bzw. Harnstoff in dem Serum.
Mit Thionylchlorid aktiviertes Succinamidpropylglas mit kontrollierten Poren wird verwendet, um ein Kaninchen-Anti-Rind-IgG kovalent zu immobilisieren [Stabel, et al., Anti-IgG immobilized controlled Pore glass. Thionyl chloride-activated succinamidopropyl glass as a covalent immobilization matrix, Appl. Biotechnol. 36(2): 87–96 (1992)]. Enzyme wie etwa das Acetylcoenzym.
Eine Synthetase wird auf CNBr-aktiviertem Glas mit gesteuerten Poren immobilisiert. Es ist berichtet worden, dass eine Aktivierung von einer inerten, organischen Polymeroberfläche wie etwa Polystyrol, Polypropylen oder Polyethylen eintritt durch eine Strahlungspfropfpolymerisation oder durch eine Technik mit gasförmigem Plasma [de Queiroz, et al., Surface studies of albumin immobilized onto PE and PVC films, J. Biomater. Sci. Polym. 8: 667–681 (1997); Siephia, et al., Immobilization of enzymes an polypropylene bead surfaces by anhydrous ammonia gaseous plasma technique. J Biomed. Mater. Res. 22(5): 417–22 (1988)].
Alle diese Verfahren leiden jedoch unter einer oder unter mehreren Unzulänglichkeiten wie etwa darunter, dass (i) sie umständlich sind, (ii) sie zeitraubend sind, (iii) sie gefährliche Chemikalien erfordern oder (iv) sie raue Reaktionsbedingungen erfordern.
Die mit Hilfe eines Fotoverbindungsmittels bzw. Fotolinkers vermittelte Technik erlaubt es eine kovalente Bindung eines Biomoleküls an eine feste Oberfläche unter einer sachten Reaktionsbedingung zu verwirklichen. Dieses Verfahren basiert gewöhnlich auf einem Fotoverbindungsmittel, das mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist, von denen eine im Wesentlichen aus einer fotoaktivierbaren Gruppe besteht.
Es gibt verschiedene Verfahren, die für das Immobilisieren eines Biomoleküls durch ein Fotoverbindungsmittel zur Verfügung stehen. Elsner et al. beschreibt in dem US Pat. No. 5427779 ein Verfahren für das Aktivieren einer inerten Oberfläche durch ein aus zwei Ringen bestehendes heterozyklisches Fotoverbindungsmittel wie etwa Psorlen durch eine fotochemische Reaktion.
Jacobsen et al. offenbaren in dem US Pat. No. 6033784 ein Verfahren für ein fotochemisches Aktivieren einer Polymeroberfläche unter Verwendung von Chinon. Unter Verwendung von einem primären Amino, das ein Chinonderivat enthält, wird die Aminogruppe auf die Polystyroloberfläche eingeführt. Diese Gruppen können jedoch nicht leicht mit dem Protein binden ohne die Zugabe von einem oder mehreren aktivierenden Reagenzien. Die Herstellung von solchen Platten und Fotoverbindungsmitteln ist auch zeitraubend und beschwerlich.
Jüngst haben Nahar et al. und Bora etal [Nahar, et al., Light-induced activation of an inert surface for covalent immobilization of a Protein ligand, Anal. Biochem. 294: 148–153 (2001); Nahar, P. US Patentanmeldung No. US-A-2003/0228410, Method for photochemical activation of polymer surface and immobilization of biomolecules onto activated surface; Bora et al., Covalent immobilization of Proteins onto photoactivated polystyrene microtiter plates (2002)] und später Naqvi et al. [Naqvi, et al., Introduction of functional groups onto polypropylene and polyethylene surfaces for immobilization of enzymes, Anal., Biochem. 306: 74–78 (2002)] ein einfaches, schnelles und leichtes Verfahren für eine lichtinduzierte Aktivierung von inerten Polymeren wie etwa Polystyrol, Polypropylen und Polyethylen unter Verwendung von 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol beschrieben. Dieses Verfahren wird in dem Test verwendet, der in WO-A-02/14868 (Scientific and Industrial Research Council) offenbart worden ist.
In den meisten dieser mit Hilfe eines Fotoverbindungsmittels vermittelten Verfahren werden die Oberflächen durch eine fotochemische Reaktion aktiviert, wobei die Biomoleküle durch eine thermochemische Reaktion immobilisiert werden. Daher müssen die Biomoleküle eine oder mehrere funktionelle Gruppen für die Reaktion mit der aktivierten Oberfläche aufweisen, was zu einer kovalenten Verbindung führt. Im Gegensatz dazu kann in der fotochemischen Immobilisierungstechnik ein Biomolekül immobilisiert werden ohne Berücksichtigung ihrer funktionellen Gruppe. Es gibt nur sehr wenige Berichte über ein fotochemisches Immobilisieren eines Biomoleküls.
Sigrist, H. et al. immobilisieren ein Biomolekül auf einer inerten Oberfläche, indem sie ein Polymerfotoverbindungsmittel verwenden, das aus der Reaktion von BSA und 3-(Triethylamin)-3-(m-isothiocyanophenyldiazirin) hergestellt ist. Ein Polymerfotoverbindungsmittel wird dann verwendet, um sowohl die Streptavidin- als auch die Polystyroloberfläche gleichzeitig zu binden, indem man sie dem Licht gegenüber aussetzt, [Sigrist, et al., Light dependent, Covalent immobilization of biomolecules an inert surface, Biotechnology 10: 1026–1028 (1992)]. Die Herstellung dieses Fotoverbindungsmittels selbst ist jedoch ein zeitraubendes, mehrstufiges Verfahren.
Guire, U. S. Pat. Nr. 3959078 offenbart ein Verfahren, bei welchem die Immobilisierung eines Enzyms durchgeführt wird unter Verwendung eines Fotoverbindungsmittels, 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol. Bei diesem Verfahren wird die amino-tragende Matrix aktiviert durch 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol im Rahmen einer bei 37°C während einer Zeitdauer von 20 Stunden ablaufenden thermochemischen Reaktion. In dem nachfolgenden Schritt wird das Enzym während einer Zeitdauer von 16 Stunden auf der aktivierten Oberfläche durch eine fotochemische Reaktion immobilisiert. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt in seiner langen Reaktionszeit in den beiden Schritten. Keines der oben genannten Verfahren liefert eine einfache und schnelle Herstellung einer fotoreaktiven Oberfläche und eine schnelle Immobilisierung eines Biomoleküls auf dieser fotoreaktiven Oberfläche.

Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik. TABELLE I

S. No	Stand der Technik	Nachteile
1	Die C-H tragende Matrix wird fotochemisch mit 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol aktiviert, gefolgt von der Bindung des Enzyms durch die thermochemische Reaktion (Nahar et al, 2001).	Das Verfahren ergab die begrenzende Wahl des Biomoleküls, d. h. das gewünschte Biomolekül muss eine Aminogruppe oder eine andere nukleophile Gruppe für die Reaktion mit der aktivierten Oberfläche aufweisen.
2	Jorg Tiller (Tiller et. al, 1999) beschreibt das Verfahren der Aktivierung von NH₂ Polymerfilmen, indem i) der Film so lange in eine konzentrierte L-Ascorbinsäurelösung eingetaucht wird, bis der Film sichtbar geschwollen ist. Das Enzym wird dann auf dem aktivierten Film während 16 Stunden immobilisiert. ii) oder der Film wird in Dimethylacetamid anschwellen gelassen und anschließend in 10 ml eisgekühlte 0,5 M HCl gelegt, und es wird dabei 1 ml einer IM NaNO₂ Lösung tropfenweise hinzugefügt. Das Enzym wird dann bei 4°C während einer Zeitdauer von 12 Stunden immobilisiert.	Das Aktivierungsverfahren des Aminopolymerfilms ist beschwerlich. Der Schritt der Immobilisierung ist zeitraubend.
3	Das Biomolekül wird auf einer inerten Oberfläche immobilisiert unter Verwendung eines Fotoverbindungsmittel-Polymers, das durch die Reaktion von BSA und 3-(Triethylamin)-3-(m-isothiocyanophenyldiazirin) hergestellt wird. Das Fotoverbindungsmittel-Polymer wird dann dazu verwendet, um sowohl Streptavidin als auch die Polystyroloberfläche gleichzeitig zu binden, wenn Aussetzung gegenüber dem Licht erfolgt, Sigrist, H. et al, (1992)	Die Herstellung von diesem Fotoverbindungsmittel selbst ist ein langwieriges und zeitraubendes, mehrstufiges Verfahren.
4	Guir et al beschreiben in dem U. S. Pat. Nr. 5002582 ein Verfahren zum Andern des einen Alkohol tragenden Polymers während einer Zeitdauer von 16 Stunden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter Verwendung eines	Das Aktivierungsverfahren ist zeitraubend.
5	Das U. S. Patent Nr. 3959078 beschreibt die Änderung eines ein Amino tragenden Polymers durch ein Fotoverbindungsmittel, das eine Azidogruppe enthält, während einer Zeitdauer von 20 Stunden. Die Immobilisierung auf diesem Polymer wird bei 0°C–15°C während einer Zeitdauer von 16 Stunden in einer fotochemischen Reaktion unter Verwendung einer 40-Watt Wolframlampe durchgeführt.	Sowohl das Verfahren der Aktivierung als auch das der Immobilisierung ist zeitraubend.

ZIELE DER ERFINDUNG
Das Hauptziel der Erfindung besteht darin, ein einfaches und schnelles Verfahren zur Herstellung von fotoreaktiven Polymeren und zur schnellen Immobilisierung von Biomolekülen auf solchen Polymeren zu liefern.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein fotoreaktives Polymer durch eine mikrowellenvermittelte Reaktion von 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol mit dem Polymer zu liefern. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches, leichtes und schnelles Verfahren zur Immobilisierung des Biomoleküls ungeachtet seiner funktionellen Gruppe durch eine fotochemische Reaktion zu liefern.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine fotoreaktive Polymeroberfläche für eine effiziente und schnelle Immobilisierung des Biomoleküls durch UV Licht zu liefern.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine fotoreaktive Polymeroberfläche herzustellen, die nützlich ist für eine lichtinduzierte Immobilisierung eines Biomoleküls, das für die chemische Industrie, für die pharmazeutische Industrie, für die Diagnostik, für die Separationstechnik und für viele damit zusammenhängende Gebiete erforderlich ist.
Die Neuheit der vorliegenden Erfindung liegt in der schnellen Herstellung des fotoreaktiven Polymers, die in Abhängigkeit von dem Polymer eine Minute bis zu zehn Minuten dauert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen und um die Nachteile der nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zu überwinden, wird ein schnelles, einfaches und effizientes Verfahren offenbart für eine vorzugsweise mikrowellenvermittelte Herstellung eines fotoreaktiven Polymers und für eine schnelle lichtinduzierte Immobilisierung eines Biomoleküls ungeachtet seiner funktionellen Gruppe auf dem Polymer.
Entsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von fotoreaktiven Polymeren mit darauf immobilisierten Molekülen, welches Verfahren umfasst:

(a) ein Reagieren eines Polymers mit einer nukleophilen Gruppe mit einem Fotoverbindungsmolekül, das in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst ist,
(b) ein Waschen des Polymers durch ein geeignetes Lösungsmittel, gefolgt von einem Trocknen des gewaschenen Polymers bei Umgebungstemperatur, um ein fotoreaktives Polymer zu erzielen,
(c) ein Hinzufügen eines in einem geeigneten Puffer aufgelösten Moleküls auf das fotoreaktive Polymer,
(d) ein Unterwerfen der Mischung einer Quelle von Fotoenergie während einer Zeitdauer, die von 2 Minuten bis zu 2 Stunden reicht, um das Molekül auf dem fotoreaktiven Polymer zu immobilisieren, und
(e) ein Waschen des Polymers mit dem immobilisierten Molekül mit einem geeigneten Puffer, gefolgt von einem Trocknen des Polymers bei Umgebungstemperatur, um fotoreaktive Polymere mit immobilisierten Molekülen darauf zu erzielen.

In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Fotoverbindungsmittel eine thermochemische Gruppe auf, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit der nukleophilen Gruppe des Polymers zu bilden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die thermochemische Gruppe des Fotoverbindungsmittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd, Carbonyl, Isothiocyanat, Halogenid und Isocyanat.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist das Fotoverbindungsmittel eine fotochemische Gruppe auf, die fotoreaktiv ist und die in der Lage ist, eine kovalente Bindung in einer fotochemischen Reaktion mit dem Molekül ohne die Zugabe irgendeines anderen Reagens zu bilden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die fotochemische Gruppe des Fotoverbindungsmittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Vorläufern von Carben, den Vorläufern von Nitren und eines Sauerstoffradikals.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Fotoverbindungsmittel 1-Fluor-2-nitro-4-azidobenzol (FNAB).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polymer irgendein Polymer mit Amino, Hydroxyl, Thiol oder mit irgendeiner anderen reaktiven nukleophilen Gruppe wie etwa Kieselgel, ein langkettiges Alkylaminoglas mit kontrollierten Poren, Polyvinylalkohol, Aminopolystyrol und Alkylaminokieselgel.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Reaktion in dem Schritt (a) durchgeführt, indem die Mischung aus dem Fotoverbindungsmittel, dem Polymer und dem Lösungsmittel einer Mikrowellenstrahlung ausgesetzt wird oder durch eine thermische Inkubation bei 37°C erfolgt, wobei die Mikrowellenstrahlung vorzugsweise durchgeführt wird bei einer Frequenz von 2000 Hz bis 2600 Hz mit einer Leistungsabgabe in dem Bereich von 100 Watt bis 1000 Watt während einer Zeitdauer in dem Bereich von 10 Sekunden bis 20 Minuten.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das für das Waschen des in dem Schritt (a) erzielten Polymers verwendete Lösungsmittel ein Lösungsmittel, das in der Lage ist, das Fotoverbindungsmittel und seine degradierten Produkte ohne Verzerrung des Polymers aufzulösen, wie etwa Methanol und Ethanol.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das in dem Schritt (a) verwendete Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylformamid und Toluol.
Vorzugsweise wird die Reaktion in dem Schritt (a) durchgeführt in Gegenwart eines Katalysators wie etwa 30% KOH.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Polymer ausgewählt in der Form einer Perle, eines Schachtes, einer Folie, eines Pulvers, eines Stabes, einer Platte, eines Streifens oder eines Rohres.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das auf dem fotoreaktiven Polymer immobilisierte Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem organischen Molekül, einem organischen Polymer, einem Biomolekül und irgendeinem Molekül mit einer C-H Verbindung.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Biomolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, Nukleinsäuren, Kohlenhydrat, Oligonukleiden, Enzym, Antigen, Antikörper und aus einem Peptid.
Das Enzym ist vorzugsweise eine Rettichperoxidase.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Quelle der Fotoenergie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus UV Licht, Sonnenlicht, ebenem Licht und aus einem Laserstrahl.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das als Quelle der Fotoenergie verwendete UV-Licht eine Wellenlänge in dem Bereich von 300 nm bis 400 nm auf und die Aussetzung, um das Molekül zu immobilisieren, wird durchgeführt während einer Zeitdauer in dem Bereich von 2 Minuten bis 2 Stunden.
Die Reaktion zwischen der nukleophilen Gruppe des Polymers und dem Fotoverbindungsmittel in dem Schritt (a) wird vorzugsweise in einem Mikrowellenofen in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines fotoreaktiven Polymers mit einem darauf immobilisierten Molekül in der Diagnostik, in der Affinitätschromatographie, in der Proteomik, in der Genomik und bei Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln.
KURZE BESCHREIBUNG DER BEILIEGENDEN ZEICHNUNGEN
FIGURE 1. OPTIMIERUNG DER MENGE VON FNAB ZUR HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM KIESELGEL (BEISPIEL 1)
Die Optimierung der Menge von FNAB zur Herstellung von fotoreaktivem Kieselgel wird bewerkstelligt, indem man verschiedene Mengen von FNAB (0, 6,25, 12,5, 25, 50, 75 und 100 mg) in jeder Reaktion mit 50 mg Alkylaminokieselgel hinzufügt und dies dann einer Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 60 Sekunden aussetzt.
Das so in jeder Reaktion hergestellte fotoreaktive Alkylaminokieselgel wird überprüft, indem man HRP (1 μg) auf dem Träger (50 mg) durch eine fotochemische Reaktion immobilisiert. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer kolorimetrischen Prüfung des immobilisierten Enzyms.
FIGURE 2. OPTIMIERUNG DER MENGE VON FNAB ZUR HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM LCAA-CPG (BEISPIEL 2)
Die Optimierung der Menge von FNAB, die zur Herstellung von fotoreaktivem LCAA-CPG benötigt wird, wird bestimmt, indem man die Konzentrationen von FNAB (0, 6,25, 12,5, 25 und 50 mg) in jeder Reaktion mit 50 mg LCAA-CPG ändert und dies dann einer Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 60 Sekunden aussetzt. Das so in jeder Reaktion hergestellte LCAA-CPG wird überprüft, indem man HRP (1 μg) mit 50 mg des Trägers fotobestrahlt und das immobilisierte Enzym kolorimetrisch prüft.
FIGURE 3. OPTIMIERUNG DER MENGE VON FNAB ZUR HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM PVA (BEISPIEL 3)
Die Optimierung der Menge von FNAB zur Herstellung von fotoreaktivem PVA wird bestimmt, indem man verschiedene Mengen von FNAB (12,5, 25, 50 und 75 mg) zu dem Reaktionsgemisch aus 50 mg PVA und 6,5 μl von 30% KOH und 5 ml Toluol hinzufügt. Die Reaktionsgemische wurden eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gehalten. Der so in jeder Reaktion hergestellte PVA wird überprüft, indem man HRP (16 μg) mit 50 mg des Trägers bestrahlt. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer Zugabe eines Substrats zu dem immobilisierten Enzym.
FIGURE 4. OPTIMIERUNG DER AUSSETZUNGSZEIT FÜR EINE MIKROWELLENBESTRAHLUNG ZUR HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM ALKYLAMINOKIESELGEL (BEISPIEL 4)
Die Zeitdauer der Mikrowellenaussetzung zur Herstellung des fotoreaktiven Alkylaminokieselgels wird optimiert durch eine Veränderung der Zeitdauer der Mikrowellenaussetzung (30, 50, 60 und 70 Sekunden) in der Reaktion von 50 mg Alkylaminokieselgel mit 50 mg FNAB. Die so in jeder Reaktion hergestellte fotoreaktive Oberfläche wird überprüft, indem man 1 μg HRP mit 50 mg des Trägers bestrahlt und das immobilisierte Enzym kolorimetrisch prüft.
FIGURE 5. OPTIMIERUNG DER MIKROWELLENAUSSETZUNGSZEIT FÜR DIE AKTIVIERUNG VON AMINOPOLYSTYROL (BEISPIEL 5)
Die Zeitdauer der Mikrowellenaussetzung zur Herstellung von fotoreaktivem Aminopolystyrol wird optimiert durch eine Veränderung der Zeitdauer der Mikrowellenaussetzung (40, 50 und 60 Sekunden) in jeder Reaktion von 20 mg Aminopolystyrol mit 20 mg FNAB. Die so in jeder Reaktion hergestellte fotoreaktive Oberfläche wird überprüft, indem man HRP (35 μg) mit 20 mg des Trägers bestrahlt. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer Zugabe eines Substrats zu dem immobilisierten Enzym.
FIGURE 6. OPTIMIERUNG DER KOH KONZENTRATION FÜR DIE HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM PVA (BEISPIEL 6)
Die KOH Konzentration für die Herstellung von fotoreaktivem PVA wird optimiert durch ein Hinzugeben unterschiedlicher Mengen einer 30% KOH Lösung (1,62, 3,25, 6,5, 13 und 20 μl) zu dem Reaktionsgemisch aus 50 mg PVA und 50 mg FNAB in 5 ml Toluol. Die so in jeder Reaktion hergestellte fotoreaktive Oberfläche wird überprüft, indem man HRP (16 μg) mit 50 mg des Trägen bestrahlt und das immobilisierte Enzym kolorimetrisch prüft.
FIGURE 7. OPTIMIERUNG DER AKTIVIERUNGSZEIT FÜR PVA BEI RAUMTEMPERATUR (BEISPIEL 7)
Die Aktivierungszeit für die Herstellung von fotoreaktivem PVA wird optimiert, indem man eine unterschiedliche Inkubationszeit (5, 10, 60, 180 und 300 Minuten) für jedes Reaktionsgemisch aus 50 mg PVA, 50 mg FNAB in 5 ml Toluol und 6,5 μl von 30% KOH nimmt. Der so in jeder Reaktion hergestellte PVA wird überprüft, indem man HRP (16 μg) mit 50 mg des Trägen bestrahlt und das immobilisierte Enzym kolorimetrisch prüft.
FIGURE 8. OPTIMIERUNG DER BESTRAHLUNGSZEIT FÜR DIE IMMOBILISIERUNG EINES ENZYMS AUF DEM ALKYLAMINOKIESELGEL (BEISPIEL 8)
Die Zeitdauer der Immobilisierung wird optimiert durch ein Mischen von HRP (1 μg) mit 50 mg fotoreaktivem Alkylaminokieselgel und durch ein Verändern der Zeitdauer der UV Bestrahlung (2, 5, 10, 20, 40, 60 und 80 Minuten) für jede Reaktion. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer Zugabe eines Substrats zu dem immobilisierten Enzym.
FIGURE 9. OPTIMIERUNG DER FOTOBESTRAHLUNGSZEIT FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM FOTOREAKTIVEN LCAA-CPG (BEISPIEL 9)
Die Zeitdauer der Immobilisierung wird optimiert durch ein Mischen von 50 mg fotoreaktivem LCAA-CPG mit HRP (1 μg) und durch ein Bestrahlen dieser Mischung durch UV mit unterschiedlichen Zeitdauern (2, 10, 20, 40 und 60 Minuten) für jede Reaktion. Das immobilisierte Enzym wird dann nach einer Zugabe eines Substrats kolorimetrisch geprüft.
FIGURE 10. OPTIMIERUNG DER UV BESTRAHLUNGSZEIT FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DER FOTOREAKTIVEN PVA OBERFLÄCHE (BEISPIEL 10)
Die Zeitdauer der Immobilisierung wird optimiert durch ein Mischen von 50 mg fotoreaktivem PVA mit HRP (16 μg) und durch ein UV Bestrahlen dieser Mischung mit unterschiedlichen Zeitdauern (5, 20, 30, 60, 120 und 180 Minuten) für jede Reaktion. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer Zugabe eines Substrat-Farbstoffpuffers zu dem immobilisierten Enzym.
FIGURE 11. OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM FOTOREAKTIVEN PVA (BEISPIEL 11)
Die HRP Konzentration wird optimiert, indem man verschiedene Mengen eines Enzyms (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 und 16,0 μg) für jede 50 mg an fotoreaktivem PVA nimmt und das Ganze dann während einer Zeitdauer von 30 Minuten durch UV Licht bestrahlt. Das immobilisierte Enzym wird dann nach einer Zugabe eines Substrats kolorimetrisch geprüft.
FIGURE 12. OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM DURCH EINE MIKROWELLE AKTIVIERTEN LCAA-CPG (BEISPIEL 12)
Die HRP Konzentration wird optimiert, indem man verschiedene Mengen eines Enzyms (0,2, 0,5, 1, 2 und 4 μg) für 50 mg an fotoreaktivem LCAA-CPG nimmt und das Ganze dann während einer Zeitdauer von 20 Minuten durch UV Licht bestrahlt. Die Absorption wird aufgezeichnet nach einer Zugabe eines Substrat-Farbstoffpuffers zu dem immobilisierten Enzym.
FIGURE 13. OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM DURCH EINE MIKROWELLE AKTIVIERTEN ALKYLAMINOKIESELGEL (BEISPIEL 13)
Die Optimierung der HRP Konzentration von 50 mg fotoreaktives Alkylaminokieselgel wird durchgeführt, indem man verschiedene Mengen eines Enzyms (0,5, 1,0, 2,0, 4,0 und 6,0 μg) für jede Reaktion nimmt und das Ganze während einer Zeitdauer von 20 Minuten durch UV Licht bestrahlt. Das immobilisierte Enzym wird dann nach einer Zugabe eines Substrats kolorimetrisch geprüft.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst ein schnelles und effizientes Verfahren für die Änderung der Polymeroberfläche für die Einführung einer latent reaktiven Gruppe darauf und für die Immobilisierung von Biomolekülen auf der modifizierten Polymeroberfläche durch Lichtenergie. Genauer gesagt wird die Polymeroberfläche mit einer latent fotoreaktiven Gruppe schnell durch eine mikrowellenvermittelte Reaktion von 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol mit einem Polymer hergestellt, das eine reaktive, nukleophile Gruppe aufweist. Das so modifizierte Polymer (fotoreaktives Polymer) weist eine fotoreaktive Azido-Gruppe auf, welche unter UV Licht hoch reaktives Nitren erzeugt, das zur Bindung mit dem Biomolekül fähig ist.
Die Konzentration eines Fotoverbindungsmittels spielt eine wichtige Rolle bei der Herstellung des fotoreaktiven Polymers. Das beste Ergebnis wird erhalten, wenn das Verhältnis des Fotoverbindungsmittels (FNAB) und des Polymer 1:1 beträgt (Gew./Gew.). Eine weitere Zunahme des FNAB erhöht nicht die fotoreaktive Gruppe in einem Polymer. Die Wirksamkeit der fotoreaktiven Oberfläche wird bestimmt, indem man HRP auf derselben immobilisiert und anschließend das immobilisierte Enzym prüft. Wenn eine unbehandelte Oberfläche (FNAB: 0 mg) verwendet wird, dann gibt es praktisch keine Immobilisierung des Biomoleküls darauf (1, 2 und 3)
Man hat herausgefunden, dass Mikrowellen ein ausgezeichnetes Instrument zur Herstellung der fotoreaktiven Oberfläche darstellen. Somit hat man herausgefunden, dass fotoreaktives LCAA-CPG, das in einer 70 Sekunden langen Mikrowellenbestrahlung hergestellt wird, bessere Ergebnisse ergibt als die fotoreaktive Oberfläche, die man nach dem bisherigen Stand der Technik erhält, d. h. bei 37°C während einer Zeitdauer von 20 Stunden (Tabelle 1).
Man hat auch herausgefunden, dass eine Mikrowellenstrahlung während einer Zeitdauer von 60 Sekunden auch fotoreaktives Aminosilikat mit guten Ergebnissen ergibt (4). Für Aminopolystyrol erweist sich eine Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 60 Sekunden auch als ausreichend für die Reaktion des Polymers und des FNAB, um ein fotoreaktives Aminopolystyrol zu produzieren (5). Im Gegensatz zu einem Aminopolymer braucht ein eine Hydroxylgruppe tragendes Polymer einen basischen Katalysator für die Reaktion mit FNAB. Die Optimierung der Menge von KOH (Katalysator) wird ausgeführt durch einen Verlauf der Reaktion von PVA und FNAB durch ein Umrühren bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von einer Stunde in Gegenwart von Toluol und verschiedenen Mengen von KOH in wässriger Lösung. Man hat 6,5 μl von 30% KOH als optimal für die Reaktion von PVA und FNAB (jeweils 50 mg) in Gegenwart von 5 ml Toluol (6) herausgefunden. Die Anmelder optimierten auch die Zeit, die für die Herstellung von fotoreaktivem PVA unter Verwendung von KOH bei Raumtemperatur erforderlich ist. Die optimale Zeit beträgt 60 Minuten (7). Vergleichbare Resultate werden jedoch durch eine Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 10 Minuten erhalten.
In dem Verfahren der Fotoaktivierung wird PVA aktiviert, indem man mit FNAB beschichteten PVA dem UV Licht aussetzt. Der fotoaktivierte PVA wird dann dazu verwendet, um eine Rettichperoxidase bei 37°C während einer Zeitdauer von 1 Stunde zu immobilisieren. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird fotoreaktiver PVA durch die Reaktion von PVA und FNAB durch die Mikrowellenbestrahlung (oder durch eine thermische Inkubation bei 37°C) hergestellt. Eine Rettichperoxidase-Immobilisierung auf diesem fotoreaktiven PVA wird dadurch vollzogen, dem man sie dem UV Licht aussetzt. Die Ergebnisse in der Tabelle 2 zeigen, dass ein fotoreaktives Polymer (thermisch aktivierte Oberfläche) eine bessere Immobilisierung eines Biomoleküls ergibt als eine thermoreaktive Oberfläche (Oberfläche, die von Licht aktiviert wird). Daher ist ein fotochemisches Immobilisierungsverfahren (thermochemische Aktivierung und fotochemische Immobilisierung), wie es in diesem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben ist, eine bessere Option als das thermochemische Immobilisierungsverfahren (fotochemische Aktivierung und thermochemische Immobilisierung).
Die Anmelder haben die Konzentration des Verbindungsmittels (Linker) (FNAB) und die Zeit der Inkubation mit dem Polymer (PVA) zur Herstellung eines fotoreaktiven Polymers optimiert. In dem zweiten Schritt wird das Enzym (HRP) auf dem Polymer durch seine fotoreaktive Gruppe durch Lichtenergie immobilisiert. Somit wird die Immobilisierung des Enzyms auf dem Alkylaminokieselgel durchgeführt durch UV Licht in einem UV Schichtenverbindungsmittel (Stratalinker) in verschiedenen Zeiten. Als die optimale Zeit für das Fotoimmobilisieren eines Enzyms auf fotoreaktivem Alkylaminokieselgel hat man 10 Minuten herausgefunden. Eine Zunahme der UV Bestrahlungszeit über 10 Minuten hinaus erhöht jedoch die Immobilisierung nicht (8). Man hat herausgefunden, dass die Immobilisierung von HRP auf fotoreaktivem LCAA-CPG während einer Zeitdauer von 20 Minuten optimal ist (9). Der fotoreaktive PVA erfordert jedoch eine Zeitdauer von 60 Minuten der UV Bestrahlungszeit für eine optimale Immobilisierung des HRP. Eine weitere Zunahme der UV Bestrahlungszeit verringert die Absorption, was auf die Deaktivierung einiger immobilisierter Enzyme zurückzuführen sein kann (10). Die Enzymkonzentration ist auch ein wichtiger Faktor für die Immobilisierung. 2 μg HRP/50 mg fotoreaktiver PVA werden als optimal für die Immobilisierung auf PVA befunden und eine weitere Zunahme führt nicht zu einer merklichen Zunahme der Immobilisierung (11). Die optimale Menge von HRP beträgt jedoch 4 μg/50 mg Träger für die Immobilisierung auf fotoreaktivem LCAA-CPG (12) und Alkylaminokieselgel (13). Man hat herausgefunden, dass das aktive Gesamtenzym, das auf 20 mg LCAA-CPG bzw. Alkylaminokieselgel immobilisiert ist, 160 U (U = Units = Einheiten) bzw. 120 U beträgt.
Somit ist in der vorliegenden Erfindung dieses Verfahren zur Herstellung von fotoreaktiven Trägem einfach, schnell und es überwindet die Nachteile der erwähnten Verfahren, über die berichtet worden ist. Auch ist die Immobilisierung von Biomolekülen auf den fotoreaktiven Oberflächen einfach und schnell.

Die Vorteile des Verfahrens der Erfindung sind unten in der Tabelle gegeben. TABELLE II VORLIEGENDE ERFINDUNG UND IHRE VORTEILE

S. Nr.	Vorliegende Erfindung	Vorteil
1	Die vorliegende Erfindung liefert ein schnelles, mikrowellenvermitteltes Verfahren zur Herstellung von fotoreaktiven Polymeren, die fähig sind, eine kovalente Bindung mit den Biomolekülen ungeachtet der funktionellen Gruppe des Biomoleküls zu bilden.	Das erfindungsgemäße Verfahren kann die Amino-Polymere in etwa 50 Sekunden und die einen Alkohol tragenden Polymere in etwa 10 Minuten durch eine Mikrowellenbestrahlung aktivieren. Daher überwindet das erfindungsgemäße Verfahren das langatmige Verfahren, ein fotoreaktives Polymer herzustellen.
2	Die vorliegende Erfindung liefert auch eine schnelle Technik, deren Länge in dem Bereich von 10–70 Minuten für die Immobilisierung von Biomolekülen auf dem fotoreaktiven Polymer variiert.	1) In der vorliegenden Erfindung beträgt die optimale Zeit für die Immobilisierung des Biomoleküls 10–70 Minuten, was weit weniger ist als die Zeit nach dem bisherigen Stand der Technik (12–16 Stunden) unter Verwendung desselben Fotoverbindungsmittels. 2) Die aktivierten Oberflächen finden eine potenzielle Anwendung in chromatographischen Separationstechniken, in der Genomik und in der Proteomik, wo immobilisierte Moleküle erforderlich sind. 3) Das als Fotoverbindungsmittel verwendete 1-Fluoro-2-nitro-4-azidobenzol kann leicht hergestellt werden.

Eine Rettichperoxidase, ein langkettiges Alkylaminglas mit gesteuerten Poren (normaler Durchmesser 500 Å Maschenweite: 80–120), o-Phenylendiamin wird von Sigma, USA, gekauft. Das Kieselgel LR (100–200 Masche) wird von S. D Fine Chemicals gekauft. H₂O₂, Methanol, Dimethyformamid, Toluol und 3-Aminopropyltriethoxysilan, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenorthophosphat, Natriumdihydrogenorthophosphat, Zitronensäure werden von analytischer Qualität von Merck, Indien, gekauft. FNAB wird aus 4-Fluoro-3-nitroanilin durch eine Diazotierungsreaktion hergestellt, wie früher berichtet worden ist [15]. Die mikrowellenvermittelten Reaktionen werden in einem BPL Sanyo Mikrowellenofen durchgeführt, der bei einer Frequenz von 2450 Hz mit einer Leistungsabgabe von 700 Watt arbeitet. Die Fotoimmobilisierung wird bei einer Wellenlänge von 365 nm in einem UV Schichtenverbindungsmittel (Stratalinker) durchgeführt; Modell 2400, (Stratagene, USA), ausgestattet mit fünf 15-Watt Rohren. Alle Lösungen werden vor dem Gebrauch frisch hergestellt in dreifach destilliertem Wasser. Mit Phosphat gepuffertes Salin (PBS = Phosphat buffered Saline) wird hergestellt, indem man 0,85% NaCl mit 0,01 M-Phosphatpuffer mischt (pH 7,2). Ein Waschpuffer wird hergestellt durch Hinzufügen von 0,1% Tween 20 in PBS. Ein frisch hergestellter Substratfärbungspuffer umfasst 12 ml Zitratpuffer (0,025 M Zitronensäure und 0,5 M Na₂HPO₄2H₂O, pH 5), 5 μl H₂O₂ (30% Gew./Vol.) und 4 mg o-Phenylendiamin.
BEISPIEL 1: OPTMIERUNG DER MENGE VON 1-FLUORO-2-NITRO-4-AZIDOBENZOL ZUR HERSTELLUNG VON FOTOREAKTIVEM KIESELGEL (FIGUR 1)
5 g trockenes (frei von Feuchtigkeit) Kieselgel, das mit 10 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan und 80 ml Toluol gemischt ist, werden bei 28°C während einer Zeitdauer von 3 Stunden gerührt. Die Mischung wird filtriert und mit Methanol, Wasser, Methanol: Wasser (1:1) bzw. Methanol gewaschen. Der Träger wird dann getrocknet und für die Aminogruppe durch einen Ninhydrintest geprüft. Ein positiver Test für Ninhydrin bestätigt die Verbindung der Aminogruppe an das Kieselgel. Ein konischer Glaskolben, der 50 mg Alkylaminokieselgel, 6,25 mg FNAB und 10 ml DMF enthält, wird gegenüber Mikrowellen während einer Zeitdauer von 60 Sekunden ausgesetzt. Danach wird der Träger aus dem konischen Glaskolben mit Methanol gewaschen, getrocknet und in einer Petrischale gehalten. Die FNAB-Konzentration wird optimiert, indem man die gleichen Experimente mit verschiedenen Mengen von FNAB durchführt (12,5, 25, 50, 75 bzw. 100 mg). HRP (1 μg/80 μl PBS) wird dann zu 50 mg des fotoreaktiven Kieselgels hinzugefügt und in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 20 Minuten bestrahlt. Der Träger wird mit einem Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 300 μl eines Substratfärbungspuffers. Die farbige Lösung wird in die jeweiligen Löcher der Polystyrolmikrotitrierplatten übertragen und die Absorption wird bei 490 nm mit einem ELISA-Lesegerät aufgezeichnet. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem Alkylaminokieselgel (FNAB: 0 mg) in der ähnlichen Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 2: OPTIMIERUNG DER 1-FLUORO-2-NITRO-4-AZIDOBENZOL KONZENTRATION ZUR HERSTELLUNG DES FOTOREAKTIVEN, LANGKETTIGEN ALKYLAMINGLASES MIT GESTEUERTEN POREN (FIGUR 2)
50 mg LCAA-CPG, 6,25 mg FNAB und 10 ml DMF werden in einen konischer Glaskolben getan und während einer Zeitdauer von 60 Sekunden den Mikrowellen ausgesetzt. Die FNAB-Konzentration wird optimiert, indem man dasselbe Experiment mit verschiedenen Mengen von FNAB durchführt (12,5, 25 bzw. 50 mg).
Die Enzymimmobilisierung und ihre Prüfung werden ähnlich durchgeführt wie in dem Beispiel 1 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem LCAA-CPG (FNAB: 0 mg) durchgeführt.
BEISPIEL 3: OPTIMIERUNG DER 1-FLUORO-2-NITRO-4-AZIDOBENZOL KONZENTRATION ZUR HERSTELLUNG DES FOTOREAKTIVEN PVA (FIGUR 3)
Ein konischer Glaskolben, der 50 mg PVA, 50 mg FNAB, 6,5 μl von 30% KOH und 5 ml Toluol umfasst, wird zum Umrühren im Dunkeln bei Raumtemperatur (28°C) während einer Zeitdauer von 1 Stunde gehalten. Drei weitere konische Glaskolben werden genommen und Reaktionsgemische werden ähnlich hergestellt, aber mit der FNAB-Konzentration von 12,5, 25 bzw. 75 mg. Nach 1 Stunde werden die Träger aus dem konischen Glaskolben mit Methanol gewaschen, getrocknet und in einer Petrischale gehalten. HRP (1 μg/80 μl von PBS) wird zu jedem fotoreaktiven PVA (50 mg) hinzugefügt und in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 30 Minuten bestrahlt. Das Enzym wird ähnlich, wie in Beispiel 1 beschrieben, geprüft. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten PVA Perlen in der ähnlichen Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 4: OPTIMIERUNG DER ZEITDAUER DER MIKROWELLENAUSSETZUNG FÜR DIE AKTIVIERUNG DES ALKYLAMINOKIESELGELS (FIGUR 4)
Vier konische Glaskolben, von denen ein jeder 50 mg Alkylaminokieselgel, 50 mg FNAB und 10 ml DMF umfasst, werden der Mikrowelle während einer Zeitdauer von 30, 50, 60 bzw. 70 Sekunden ausgesetzt. Nach der vorgesehenen Zeit werden die Träger von jedem konischen Glaskolben getrennt mit Methanol gewaschen, getrocknet und auf vier Petrischalen gehalten. HRP wird dann ähnlich immobilisiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten Perlen aus Alkylaminokieselgel auf ähnliche Art durchgeführt.
BEISPIEL 5: OPTIMIERUNG DER ZEITDAUER DER MIKROWELLENAUSSETZUNG FÜR DIE AKTIVIERUNG VON AMINOPOLYSTYROL (FIGUR 5)
20 mg Aminopolystyrol, 20 mg FNAB und 10 ml Ethanols werden in einen 50 ml großen konischen Glaskolben genommen und den Mikrowellen während einer Zeitdauer von 40 Sekunden ausgesetzt. Weitere zwei Experimente werden in einer ähnlichen Art und Weise durchgeführt, aber mit der Mikrowellenexpositionsdauer von 50 bzw. 60 Sekunden. Nach der vorgesehenen Zeitdauer der Mikrowellenaussetzung wird der Träger von den konischen Glaskolben mit Ethanol gewaschen, getrocknet und auf vier Petrischalen gehalten. HRP (35 μg/80 μl von PBS) werden zu jedem fotoreaktiven Aminopolystyrol hinzugefügt (50 mg) und in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 20 Minuten bestrahlt. Das Enzym wird ähnlich geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem Aminopolystyrol auf ähnliche Art durchgeführt.
BEISPIEL 6: OPTIMIERUNG DER KOH KONZENTRATION ZUR THERMOAKTIVIERUNG DES PVA (FIGUR 6)
Ein konischer Glaskolben, der 50 mg PVA, 50 mg FNAB, 1,62 μl von 30% KOH und 5 ml Toluol umfasst, wird während einer Zeitdauer von 1 Stunde im Dunkeln gehalten, wobei bei Raumtemperatur kontinuierlich umgerührt wird. Vier weitere Experimente werden ähnlich durchgeführt, aber mit verschiedenen Mengen von 30% KOH Lösung, (3,25, 6,5, 13 beziehungsweise 20 μl). Nach einer Stunde werden die Träger von den konischen Glaskolben mit Methanol getrennt gewaschen, getrocknet und in Petrischalen gehalten. HRP (16 μg/80 μl von PBS) wird zu jedem fotoreaktiven PVA (50 mg) hinzugefügt und in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 30 Minuten bestrahlt. Die Träger werden mit einem Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 300 μl eines Substratfärbungspuffers. Die farbige Lösung wird in die jeweiligen Löcher der Polystyrolmikrotitrierplatten übertragen und die Absorption wird bei 490 nm mit einem ELISA-Lesegerät aufgezeichnet. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten PVA Perlen auf ähnliche Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 7: OPTIMIERUNG DER ZEITDAUER FÜR DIE THERMISCHE AKTIVIERUNG VON PVA (FIGUR 7)
Vier konische Glaskolben, von denen ein jeder 50 mg PVA, 50 mg FNAB, 6,5 μl von 30% KOH und 5 ml Toluol umfasst, werden im Dunkeln gehalten und bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von 5, 10, 60, 180 bzw. 300 Minuten umgerührt. HRP wird auf dem fotoreaktiven PVA immobilisiert und so, wie in Beispiel 6 beschrieben, geprüft. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten PVA Perlen in einer ähnlichen Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 8: OPTIMIERUNG DER UV BESTRAHLUNGSZEIT ZUR IMMOBILISIERUNG EINES ENZYMS AUF DEM DURCH DIE MIKROWELLE AKTIVIERTEN, FOTOREAKTIVEN ALKYLAMINOKIESELGEL (FIGUR 8)
300 mg Alkylaminokieselgel wird aktiviert unter Verwendung von 300 mg FNAB in 10 ml DMF durch eine Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 70 Sekunden. Sechs Petrischalen, von denen eine jede 50 mg fotoreaktives Alkylaminokieselgel und HRP (1 μg/80 μl von PBS) enthält, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 2, 5, 10, 20, 40, 60 bzw. 80 Minuten bestrahlt. Die Träger werden mit einem Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 300 μl eines Substratfärbungspuffers. Die farbige Lösung wird in die jeweiligen Löcher der Polystyrolmikrotitrierplatten übertragen und die Absorption wird bei 490 nm mit einem ELISA-Lesegerät aufgezeichnet. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem Alkylaminokieselgel auf ähnliche Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 9: OPTIMIERUNG DER BESTRAHLUNGSZEIT ZUR IMMOBILISIERUNG EINES ENZYMS AUF DEM DURCH DIE MIKROWELLE AKTIVIERTEN, FOTOREAKTIVEN LCAA-CPG (FIGUR 9)
300 mg LCAA-CPG werden aktiviert unter Verwendung von 300 mg FNAB in 10 ml DMF durch eine Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 70 Sekunden. Sechs Petrischalen, von denen eine jede 50 mg fotoreaktives LCAA-CPG und HRP (1 μg/80 μl von PBS) enthält, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 2, 10, 20, 40, bzw. 60 Minuten bestrahlt. Das immobilisierte Enzym wird geprüft wie in Beispiel 8 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem LCAA-CPG auf ähnliche Art durchgeführt.
BEISPIEL 10: OPTIMIERUNG DER UV BESTRAHLUNGSZEIT ZUR ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM DURCH DIE MIKROWELLE AKTIVIERTEN, FOTOREAKTIVEN PVA (FIGUR 10)
300 mg PVA wird aktiviert unter Verwendung von 300 mg FNAB, das in 10 ml DMF aufgelöst ist, durch eine Mikrowellenbestrahlung während einer Zeitdauer von 10 Minuten. Sechs Petrischalen, von denen eine jede 50 mg fotoreaktiven PVA enthält, der mit HRP (16 μg/80 μl von PBS) gemischt ist, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 5, 20, 30, 60, 120 bzw. 180 Minuten bestrahlt. Die Träger werden mit einem Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 300 μl eines Substratfärbungspuffers. Die farbige Lösung wird in die jeweiligen Löcher der Polystyrolmikrotitrierplatten übertragen und die Absorption wird bei 490 nm mit einem ELISA-Lesegerät aufgezeichnet. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem PVA auf ähnliche Art und Weise durchgeführt.
BEISPIEL 11: OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE ENZYMIMMOBILISIERUNG AUF DEM FOTOREAKTIVEN PVA (FIGUR 11)
Die Ausgangslösung wird hergestellt, indem man 1 mg HRP in 100 ml PBS nimmt. Sieben Petrischalen, von denen eine jede 50 mg fotoreaktiven PVA und verschiedene Konzentrationen an HRP umfasst, d. h. 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 bzw. 160 μl entsprechend 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 bzw. 16,0 μg von HRP, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 30 Minuten bestrahlt. Der Träger wird mit einem Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 300 μl eines Substratfärbungspuffers. Das Enzym wird ähnlich geprüft wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird ähnlich mit unbehandeltem PVA durchgeführt.
BEISPIEL 12: OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE IMMOBILISIERUNG AUF DEM DURCH DIE MIKROWELLE AKTIVIERTEN LCAA-CPG (FIGUR 12)
Fünf Petrischalen, von denen eine jede 50 mg fotoreaktives LCAA-CPG und jeweils 10, 25, 50, 100 oder 200 μl HRP Lösung umfasst entsprechend jeweils 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 oder 4,0 μg von HRP, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 20 Minuten bestrahlt. Das auf dem fotoreaktiven LCAA-CPG immobilisierte Enzym wird dann geprüft wie in Beispiel 8 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird ähnlich mit unbehandeltem LCAA-CPG durchgeführt.
BEISPIEL 13: OPTIMIERUNG DER ENZYMKONZENTRATION FÜR DIE IMMOBILISIERUNG AUF DEM DURCH DIE MIKROWELLE AKTIVIERTEN, FOTOREAKTIVEN ALKYLAMINOKIESELGEL (FIGUR 13)
Fünf Petrischalen, von denen eine jede 50 mg durch die Mikrowelle aktiviertes, fotoreaktives Alkylaminokieselgel und jeweils 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 oder 6,0 μg HRP enthält, werden in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 mit während einer Zeitdauer von 20 Minuten bestrahlt. Das immobilisierte Enzym wird geprüft wie in dem Beispiel 8 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem Alkylaminokieselgel in ähnlicher Weise durchgeführt.
BEISPIEL 14: OPTIMIERUNG DER ZEITDAUER DER MIKROWELLENAUSSETZUNG FÜR DIE ANBINDUNG DES PHOTOVERBINDUNGSMITTELS AN LCAA-CPG (TABELLE 1)
Vier konische Glaskolben, von denen ein jeder 50 mg LCAA-CPG, 50 mg FNAB und 10 ml DMF umfasst, werden der Mikrowelle während einer Zeitdauer von 30, 50, 60 bzw. 70 Sekunden ausgesetzt. Nach der vorgesehenen Zeit wird der Träger von jedem konischen Glaskolben getrennt mit Methanol gewaschen, getrocknet und auf vier Petrischalen gehalten. HRP wird dann ähnlich immobilisiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten Perlen aus LCAA-CPG auf ähnliche Art durchgeführt.
BEISPIEL 15: OPTIMIERUNG DER AKTIVIERUNGSZEIT FÜR LCAA-CPG BEI 37°C (TABELLE 1)
Vier konische Glaskolben, von denen ein jeder 50 mg LCAA-CPG, 50 mg FNAB und 10 ml DMF umfasst, werden während einer Zeitdauer von 5, 10, 15 bzw. 20 Stunden bei 37°C umgerührt. Nach der vorgesehenen Zeit wird der Träger von jedem konischen Glaskolben getrennt mit Methanol gewaschen, getrocknet und auf einer Petrischale gehalten. HRP wird dann immobilisiert und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben geprüft. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandelten Perlen aus LCAA-CPG auf eine ähnliche Art durchgeführt.
BEISPIEL 16: VERGLEICH ZWISCHEN DER FOTOCHEMISCHEN UND THERMOCHEMISCHEN AKTIVIERUNG VON PVA (TABELLE 2)
Fotochemische Aktivierung von PVA: 250 mg PVA und 250 mg FNAB in 2500 μl Methanol werden in einer Petriplatte gemischt. Nach dem Verdunsten von Methanol wird das Reaktionsgemisch in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 60 Minuten bestrahlt. Danach wird der Träger mit Methanol gewaschen und getrocknet. Vier Petriplatten, von denen eine jede 50 mg thermoreaktiven PVA umfasst, werden mit 2, 4, 8 beziehungsweise 16 μg HRP gemischt und bei 37°C während einer Zeitdauer von 60 Minuten inkubiert. Das Enzym wird wie in Beispiel 1 geprüft. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem PVA auf ähnliche Art und Weise durchgeführt.
Thermochemische Aktivierung von PVA: Die thermische Aktivierung von PVA und die HRP Immobilisierung auf diesem fotoreaktiven PVA werden durchgeführt, indem man dieselbe Menge PVA, FNAB und HRP wie oben und gemäß dem in dem Beispiel 3 beschriebenen Verfahren verwendet.
BEISPIEL 17: BESTIMMUNG DER AKTIVITÄT VON IMMOBILISIERTEM HRP AUF DEM FOTOREAKTIVEN LCAA-CPG UND AUF DEM ALKYLAMINOKIESELGEL
HRP wird auf dem fotoreaktiven LCAA-CPG immobilisiert, indem man das Reaktionsgemisch (1 μg HRP/50 μl PBS und 50 mg fotoreaktives LCAA-CPG) in einem UV Schichtenverbindungsmittel während einer Zeitdauer von 20 Minuten bestrahlt Die Aktivität des immobilisierten HRP wird bestimmt, indem man die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei 490 nm misst unter Verwendung von Dianisidin als Wasserstoffdonator und von Wasserstoffperoxid als Substrat Die Standardkurve wird gezeichnet unter Verwendung von verschiedenen Mengen von HRP (0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 und 64 ng). Die Absorption wird in 1-Minuten Intervallen während einer Zeitdauer von 10 Minuten aufgezeichnet und die Geschwindigkeit der Änderung der Absorption pro Minute wird bestimmt. Die Aktivität des immobilisierten HRP auf dem fotoreaktiven Alkylaminokieselgel wird wie oben bestimmt.
BEISPIEL 18: VERGLEICH ZWISCHEN DER MIKROWELLENAKTIVIERUNG UND DER THERMISCHEN AKTIVIERUNG VON PVA
PVA (50 mg) wird mit FNAB (50 mg), Toluol (5 ml) und 6,5 μl von 30% KOH gemischt und zum Rühren bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von 1 Stunde gehalten. Ein ähnliches Reaktionsgemisch wird der Mikrowellenstrahlung während einer Zeitdauer von 10 Minuten ausgesetzt.

Nach der Reaktion wird der Träger mit Methanol gewaschen und getrocknet. 50 mg fotoreaktives Alkylaminokieselgel, das bei Raumtemperatur hergestellt worden ist, wird mit 1 μl HRP in einer Petriplatte gemischt und in einem UV Schichtenverbindungsmittel bei 365 nm während einer Zeitdauer von 30 Minuten bestrahlt. Ein ähnliches Experiment wird durch den fotoreaktiven PVA ausgeführt, der durch Mikrowellen hergestellt worden ist. Das immobilisierte HRP wird wie oben beschrieben geprüft. Ein Kontrollexperiment wird mit unbehandeltem PVA auf ähnliche Art und Weise durchgeführt. TABELLE 1

Zeit (Sekunden/Stunden)	Verfahren der Aktivierung	+FNAB	–FNAB
30 Sekunden	Mikrowelle	0,823	0,215
50 Sekunden	Mikrowelle	1,021	0,311
60 Sekunden	Mikrowelle	1,722	0,320
70 Sekunden	Mikrowelle	1,960	0,415
5 Stunden	37°C	0,885	0,337
10 Stunden	37°C	0,966	0,321
15 Stunden	37°C	0,998	0,331
20 Stunden	37°C	1,368	0,320

TABELLE 2

HRP (μg)	Verfahrensart zur Aktivierung von PVA
	Thermoaktivierung		Fotoaktivierung
	+L	–L	+L	–L
2	0,992	0,177	0,359	0,181
4	1,447	0,221	0,482	0,211
8	1,742	0,335	0,831	0,320
16	1,791	0,411	1,317	0,359

TABELLE 1. WIRKSAMKEITSSTUDIEN VON FOTOREAKTIVEM LCAA-CPG, DAS DURCH MIKROWELLENBESTRAHLUNG UND DURCH EINE 37°C INKUBATION IN VERSCHIEDENEN ZEITEN HERGESTELLT WIRD (BEISPIEL 14, 15)
Fotoreaktives LCAA-CPG wird in verschiedenen Mikrowellenexpositionsdauern (30, 50, 60 und 70 Sekunden) und bei verschiedenen Inkubationszeiten (5, 10, 15 und 20 Stunden) bei 37°C hergestellt. Die fotoreaktive-Oberfläche wird überprüft durch ein Fotobestrahlen von 1 μg HRP mit 50 mg Träger und durch ein kolorimetrisches Prüfen des immobilisierten Enzyms.
TABELLE 2. VERGLEICH DER WIRKSAMKEIT DER IMMOBILISIERUNG AUF THERMOCHEMISCH UND FOTOCHEMISCH AKTIVIERTEM PVA (BEISPIEL 16)
Fotoreaktive und thermoreaktive PVAs werden durch thermochemische bzw. fotochemische Reaktionen hergestellt. Ihre Wirksamkeit der Immobilisierung wird verglichen durch ein Immobilisieren verschiedener Mengen von HRP (2, 4, 8 und 16 μg) auf ihnen und durch ein anschließendes Prüfen des immobilisierten Enzyms.
VORTEILE

1. Ein einfaches, schnelles und effizientes Verfahren zur Herstellung eines fotoreaktiven Polymers und zur schnellen Immobilisierung eines Biomolekül durch UV Licht auf dieser Oberfläche ist erfunden.
2. Jedes Polymer mit einer reaktiven, nukleophilen Gruppe kann durch das erfindungsgemäße Verfahren aktiviert werden.
3. Die Aktivierung des Polymers kann in 50 Sekunden für die ein Amino tragenden Polymere und in 10 Minuten für die eine Hydroxylgruppe und einen Alkohol tragenden Polymere durch das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden.
4. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Aktivierung durch eine Mikrowellenstrahlung durchgeführt.
5. Die erfindungsgemäße fotoreaktive Oberfläche kann potenziell für die Immobilisierung von Biomolekülen verwendet werden, die in der Diagnostik, in der Affinitätsschromatographie, in der Proteomik, in der Genomik, bei Verfahren zum Screenen bzw. Klassieren von Arzneimitteln und in damit zusammenhängenden Gebieten verwendet werden.

REFERENZEN

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13. Nahar, P. A method for photochemical activation of polymer surface and immobilisation of biomolecules onto the activated surface. Anhängiges US Patent.
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ANDERE REFERENZEN

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60337842000 M. Jacobsen, et al.
3959078 1976 P. E. Guire
5002582 1991 P. E. Guire, et al.
Internationale Patentanmeldung
WO-A-02/14868 (Scientific and Industrial Research Council)
U. S. Patentanmeldung
US-A-2003/0228410 (P. Nahar)

Claims

Verfahren zum Herstellen von photoreaktiven Polymeren mit darauf immobilisierten Molekülen, Verfahren welches umfasst: (a) ein Reagieren eines Polymers mit einer nukleophilen Gruppe mit einem Photoverbindungsmolekül, das in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst ist, (b) ein Waschen des Polymers mit einem geeigneten Lösungsmittel, gefolgt von einem Trocknen des gewaschenen Polymers bei Umgebungstemperatur, um ein photoreaktives Polymer zu erzielen, (c) ein Hinzufügen eines in einem geeigneten Puffer aufgelösten Moleküls auf das photoreaktive Polymer, (d) ein Unterziehen der Mischung einer Quelle einer Photobestrahlung während einer von 2 Minuten bis zu 2 Stunden reichenden Zeitdauer, um das Molekül auf dem photoreaktiven Polymer zu immobilisieren, und (e) ein Waschen des Polymers mit dem immobilisierten Molekül mit einem geeigneten Puffer, gefolgt von einem Trocknen des Polymers bei Umgebungstemperatur, um photoreaktive Polymere mit darauf immobilisierten Molekülen zu erzielen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Photoverbindungsmittel eine thermochemische Gruppe aufweist, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit der nukleophilen Gruppe des Polymers zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem die thermochemische Gruppe des Photoverbindungsmittels ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd, Carbonyl, Isothiocyanat, Halid und Isocyanat.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Photoverbindungsmittel eine photochemische Gruppe aufweist, die photoreaktiv ist und die in der Lage ist, eine kovalente Bindung bei einer photochemischen Reaktion mit dem Molekül ohne Zugabe irgendeines anderen Reagensmittels zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 4, bei welchem die photochemische Gruppe des Photoverbindungsmittels ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Vorläufern von Carben, den Vorläufern von Nitren und einem Sauerstoffradikal.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Photoverbindungsmittel 1-Fluor-2-nitro-4-azidobenzol (FNAB) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Polymer irgendein Polymer mit Amino, Hydroxyl, Thiol oder mit irgendeiner anderen reaktiven nukleophilen Gruppe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kieselgel, langkettigem Alkylaminoglas mit kontrollierten Poren, Polyvinylalkohol, Aminopolystyrol und Alkylaminokieselgel.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das in dem Schritt (a) verwendete Lösungsmittel ausgewählt ist am der Gruppe bestehend am Dimethylformamid und Toluol.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt (a) in Gegenwart eines Katalysators durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, bei welchem der Katalysator 30% KOH umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Reaktion nach dem Schritt (a) durchgeführt wird, indem die Mischung aus dem Photoverbindungsmittel, dem Polymer und dem Lösungsmittel einer Mikrowellenstrahlung ausgesetzt wird oder durch eine thermische Inkubation bei 37°C erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 12, bei welchem die Aussetzung gegenüber einer Mikrowellenstrahlung bei einer Frequenz von 2000 Hz bis 2600 Hz mit einer Leistungsabgabe in dem Bereich von 100 Watt bis 1000 Watt während einer Zeitdauer in dem Bereich von 10 Sekunden bis 20 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das für das Waschen des bei dem Schritt (a) erzielten Polymers verwendete Lösungsmittel ein Lösungsmittel umfasst, welches in der Lage ist, das Photoverbindungsmittel und seine degradierten Produkte ohne Verzerrung des Polymers aufzulösen.
Verfahren gemäß Anspruch 14, bei welchem das verwendete Lösungsmittel ausgewählt ist unter Methanol und Ethanol.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Polymer ausgewählt ist in der Form einer Perle, eines Schachtes, einer Folie, eines Pulvers, eines Stabes, einer Platte, eines Streifens oder eines Rohres.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das auf dem photoreaktiven Polymer immobilisierte Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem organischen Molekül, einem organischen Polymer, einem Biomolekül und irgendeinem Molekül mit einer C-H Verbindung.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei welchem das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein, Nukleinsäuren, Kohlenhydrat, Oligonukleotiden, Enzym, Antigen, Antikörper und Peptid.
Verfahren gemäß Anspruch 18, bei welchem das Enzym eine Rettichperoxidase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Quelle der Photoenergie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus UV Licht, Sonnenlicht, ebenem Licht und aus einem Laserstrahl.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das als Quelle für die Photoenergie verwendete UV-Licht eine Wellenlänge in dem Bereich von 300 nm bis 400 nm aufweist und das Aussetzen zum Immobilisieren des Moleküls während einer Zeitdauer in dem Bereich von 2 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Reaktion zwischen der nukleophilen Gruppe der Polymeroberfläche und dem Photoverbindungsmittel in einem Mikrowellenofen in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt wird.