EP1379680A2 - Verfahren zur anbindung von biomolekülen an chemisch inerte oberflächen - Google Patents

Verfahren zur anbindung von biomolekülen an chemisch inerte oberflächen

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Publication number
EP1379680A2
EP1379680A2 EP02732600A EP02732600A EP1379680A2 EP 1379680 A2 EP1379680 A2 EP 1379680A2 EP 02732600 A EP02732600 A EP 02732600A EP 02732600 A EP02732600 A EP 02732600A EP 1379680 A2 EP1379680 A2 EP 1379680A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chemically inert
biomolecule
immobilized
biomolecules
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02732600A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Willi Kling
Jens Seemann
Johannes Georg Schindler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cognis IP Management GmbH
Original Assignee
Cognis Deutschland GmbH and Co KG
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Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001118553 external-priority patent/DE10118553A1/de
Priority claimed from DE2001118554 external-priority patent/DE10118554A1/de
Application filed by Cognis Deutschland GmbH and Co KG filed Critical Cognis Deutschland GmbH and Co KG
Publication of EP1379680A2 publication Critical patent/EP1379680A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a method for binding biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, to chemically inert carrier surfaces.
  • the present invention relates to a method for immobilizing biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, by attachment, in particular physical and / or chemical attachment, to chemically inert support surfaces and the use of the immobilized systems produced in this way, preferably for use in bioreactors , Biosensors and chromatographic systems.
  • the binding can be carried out by adsorption, ion binding or covalent binding.
  • the binding to the carrier can also take place within the original microbial cell.
  • the activity of the enzyme is not affected by the fixation; it can be used multiple or continuously in a carrier-bound manner.
  • the enzyme When immobilized by inclusion, the enzyme is mostly enclosed between semipermeable membranes and / or gels, microcapsules or fibers.
  • the encapsulated enzymes are e.g. B. separated by a semipermeable membrane from the surrounding substrate and product solution. Cells can also be encapsulated. The activity of the enzyme is not affected by the fixation in space.
  • Immobilized enzymes, enzyme-producing microorganisms or cells are used in particular in biotechnological processes.
  • the first technical processes with immobilized cells were empirically optimized and are still used today.
  • Another older process is vinegar production using the generator process.
  • the most important process is the use of cells with glucose isomerase to produce syrup containing fructose.
  • Glucose amylase for the production of glucose in the starch process is also used immobilized.
  • the cleavage of lactose using the immobilized ß-galactosidase from yeast to glucose and galactose is also a common procedure.
  • a disadvantage of the methods for immobilizing enzymes known from the prior art is in particular the fact that the immobilization of the enzymes has to be carried out in a relatively complex manner and a combination with systems which are inert to the enzymes is not possible.
  • the problem underlying the present invention now consists in providing a method with which biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, can also be attached to chemically inert carrier surfaces.
  • a new method is to be provided with which biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, can be immobilized by binding to chemically inert carrier surfaces.
  • Another problem on which the present invention is based is to provide a method with which biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, can be immobilized in a simple manner, the reactivity of the biomolecules immobilized in this way being essentially to be retained, i. H. the reactivity of the biomolecules immobilized in this way should essentially not be restricted.
  • the present invention thus relates to a process for immobilizing biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, by fixing or binding them to a chemically inert support surface, the process comprising the following process steps: (a) activation of the chemically inert support surface by modification of the support surface using plasma chemical methods; subsequently
  • step (b) Linking the biomolecule (s) to be immobilized, if necessary after converting them into an activated or attachable state, to the carrier surface activated in step (a).
  • step (a) of the method according to the invention the chemically inert carrier surface is activated by modifying the carrier surface using plasma-chemical methods.
  • the plasma-chemical modification of surfaces is known per se to the person skilled in the art. You can refer to the relevant specialist literature here. So far, however, this method has not been used to prepare surfaces for the attachment or immobilization of biomolecules.
  • the - initially - chemically inert carrier surface is functionalized.
  • “chemically inert support surface” is understood to mean a surface that is non-reactive with respect to the respective application. In the present case, it is particularly meant that the support surface is initially, ie originally or per se, not suitable for binding biomolecules, that is, in other words, the support surface initially does not have any reactive functional groups which are associated with the biomolecule to be connected or coupled ( can react. In the sense of the present invention, “chemically inert” means in particular non-reactive towards the respective biomolecules or not suitable for binding biomolecules.
  • Suitable chemically inert surfaces according to the invention are all surfaces which do not or essentially do not impair the catalytic activity of the biomolecule to be connected or coupled in process step (b), in particular enzyme, and which do not or essentially do not interfere with enzymatically catalyzed processes and methods , These can be, for example, chemically inert metal surfaces, in particular surfaces made of precious metal or their alloys (e.g. platinum or stainless steel).
  • Chemically inert plastic surfaces in particular polyhalogenated polymers, preferably polyalkyls or polyalkylenes such as polytetrafluoroethylene ( Teflon® ) or polyvinyl chloride (PVC), are also suitable according to the invention.
  • polyhalogenated polymers preferably polyalkyls or polyalkylenes such as polytetrafluoroethylene ( Teflon® ) or polyvinyl chloride (PVC)
  • Teflon® polytetrafluoroethylene
  • PVC polyvinyl chloride
  • Teflon ® Polytetrafluoroethylene (Teflon ® ) or PVC. It is also possible to combine different materials, for example chemically resistant ones
  • metal surfaces e.g. stainless steel or platinum
  • polytetrafluoroethylene (Teflon ® ) or PVC e.g. B.
  • Teflon ® polytetrafluoroethylene
  • PVC polytetrafluoroethylene
  • Another material suitable for binding biomolecules is, for example, cellulose acetate.
  • the activation of the chemically inert support surface in step (a) of the method according to the invention takes place in particular in that at least one suitable functional group which is reactive towards the biomolecules to be attached is attached or fixed directly to the chemically inert support surface under plasma chemical conditions.
  • This method is known per se to the person skilled in the art.
  • the activation of the chemically inert carrier surface in step (a) of the method according to the invention can take place in reactive plasma, in particular high-frequency plasma. This happens, for example, in a - reactive - plasma, in particular high-frequency plasma, from inert gas (s), such as, for example, B. noble gases, and reactant gas (s), such as. B. ammonia.
  • suitable functional group reactive towards the biomolecule or enzyme to be bound denotes a functional group which is suitable for direct (direct) attachment or coupling or else for indirect (indirect) attachment or coupling of the respective biomolecule, in particular enzyme is, ie is reactive towards the respective biomolecule or enzyme or reacts with it with binding or coupling.
  • the originally chemically inert surface has functional groups which are reactive towards the biomolecules to be attached or coupled.
  • Non-limiting examples of reactive functional groups suitable according to the invention are in particular groups or groupings which comprise or represent a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group and / or a thio group, optionally in protonated or deprotonated form.
  • the plasma chemical conducted amino, hydroxyl and / or carboxyl modification chemically inert surfaces in particular chemically inert surfaces of polytetrafluoroethylene (eg., Teflon ® membrane) or PVC. This method is known per se to the person skilled in the art.
  • the peculiarity of the plasma chemical activation in step (a) of the method according to the invention is in particular that the activation of the chemically inert carrier surface takes place selectively only on the surface.
  • the chemically inert carrier surface is activated by means of plasma chemical methods in step (a) of the method according to the invention, the bulk properties of the originally chemically inert carrier surface are retained, for example.
  • Process step (a) is then followed in process step (b) by the connection or coupling of the biomolecule (s) to be immobilized to the plasma-chemically modified support surface, this being done by connection or coupling of the biomolecules via the functional groups reactive in step (a).
  • the biomolecules can be attached directly to the reactive functional groups applied to the support surface or indirectly, e.g. B. via suitable linkers or linker molecules. Methods for this are known per se to the person skilled in the art.
  • a "linker” - also synonymously referred to as a “linker molecule” - is understood to mean a molecule or a part of a molecule which serves to link fragments and / or other molecules (here: linkage or connection of plasma-chemically activated or modified, chemically inert carrier surfaces with biomolecules, especially enzymes).
  • the biomolecule in particular the enzyme or the enzymatic enzyme
  • the plasma-chemically activated or modified carrier surface it may be advisable to convert the biomolecule to an activated or connectable state. Methods for this are well known to the person skilled in the art.
  • Such methods are known per se to the person skilled in the art.
  • the biomolecules can be directly or indirectly attached to a plasma chemical by means of covalent and / or ionic bonding, preferably covalent bonding, via the reactive functional group (s) attached in step (a) activated, chemically inert carrier surface.
  • This causes the biomolecule, in particular the enzyme, to be immobilized.
  • biomolecules in particular all types of enzymes, can be immobilized using the method according to the invention.
  • the biomolecule to be immobilized is an enzyme, this can for example be selected from the group of oxidoreductases, transferases, hydrolases (e.g. esterases such as lipases), lyases, isomerases and ligases (synthetases) and their mixtures and combinations with one another.
  • Process step (b) can optionally be followed by a process step (c) which comprises crosslinking the enzymes coupled in process step (b).
  • cross-linking reagents eg glutard ialdehyde
  • Process step (c) which comprises crosslinking the enzymes coupled in process step (b).
  • FIG. 1 schematically shows the sequence of the method according to the invention with method steps (a) and (b).
  • the activation of the chemically inert carrier surface 1 in method step (a) is carried out by modifying the carrier surface 1 with plasma chemical methods, FIG. 1 showing an embodiment according to which - starting from a starting molecule 2 - a suitable functional one which is reactive towards the biomolecule to be bound Group 2 '(z. B. an amino group) is attached directly to the chemically inert support surface 1.
  • process step (b) the direct coupling or connection of the biomolecule 3 to be immobilized to the carrier surface 1 activated in step (a) then follows, thereby immobilizing the biomolecule 3 is effected.
  • the method according to the invention makes it possible to bind biomolecules, in particular enzymes, to chemically inert surfaces and to immobilize them in this way, whereby the reactivity of the biomolecule, in particular the enzyme, is not or essentially not limited in its reactivity.
  • the immobilization makes the biomolecules, in particular enzymes, reusable. After use, the enzymes can be easily separated. On in this way they can be used, in particular, in a high local concentration and, for example, in a continuous flow.
  • the substrate specificity and the specificity of the reaction and the reactivity of the biomolecules, in particular enzymes are retained in the immobilization according to the invention.
  • the present invention also relates to the biomolecules which can be produced, immobilized and, if appropriate, crosslinked by the process according to the invention, in particular enzymes or enzymatic systems.
  • the immobilized biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems are fixed directly or indirectly to a chemically inert support surface, in particular attached or coupled, the attachment or coupling of the biomolecule being effected via suitable reactive functional groups attached to the chemically inert support surface, for example directly via ionic and / or covalent bonds or indirectly via a suitable linker with biomolecule- or enzyme-reactive functional groups.
  • the immobilized biomolecules which can be produced by the process according to the invention, in particular enzymes or enzymatic systems, can be used, for example, in biosensors or bioreactors. Furthermore, their use in chromatographic systems, in particular chromatographic columns, is also possible, either for preparative purposes or synthesis purposes or else for analytical purposes.
  • the present invention thus also relates to biosensors, bioreactors and chromatographic systems which comprise the immobilized biomolecules obtainable according to the invention, in particular enzymes or enzymatic systems.
  • biosensors are sensors with a bioactive component, based on the coupling of biomolecules that specifically recognize analytes as receptors in the broadest sense, with physicochemical transducers that generate a biologically generated signal (e.g. oxygen concentration, pH value) , Dye, etc.) into electrical measurement signals.
  • a biologically generated signal e.g. oxygen concentration, pH value
  • FIG. 2 shows the typical structure of a biosensor for the specific detection of an analyte 1, the biosensor comprising a receptor 2 and a transducer 3 which converts the biological signal generated by the receptor 2 into an electronic signal 4 which is forwarded to electronics 5 ,
  • biomolecules can be used for specific recognition, in particular enzymes.
  • Potentiometric sensors, amperometric electrodes, piezoelectric sensors, thermistors or optoelectronic sensors can be used as transducers. Due to the reaction or interaction of the analyte with the receptor, a distinction is made between two basic types of biosensors, namely, on the one hand, bioaffinity sensors, which take advantage of changes in the electron density that occur during complex formation, and, on the other hand, metabolism sensors, which are based on the specific detection and conversion of substrates.
  • Biosensors are used - especially in the form of enzyme electrodes - in healthcare, for the control of biotechnological processes, in the food industry or in environmental protection. A wide variety of systems can be analyzed with biosensors.
  • the enzyme molecules are either introduced into polymer matrices (such as PVC, gels, graphites or zeolites) or between foils (e.g. cellulose acetate).
  • polymer matrices such as PVC, gels, graphites or zeolites
  • foils e.g. cellulose acetate
  • Oxygen based and have a chemically inert membrane eg a Teflon membrane
  • a chemically inert membrane eg a Teflon membrane
  • suitable biomolecule- or enzyme-reactive functional groups must be bound to the chemically inert membrane surface.
  • B. amino or carboxyl groups, and these groups can be attached in a plasma coating process. If necessary, cross-linking reagents can then be used to bind the immobilized enzymes.
  • suitable biosensor systems according to the invention are e.g. B.
  • Further exemplary embodiments provide for the binding of 1,000 to 100,000 U (units) of catalase or 10 to 100 U of glucose oxidase with the bifunctional glutardialdehyde on aminated PTFE membranes with a membrane diameter of 1 to 10 mm, preferably 8 mm, but represent the ranges given are not restrictions, but rather have to be based on the types of application, taking into account the desired concentration range of the analyte to be measured.
  • the service life of such 0 2 -sensitive-enzymatic sensors is approximately 2 months.
  • biosensors according to the invention enable, for example, the production of microelectrodes (arrays) for small volumes and high sample throughput (e.g. for combinatorial use).
  • the solution to the problem lies in the simultaneous introduction of chemically bound oxygen, which then has to be released within the enzyme membrane for the substrate conversion of the ⁇ -D-glucose by GOD.
  • This can be done in a particularly elegant manner on the basis of a bienzyme membrane, for example by B.
  • catalase with glutardialdehyde is additionally covalently bound and crosslinked according to the invention on an aminized PTFE membrane.
  • the two enzymes can be immobilized in mixed form, but also in layers.
  • the immobilization in layers can in turn be carried out in two or more layers.
  • the order of the enzyme layers can, but need not, be application-oriented.
  • oxygen from hydrogen peroxide for the substrate conversion of glucose oxidase. Since on the one hand there are 0 2 -sensitive-enzymatic membrane electrodes and on the other hand oxygen is one of the reactants of glucose oxidase, the hydrogen peroxide should be offered in a constant concentration. In the case of an oxygen-containing measuring medium, it should also be provided that the proportion of the physically dissolved is also Oxygen in constant concentration reaches the sensor.
  • the present invention thus relates to a biosensor, in particular for measuring glucose, preferably ⁇ -D-glucose, the biosensor having at least one on an activated, plasma-chemically modified and / or functionalized carrier surface of a chemically inert carrier material, preferably polytetrafluoroethylene.
  • a chemically inert carrier material preferably polytetrafluoroethylene.
  • fixed peroxide-sensitive biomolecule in particular enzyme, preferably glucose oxidase, optionally in combination with catalase.
  • the biosensor is a peroxide sensor or a biochemical peroxide sensor.
  • this is understood to mean a biosensor or a measuring element which is qualitatively or quantitatively sensitive or sensitive to the presence or concentration of inorganic or organic peroxides (e.g. hydrogen peroxide, dissolved peroxides from inorganic or organic salts, organic peracids etc.)
  • inorganic or organic peroxides e.g. hydrogen peroxide, dissolved peroxides from inorganic or organic salts, organic peracids etc.
  • Such a (biochemical) peroxide sensor contains - quasi as an active component - molecules which indicate the presence of peroxides or react with peroxides.
  • These can be, for example, molecules, in particular hydrogen peroxide-sensitive enzymes, which are bound to an activated, chemically inert carrier surface by binding, without this fundamentally changing their reactivity.
  • the biochemical peroxide sensor according to the invention is a biosensor for the qualitative and / or quantitative determination of organic or inorganic peroxides, in particular hydrogen peroxide, of dissolved peroxides from inorganic or organic salts and / or of organic peracids, wherein the biochemical peroxide sensor has at least one, in particular on an activated, plasma-chemically modified or functionalized carrier surface of a chemically inert carrier material
  • polytetrafluoroethylene z. B. Tefion ® membrane
  • peroxide-sensitive biomolecule in particular enzyme, preferably catalase.
  • one or more can be on the carrier Biomolecules or enzymes - either directly or indirectly via linkers - that are mutually complementary in their effect: the enzyme that actually reacts with hydrogen peroxide can be a catalase, for example.
  • Such enzymes are commercially available, for example from Merck KGaA in Germany.
  • the biomolecules or enzymes bound to the chemically inert support surface can then be cross-linked, for example with glutardialdehyde.
  • the biomolecules or enzymes are fixed or bound to the surface by means of suitable, reactive functional groups which have previously been applied to the support surface by known plasma-chemical methods.
  • the carrier surface consists of surface chemistry modified by plasma chemistry
  • Polytetrafluoroethylene Teflon ®
  • a coating thereof e.g. a metal vapor-coated with polytetrafluoroethylene, such as platinum
  • Teflon ® layer is modified as described above and the enzyme or enzymes are fixed thereon.
  • the superficial modification of the Teflon preferably consists in generating or attaching plasma-chemically reactive groups, such as amino or carboxyl groups, to the support surface and then attaching the enzyme or enzymes and then possibly crosslinking them.
  • the unit consisting of the biomolecule (s), in particular enzyme (s), and the carrier surface provides a preferably electrical signal, on the basis of which the presence and / or concentration of peroxides can be deduced (e.g. using a previously created calibration curve ).
  • the biochemical peroxide sensor according to the invention thus enables the qualitative and / or quantitative determination of peroxides in free or in bound form, for example in the form of free hydrogen peroxide, in the form of peracids, in the form of perborates or in the form of soluble peroxides.
  • a certain concentration of the per-compound is in equilibrium with a certain concentration of hydrogen peroxide, the can be determined by the peroxide sensor according to the invention.
  • the level of the electrical signal of the peroxide sensor according to the invention can be correlated with the concentration of the per compound present in each case by means of corresponding calibration curves. If one wishes to determine the concentration of hydrogen peroxide in free or bound form, the measurement solution is preferably buffered to a pH in the range from 4.5 to 8.
  • the presence or concentrations of molecules which react with the peroxides or which cause peroxide consumption can also be determined indirectly (for example nitrite or hydroxylamine).
  • the reaction of the peroxide-consuming molecules with the peroxides (e.g. hydrogen peroxide) or the competitive reaction of the peroxide sensor is used for this. Accordingly, one can, for example, add a known amount of hydrogen peroxide to the solution of the peroxide-consuming molecules, measure the level of the electrical signal of the biochemical peroxide sensor, compare it with the theoretically expected level (e.g. based on calibration) and, from the difference, the concentration of the peroxide-consuming level Derive molecules.
  • the peroxide sensor according to the invention is suitable, for example, for process monitoring, control or control (for example during phosphating).
  • biomolecules immobilized according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems, in biosensors, it is therefore possible to combine at least two different types of biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, with one another, ie in particular to use so-called enzyme chains or enzyme degradation chains.
  • the various enzymes can either be present in a reaction system (for example in a measuring cell) or can be sequentially connected in series (for example in successive measuring cells). If necessary, however, a parallel multi-electrode structure can also be advantageous (e.g. for differential measurements).
  • several substances can be determined in parallel by several enzymes (or enzyme chains) in a measuring cell or in measuring systems.
  • the immobilized biomolecules obtainable by the process according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems, can also be used in bioreactors.
  • bioreactors are understood to mean the physical container in which biological substance conversions are carried out, in particular with biomolecules such as enzymes.
  • the method according to the invention can be used to achieve, for example, a modification of the wall surfaces of bioreactors.
  • It can be any type of bioreactor, such.
  • Reactor surfaces suitable according to the invention can, for example, consist of metal or can be coated (for example Teflon® or PVC) or have a combination of these materials with all the common polymers used for reactor production.
  • biomolecules immobilized according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems
  • bioreactors there is also the possibility, particularly in the case of fixed bed reactors, of the immobilized biomolecule, in particular to bind enzyme or enzymatic system to the stationary carrier material or bulk material.
  • biomolecules immobilized according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems, in bioreactors, in particular for modifying the wall surface or when binding the enzyme to the carrier material or bulk material
  • biomolecules in particular enzymes or enzymatic Systems
  • bioreactors in particular for modifying the wall surface or when binding the enzyme to the carrier material or bulk material
  • biomolecules in particular enzymes or enzymatic Systems
  • biomolecule or enzyme chains in particular enzymes or enzymatic Systems
  • biomolecule or enzyme chains or biomolecule or enzyme degradation chains can be connected either in a single reaction zone or sequentially (e.g. in successive reaction zones). This enables, for example, multi-stage, enzymatically catalyzed syntheses and processes.
  • FIG. 3A shows a stirred tank reactor in which the energy is introduced by mechanically moving units.
  • G denotes the gas flow and M the mechanical drive device (e.g. motor). Because of their versatility, stirred tank reactors are used most frequently.
  • 3B shows a bubble column reactor in which the mixing is carried out by supplying air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • 3C shows a so-called airlift fermenter with an internal passage, a liquid circulation and mixing being generally generated by the introduction of air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • 3D shows a so-called airlift fermenter with an external passage, a liquid circulation and mixing being generally generated by the introduction of air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • bioreactor types of the prior art can be modified according to the invention, for example by modifying the wall surface (for example by coupling biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems according to the invention, to the chemically inert reactor walls) or in the case of fixed bed Bioreactors by connecting the biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, to the carrier material or bulk material.
  • FIG. 4 shows an example and schematically some embodiments of bioreactors according to the present invention:
  • FIG. 4A shows a bioreactor, the chemically inert walls of which are modified by coupling an immobilized biomolecule, in particular type A enzyme.
  • G denotes the gas flow.
  • FIG. 4B shows a bioreactor, the chemically inert walls of which are modified by coupling an immobilized biomolecule, in particular enzyme, of type A and an immobilized biomolecule, in particular enzyme, of type B, which are arranged in different, successive reaction zones.
  • G denotes the gas flow.
  • 4C shows a bioreactor whose chemically inert walls are modified by coupling an immobilized biomolecule, in particular enzyme, of type A and an immobilized biomolecule, in particular enzyme, of type B, which are arranged within a single reaction zone.
  • 4D shows a bioreactor in the form of a fixed bed reactor, on the carrier material or bulk material immobilized biomolecules, in particular enzymes, of type A and type B are coupled, which are arranged within a reaction zone.
  • bioreactor wall surfaces and / or bulk bioreactors and the like are possible, which the person skilled in the art will readily consider when reading the present description without departing from the scope of the present invention.
  • biomolecules immobilized according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems, in chromatographic systems, in particular in chromatographic columns. This can be done for preparative or synthetic purposes (e.g. carrying out enzymatically catalyzed reactions on a chromatographic column) or else for analytical purposes (e.g. for analytical column chromatography).
  • biomolecules immobilized according to the invention in particular enzymes or enzymatic systems
  • biosensors bioreactors and chromatographic systems
  • biomolecules in particular enzymes or enzymatic systems
  • they are easy to use after use Separation is possible (e.g. after synthesis in the bioreactor, for example by draining the reaction mixture).
  • the biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems can be used efficiently and inexpensively in a high local concentration and in a continuous flow.
  • the substrate specificity and the specificity of the reaction and the reactivity of the enzymes are not lost by the immobilization according to the invention.
  • the aim of the process of the invention is (for example Teflon ®.), Among other things, the chemically inert surface material as a diffusion barrier - in the plasma - sputter, and then the functional groups for sole or Reactor applications directly e.g. B. to apply the amino or carboxyl groups to which the biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, can then be coupled.
  • the chemically inert surface material as a diffusion barrier - in the plasma - sputter, and then the functional groups for sole or Reactor applications directly e.g. B. to apply the amino or carboxyl groups to which the biomolecules, in particular enzymes or enzymatic systems, can then be coupled.
  • a chemically inert carrier surface in this case a PTFE membrane
  • Teflon ® membrane is first functionalized in reactive high-frequency plasma under conditions known per se. Suitable, enzyme-reactive functional groups are bound to the chemically inert membrane surface, in particular amino and / or carboxyl groups.
  • the cavity of the acrylic glass ring is charged with an internal electrolyte on the detector side for the purpose of connecting the measuring cathode made of Pt and Ag / AgCI reference anode.
  • bioelectrochemical sensors according to the invention result, as previously defined in the general description.
  • the service life of such sensors is approximately two months.
  • the glucose sensors according to the invention measure ⁇ -D-glucose.
  • the ⁇ - and ⁇ -forms of glucose are present in a constant ratio after the mutarotation equilibrium has been set, one can speak of glucose sensors in the present case, since the calibration process also takes these circumstances into account.
  • biosensors according to the invention were produced:
  • SBC-1321-ß-D-glucose-HDKS-No. 1 is a membrane system based on an aminized PTFE membrane with GOD covalently bound by glutardialdehyde, the amination of the PTFE membrane and the subsequent immobilization of the GOD being carried out by the method according to the invention.
  • This membrane system was integrated in an amperometric flow cell with Pt measuring cathode and Ag / AgCI reference anode: A 0 2 -sensitive-enzymatic ß-D-glucose sensor for flow measurements was created.
  • the sensor system according to the invention was tested in an endurance test.
  • the senor according to the invention was continuously perfused with a phosphate buffer (pH value of 7.04 at 25 ° C.). During this period, about 100 liters of this buffer were pumped through the measuring system. Finally, glucose measurements with the phosphate buffer as Solvent for the analyte to demonstrate the functionality of the membrane system carried out (pump: Permax 12/6 at 20 digits with silicone tubing 1.9 x 4.5 mm). Despite continuous perfusion of the sensor according to the invention with phosphate buffer (HPL) at a temperature of 20 to 25 ° C. for one year, the enzymatic activity of the membrane system can still be described as sufficient even after one year.
  • HPL phosphate buffer
  • biosensors were produced which contain glucose oxidase and catalase. Such biosensors can be used, for example, for the continuous monitoring of measured values of glucose in low-oxygen or even oxygen-free media. In addition, this allows the measuring range to be expanded.
  • concentrations of units (U) of catalase or glucose oxidase to be immobilized for such biosensors are given below.
  • the two aforementioned enzymes can also be present in the membrane system in an immobilized manner without restriction. This is substantiated on the basis of three examples, specifying the membrane composition, with the two enzymes in turn being covalently bound and crosslinked on an aminized PTFE membrane using glutardialdehyde:
  • the measuring medium can be sucked in with a roller pump connected downstream.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Anbindung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an plasmachemisch aktivierte bzw. funktionalisierte, chemisch inerte Trägeroberflächen beschrieben. Insbesondere wird ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, vorzugsweise Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch direkte oder mittelbare Anbindung, insbesondere chemische und/oder physikalische Anbindung, an plasmachemisch aktivierte bzw. funktionalisierte, chemisch inerte Trägeroberflächen beschrieben. Die auf diese Weise immobilisierten Biomoleküle eignen sich beispielsweise zur Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen.

Description

Verfahren zur Anbindung von Biomolekülen an chemisch inerte Oberflächen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anbindung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an chemisch inerte Trägeroberflächen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch Anbindung, insbesondere physikalische und/oder chemische Anbindung, an chemisch inerte Trägeroberflächen sowie die Verwendung der auf diese Weise hergestellten immobilisierten Systeme, vorzugsweise für die Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen.
In der angewandten Mikrobiologie, insbesondere in der Biotechnologie, ist es bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen auf bestimmten Trägern zu fixieren, insbesondere wenn sie als Biokatalysatoren verwendet werden. Dieser Vorgang wird im allgemeinen als Immobilisierung bezeichnet.
Da native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität reduziert werden, besteht wegen der hohen Herstellungskosten von Enzymen ein Bedarf, diese Enzyme zu stabilisieren. Durch die Immobilisierung werden sie wiederverwendbar. Nach der Verwendung können die Enzyme leicht abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität des Enzyms dürfen durch die Immobilisierung nicht verloren gehen.
Bei der Immobilisierung von Enzymen werden im allgemeinen drei grundsätzliche Methoden unterschieden, nämlich erstens die Immobilisierung durch Quervernetzung, zweitens die Immobilisierung durch Bindung an einen Träger und drittens die Immobilisierung durch Einschluß. Bei der Immobilisierung durch Quervernetzung erhält man quervernetzte Enzyme, die miteinander fixiert sind, ohne daß ihre Aktivität beeinflußt wird. Die Enzyme sind jedoch nicht mehr löslich. Die Quervernetzung erfolgt beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Wenn die Immobilisierung durch Anbindung an einen Träger erfolgt, kann die Bindung durch Adsorption, lonenbindung oder kovalente Bindung erfolgen. Die Bindung an den Träger kann auch innerhalb der ursprünglichen mikrobiellen Zelle stattfinden. Das Enzym wird durch die Fixierung nicht in seiner Aktivität beeinflußt, es kann trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
Bei der Immobilisierung durch Einschluß wird das Enzym meist zwischen semipermeable Membranen und/oder Gelen, Mikrokapseln oder Fasern eingeschlossen. Die gekapselten Enzyme sind z. B. durch eine semipermeable Membran von der umgebenden Substrat- und Produkt-Lösung getrennt. Es können auch Zellen gekapselt werden. Das Enzym ist durch die Fixierung im Raum nicht in seiner Aktivität beeinflußt.
Immobilisierte Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen werden insbesondere in biotechnologischen Verfahren eingesetzt. Die ersten technischen Verfahren mit immobilisierten Zellen wurden empirisch optimiert und werden noch heute eingesetzt, so z. B. die Abwasserreinigung im Tropfkörper. Ein ebenfalls älteres Verfahren ist die Essigproduktion mit dem Generatorverfahren. Im Nahrungsmittelbereich ist der Einsatz von Zellen mit Glucose-Isomerase zur Produktion von fructosehaltigem Sirup das wichtigste Verfahren. Glucose-Amylase zur Glucose-Herstellung im Stärkeprozeß wird ebenfalls immobilisiert eingesetzt. Die Spaltung von Laktose mit Hilfe der immobilisierten ß-Galactosidase aus Hefen zu Glucose und Galactose ist ebenfalls ein gängiges Verfahren. Weitere technische Verfahren mit immobilisierten Systemen gibt es bei der Aminosäureherstellung, bei der Spaltung von Penicillin G zu 6- Aminopenicillinsäure und bei der Herstellung von Ethanol mit wachsenden, immobilisierten Zellen von Saccharomyces sp. Immobilisierte Enzym- und Zellsysteme werden nicht nur in biotechnologisch ablaufenden Produktionsverfahren, sondern auch in der Analytik eingesetzt, so z. B. in sogenannten Biosensoren. Das Prinzip der Analytik mit Hilfe von immobilisierten Systemen beruht darauf, daß ein zu bestimmendes Substrat durch ein immobilisiertes System umgesetzt wird, wobei die Veränderung der Produkt-, Substrat- oder Cosubstrat-Konzentration verfolgt werden kann, beispielsweise mit mehreren gekoppelten Methoden (z. B. Enzym-Elektroden).
Nachteilig bei den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zur Immobilisierung von Enzymen ist insbesondere die Tatsache, daß die Immobilisierung der Enzyme in relativ aufwendiger Weise durchgeführt werden muß und eine Kombination mit gegenüber den Enzymen an sich inerten Systemen nicht möglich ist.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem besteht nunmehr darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, auch an chemisch inerte Trägeroberflächen anbinden lassen. Insbesondere soll ein neues Verfahren bereitgestellt werden, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, durch Anbindung an chemisch inerte Trägeroberflächen immobilisieren lassen.
Ein weiteres, der vorliegenden Erfindung zugrundeliegendes Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, in einfacher Weise immobilisieren lassen, wobei die Reaktivität der auf diese Weise immobilisierten Biomolekülen im wesentlichen erhalten bleiben soll, d. h. die auf diese Weise immobilisierten Biomoleküle in ihrer Reaktivität im wesentlichen nicht beschränkt werden sollen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch deren Fixierung bzw. Bindung an eine chemisch inerte Trägeroberfläche, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt: (a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden; anschließend
(b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle, gegebenenfalls nach deren Überführung in einen aktivierten bzw. anbindungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche.
In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt also eine Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden. Die plasmachemische Modifizierung von Oberflächen ist dem Fachmann an sich bekannt. Hier kann auf die einschlägige Fachliteratur verwiesen werden. Bislang wurde aber diese Methode noch nicht genutzt, um Oberflächen für die Anbindung bzw. Immobilisierung von Biomolekülen vorzubereiten. Mit anderen Worten erfolgt in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Funktionalisierung der - zunächst - chemisch inerten Trägeroberfläche.
Unter "chemisch inerter Trägeroberfläche" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine in bezug auf die jeweilige Anwendung nichtreaktive Oberfläche verstanden. Insbesondere ist vorliegend damit gemeint, daß die Trägeroberfläche zunächst, d. h. ursprünglich bzw. an sich, nicht zur Anbindung von Biomolekülen geeignet ist, d. h. mit anderen Worten die Trägeroberfläche zunächst keinerlei reaktive funktionelle Gruppen aufweist, die mit dem oder den anzubindenden bzw. anzukoppelnden Biomolekül(en) reagieren können. "Chemisch inert" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint also insbesondere nichtreaktiv gegenüber den jeweiligen Biomolekülen bzw. nicht zur Anbindung von Biomolekülen geeignet. Erst durch die plasmachemische Behandlung in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Oberfläche des chemisch inerten Trägermaterials für die Fixierung, d. h. Ankopplung bzw. Anbindung des oder der Biomoleküle bzw. Enzyme in dem sich anschließenden Verfahrensschritt (b) vorbereitet. Als erfindungsgemäß geeignete, chemisch inerte Oberflächen kommen alle Oberflächen in Betracht, welche die katalytische Aktivität des in Verfahrensschritt (b) anzubindenden bzw. anzukoppelnden Biomoleküls, insbesondere Enzyms, nicht oder im wesentlichen nicht beeinträchtigen und enzymatisch katalysierte Prozesse und Verfahren nicht oder im wesentlichen nicht stören. Hierbei kann es sich beispielsweise um chemisch inerte Metalloberflächen, insbesondere Oberflächen aus Edelmetall oder deren Legierungen (z. B. Platin oder Edelstahl), handeln. Erfindungsgemäß geeignet sind aber auch chemisch inerte Kunststoffoberflächen, insbesondere polyhalogenierte Polymere, vorzugsweise Polyalkyle oder Polyalkylene wie Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder Polyvinylchlorid (PVC) umfassende Oberflächen. Des weiteren kommen als chemisch inerte Oberflächen zur Anbindung der Biomoleküle bzw. Enzyme alle gängigen Polymere in Betracht, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, beispielsweise auch die bereits genannten polyhalogenierten Polymere wie
Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder PVC. Möglich ist es auch, verschiedene Materialien zu kombinieren, beispielsweise chemisch beständige
Metalloberflächen (z. B. Edelstahl oder Platin) mit Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder PVC zu beschichten, z. B. durch Bedampfen. Ein weiteres, zur Anbindung von Biomolekülen geeignetes Material ist beispielsweise auch Celluloseacetat.
Die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt insbesondere dadurch, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber den anzubindenden Biomolekülen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht bzw. fixiert wird. Diese Methode ist dem Fachmann an sich bekannt. Insbesondere kann die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgen. Dies geschieht beispielsweise in einem - reaktiven - Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, aus lnertgas(en), wie z. B. Edelgase, und Reaktantgas(en), wie z. B. Ammoniak. Die Formulierung "geeignete, gegenüber dem anzubindenden Biomolekül bzw. Enzym reaktive funktionelle Gruppe" bezeichnet ein funktionelle Gruppe, die zur direkten (unmittelbaren) Anbindung bzw. Ankopplung oder aber zur indirekten (mittelbaren) Anbindung bzw. Ankopplung des jeweiligen Biomoleküls, insbesondere Enzyms, geeignet ist, d. h. gegenüber dem jeweiligen Biomolekül bzw. Enzym reaktiv ist bzw. hiermit unter Anbindung bzw. Ankopplung reagiert.
Nach der plasmachemischen Aktivierung bzw. Modifizierung gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die ursprünglich chemisch inerte Oberfläche funktionelle Gruppen auf, die gegenüber den anzubinden bzw. anzukoppelnden Biomolekülen reaktiv sind.
Nichtbeschränkende Beispiele für erfindungsgemäß geeignete, reaktive funktionelle Gruppen sind insbesondere Gruppen oder Gruppierungen, die eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Hydroxygruppe und/oder eine Thiogruppe umfassen oder darstellen, gegebenenfalls in protonierter oder deprotonierter Form.
Besonders bevorzugt ist die plasmachemisch durchgeführte Amino-, Hydroxy- und/oder Carboxylmodifizierung chemisch inerter Oberflächen, insbesondere chemisch inerter Oberflächen aus Polytetrafluorethylen (z. B. Teflon®-Membran) oder PVC. Diese Methode ist dem Fachmann an sich geläufig.
Die Besonderheit der plasmachemischen Aktivierung in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche selektiv nur an der Oberfläche erfolgt. Mit anderen Worten bleiben bei der Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bulk-Eigenschaften der ursprünglich chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten, so z. B. Hydrophobie- oder Hydrophilieeigenschaften, Permeabilitäten, Mikroporositäten, mechanische Eigenschaften wie Härte, Sprödigkeit etc. Dem Verfahrensschritt (a) schließt sich dann in Verfahrensschritt (b) die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche an, wobei dies durch Anbindung oder Ankopplung der Biomoleküle über die in Schritt (a) reaktiven funktioneilen Gruppen erfolgt. Dabei können die Biomoleküle unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden werden oder aber mittelbar, z. B. über geeignete Linker oder Linkermoleküle. Methoden hierfür sind dem Fachmann an sich geläufig.
Unter einem "Linker" - synonym auch als "Linkermolekül" bezeichnet - versteht man erfindungsgemäß ein Molekül oder einen Molekülteil, welches oder welcher zum Verknüpfen von Fragmenten und/oder anderen Molekülen dient (hier: Verknüpfung bzw. Verbinden von plasmachemisch aktivierten bzw. modifizierten, chemisch inerten Trägeroberflächen mit Biomolekülen, insbesondere Enzymen).
Vor der Anbindung bzw. Ankopplung des Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Enzyms, an die plasmachemisch aktivierte bzw. modifizierte Trägeroberfläche kann gegebenenfalls eine Überführung des Biomoleküls in einen aktivierten bzw. anbindungsfähigen Zustand empfehlenswert sein. Methoden hierzu sind dem Fachmann an sich ohne weiteres geläufig. Alternativ hierzu oder aber gleichzeitig hiermit kann gegebenenfalls auch eine Aktivierung der in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens an der Trägeroberfläche fixierten, reaktiven funktionellen Gruppe(n) empfehlenswert sein, beispielsweise durch Protonierung, Deprotonierung etc., abhängig von der chemischen Natur der funktionellen Gruppe(n). Derartige Methoden sind dem Fachmann an sich bekannt.
Nach dem erfindungemäßen Verfahren können also die Biomoleküle mittels kovalenter und/oder ionischer Bindung, vorzugsweise kovalenter Bindung, über die in Schritt (a) angebrachte(n), reaktive(n) funktionelle(n) Gruppe(n) unmittelbar oder mittelbar an eine plasmachemisch aktivierte, chemisch inerte Trägeroberfläche angebunden werden. Hierdurch wird eine Immobilisierung des Biomoleküls, insbesondere Enzyms, bewirkt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich grundsätzlich alle Arten von Biomolekülen, insbesondere alle Arten von Enzymen, immobilisieren. Wenn das zu immobilisierende Biomolekül ein Enzym ist, kann dieses beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen (z. B. Esterasen wie Lipasen), Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen und Kombinationen untereinander.
Dem Verfahrensschritt (b) kann sich gegebenenfalls ein Verfahrensschritt (c) anschließen, der eine Quervernetzung der in Verfahrensschritt (b) angekoppelten Enzyme umfaßt. Hierbei werden im allgemeinen quervernetzende, dem Fachmann an sich geläufige Reagenzien (z. B. Glutard ialdehyd) eingesetzt, um die Enzyme zu binden.
Fig. 1 zeigt schematisch den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahrensschritten (a) und (b). Zunächst erfolgt die in Verfahrensschritt (a) durchgeführte Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche 1 durch Modifizierung der Trägeroberfläche 1 mit plasmachemischen Methoden, wobei Fig. 1 eine Ausführungsform zeigt, gemäß welcher - ausgehend von einem Ausgangsmolekül 2 - eine geeignete, gegenüber dem anzubindenden Biomolekül reaktive funktionelle Gruppe 2' (z. B eine Aminogruppe) direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche 1 angebracht wird. Wie in der Ausführungsform gemäß Fig. 1 dargestellt, schließt sich dann im Verfahrensschritt (b) die unmittelbare Ankopplung bzw. Anbindung des zu immobilisierenden Biomoleküls 3 an die in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche 1 an, wobei auf diese Weise eine Immobilisierung des Biomoleküls 3 bewirkt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Biomoleküle, insbesondere Enzyme, an chemisch inerte Oberflächen anzubinden und auf diese Weise zu immobilisieren, wobei hierdurch das Biomolekül, insbesondere das Enzym, in seiner Reaktivität nicht bzw. im wesentlichen nicht beschränkt wird. Durch die Immobilisierung sind die Biomoleküle, insbesondere Enzyme, wiederverwendbar. Nach der Verwendung können die Enzyme leicht wieder abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich insbesondere in hoher lokaler Konzentration und beispielsweise in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Biomoleküle, insbesondere Enzyme, bleiben bei der erfindungsgemäßen Immobilisierung erhalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren, immobilisierten und gegebenenfalls quervernetzten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme. Hierbei sind die immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt, wobei die Anbindung oder Ankopplung des Biomoleküls über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt ist, beispielsweise unmittelbar über ionische und/oder kovalente Bindungen oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker mit biomolekül- bzw. enzymreaktiven funktionellen Gruppen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, können beispielsweise in Biosensoren oder Bioreaktoren Verwendung finden. Des weiteren ist auch ihre Verwendung in chromatographischen Systemen, insbesondere chromatographischen Säulen, möglich, entweder zu präparativen Zwecken bzw. Synthesezwecken oder aber auch zu analytischen Zwecken.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Biosensoren, Bioreaktoren und chromatographische Systeme, welche die erfindungsgemäß erhältlichen, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, umfassen.
Wie zuvor beschrieben, können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, auch in Biosensoren Verwendung finden. Unter "Biosensoren" versteht man erfindungsgemäß Meßfühler mit einer bioaktiven Komponente, basierend auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifisch Analyte erkennen, mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal (z. B. Sauerstoff konzentration, pH-Wert, Farbstoff etc.) in elektrische Meßsignale umformen.
Fig. 2 zeigt den typischen Aufbau eines Biosensors zur spezifischen Erkennung eines Analyten 1 , wobei der Biosensor einen Rezeptor 2 und einen Transduktor 3 umfaßt, der das vom Rezeptor 2 erzeugte biologische Signal in ein elektronisches Signal 4 umwandelt, welches an eine Elektronik 5 weitergeleitet wird.
Zur spezifischen Erkennung können verschiedene Biomoleküle verwendet werden, insbesondere Enzyme. Als Transduktoren können eingesetzt werden potentiometrische Sensoren, amperometrische Elektroden, piezoelektrische Sensoren, Thermistoren oder optoelektronische Sensoren. Aufgrund der Reaktion oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor unterscheidet man insbesondere zwei Grundtypen von Biosensoren, nämlich einerseits Bioaffinitätssensoren, die bei der Komplex-Bildung eintretende Veränderung der Elektronendichte ausnutzen, und andererseits Metabolismussensoren, die auf der spezifischen Erkennung und Umsetzung von Substraten beruhen.
Biosensoren finden - insbesondere in Form von Enzym-Elektroden - im Gesundheitswesen, zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse, in der Lebensmittelindustrie oder im Umweltschutz Verwendung. Mit Biosensoren können unterschiedlichste Systeme analysiert werden z. B. Glucose, Galactose, Lactose, Ethanol, Milchsäure oder Harnsäure.
Bei der Verwendung der immobilisierten Enzyme in herkömmlichen Biosensoren werden die Enzymmoleküle entweder in polymere Matrizes (wie z. B. PVC, Gele, Graphite oder Zeolithe) bzw. zwischen Folien (z. B. Celluloseacetat) eingebracht. Das erfindungsgemäße Konzept besteht dagegen darin, daß bei Sensoren, die beispielsweise auf der enzymatischen Erzeugung oder dem Verbrauch von
Sauerstoff basieren und eine chemisch inerte Membran (z. B. eine Teflon - Membran) besitzen, diese genutzt wird, um Enzyme nach dem erfindungsgemäßen Verfahren anzubinden; wie zuvor beschrieben müssen hierzu geeignete, biomolekül- bzw. enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden werden, so z. B. Amino- oder Carboxylgruppen, wobei die Anbringung dieser Gruppen in einem Plasmabeschichtungsverfahren erfolgen kann. Gegebenenfalls können anschließend quervernetzende Reagenzien eingesetzt werden, um die immobilisierten Enzyme zu binden. Beispiele für geeignete erfindungsgemäße Biosensor-Systeme sind z. B. die Katalase und/oder Glucoseoxidase, bei denen nach Ankopplung des jeweiligen Enzyms an eine geeignete funktionelle Gruppe, die an eine chemisch inerte Oberfläche gebunden ist, eine Quervernetzung mit Glutardialdehyd durchgeführt werden kann (z. B. 5 % in Puffer, pH-Wert = 7 und 20 mg Katalase (Firma Merck) bzw. Glucoseoxidase (Firma Merck) auf 500 μl Lösung). Weitere Ausführungsbeispiele sehen die Bindung von 1.000 bis 100.000 U (Units) Katalase bzw. 10 bis 100 U Glucoseoxidase mit dem bifunktionellen Glutardialdehyd auf aminisierten PTFE-Membranen bei einem Membrandurchmesser von 1 bis 10 mm, vorzugsweise 8 mm, vor, jedoch stellen die angegebenen Bereiche keine Beschränkungen dar, sondern haben sich vielmehr nach den Applikationsarten unter Berücksichtigung des gewünschten, zu messenden Konzentrationsbereichs des Analyten auszurichten. Die Standzeit solcher 02-sensitiv-enzymatischer Sensoren beträgt circa 2 Monate.
Die erfindungsgemäßen Biosensoren ermöglichen beispielsweise die Herstellung von Mikroelektroden(arrays) für kleine Volumina und hohen Probendurchsatz (z. B. für die kombinatorische Anwendung).
Es wurde bereits auf die kombinierte Immobilisierung der beiden Enzyme Katalase und Glucoseoxidase hingewiesen. Dies ist dann von analytisch relevanter Bedeutung, wenn es z. B. um die kontinuierliche Meßwertüberwachung von Glucose in sauerstoffarmen oder gar sauerstofffreien Medien geht. Darüber hinaus gestattet das im folgenden beschriebene Verfahren eine Meßbereichserweiterung. Da beim Substratumsatz der Glucoseoxidase (GOD) aber Sauerstoff ein wichtiger Reaktant ist,
ß-D-Glucose + 02 + H20 GQP H202 + Glucosesäure
liegt die Lösung des Problems in der gleichzeitigen Heranführung von chemisch gebundenem Sauerstoff, der für den Substratumsatz der ß-D-Glucose durch GOD dann innerhalb der Enzymmembran noch freigesetzt werden muß. Das kann in besonders eleganter Weise auf der Basis einer Bienzymmembran erfolgen, indem z. B. erfindungsgemäß auf einer aminisierten PTFE-Membran außer Glucoseoxidase zusätzlich Katalase mit Glutardialdehyd kovalent gebunden und quervernetzt vorliegt. Die beiden Enzyme können in gemischter Form, aber auch schichtweise immobilisiert werden. Die schichtweise Immobilisierung kann wiederum in zwei oder mehreren Schichten vorgenommen werden. Die Reihenfolge der Enzymschichten kann, muß aber nicht applikationsorientiert von Bedeutung sein.
Wenn nun in einem 02-sensitiv-enzymatischen Durchflußsensor mit der beschriebenen Bienzymmembran in ihrer erfindungsgemäßen Ausgestaltungsform neben ß-D-Glucose, die bei eingestelltem Mutarotationsgleichgewicht mit der - Form im Gleichgewicht steht, gleichzeitig chemisch gebundener Sauerstoff in Form von H2O2 anflutet, wird Katalase gemäß der Reaktionsgleichung
2 H202 Katal se 02 + 2 H20
Sauerstoff aus Wasserstoffperoxid für den Substratumsatz der Glucoseoxidase zur Verfügung stellen. Da es sich einerseits um 02-sensitiv-enzymatische Membranelektroden handelt und andererseits Sauerstoff einer der Reaktanden der Glucoseoxidase ist, sollte das Wasserstoffperoxidangebot in konstanter Konzentration erfolgen. Für den Fall eines sauerstoffhaltigen Meßmediums ist darüber hinaus vorzusehen, daß ebenfalls der Anteil des physikalisch gelösten Sauerstoffs in konstanter Konzentration den Sensor erreicht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einer besonderen Ausführungsform ist somit ein Biosensor, insbesondere zur Messung von Glucose, vorzugsweise ß-D-Glucose, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixiertes peroxidsensibles Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Katalase, umfaßt.
Nach einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Biosensor ein Peroxidsensor bzw. ein biochemischer Peroxidsensor. Hierunter versteht man erfindungsgemäß einen Biosensor bzw. ein Meßelement, welches qualitativ oder quantitativ auf die Anwesenheit oder Konzentration von anorganischen oder organischen Peroxiden (z. B. Wasserstoffperoxid, gelöste Peroxide aus anorganischen oder organischen Salzen, organische Persäuren etc.) reagiert bzw. sensitiv ist. Ein solcher (biochemischer) Peroxidsensor enthält - quasi als Wirkkomponente - Moleküle, welche die Anwesenheit von Peroxiden indizieren bzw. mit Peroxiden reagieren. Hierbei kann es sich beispielsweise um Moleküle, insbesondere wasserstoffperoxidsensitive Enzyme, handeln, die durch das Anbinden an eine aktivierte, chemische inerte Trägeroberfläche angebunden sind, ohne daß sich hierdurch ihre Reaktivität grundlegend ändert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen biochemischen Peroxidsensor um einen Biosensor zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von organischen oder anorganischen Peroxiden, insbesondere von Wasserstoffperoxid, von gelösten Peroxiden aus anorganischen oder organischen Salzen und/oder von organischen Persäuren, wobei der biochemische Peroxidsensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten bzw. funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, insbesondere
Polytetrafluorethylen (z. B. Tefion®-Membran), fixiertes bzw. angebundenes peroxidsensitives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Katalase, umfaßt. Mit anderen Worten können auf dem Träger ein oder mehrere Biomoleküle bzw. Enzyme - unmittelbar oder aber mittelbar über Linker - fixiert bzw. angebracht sein, die sich in ihrer Wirkung gegenseitig ergänzen: Das eigentlich mit Wasserstoffperoxid reagierende Enzym kann beispielsweise eine Katalase sein. Derartige Enzyme sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von der Merck KGaA in Deutschland. Die an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebundenen Biomoleküle bzw. Enzyme können anschließend noch quervernetzt werden, beispielsweise mit Glutardialdehyd. Die Fixierung oder Anbindung der Biomoleküle bzw. Enzyme an die Oberfläche erfolgt mittels geeigneter, reaktiver funktioneller Gruppen, die zuvor durch an sich bekannte plasmachemische Methoden auf die Trägeroberfläche aufgebracht worden sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hiervon besteht die Trägeroberfläche aus plasmachemisch oberflächlich modifiziertem
Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder weist eine Beschichtung hiervon auf (z. B. ein mit Polytetrafluorethylen bedampftes Metall wie beispielsweise Platin), wobei die
Oberfläche der Teflon®-Schicht wie vorstehend beschrieben modifiziert und hieran das oder die Enzyme fixiert sind. Die oberflächliche Modifizierung des Teflons besteht vorzugsweise darin, daß man plasmachemisch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino- oder Carboxylgruppen, auf der Trägeroberfläche erzeugt bzw. anbringt und hieran anschließend das oder die Enzyme anbindet und dann gegebenenfalls quervernetzt.
Im erfindungsgemäßen biochemischen Peroxidsensor liefert die Einheit aus Biomolekül(en), insbesondere Enzym(en), und Trägeroberfläche ein vorzugsweise elektrisches Signal, aufgrund dessen auf die Anwesenheit und/oder Konzentration von Peroxiden geschlossen werden kann (z. B. anhand einer zuvor erstellten Kalibrierkurve).
Der erfindungsgemäße biochemische Peroxidsensor ermöglicht also die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Peroxiden in freier oder in gebundener Form, beispielsweise in Form von freiem Wasserstoffperoxid, in Form von Persäuren, in Form von Perboraten oder in Form von löslichen Peroxiden. In allen diesen Fällen steht eine bestimmte Konzentration der Perverbindung mit einer bestimmten Konzentration von Wasserstoffperoxid im Gleichgewicht, die durch den erfindungsgemäßen Peroxidsensor bestimmt werden kann. Beispielsweise kann durch entsprechende Kalibrierkurven die Höhe des elektrischen Signals des erfindungsgemäßen Peroxidsensors mit der Konzentration der jeweils vorliegenden Perverbindung korreliert werden. Möchte man die Konzentration von Wasserstoffperoxid in freier oder gebundener Form bestimmen, puffert man die Meßlösung vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 8 ab.
Mit dem erfindungsgemäßen Peroxidsensor lassen sich indirekt auch die Anwesenheit oder Konzentrationen von Molekülen bestimmen, die mit den Peroxiden reagieren bzw. einen Peroxidverbrauch bewirken (z. B. Nitrit oder Hydroxylamin). Hierfür nutzt man die Reaktion der peroxidverbrauchenden Moleküle mit den Peroxiden (z. B. Wasserstoffperoxid) oder die Konkurrenzreaktion des Peroxidsensors hiermit aus. Demnach kann man beispielsweise eine bekannte Menge Wasserstoffperoxid zu der Lösung der peroxidverbrauchenden Moleküle geben, die Höhe des elektrischen Signals des biochemischen Peroxidsensors messen, mit der theoretisch zu erwartenden Höhe (z. B. aufgrund von Kalibrierung) vergleichen und aus der Differenz die Konzentration der peroxidverbrauchenden Moleküle ableiten.
Der erfindungsgemäße Peroxidsensor eignet sich beispielsweise zur Prozeßüberwachung, -kontrolle oder -Steuerung (z. B. bei der Phosphatierung).
Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Biosensoren besteht also die Möglichkeit, mindestens zwei verschiedene Arten von Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, miteinander zu kombinieren, d. h. insbesondere sogenannte Enzymketten oder Enzymabbauketten einzusetzen. Dabei können die verschiedenen Enzyme entweder in einem Reaktionssystem (z. B. in einer Meßzelle) vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Meßzellen). Gegebenenfalls kann jedoch auch ein parallel angeordneter Multimeßkettenaufbau vorteilhaft sein (z. B. für Differenzmessungen). Auf diese Weise gelingt beispielsweise die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere Enzyme (oder Enzymketten) in einer Meßzelle oder in Meßsystemen. Diesbezüglich kann Bezug genommen werden auf die Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 101 18 554.5, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Wie zuvor beschrieben, können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, auch in Bioreaktoren Verwendung finden.
Unter "Bioreaktoren" versteht man erfindungsgemäß das physikalische Behältnis, in dem biologische Stoffumwandlungen insbesondere mit Biomolekülen wie Enzymen durchgeführt werden.
Dabei kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu angewandt werden, um beispielsweise eine Modifizierung der Wand ungsoberf lachen von Bioreaktoren zu erreichen. Dabei kann es sich um beliebige Arten von Bioreaktoren handeln, so z. B. um Reaktoren mit planaren Oberflächen wie auch um röhrenförmige Reaktoren. Beispiele hierfür sind mit Polytetrafluorethylen beschichtete Enzymreaktoren, an deren Wandungen das Enzym nach der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Vorbehandlung angebunden ist, so daß eine effizientere Generation von Reaktoren verwirklicht werden kann, bei denen keine Abtrennung der Enzyme von der Reaktionslösung erforderlich ist. Erfindungsgemäß geeignete Reaktoroberflächen können beispielsweise aus Metall bestehen oder mit allen gängigen Polymeren, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, beschichtet sein (z. B. Teflon® oder PVC) oder eine Kombination dieser Materialien aufweisen.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Bioreaktoren besteht nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch die Möglichkeit, insbesondere im Fall von Festbettreaktoren, das immobilisierte Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatische System, an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut anzubinden.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Bioreaktoren, insbesondere zur Modifizierung der Wandungsoberfläche oder bei der Anbindung des Enzyms an das Trägermaterial bzw. Schüttgut, besteht die Möglichkeit, mindestens zwei verschiedene Arten von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, miteinander zu kombinieren, d. h. sogenannte Biomolekül- bzw. Enzymketten oder Biomolekül- bzw. Enzymabbauketten einzusetzen. Dabei können die verschiedenen Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, entweder in einer einzigen Reaktionszone oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Reaktionszonen). Auf diese Weise werden beispielsweise mehrstufige, enzymatisch katalysierte Synthesen und Prozesse ermöglicht.
Fig. 3 zeigt beispielhaft und schematisch verschiedene Arten von Bioreaktoren des Standes der Technik:
Fig. 3A zeigt einen Rührkessel-Reaktor, bei denen der Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einheiten erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom und M die mechanische Antriebsvorrichtung (z. B. Motor). Wegen ihrer Vielseitigkeit werden Rührkessel-Reaktoren am häufigsten eingesetzt.
Fig. 3B zeigt einen Blasensäulen-Reaktor, bei dem die Durchmischung durch Zufuhr von Luft oder eines anderen Gases erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 3C zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit innerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom. Fig. 3D zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit äußerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Die zuvor beschriebenen Bioreaktor-Typen des Standes der Technik können erfindungsgemäß modifiziert werden, beispielsweise durch zur Modifizierung der Wandungsoberfläche (z. B. durch erfindungsgemäße Ankopplung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an die chemisch inerte Reaktorwandungen) oder im Fall von Festbett-Bioreaktoren durch Anbindung der Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, an das Trägermaterial bzw. Schüttgut.
Die Fig. 4 zeigt exemplarisch und schematisch einige Ausführungsformen von Bioreaktoren nach der vorliegenden Erfindung:
Fig. 4A zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A modifiziert sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 4B zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A und eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ B modifiziert sind, welche in unterschiedlichen, aufeinanderfolgenden Reaktionszonen angeordnet sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 4C zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A und eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ B modifiziert sind, welche innerhalb einer einzigen Reaktionszone angeordnet sind.
Fig. 4D zeigt einen Bioreaktor in Form eines Festbettreaktors, an dessen Trägermaterial oder Schüttgut immobilisierte Biomoleküle, insbesondere Enzyme, vom Typ A und vom Typ B angekoppelt sind, welche innerhalb einer Reaktionszone angeordnet sind.
Es sind noch zahlreiche andere Varianten zur erfindungsgemäßen Modifizierung von Bioreaktoren, insbesondere Bioreaktorwandungsoberflächen und/oder Bioreaktorschüttgut und dergleichen, möglich, die der Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres in Betracht ziehen wird, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, die erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, in chromatographischen Systemen, insbesondere in chromatographischen Säulen, einzusetzen. Dies kann zu präparativen bzw. synthetischen Zwecken geschehen (z. B. Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen auf einer chromatographischen Säule) oder aber auch zu analytischen Zwecken (z. B. bei der analytischen Säulenchromatographie).
Der Einsatz der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, in Biosensoren, Bioreaktoren und chromatographischen Systemen hat den Vorteil, daß einerseits die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, durch die Immobilisierung wiederverwendet werden können und andererseits nach ihrer Verwendung eine leichte Abtrennung möglich ist (z. B. nach erfolgter Synthese im Bioreaktor, beispielsweise durch Ablassen der Reaktionsmischung). Auf diese Weise lassen sich die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, effizient und kostengünstig in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Enzyme gehen durch die erfindungsgemäße Immobilisierung jedoch nicht verloren.
Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es unter anderem, das chemisch inerte Oberflächenmaterial (z. B. Teflon®) als Diffusionsbarriere - im Plasma - aufzusputtern und danach die funktionellen Gruppen bzw. für alleinige Reaktoranwendungen direkt z. B. die Amino- oder Carboxylgruppen aufzubringen, an welche dann die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, angekoppelt werden können.
Weitere Ausgestaltungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Patentschrift ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen.
Ausführungsbeispiele
Herstellung erfindungsgemäßer bioelektrochemischer Peroxid- und Glucosesensoren
Eine chemisch inerte Trägeroberfläche, im vorliegenden Fall eine PTFE-Membran
(Teflon®-Membran), wird zunächst im reaktiven Hochfrequenzplasma unter an sich bekannten Bedingungen funktionalisiert. Hierbei werden geeignete, enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden, insbesondere Amino- und/oder Carboxylgruppen.
Nach Ausstanzen von im Durchmesser 13 mm großen aminisierten PTFE- Membranen werden diese auf einen Acrylglasring mittels O-Ring so aufgespannt, daß eine plane Fläche von 8 mm im Durchmesser vorliegt, so daß an deren Meßlösungsseite die kovalente Bindung und Quervernetzung der Enzyme erfolgen kann, z. B. applikationsorientiert (Meßbereich):
für verschiedene H202-Sensoren: 1.000 bis 100.000 U Katalase/
Membran
für verschiedene Glucose-Sensoren: 10 bis 100 U Glucoseoxidase/
Membran.
Detektorseitig wird die Kavität des Acrylglasringes mit einem Innenelektrolyt beschickt zwecks Verbindung Meßkathode aus Pt und Ag/AgCI-Referenzanode.
Nach Aufschieben des Acrylglasringes mit Membransystem auf eine 02-Elektrode und Arretierung in einer Durchflußkammer resultieren erfindungsgemäße bioelektrochemische Sensoren, wie sie zuvor in der allgemeinen Beschreibung definiert worden sind. Die Standzeit derartiger Sensoren beträgt circa zwei Monate. Die erfindungsgemäßen Glucose-Sensoren messen strenggenommen ß-D- Glucose. Da aber ß- und α-Form der Glucose nach Einstellung des Mutarotationsgleichgewichtes in einem konstanten Verhältnis vorliegen, kann im vorliegenden Fall von Glucose-Sensoren gesprochen werden, da der Kalibriervorgang ebenfalls diese Gegebenheiten berücksichtigt.
Beispielsweise wurden die folgenden erfindungsgemäßen Biosensoren hergestellt:
1. Glucose-Sensor mit Labor-Code 2.) SBC-1320-ß-D-Glucose-HDKS-Nr. 1 :
40 U Glucoseoxidase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an carboxylierte PTFE-Membran eines 02-Detektors.
2. Glucose-Sensor mit Labor-Code 3.) SBC-1321-ß-D-Glucose-HDKS-Nr. 1 :
40 U Glucoseoxidase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an aminisierte PTFE Membran eines 02-Detektors.
3. Wasserstoffperoxid-Sensor mit Labor-Code 5.) SBC-1323-H202-HDKS1-Nr. 1 : 26.000 U Katalase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an aminisierte PTFE-Membran eines 02-Detektors.
Bei dem Glucose-Sensor mit Labor-Code 3.) SBC-1321-ß-D-Glucose-HDKS-Nr. 1 handelt es sich um ein auf einer aminisierten PTFE-Membran basierendes Membransystem mit kovalent durch Glutardialdehyd gebundener GOD, wobei die Aminisierung der PTFE-Membran und die anschließende Immobilisierung der GOD nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wurde. Dieses Membransystem wurde in eine amperometrische Durchflußzelle mit Pt- Meßkathode und Ag/AgCI-Referenzanode integriert: Es entstand ein 02-sensitiv- enzymatischer ß-D-Glucose-Sensor für Durchflußmessungen. Das erfindungsgemäße Sensorsystem wurde in einem Dauerversuch getestet. Hierzu wurde eine Dauerperfusion des erfindungsgemäßen Sensors mit einem Phosphatpuffer (pH-Wert von 7,04 bei 25 °C) durchgeführt. Innerhalb dieses Zeitraums wurden etwa 100 1 dieses Puffers durch das Meßsystem gepumpt. Abschließend wurden nochmals Glucosemessungen mit dem Phosphatpuffer als Lösungsmittel für den Analyten zum Nachweis der Funktionsfähigkeit des Membransystems durchgeführt (Pumpe: Permax 12/6 bei 20 Digits mit Silikonschlauch 1 ,9 x 4,5 mm). Trotz einjähriger Dauerperfusion des erfindungsgemäßen Sensors mit Phosphatpuffer (HPL) bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C kann die enzymatische Aktivität des Membransystems selbst nach einem Jahr noch als hinreichend bezeichnet werden.
Des weiteren wurden Biosensoren hergestellt, die Glucoseoxidase und Katalase enthalten. Solche Biosensoren können beispielsweise verwendet werden für die kontinuierliche Meßwertüberwachung von Glucose in sauerstoffarmen oder gar sauerstofffreien Medien. Darüber hinaus gestattet dies eine Meßbereichserweiterung. Im folgenden sind die Konzentrationen an zu immobilisierenden Units (U) von Katalase bzw. Glucoseoxidase für solche Biosensoren angegebenen. Die beiden zuvor genannten Enzyme können uneingeschränkt auch gleichzeitig im Membransystem in immobilisierter Weise vorliegen. Dies wird anhand von drei Beispielen unter Angabe der Membranzusammensetzung konkretisiert, wobei wiederum die kovalente Bindung und Vernetzung der beiden Enzyme auf einer aminisierten PTFE-Membran durch Glutardialdehyd erfolgt:
Katalase Glucoseoxidase
2,6 x 10 U 40 U
5,2 x 104 U 80 U
7,8 x 104 U 120 U
Bei den erfindungsgemäßen bioelektrochemischen Durchflußsensoren kann das Meßmedium mit nachgeschalteter Rollenpumpe angesaugt werden.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch deren Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte Trägeroberfläche, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
(a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden; anschließend
(b) Anbindung mindestens eines zu immobilisierenden Biomoleküls, gegebenenfalls nach seiner Überführung in einen aktivierten, anbindungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) eine Funktionalisierung der chemisch inerten Trägeroberfläche umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber den anzubindenden Biomolekülen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive funktionelle Gruppe eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbesondere protonierter oder deprotonierter Form, umfaßt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) selektiv nur an der Oberfläche erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) die Bulk- Eigenschaften der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch inerte Trägeroberfläche Edelmetalle wie insbesondere Platin sowie deren Legierungen, Edelstahl oder polyhalogenierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte polymere Kohlenwasserstoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Polyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Materialien umfaßt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche durch Anbindung oder Ankopplung der Biomoleküle über die in Schritt (a) reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Biomoleküle unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden werden oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomoleküle mittels kovalenter und/oder ionischer Bindung, vorzugsweise kovalenter Bindung, über die reaktive(n) funktionelle(n) Gruppe(n) unmittelbar oder mittelbar an die Trägeroberfläche angebunden werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu immobilisierende Biomolekül ein Enzym ist und insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen wie insbesondere Esterasen wie Lipasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich dem Verfahrensschritt (b) ein Verfahrensschritt (c) anschließen kann, der eine Quervernetzung der in Verfahrensschritt (b) angebundenen oder angekoppelten Biomoleküle umfaßt, wobei die Verfahrensschritte (b) und (c) gegebenenfalls auch zusammengefaßt, insbesondere gleichzeitig durchgeführt werden können.
14. Immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatisches System, erhältlich nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13.
15. Immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatisches System, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt ist, wobei die Anbindung oder Ankopplung des Biomoleküls über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt ist.
16. Verwendung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Systems, nach Anspruch 14 oder 15 in Bioreaktoren oder Biosensoren.
17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Modifizierung der Wandungsoberflächen von Bioreaktoren.
18. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das immobilisierte Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatische System, an das Trägermaterial oder Schüttgut eines Bioreaktors angebunden ist.
19. Verwendung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Systems, nach Anspruch 14 oder 15 in chromatographischen Systemen, insbesondere chromatographischen Säulen.
20. Verwendung nach Anspruch 19 zu analytischen oder präparativ-synthetischen Zwecken.
21. Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographische Systeme, enthaltend ein immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatisches System, nach Anspruch 14 oder 15.
22. Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Peroxiden, insbesondere anorganischen und/oder organischen Peroxiden wie Wasserstoffperoxid, gelösten Peroxiden aus anorganischen oder organischen Salzen und/oder organischen Persäuren, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixiertes peroxidsensitives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Katalase, umfaßt.
23. Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Glucose, insbesondere ß-D-Glucose, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixiertes peroxidsensitives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Katalase, umfaßt.
24. Biosensor nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebundenen Biomoleküle, insbesondere Enzyme, zusätzlich quervernetzt sind, insbesondere mit Glutardialdehyd.
25. Biosensor nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Biosensor die Einheit aus Biomolekül(en), insbesondere Enzym(en), und Trägeroberfläche ein vorzugsweise elektrisches Signal liefert, insbesondere wobei aufgrund des Signals auf die Anwesenheit und/oder Konzentration von Peroxiden bzw. Glucose, insbesondere ß-D- Glucose, geschlossen werden kann.
26. Biosensoren, insbesondere nach einem der Ansprüche 21 bis 25, enthaltend Glucoseoxidase und/oder Katalase jeweils in immobilisierter Form.
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