JP4649680B2 - 酵素固定化マイクロリアクター、及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、酵素固定化されているマイクロリアクターに関するものである。

最近、化学分野、電気機械的分野において、径１０〜１００μｍのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている（非特許文献参照）。
これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。

ところで、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。

他方、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。

例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。
したがって、マイクロリアクターについても触媒反応を効率よく行わせるためのマイクロチャネル構造を組み立てることが、これを実用化するために必要な要件となっている。

従来のマイクロリアクターは、触媒をマイクロチャネルに固定させるまでに、特許文献１に記載のようにマイクロチャネルを刻設後、触媒と結合する特定残基を導入する等の多段階な物理的・化学的処理が必要であり、マイクロリアクターの製造過程が煩雑であった。

「サイエンス（SCIENCE）」，第２８５巻，第８３〜８５ページ 特開２００３−２６０３５１

本発明は、このような事情に鑑み、マイクロリアクターの製造工程を簡略化し、かつ設計的に自由度があり、微量分析を可能にする、屈曲可能なマイクロリアクターを提供することを目的とする。

本発明者らは、従来のガラス、石英等の不活性材料からなるマイクロリアクターは、屈曲性を有しない、壊れやすい等の理由により、当該技術の応用分野が制限されていることを見出し、鋭意研究の結果、屈曲可能な不活性材料に対する酵素の固定化方法を確立し本発明をするに至った。

すなわち、本発明は、（１）、屈曲可能なフッ素樹脂またはシリコンゴムからなる中空状マイクロチャネル内表面に、酵素分子が架橋剤を介して固定化されているマイクロリアクターであって、架橋剤がグルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドであり、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドの混合比がグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド＝１／１００〜１／１であるマイクロリアクターに存する。

また、本発明は、（２）、液体クロマトグラフィーに直接組み込まれて用いられる上記（１）記載のマイクロリアクターに存する。

また、本発明は、（３）、屈曲可能なフッ素樹脂またはシリコンゴムからなる中空状マイクロチャネル内表面に、酵素分子とグルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドからなる架橋剤を、前記グルタルアルデヒド、前記パラホルムアルデヒドの混合比がグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド＝１／１００〜１／１となるように流通し、その内表面に酵素分子を固定化する工程を含むマイクロリアクターの製造方法に存する。
また、本発明は、（４）、マイクロチャネルに酵素分子を固定化するに際し、該固定化反応に先立ってチャネル内を、強酸化剤を用いて洗浄する上記（３）記載のマイクロリアクターの製造方法に存する。

また、本発明は、（５）、上記（１）又は（２）に記載のマイクロリアクターを用いて有機化合物の酵素消化反応、縮合反応あるいは抗原抗体反応のいずれかを行う、酵素固定化マイクロリアクターの使用方法に存する。

本発明によれば、化学的に不活性な表面に酵素を固定化できると同時に、水溶液のみならず含有機溶媒の反応液でも酵素反応を行うことができ、さらには刻設等する必要がなくなりマイクロリアクターの製造工程を簡略化することができる。

マイクロリアクターは、マイクロチャネルリアクターとも呼ばれ、数〜数百μｍの微細流路を有する微小反応器の総称をいう。
本発明においてマイクロチャネルは中空状である必要がある。
中空の形状は、円形が好ましいが、所望ならば楕円形、多角形等でも良い。
また、マイクロチャネルの内径は流通性、反応性の観点から１７０μm以上１ｍｍ未満が好ましく、１７０μm以上５００μm以下がより好ましい。

本発明におけるマイクロリアクターのマイクロチャネルとして用いられる不活性材料は、触媒反応の反応体や溶媒及びその生成物に対し反応性を示さず、屈曲性を有する材料である。

上記の要件を満たす不活性材料であれば公知のものを使用できるが、好適な例としてはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（PFA）、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（FEP）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ETFE）、ポリビニリデンフルオライド（PVDF）、ポリクロロトリフルオロエチレン（PCTFE）等のフッ素樹脂、シリコンゴム、ポリエチルエーテルケトン、ポリエチルイミド、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンなどが挙げられ、有機溶媒への耐性の観点から、フッ素樹脂、シリコンゴムがより好ましく、フッ素樹脂がさらに好ましい。

このマイクロチャネルの外形状は、円筒状が好ましいが、所望ならば楕円筒、多角柱（例えば三角柱、四角柱、五角柱、六角柱など）等のものも用いることができる。
マイクロチャネルに酵素分子を固定化するに際し、所望ならば、該固定化反応に先立ってチャネル内を、例えば濃硫酸と過酸化水素水との混合物のような強酸化剤を用いて洗浄し、汚染物を除去しておくこともできる。

本発明において、触媒能を有する酵素分子は架橋剤を介して、中空形状のマイクロチャネルの内表面に固定化される必要がある。
マイクロチャネルの内表面には、架橋剤により酵素が重合されたことによるフィルムが形成され、これが貼りつくことで酵素が固定化される。
固定化された酵素フィルムは、強酸化剤によって可逆的に除去することが可能であるため、マイクロリアクターを再利用することもできる。
強酸化剤は例えばpiranha溶液（過酸化水素水：濃硫酸 ＝ ３：７（体積比））等を用いることができる。

架橋剤は、経済性、架橋速度、活性保持の観点から、グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドを併用することが好ましいが、ある程度の鎖長をもち、一分子内に２つ以上の結合基（タンパク質中のアミノ酸等に結合できる官能基）を有する化合物、例えばポリエチレングリコールの両端に官能基を結合させた化合物なども用いることができる。

グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドの濃度は、グルタルアルデヒドについては０．２５質量％以上１質量％以下が好ましく、パラホルムアルデヒドについては４質量％以上１６質量％以下が好ましい。
グルタルアルデヒド（GA）、パラホルムアルデヒド（PA）の混合比はGA／PA＝1／１００〜１／１が好ましく、1／７０〜１／４がより好ましく、１／１６〜１／８が更に好ましい。
また、このように中空形状のマイクロチャネルの内表面に固定化できる酵素分子としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等が挙げられる。

本発明の酵素固定化マイクロリアクターは、固定化された酵素分子の種類に応じて、微量での酵素消化反応、縮合反応あるいは抗原抗体反応等に利用することができる。
特に酵素消化反応では、具体的にプロテオミクスのタンパク質同定における前処理である酵素消化で好適に利用できる。

本発明の酵素固定化マイクロリアクター（内積：数μl）によれば、微量サンプルの処理に効果的なだけでなく、処理後のサンプルへの酵素自体の混入を防ぐことも可能である。
酵素固定化マイクロリアクターを、液体クロマトグラフィー等の機器に直接組み込ませることも容易であり、連続的な操作が可能となる。

次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。

<収率測定>
酵素固定化マイクロリアクターに基質溶液を一定流速（１〜１０μｌ／ｍｉｎ）で流入し、マイクロリアクターの先端から流出液を回収した。(３７℃で実施)
その後、液体クロマトグラフィーでサンプル中に含まれる基質の量を解析した。
A：マイクロリアクターに流入前の基質溶液
B：マイクロリアクターに流出後の回収溶液
液体クロマトグラフィーで、Aの基質のピーク面積：aと、Bの基質のピーク面積：bとを比較し、以下の式で収率を計算した。
収率＝{（a−b）／a}×１００

〔実施例１〕
<試薬の調製>
１．アルデヒド溶液の調製
１６質量％のパラホルムアルデヒド水溶液７５０μｌおよび２５質量％のグルタルアルデヒド水溶液３０μｌを０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐH７．５)１５００μｌに混合し、水７２０μｌを添加しアルデヒド溶液を調製した。
２．酵素溶液の調製
キモトリプシン２０ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．５)１０００μｌに溶解し、酵素溶液を調製した。

<酵素の固定化>
アルデヒド溶液および酵素溶液を、二本のdisposable syringe(内積：１ｍｌ)にそれぞれ充填した。
次に図１のように三方コックを用いて、２液を１本のテフロン（米国デュポン社製；登録商標）チューブに流入させた。
その際の条件は、流速１〜５μｌ／ｍｉｎ(２液とも同速度)、４℃、６〜１２時間であった。
その後、未反応の酵素やアルデヒド試薬を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０００μｌで流速１０μｌ／ｍｉｎ、４℃、１００分で洗浄することで、キモトリプシンが固定化されたマイクロリアクターを得た。
保存には、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）でチューブ内を満たすことで行った。

〔実施例２〕
酵素にトリプシンを使用した以外は実施例１と同様の操作を行ったところ、同様にトリプシンが固定化されたマイクロリアクターを得た。

〔実施例３〕
実施例１で得られたキモトリプシン固定化マイクロリアクターを用いて、ペプチドの消化反応を行った。
基質はＮ−Ｇｌｕｔａｒ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（グルタリル フェニルアラニル パラニトロアニリド）を用い、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍＭになるように溶解し基質溶液とした。
この分子にはペプチド結合が一カ所あり、酵素は当該ペプチド部分を切断してＧｌｕｔａｒ−ＰｈｅとｐＮＡの２分子を生じるため、液体クロマトグラフィーにおいて、分解産物は元の基質分子とは異なる部位にピークとして検出できる。
この時の収率は９８％であった。
また、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を充填して７日間保存後に上記と同様の実験を行ったところ収率９６％と高い値を示した。

〔実施例４〕
実施例１で得られたキモトリプシン固定化マイクロリアクターを用いて、タンパク質の消化反応を行った。
基質はミオグロビンを用い、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に７０μｇ／ｍｌになるように溶解したものを基質溶液とした。
基質溶液をキモトリプシン固定化マイクロリアクターに流入し、1０分間反応させた後に流出液を回収、逆相液体クロマトグラフィーによる解析を行ったところ、ミオグロビンが酵素消化された際に生じるペプチドのピークが検出された。
この時の収率は６８％であった。

〔実施例５〕
実施例１で得られたキモトリプシン固定化マイクロリアクター用いて、有機物質の縮合反応を行った。
５０mＭのアセチルフェニルアラニンエチルエステル（Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ）と２００mＭのリジンエチルエステル（Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＥｔ）を２０％のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に混合した後、該混合液をキモトリプシン固定化マイクロリアクターに流入し、1分間反応させた後に流出液を回収、液体クロマトグラフィーによる解析を行ったところ、縮合産物である甘味物質前駆体（Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＥｔ）が得られた。
この時の収率は４４％であった。

本発明の酵素固定化マイクロリアクターは、固定化された酵素分子の種類に応じて、微量での酵素消化反応、縮合反応あるいは抗原抗体反応等に好適に利用することができる。

図１は、マイクロリアクター作成過程を説明する概略図である。

Claims (5)

1. 屈曲可能なフッ素樹脂またはシリコンゴムからなる中空状マイクロチャネル内表面に、酵素分子が架橋剤を介して固定化されているマイクロリアクターであって、
   架橋剤がグルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドであり、
   前記グルタルアルデヒド、前記パラホルムアルデヒドの混合比がグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド＝１／１００〜１／１であることを特徴とするマイクロリアクター。
2. 液体クロマトグラフィーに直接組み込まれて用いられる請求項１記載のマイクロリアクター。
3. 屈曲可能なフッ素樹脂またはシリコンゴムからなる中空状マイクロチャネル内表面に、酵素分子とグルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドからなる架橋剤を、前記グルタルアルデヒド、前記パラホルムアルデヒドの混合比がグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド＝１／１００〜１／１となるように流通し、その内表面に酵素分子を固定化する工程を含むことを特徴とするマイクロリアクターの製造方法。
4. マイクロチャネルに酵素分子を固定化するに際し、該固定化反応に先立ってチャネル内を、強酸化剤を用いて洗浄することを特徴とする請求項３記載のマイクロリアクターの製造方法。
5. 請求項１又は２に記載のマイクロリアクターを用いて有機化合物の酵素消化反応、縮合反応あるいは抗原抗体反応のいずれかを行うことを特徴とする、酵素固定化マイクロリアクターの使用方法。

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