CN1791509A - 检测和分析病原体的方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于实现微流控分析装置的方法和设备。与集成的充气集管相伴随的整体弹性膜件可以设置有和驱动多种流控结构的密集阵列，例如用于隔离、选路、混合、分流和存储流体量的结构。该流控结构可用于实施病原体的监测和分析系统，包括集成式免疫亲和性捕获和分析，例如聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳(CE)分析。将分析物溶液引入并且泵压通过微细加工腔室中的一系列免疫亲和性捕获基质，其中具有靶向各类微生物有机体的抗体，例如细菌、病毒和细菌芽孢的抗体。该免疫亲和性腔室能够捕获、纯化和富集目标物以便进行进一步的分析步骤。

Description

检测和分析病原体的方法和设备

有关政府赞助研究的声明

本发明的技术和机构是在政府支持下，通过美国能源部的DEFG91ER61125号合同，根据NASA许可No.NAG 5-9659，以及NIH许可HG01399和P01 CA 77664而实施的。

发明背景

本发明涉及病原体的检测和分析。在一个实施例中，本发明提供了利用微流控构造实现的样品制备、处理、检测、以及分析的系统。在另一个实施例中，本发明提供了制造用于高通量分析应用的流控元件密集阵列的强大技术。

常规的微流控分析机构具有局限性。一些现有的机构包括单通道分离装置和多通道分离装置。另一些包括集成了一些样品制备和分析措施的分析装置。然而，许多具有流控能力的微流控分析装置对许多化学或生化测定试验不具有化学或物理相容性。而且，由于制作过程、耐用性和/或设计上的限制，许多微流控元件难以制成密集的阵列。许多常规的装置需要持续驱动以维持流控。将采用这种阀的微流控装置从其控制系统中去除之后会失去对装置中流动成分的控制能力。此外，许多微流控分析的技术和机构还缺乏灵敏度、特异性或者定量分析的能力。尤其是，对于系统例如病原体检测器和分析仪的系统来说，常规的微流控分析机构缺乏有效实现样品制备的功能和能力。

因此人们希望能提供改进的方法和设备来实现微流控的控制机构，例如阀、泵、选路器、反应器等等，以便在微流控装置中能够有效地集成样品的引入、制备、处理以及分析的功能。在一个实例中，优选提供具有微细加工效能的微流控装置，其既可以用于实现单通道系统又可以用于实现基于阵列的系统，其中所述系统可用作病原体检测器和分析仪以提供假阳性结果很少、高通量和廉价的连续监测。

发明简述

提供了实现微流控分析装置的方法和设备。与集成的充气集管相伴随的整体弹性膜件可以设置有并驱动多种流控结构(例如用于隔离、选路、混合、分流和存储流体量的结构)的密集阵列。该流控结构可用于实现病原体的监测和分析系统，包括集成式免疫亲和性捕获和分析，例如聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳(CE)分析。将分析物溶液引入并且泵压通过微细加工腔室中的一系列免疫亲和性捕获基质，其中具有靶向各类微生物有机体的抗体，例如细菌、病毒和细菌芽孢的抗体。该免疫亲和性腔室能够捕获、纯化和富集目标物以便进行进一步的分析步骤。

在一种实施方式中，提供了一种病原体检测系统。该系统包括集成在微流控装置上的免疫捕获腔室。该免疫捕获腔室可用于捕获通过微流控通道提供给免疫捕获腔室的目标物。该系通还包括与免疫捕获腔室相伴随的DNA分析机构。该DNA分析机构集成在该微流控装置上。该DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。

在另一种实施方式中，提供了一种位于整体装置上的病原体检测系统。该系统包括集成在整体装置上的多个免疫捕获腔室。该免疫捕获腔室可用于捕获通过微流控通道提供给免疫捕获腔室的目标物。该系统还包括与免疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构。所述多个DNA分析机构集成在该整体装置上。所述多个DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。

在另一种实施方式中，提供了一种用于病原体分析的方法。通过集成在整体装置上的微流控通道将流体分析物提供给多个免疫捕获腔室。与该流体分析物相关的目标物在免疫捕获腔室中被捕获。利用与多个免疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构对目标物进行DNA分析。所述多个DNA分析机构集成在所述整体装置上。

在以下的发明说明和附图中，将更加详细地介绍本发明的这些以及其它的特点和优点，其中通过实例来说明了本发明的原理。

附图简述

结合附图参考以下说明，本发明将更容易理解，其中附图表示了本发明的特殊实施方式。

图1A-1E表示一种适合于实现本发明技术的微流控装置上的机构图示。

图2是描绘一种隔膜泵的图示。

图3是表示一种流控选路器的平面图示。

图4是表示一种混合环路的平面图示。

图5A-5D是表示一种流体储液池的图示。

图6是表示总线阀(bus valve)的图示。

图7是一种病原体检测系统的图示。

图8是描绘免疫亲和性捕获阀机构的图示。

图9是表示免疫亲和性捕获阀机构的图示。

图10A和10B表示免疫亲和性捕获的分析物的捕获和选路的图示。

图11表示可与免疫亲和性捕获构造集成的PCR和CE的图示。

图12是表示联合免疫捕获和PCR腔室的图示。

图13A是一种病原体检测系统的图示。

图13B是表示一种微细加工阶段的图示。

图14是一种病原体检测系统的径向阵列图示。

特殊实施方式详述

现在将详细介绍一些本发明的特殊实施方式，包括发明者认为的实施本发明最佳的实施方式。附图中表示了这些实施方式的例子。尽管本发明是结合这些特殊的实施方式进行说明的，但应当明白这并不意味着本发明仅限于所描述的实施方式。相反，其包括那些落在本发明实质和范围之内的可选择方案、改良方案以及等价方案，如在所附的权利要求中所限定。例如，文中将以玻璃微流控装置来描述本发明的技术方案，尽管也可以采用其它的装置，例如塑料装置。

应当指出的是，适用于玻璃微流控装置的流控构造可以应用于各种微流控装置中。在利用流控构造优点的一种可能的应用中，病原体检测系统就是一个很好的例子。在以下说明中，列出了许多特殊的细节以便提供对本发明的全面理解。本发明可以在不具有部分或全部这些特殊细节的情况下实施。在其它情况下，没有对公知的处理操作进行详细描述以免与本发明发生不必要的混淆。

从最早的单通道隔离装置以来，微流控分析技术领域就发展很快。一些装置含有用于高通量分析的多通道隔离装置和在单个芯片上集成了样品制备和分析功能的分析器。同时结合了多通道分析和集成化样品制备的装置能够减少进行多个测定试验所需的资源和成本量。在基因组学领域可以找到一个例证：在单个装置中集成测序样品的制备、纯化和电泳分析可以使测定时间和成本降低并且提高测定的通量效率和耐用性。在所有情况下，微流控装置中高水平的集成度都需要芯片机构具有耐用性以便分离、选路、混合、分流、和储存大量的流体。

用于硅、玻璃硅、聚合物、和弹性微流控装置中的一些阀技术以有限的方式满足了这些需要。然而，许多这些技术与许多化学或生化测定试验在化学或物理性质上不兼容。而且，对现有的玻璃微流控装置来说，许多技术缺乏耐用表面修饰的各种化学性质。此外，典型地制造单个微流控阀是采用单独的膜件，其通常保持打开。具有通常为打开的阀就需要持续驱动以保持对流动的控制。采用这种阀的微流控装置不能够从控制系统中去掉，否则会失去对装置中流动成分的控制能力。此外，一些典型的装置采用单独设置的乳胶膜件。单独设置的气动乳胶膜件虽然有所发展，但这种制造方法阻碍了大规模集成化为多通道、高通量的分析装置。

另一些微流控装置是利用阳极结合的硅和玻璃晶片制成，并通过压电驱动。然而，由于硅的导电性和化学相容性造成其在分析装置中的应用较复杂。结合或者沉积在硅上的薄膜只能部分地减少其导电性和化学相容性。

人们还试验了弹性装置。然而，弹性材料的疏水性和多孔性使得弹性装置与许多化学和生化测定试验不相容。因此人们希望与弹性体表面的流体接触最小化。复杂的制作、化学相容性、不可靠的流体操控性以及其它的问题造成了现有的流体操控技术不适合于集成到大规模、高通量的芯片式实验室(lab-on-a-chip)装置上。

因此，本发明的技术和机构提供了一种适合于高密度集成到微流控装置上的整体膜件阀结构。还提供了各种基于该整体膜件阀结构的流控构造。

具有整体膜件的微流控装置是特别适合在芯片上实现病原体检测系统的装置的一个实例。根据多种实施方式，病原体检测系统包括免疫捕获和DNA分析机构，例如聚合酶链式反应(PCR)，和毛细管电泳(CE)机构。在一个实施例中，该病原体检测系统可以在具有各种流控构造的玻璃微流控装置上实现。

图1A-1E是可以在玻璃微流控装置上实现的整体膜件阀的图示。图1A为整体膜件阀的顶视图图示。图1B为具有该阀的三层式装置的侧视图图示。图1C为具有该阀的四层式装置的侧视图图示。图1D为三层式装置的一种打开式阀的侧视图图示。图1E为四层式装置的一种打开式阀的侧视图图示。根据图1A和1B中所示的各种实施方式，三层式玻璃微流控装置包括夹在两个玻璃晶片101和105之间的弹性膜件111。在一个实施例中，该弹性膜件为聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜件，购自Bisco Silicons of Elk Grove，IL，254um厚的HT-6135和HT-6240型膜件。也可以采用其它的柔性膜件。弹性膜件111使得晶片之间的结合可逆而牢固。

在结合之前，晶片中蚀刻了流体通道103用于承载流体。类似地蚀刻出集管通道107和阀区域109用以在压力或真空下运送空气或其它工作流体以驱动该阀。典型的是，该充气通道107和109位于一个晶片105上，这里称之为充气晶片，而流体通道蚀刻在第二晶片101上，这里称为流体晶片。这些蚀刻的通道特征可直接与膜件接触并形成混合式玻璃/弹性体通道，如图1B所示。

或者，膜件可位于热接合的全玻璃流体晶片夹层(XY)与充气晶片159之间，如图1C的四层式装置150中所示。具有全玻璃的通道可以让装置受益于玻璃的良好物理和化学性质。任何具有良好物理和化学性质的层被称作化学惰性层。该化学惰性层可用于制造XY。在一个实施例中，构成XY的151和155夹层就由玻璃制成。

四层式装置的例子包括热粘合到连结晶片155上的流体晶片151。小直径的通孔设置在流体通道153中的间断点上。弹性膜件157粘附在该流体/连结晶片夹层XZ的连接晶片155一侧。阀偏流腔室161蚀刻在集管晶片159中并与膜件157粘合，完成了该四层式装置150。这样，流体通道153保持了全玻璃化学上有益的构造，同时可以实现大规模集成化的流控构造。在一些实施方式中，图1C中所示的四层式装置相比较三层式装置具有相当的优点，因为其减小了样品和弹性膜件之间的接触。

根据多种实施方式，整体膜件装置内的各种流控成分是通过向充气晶片上的孔施加压力或真空来驱动的。这里将任何单个的膜件称为整体膜件。具有整体膜件的任何单个装置在此被称为整体装置。用于向与充气晶片相伴随的蚀刻通道施加压力或真空的机构在此被称为气口或充气口。在三层式装置中，充气晶片中的蚀刻通道将驱动真空分散于弹性膜件111的阀区域109内。通过阀区域109处的集管通道施加的真空推动膜件远离通道的间断点，并为流体流动提供了穿过该间断点的路径，从而打开阀，如图1D所示。利用充气压力可开关的阀在此被称为可开关阀或气动开关阀。

施加充气压力包括加压或者施加真空的情况。因而膜件157能够调节附近流体通道中的流体流动，如图1D中所示。在图1D中，通过与充气晶片105相伴随的蚀刻通道向阀区域109施加真空来打开流体通道103。当不再向阀区域109施加真空或者吸力时，膜件111关闭流体通道103，如图1B所示。图1E表示了一种四层式装置。该四层式装置包括通道层151、通道153、连接层155、膜件层157，以及充气层159。如上所述，该四层式装置比三层式装置具有相当的好处，因为其使样品与弹性膜件之间的接触最小化，在一些情况下只在阀区域161处有接触。

应当注意，所示构造可以朝着任何方向。在一些实施例中，阀可以在装置上倒置。充气层可以位于流动层的上方或下方。本发明的技术方案允许朝着各种方向，因为重力并不会对该膜件阀造成不利的影响。

流控构造具有多种优点。例如，整体膜件阀通常为关闭的阀，也就是说该阀即使在装置不与驱动压力源连接时也保持关闭状态。现有的通常为打开式的微流控阀需更持续驱动以保持对装置流动成分的控制能力。而且，不像形状记忆合金的结构，该阀构造的开关温度都是处于环境温度之下，这有利于在水溶液的生物流体情况下工作。

在许多典型的实施方式中，微流控装置之间需要许多接口以便操控各种流控机构。然而，根据本发明的多种实施方式，膜件的多个区域可以通过连接它们的充气控制通道来并行驱动。在一个实施例中，利用单个充气口就可以控制一系列阀。因此，仅使用有限数量的外部接口或充气口就能够控制相当多的阀。这就简化了实现过程并最小化了装置接口的问题。根据各种实施方式，以这种方式控制阀能够对整体膜件进行大量并行的充气驱动，用以操控阀、泵、储液池、选路器、以及装置内的其它流控构造。

膜件阀可用于构成各种流控机构。图2A和2B为采用膜件阀构成的泵的图示。根据图2A和2B中所示的多种实施方式，串联设置的三个阀构成了隔膜泵210。按照五个步骤的循环驱动这些阀就可以实现抽吸过程。图2A表示了一种三层式整体膜件隔膜泵的顶视图。图2B表示了该三层式整体膜件隔膜泵的侧视图。该隔膜泵包括输入阀201、隔膜阀203和输出阀205。应当注意该隔膜泵在两个方向上都可以工作，因而输入阀和输出阀的指定为任意的。该泵包括具有蚀刻的流体通道211的流动层209，整体膜件207，以及集管层213。阀的气密特征使该泵能自动充满并且除了其它气体和流体之外还能够抽吸空气。

根据各种实施方式，抽吸过程可通过一系列阶段来实施。第一步，输出阀205关闭，输入阀201打开。第二步，隔膜阀203打开。第三步，输入阀201关闭。第四步，输出阀205打开。第五步，隔膜阀203关闭，通过打开的输出阀205抽吸分析物流体。

每次循环抽吸的量取决于打开的隔膜阀内所包含的容积，该容积又依次取决于隔膜阀中充气腔室的大小。因此，可以通过调节隔膜阀充气腔室的大小来制造为了测量已知在纳升至微升规格的流体量而设计的泵。该隔膜泵能自动充满并且能够向前抽吸流体或者通过反向运行所述驱动循环过程向后抽吸流体。还应当注意的是，膜件接触玻璃密封表面处的阀所在位置可以蚀刻成具有凸脊或者其它的表面修饰，以控制膜件与玻璃表面的粘着性。

整体阀还可以用于形成选路器、混合器和分流器。应当注意的是，尽管以下构造将通过三层式构造的文字来说明，但该构造也可以用于四层或更多层式的结构。图3为一种选路器300的图示。该选路器包括阀301、303、305和317，充气通道331、333、335、337和339，流体通道321、323、325和327，以及隔膜阀309。该选路器将流体从任一输入口抽吸到任一输出口，其取决于在该抽吸循环过程中在什么部位驱动了哪个输入/输出阀。同时驱动两个或多个输入阀可在输出阀处将几股不同的流体流混合成一股流。相反，同时驱动两个或多个输出阀可在输出阀处将单股流体流分流成几股不同的液流。

例如，为使流体以通道327选路到通道321，阀301和305要保持关闭。然后如上面所述用阀317、309和303做为泵。选路器包括混合和分流流体通道的功能。为将流体从通道325和327混合到通道323，阀303要保持关闭。为将流体从通道321分流到通道323和327，阀301要保持关闭。而在另一个实施例中，为将经通道327引入的流体选路到通道325，阀303和305要保持关闭。打开阀317和301以使流体通过通道327流到通道325。各种设置方式皆有可能。

利用整体阀还可以形成混合环路。在一个实施例中，通过流体在装置的两个区域之间流动可实现混合过程。混合过程可用于实现在芯片上进行的所有类型的操作。图4为一种混合环路400的图示。该混合环路或混合器包括阀401、403和405，流体通道411、413和415，以及充气通道421、423和425。该环路上连接着其它的有阀的通道，向流体提供通向或来自混合器的路径。通过通道413和415可使两种或多种流量的流体进入该混合环路中，并且如上所述，将其抽吸到循环中直到这些流体通过扩散作用而混合。再将该混合物抽吸出该混合环路。混合过程还可以通过使流体在两个储液池之间来回流动而实现。

图5A-5C为储液池500的图示。图5A为具有蚀刻的排液腔室的储液池顶视图。图5B为该储液池的侧视图。图5C为表示注满后的储液池的侧视图。图5D为具有钻孔排液腔室和用于自发填注/分配过程的泵的大容量储液池的侧视图。该储液池包含在充气晶片513上，其中膜件505夹在该充气晶片513与流体晶片511之间。通过通道501储液池可以注满或排空。根据多种实施方式，阀区域503中打开的整体膜件阀起着储液池的作用以用于芯片上流体的储存。充气晶片513中腔室的大小决定了储存在储液池内的流体体积，当施加真空时该储液池填满，施加压力时其排空。

根据多种实施方式，制造用于储存大量流体的储液池时可以用钻孔来代替蚀刻充气腔室，并可直接向该钻孔施加驱动压力或真空。或者，可以将储液池连接到隔膜泵上来制造不具有直接充气连接的储液池。图5D表示了一种连接到泵上的储液池503。该储液池根据抽吸的方向被注满或抽空，其具有可变容积的优点。在一个实施例中，泵例如阀531、533和535可用于对储液池503进行填注或分配流体。

具有一个或多个流体输入口的整体膜件储液池起到芯片反应器的作用。如同储液池一样，该反应器可以利用通过充气集管晶片施加的直接压力或真空来直接引入反应物或排出产物。或者，该反应器可以利用集成的泵、混合器、和/或选路器构造来间接引入反应物或排出产物。根据多种实施方式，由于反应器的容积受到充气晶片中腔室503的尺寸限制，在不大幅改变流体晶片内结构设计的情况下，在装置的任何部位都可以具有任意容积的反应器。而且，根据芯片上涉及不同体积反应物的反应需要，可以部分填注该反应器。

大多数弹性膜件为透气性的，因而这种性质目前被利用以简化所有弹性装置的流体注入过程。

根据多种实施方式，膜件的透气性可消除气泡或着气穴。当向整体膜件反应器或其它流动结构施加驱动真空时，来自于产生气体的反应中的气泡可以被消除。例如，透气性膜件可减少PCR反应物在芯片上的热循环过程中形成的气泡，该气泡会导致反应混合物含量的损耗。

复杂的微流控装置可包括一些与流动总线相连接的独立模块。在一个实施例中，向多个不同的流体通道提供分析物流体很有用处。在另一个实施例中，可将能获得的多种试剂引入微流控装置中。图6是可用于分配分析物流体的总线阀600的图示。该总线阀600包括阀601、603、605和607，其被制成使流体从流体总线通道611选路到流体通道621、623、625和627中。充气通道631、633、635和637分管控制流体分配的阀。典型的总线阀在总线一侧具有死体积。死体积造成难以彻底冲洗流体选路操作之间的总线。根据多种实施方式，本发明的技术提供的总线阀在总线侧的死体积很少或者没有。这使得流体选路操作之间的总线能够被彻底地冲洗，并且防止了在装置操作过程中不同流体之间的混合或交叉污染。

微流控装置机构可以采用各种技术来制造。根据多种实施方式，通道特征被蚀刻进玻璃晶片，例如，利用标准的湿法化学蚀刻技术。玻璃晶片(厚度1.1mm，直径100mm)用硫酸/过氧化氢(piranha)清洗(20∶1)并利用LPCVD炉或溅射系统来涂覆牺牲层(200nm)多晶硅蚀刻掩摸层。将Borofloat玻璃晶片或者Schott D263硅酸硼玻璃晶片用于所述具有三层式或四层式设计的装置。多晶硅沉积之后，用阳性光刻胶旋涂该晶片，温和烘烤并用接触式对准机制成图案。用Microposit显影剂去除光刻胶的紫外线曝光区域。通过在SF6等离子中进行蚀刻去除多晶硅的曝光区域。在HF溶液中(49％的HF用于Borofloat晶片，1∶1∶2的HF∶HCl∶H2O用于D263晶片)以7um/min的速度等向蚀刻晶片，直到达到所需的蚀刻深度。

根据多种实施方式，三层式装置的流体通道晶片蚀刻成20um深，而四层式装置蚀刻成40um深。三层式装置的集管晶片蚀刻70um深，而四层式装置在阀位置钻孔。然后分别用PRS-3000和SF等离子将剩余的光刻胶和多晶硅从晶片上剥去。钻出贯穿流体和集管晶片的通孔并再次用硫酸/过氧化氢清洁该晶片。

在一些实施例中，采用三层式设计的装置的组装是通过将PDMS膜件(254um厚的HT-6135和HT-6240，Bisco Silicones，Elk Grove，IL)加到流体通道晶片中的蚀刻构造上，并且无论集管上钻孔或蚀刻排液腔室是如何朝向的，都直接按压具有阀的集管混合玻璃-PDMS流体通道从阀位置横过PDMS膜。采用四层式设计的装置的组装是通过首先将流体通道晶片热粘合到具有直径为254um的成对钻孔通孔的210um厚的D263连接晶片上，其中该通孔位置对应通道间隙的位置。该流体通道和连接晶片在真空炉(J.M.Ney，Yucaipa，CA)中以570℃加热3.5h而粘合。然后将得到的含有全玻璃通道的两层式结构粘合在PDMS膜和集管晶片上。这样形成的玻璃-PDMS键合是可逆的，但仍然足够牢固以承受施加到该装置上的真空和压力范围。任选地，在组装之前通过在UV臭氧清洁器(Jelight Company Inc.，Irvine，CA)中清洁集管晶片和PDMS膜可获得不可逆的玻璃-PDMS键合。

上述的微流控装置的机构可用于实现各种装置。可以灵活地设置包括阀和泵的构造以提供多通道的芯片式实验室仪器，使其能够在单个装置上集成样品制备和分析步骤。该微流控平台特别适合于用作一个能够实现集成化病原体检测系统的装置。

常规的快速病原体检测系统采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或荧光免疫测定法(FIA)来进行检测。典型地，检测会涉及到分析物特异性抗体的固定、与样品溶液的温育、连接着酶或荧光团的夹心抗体的识别，然后是显色和检测过程。也可以使用免疫荧光检测测定法。然而，每一种测定法都相对具有检测局限性。

采用各种形式的基于PCR的基因检测和类型测定也很普遍，因为其具有高度的特异性和获得量。然而，尽管基于DNA的PCR方法功能强大，但它们对活和死的病原体都呈阳性反应，这就有可能产生假阳性的结果。因而可优选对RNA目标物进行检测，因为其能够很快地降解，也就意味着需要活的目标物才能够被检测出。

人们还提出了多种可选择的检测方法。已开发出质谱分析法通过检测中性脂质体、极性质脂体和芽孢特异性生物标记来检测病原体、芽孢以及其它生物试剂。然而，质谱分析法的速度、通量和便携性并不出色而且其特异性还未得到证实。

对来自于土壤、空气等的芽孢(例如炭疽)的检测是个难题，因为其具有高度的传染性(在10个孢子/L下可在10分钟内达到吸入10000个芽孢的剂量)。大多数先进的检测原理是利用在具有薄膜加热器和集成荧光激发和检测过程的硅制微型反应器中对PCR产物进行实时检测的。该系统后来被扩展到了一种十通道的高级核酸分析仪(ANAA)以及一种便携的形式。该系统的各种形式还被开发用于军事上和邮局中。还开发出了一种具有集成(多微升)样品处理过程的GeneXpert样品制备系统用于进行实时PCR分析。

开发出能够快速实施自动和复杂的前述化学反应并定量病原体浓度和抗生素抗性的便携式分析仪是一个很大的进步。类似地，当需要筛选大量样品或者可能存在的受感染个体时，能够在高通量、多样品筛选应用中快速地检测和测定大量样品的类型并且假阳性率非常低也很有用处。这类自动化临床分析仪的发展也有所进步。在一个实施例中，开发出了大致为普通自动分析仪的微型形式的复杂微流控回路系统用于血液临床分析。还开发出了一种全面集成的分析仪(微升体积规格)，可用于血液样品制备用以在微阵列上进行HIV分析。该系统可进行包括多个核酸步骤的复杂测定，并且采用了＞100nL的死体积充气膜件阀，该阀将在下面作更详细的论述。

已经开发出透明塑料(lucite)微流控管用于控制溶液在六个不同的免疫阵列传感器上流动，该传感器以小型便携式系统的形式控制流体，其具有简单的减压系统从而有利于其免疫测定的性能。所开发的这种形式的系统如，利用集成式流动系统和纤维光学生物传感器毛细管的Raptor便携式分析仪，可在十分钟的操作时间内分析四种不同的试剂。人们已经认识了可寻址阵列的独特性质从而开发出一种集成式的叠层微型实验室，其可以实现自动化电场驱动免疫捕获和DNA杂交阵列分析。例如，随后免疫捕获细菌被释放出用于链置换扩增(SDA)，然后进行扩增志贺样(Shiga like)毒素基因的杂交分析。然而，其不能进行多样品分析也设有研究过检测的局限性。

尽管常规的微细加工是在硅上进行的，但人们已发现对于化学和生化分析来说，玻璃微流控结构呈现出优选的化学和电泳性能，并且塑料结构的范围也在不断扩展。在高通量应用中，本发明的技术具有径向的通道设计，其能够快速并行地分析96至384个片段大小或者平行地进行测序分离。在芯片上直接集成PCR与CE分析并具有DNA酶切和亲和捕获的功能。

根据多种实施方式，本发明的微流控装置机构可以形成复杂的通道构造，其能够制成腔室、阀和CE分析通道的复杂阵列。这些小型的CE通道与交叉注射器一起使用有助于实现十分快速的高分辨率电泳分离。基本上在色谱柱或毛细管中进行的所有操作也都减小到了芯片的形式，所需的样品量随之减少，分析时间和灵敏性得到了提高。

根据多种实施方式，本发明的病原体检测系统具有灵敏性与特异性和定量能力相结合的特征，从而提供了一种特别有用的测定方法。许多病原体在摄入细菌量＞10³时具有感染性，而V.cholera(霍乱病毒)在经口摄入量低于10⁵时都不会引起症状，或者B.anthracis(炭疽杆菌)在量低得多的水平上也被认为具有影响力。识别菌株以便将致病菌株与非致病菌株区分开来，以及鉴定特异性毒素或抗生素抗性基因的存在对于鉴定危险性和确定治疗方法来说也很关键。此外，能够确定细菌的浓度或剂量并且随着所述鉴定结果一起进行定量报告不同于背景技术的激发测定试验，能提供重要激发测定试验结果。

图7为一种病原体检测系统700的一个实施例图示。分析物通过通道701引入到免疫亲和性捕获腔室703、713和723中，通道731处收集残余物。根据多种实施方式，免疫亲和性试剂用于将输入的细菌混合物捕获、集中并分层到一系列分离的免疫腔室703、713和723中。该便易的过程将重要的大型界面处理为微小界面，原先它们是应用微流控系统进行痕量病原体检测的一个障碍。免疫捕获的第一阶段还在提高测定的特异性方面起到了重要的作用。为达到较高的灵敏度，病原体检测系统的使用者可接着对存在试剂进行基于PCR的重复确认，还开发出了利用DNA分析机构705、715和725进行的基于特定引物的方法或者更普通的测定基因类型的方法，例如PCR，用以鉴定特定的菌株、毒素基因的存在以及抗生物素抗性标记的存在。在一个实施例中，DNA分析机构705、715和725包括PCR和CE。

根据多种实施方式，免疫亲和性捕获腔室703、713和723与PCR腔室集成，但CE机构保持独立。联合免疫捕获与核酸分析大大提高了个体测定试验的灵敏度和特异性。

从遗传学上区分病原体和非病原体在许多应用中很重要。联合免疫捕获作为PCR分析的上游端对输入的细菌种群具有重要的纯化作用，可以处理通常存在于不纯的复杂“现实”样品中的PCR抑制物。根据多种实施方式，病原体检测系统将建立起实施低循环数(非渐近的)方案的PCR，这样可保持并报告输入的目标种群的数量。在许多实施例中，处理的样品可接着供以CE分析。使用现代微流控技术可以制造廉价、快速和耐用的测定系统，其体积小、便于携带、并且只需要很少的能量、资源和操作技能。

病原体分析仪中包含了集成式免疫亲和捕获腔室。可以使用各种捕获机构，例如熔块、微珠、凝胶、整体件(monoliths)、以及聚合物。图8和图9是表示利用二氧化硅熔块和微珠实现的免疫捕获腔室图示。根据多种实施方式，免疫捕获腔室包括一系列用二氧化硅粉和硅酸钠粘结剂的混合物填充晶片孔而制成的二氧化硅熔块。经过脱水和冲洗，该硅酸盐凝结成硅胶并且在801、803、805和807处形成了不溶的二氧化硅熔块。

根据多种实施方式，在1.1mm厚的玻璃晶片中形成的每个硅熔块直径为1mm。免疫捕获腔室与用于引入和排出分析物的通道821相伴随。晶片内的熔块很容易集成到含有膜件811和813以及阀和泵结构的装置上。在图8中，四个硅熔块801、803、805和807通过膜件811和813封闭住。每个熔块的较大硅表面适合于通过各种有机硅烷试剂来化学地衍生。为进一步简化装置的制造，在PDMS非热粘合到其余装置上之前可以化学衍生所述整体晶片。

在一个实施例中，诸如熔块或1.5um的微珠这样的机构被加入捕获腔室中以便能够捕获许多大的物质种类，例如芽孢和细菌。固相捕获许多大的物质种类对本领域技术人员来说是已知的，并且其特征曾描述于Weimer，B.C.，M.K.Walsh，C.Beer，R.Koka，以及X.Wang，2001 Solid Phase Capture OfProteins，Spores，and Bacteria.Appl Environ.Microbiology，67：1300-1307。在一些实施例中，为采用微珠试剂进行捕获，要用围堰结构来修饰腔室以便提供微珠的止动件以及微珠的引入通道。电动式微珠床装填与围堰微珠捕获对于本领域技术人员来说是已知的。或者，可以将具有免疫功能的磁性微珠引入没有围堰的腔室中。

图9是表示具有不再密封的整体件的打开阀图示。根据多种实施方式，在区域901、903、905、907和909处施加气动真空以使得分析物沿着通道921流动通过熔块931、933、935和937。在所制造的装置中可以含有任何数量的熔块。

图10A是表示分析物捕获的图示。根据多种实施方式，包括三个膜件阀1001、1003和1005的泵1000用于抽吸含有寡核苷酸、蛋白质、细胞等的分析物溶液通过一系列免疫捕获腔室。

腔室可使用各种机构来捕获感兴趣的目标物。在免疫捕获腔室中捕获的任何感兴趣的物质在此被称为目标物。携带目标物的流体或物质在此被称为分析物。在一个实施例中，目标物为流体分析物中携带的沙门氏菌或利斯特氏菌(Listeria)。

在另一个实施例中，每个捕获腔室填充了含有寡核苷酸探针的粘性聚合物基质，以便选择性地结合目标物分子。在DNA分析时，Sanger DNA序列延伸产物，包括高盐浓度中的引物和聚合酶试剂，电泳通过免疫捕获腔室，其中该免疫捕获腔室中包含了含有共价寡核苷酸探针的固定化丙烯酰胺基质。捕获的序列是这样选择的，使只有DNA扩增产物被探针捕获，而引物和聚合酶试剂随同盐一起流过该装置。这就像需要从分析时遇到的复杂、不纯的混合物中纯化目标物分子那样。

制备具有功能性聚合物捕获基质的微捕获腔室的一个可选择方法包括制备具有10-20um范围的孔的整体件，以及制备具有较大的、表面修饰了功能性薄交联聚合物层的微细加工元件(大约100um)的腔室。该方法很有用，因为有时候微珠难于填装到捕获腔室中并且微珠床对于常规操作常常缺乏足够的机械稳定性。根据多种实施方式，多孔(10-20um)的表面功能性聚合物整体件的成型块是通过含有单体和孔生(porogenic)溶剂的前体混合物光聚合反应而直接形成在捕获腔室中的。

由于聚合过程是利用UV光来实现的，通过光刻法可以在微流控装置的任何需要区域形成多孔聚合物。利用填充有前体混合物的玻璃芯片的这种“微刻法”聚合过程的动力学对本领域技术人员来说是已知的，例如描述于Yu，C.，F.Svec，和J.M.J.Frechet 2000中的Towards stationary phases forchromatography on a microchip：Molded porous polymer monolithsprepared in capillaries by photoinitiated in situ polymerization asseparation media for electrochromatography.(在微芯片上进行的固相色谱技术：通过光起始原位聚合反应在毛细管中制备成型的多孔聚合物整体件作为电色谱隔离介质)，Electrophoresis，21：120-127，以及Yu，C.，M.Xu，F.Svec，和J.M.J.Frechet 2002中的Preparation of monolithic polymerswith controlled porous properties for microfluidic chip applicationsusing photoinitated free radial polymerization.(利用光起始自由基聚合反应制备具有可控多孔特征的整体件聚合物用于微流控芯片应用)，J.Polymer Sci.，40：755。类似地，可以控制装置上整体件材料的精确位置以及其表面化学性质，这对于本领域技术人员也是已知的，如描述于Rohr，T.C，C.Yu，H.M.Davey，F.Svec，和J.M.J.Frechet 2001.Simple and efficientmixers prepared by direct polymerization in the channels ofmicrofluidic chips.(通过在微流控芯片的通道中的直接聚合反应制备简单而有效的混合物)，Electrophoresis，22：3959。整体件聚合物的多孔特性可以通过调节致孔溶剂的组分来实现。

无论使用具有微细加工元件的整体件还是表面，都可以使用同样的接合方法来引入所需的接合元件。由于目的在于将抗体固定在这些整体件的孔表面上，因此接合的化学物质特别易于与生物聚合物发生反应。在一个实施例中，加入表面接合物的2-乙烯-4，4-二甲基吖内酯可以与蛋白质迅速反应。这样的机构对本领域技术人员是已知的，如描述于Peterson，D.S.，T.Rohr，F.Svec，和J.M.J.Frechet，2002中所述，Enzymatic microreactor-on-a-chip：protein Mapping using trypsin immobilized on porous polymer monolithsmolded in channels of microfluidic devices.(酶芯片微反应器：利用微流控装置通道中成型的多孔聚合物整体件上固定的胰岛素作蛋白质图谱)，Anal.Chem.，74：4081：4088。可将要修饰的表面(多孔整体件，或者微细加工元件)浸入单体溶液中，并且用UV光辐射装置从而在于选定区域上实现接合过程。表面功能化的程度由反应溶液中单体的浓度、辐射时间，和UV光的强度控制。

在另一个实施例中，胰岛素被固定在由2-乙烯-4，4-二甲基吖内酯、二甲基丙烯酸乙酯和丙烯酰胺或2-甲基丙烯酸羟乙酯构成的多孔聚合物整体件上。吖内酯的功能是容易与酶的胺和硫醇基反应形成稳定的共价键。在一些实施例中，整体件优化的多孔性特征形成了非常低的背压，使得能够使用简单的机构进行抽吸来既实现从溶液中固定酶又实现随后的底物溶液分析。反应器的Michealls-Menten动力学特征可以利用低分子量的底物，如N-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯来检测。

人们详细研究了固定化变量，例如溶液中胰岛素浓度和吖内酯的百分比在整体件中的泛函性作用，以及反应时间对酶活性的作用，和过程变量如底物流速和在反应器中的停流时间的作用。芯片上酶微反应器的蛋白水解活性在不同流速下随着作为底物的荧光标记酪蛋白的裂解而得到证实。该整体微反应器的优良特性还可以通过快速流动速率为0.5uL/min时的肌红蛋白消化作用来证实，其中停留时间仅为11.7s。然后利用MALDI-TOFMS来表征消化物，在153条可能的肽片断中识别了102条，序列覆盖率达67％。

已经作出了巨大的努力来开发新型的微细加工分析装置及其集成化，以制成微型全面分析系统(Ptas)。这些系统提供了比原尺寸仪器具有更高通量、更少的样品和试剂消耗量、更小尺寸以及更低操作成本的可能性。在微流控装置的各种应用中，分析技术，例如电泳、电色谱、涉及酶的测定法，以及免疫测定法都通过这种方式得到了证实。尽管微流控芯片技术不可否认取得了成功，但仍存在一些问题。例如，大多数的微流控芯片特征是开放的通道构造。因此，这些通道的表面积与体积比相当小。在依赖于与固相表面发生反应的应用中，例如在色谱分离、固相提取和多相催化中，其可能成为严重的问题。由于只有通道壁可以用于提供所需的相互作用，所述微型装置只能处理微量的化合物。

图10B是表示使用二维分析系统的图示。在整体件1027捕获了由具有阀1001、1003和1005的泵提供的目标物之后，整体件1027封闭。在一个实施例中，每个腔室随后被加热以熔化双链DNA并分离出单链DNA产物。根据多种实施方式，纯化作用发生在120秒内，可以从最初的3uL达到仅仅20nL的200倍浓缩物。每条管线1011、1013、1015、1017、1019和1021都包括用于控制或抽吸被捕获目标物的阀以用于进一步的分析步骤。

在一个实施例中，测试装置上提供了捕获的目标物用于PCR和CE分析。利用诸如加热或改变pH值的机构可以释放被捕获的目标物用于DNA分析。这种集成测试装置的基本特征包括：1)免疫捕获腔室，其蚀刻进具有微细加工的加热器和温度传感器的玻璃基板；2)100-300nL的聚合酶链式反应腔室，用于扩增从目标细胞裂解所获得的DNA；以及3)毛细管电泳微通道，其蚀刻进用于分离和检测PCR扩增子的玻璃基板。

任选的第四条特征，集成DNA预浓缩/纯化腔室也可以加到该装置上，用于纯化释放的病原体基因组DNA或者，在注入CE微通道之前如果需要的话用于预浓缩扩增的DNA。尽管先前的研究表明，为进行成功的分析，将PCR扩增子直接注入CE微通道上，可以避免需要这样额外的复杂性，但是要获得高质量的电泳图谱这种纯化过程是必要的。利用寡核苷酸捕获基质的化学性质可以实现扩增子的纯化过程。如果需要纯化基因组DNA，可以在纯化腔室中填充羧化的二氧化硅微珠，并在PCR之前用作全面捕获细菌DNA的基质。

集成化的一种方法是在玻璃芯片上仅仅制造免疫捕获、模版纯化、PCR、扩增子纯化、以及CE的单独模块。再利用微通道和各种PDMS阀结构将这些模块彼此相接。图11中给出了一种被制成具有单独的免疫捕获和PCR反应器的病原体分析芯片的示意图。该集成化病原体检测系统包括免疫亲和性捕获腔室1101。分析物通过该免疫亲和性捕获腔室1101引入到该病原体检测系统中。PCR腔室1103与该免疫亲和性捕获腔室1101偶联并接收由该免疫亲和性捕获腔室1101捕获的目标物。CE通道1105与该PCR腔室1103偶联用以进行进一步的分析。微细加工的电极1113可用于提供电势差。还可以具有一个与该免疫捕获腔室和/或PCR腔室偶联的加热器(未画出)。各种阀控制了分析物流动通过该集成化系统。根据多种实施方式，这些阀为整体阀。

尽管在装置上提供免疫捕获、PCR、CE和纯化单独模块是一个合理的方案，但根据多种实施方式建议使用为更简单的装置，以便有利于捕获效率、PCR效率以及DNA片段的高灵敏度分离和检测。尽管免疫捕获和PCR可以在单独的腔室中进行，但在一个实施例中，免疫捕获和PCR可以相结合以便简化装置和处理过程。在该实施例中，PCR可以成功地从固体基质和固相免疫捕获试剂中引发。在一个实施例中，PCR可以利用免疫标记的微珠来进行。

图12是表示联合免疫捕获和PCR腔室1201的图示。根据多种实施方式，该联合腔室具有在该纳升级腔室内制造的集成电阻加热机构(未画出)和电阻式温度检测器(RTD)1205。在一些实施例中，分析物通过输入口1211并通过膜件阀1221引入。利用压力驱动流体流动将目标病原体固定在腔室1201内，而废液通过阀1223在出口1213处被收集起来。病原体固定之后，用缓冲液冲洗该腔室1201以去除松弛附着的细胞或者非特异性结合的试剂。

PCR缓冲液要么通过原始的样品入口1211引入，要么通过单独的专用入口来引入。根据腔室1201中的目标病原体，化学裂解剂可直接包含在该PCR缓冲液中。引入裂解试剂和/或PCR缓冲液之后，用捕获/PCR腔室中的集成式加热器1203将样品温度升高到一温度下，使得病原体从捕获基质中同时释放出并且根据试剂种类而发生溶菌。

最简单但通常是最有效的裂解方法是仅仅进行加热/冷却循环。只加热或者在低浓度的化学裂解溶剂下加热时，革兰氏阴性细菌和一些具有较薄外部细胞膜的真核细胞更易于裂解。在一些情况下，例如对于芽孢或者革兰氏阳性细菌来说，就可能需要使用能干扰PCR反应的较强的裂解试剂。例如，通常需要将溶菌酶、蛋白酶K、溶葡萄球菌素、和变溶菌素单独或先后地加入，以裂解一些顽固的革兰氏阳性葡萄球菌和&葡萄球菌菌株。在这些情况下，使用单独的免疫捕获腔室再加上纯化/预浓缩腔室可以使在细胞裂解之后PCR扩增之前进行DNA的中间捕获过程。

在该方案的捕获和裂解之后，提取的DNA可以通过电泳而驱动进入纯化腔室，由羧基微珠吸收而存储下来。利用加热或者改变离子强度可以将纯化的DNA从该纯化腔室中释放出来，并通过电泳输送到PCR腔室中用于扩增。一旦来自于裂解细胞的DNA出现在具有PCR缓冲液的腔室中，利用微细加工的加热器和温度传感器，就可以在该释放的基因物质上直接进行PCR了。

应当注意在一些情况下，由于其复杂性或对PCR的抑制性，兼有捕获和PCR用途的单个腔室会出现问题。在这些特殊的情况下，仅仅需要将这两个阶段分开进行。在一些实施例中，如果存在的捕获基质或微珠抑制了PCR反应或者如果输入的样品引入了不能洗去或中和的PCR抑制剂时，就应该这样做。这样，释放的DNA可以从捕获腔室中的裂解细菌中被抽吸到或者电泳到单独的PCR反应器中用于分析。

一旦完成了PCR，可以将扩增子直接注入到CE微通道中用于分离和检测，根据所需的分辨率，可采用在分离基质中的嵌入染料或者荧光标记的引物并变性分离基质。在一些情况下，在注入CE微通道之前，可引入DNA纯化腔室以便脱盐和浓缩扩增的DNA。通过将扩增的DNA电泳进入纯化腔室，其中它结合到羧化微殊或者寡核苷酸捕获基质(与所需目标物互补的捕获寡核苷酸)，实现了纯化过程。结合之后进行洗涤并利用微加热器来进行温度相关的释放，然后通过注入CE微通道的十字，对浓缩和脱盐化的PCR扩增子进行电泳用以分离和检测。

采用整体膜件阀建立病原体检测和分析系统的装置构造可以有很大的变化。图13A是表示一种病原体检测和分析系统设计的一个实施例图示。该设计包括三个玻璃层，包括通道层1303，连接层1305，和集管层1309。连接层1305与集管层1309之间设置了一PDMS膜件层。集管层1309包括了可以向膜件1307施加真空的机构用以控制阀机构。

层1301上设置了电源接头，层1311上具有集管卡盘层。通道层1303包括免疫捕获/PCR/纯化腔室和CE微通道，以及位于该晶片的上表面的加热器。根据多种实施方式，通道层1303与含有玻璃钻孔作为阀连接的薄玻璃晶片1305热键合。PDMS阀/泵膜件1307可逆或者不可逆地与该多层叠层结构相键合。底部蚀刻的集管层1309将真空或压力传递给装置上的阀和泵。

利用现有的薄膜技术制造温控元件提供了构建测试装置的第一种可行途径。然而，通过采用氧化铟锡(ITO)加热器可降低该装置的加工难度。ITO加热器以其低电阻率、任选的透明度、以及与玻璃基板的兼容性而著称。这些加热器可以沉积在同一个晶片上作为温度传感器，以避免需要背面加工和电镀形成加热器。加热器可以直接设置在腔室内用于任选的热传递，或者其可以设置成抵靠在腔室上以便通过玻璃晶片传导热能。ITO的任选的透明度也使得可以在流体微通道的上方选择电加热器引线的路线，而不会妨碍样品或PCR扩增子的可视效果或检测。

图13B是表示根据多种实施方式的微细加工过程图示。1381和1383表示了微细加工过程。在一些实施例中，先清洁玻璃晶片(550μm厚的D263，购自Schottof Yonkers，NY)，然后通过直流磁控溅射系统(购自于UHV Sputtering of SanJose，CA)将2000的无定形硅层沉积在该晶片的一面。利用购自Karl Sussof Waterbury Center，VT的接触式对准机将购自Shipley 1818 ofMarlborough，MA的光刻胶旋涂上并形成光刻图案，然后利用购自Plasma Thermof St.Petersburg，FL的平行板反应离子蚀刻(RIE)系统中的SF6将底层硅蚀刻掩模有选择地去除掉。

在一些实施例中，流体通道、电泳通道、和PCR腔室在49％的氢氟酸中被蚀刻成36μm的深度。用购自Flashcut CNC of Menlo Park，CA、具有金刚石钻头的CNC磨机钻出PDMS阀的储液池入孔(直径1.5mm)和流动通孔(直径0.020”)。然后用晶片划片机将晶片切割成两个20mm×75mm的滑片。

要形成RTD和电极，首先可将200的Ti和2000的Pt(UHV)溅涂在550μm厚的D263晶片上。利用购自Suss Microtec of Waterbury Center，VT的接触式对准机将购自Shipley(SJR 5740)of Marlborough，MA的厚光刻胶旋涂上并形成图案。根据多种实施方式，在70℃下将光刻胶烤干2小时。利用热王水(3∶1的HCl∶HNO3，90℃)蚀刻金属可形成RTD元件。集成式加热器的形成是通过：首先利用购自于Perkin Elmer of Wellesley，MA的RF溅射系统将200的Ti和2000的Pt的多层薄膜沉积在RTD晶片的背面。将厚光刻胶旋涂在该面，利用背面接触式对准机(Suss)使该晶片形成图案，然后烤干。利用购自Technic(TG 25 E)of Anaheim，CA的亚硫酸金电镀液以4.3mA/cm2的电流密度将金电镀在所述Ti/Pt种层上23分钟，厚度达5μm，从而制成加热器导线。

根据多种实施方式，去除光刻胶并利用厚光刻胶在背面重新形成图案。利用购自Veeco Instruments of Plainview，NY的离子束蚀刻系统将加热元件蚀刻成Ti/Pt种层。将RTD/加热器晶片切割成两个25mm×75mm的滑片(Disco)。在一些实施例中，利用购自Centurion VPM，J.M.Ney，of Yucaipa，CA的可编程真空炉将钻孔通道晶片与RTD/加热器晶片热键合。

尽管基板上可以包括单个的免疫捕获、PCR、和CE系统，但本发明的技术认识到，开发用于临床诊断的并行免疫捕获、PCR、和CE系统也是有效的。在一个实施例中，一种便携式病原体分析仪包括三个连续的免疫捕获/PCR系统，目标在于检测样品中的三种不同的病原体。直接并行排列了流控系统、加热器电路、温度传感器以及用于三个系统的电泳装置，单个显微载玻片具有足够的表面积来制造三个完全并行的系统。

在另一个实施例中，提供了用于临床诊断的整体并行免疫捕获/PCR系统。这种能够分析来自多个个体或者成组个体的多种不同试剂的能力提供了一种强有力的方法来鉴别和在疫病学上追踪感染物。图14是一种径向平行的免疫捕获/PCR装置1400的部分图示。围绕圆环轴排列的任何具有多个免疫捕获和DNA分析机构的系统或装置在此被称为径向平行装置。

根据多种实施方式，该设计包括成对的分析器阵列，每个分析器含有一个与CE分析器集成的免疫捕获/PCR腔室1423。样品连续地通过装置的给定小单元内的所有腔室，使得连续捕获多种试剂。装置的单个小单元1401、1403、1405、1407、1409、1411能够并行地分析不同的物质。储液池1447和1445提供了微珠的输入和微珠的排出。储液池1443和1441分别为常规的毛细管电泳的阴极储液池和废液储液池。

将腔室相互连接用于级联式免疫亲和捕获。阀1431和1433在级联环路上封闭了所述腔室。阀1435和1437从微珠引入和废液通道处封闭了腔室。CE微通道连接着常规的中心阳极，以利用现有的旋转共焦荧光扫描仪(未画出)进行检测。提供了联合捕获腔室1423的平行阵列和具有引线1451的加热器，以及改进的阀和泵的耐用阵列。由于与腔室1423相伴随的加热器和温度传感器在分析通道上平行工作，使用简单的环形加热器就绰绰有余了。因而不再需要单个的加热器和温度传感器，从而提供了经济和有效的平行病原体检测系统。

尽管上面为简便起见以单数形式描述了许多元件和加工方法，但本领域技术人员应当明白，也可以使用多个元件和重复的过程来实践本发明的技术。

尽管本发明是根据其特定的实施方式来绘制和说明的，但本领域技术人员工应明白在不偏离发明实质和范围的情况下，可以对所公开的实施方式的形式和细节作出改变。例如，上述实施方式可以利用各种材料来实现。因此，本发明的范围应当参考所附的权利要求来确定。

Claims (37)

1.一种病原体检测系统，该系统包括：

集成在微流控装置上的免疫捕获腔室，该免疫捕获腔室可用于捕获通过微流控通道提供给所述免疫捕获腔室的目标物；

与所述免疫捕获腔室相伴随的DNA分析机构，该DNA分析机构集成在所述微流控装置上，所述DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。

2.权利要求1所述的病原体检测系统，其中所述DNA分析机构包括PCR和CE。

3.权利要求2所述的病原体检测系统，其中PCR包含在与所述免疫捕获腔室相分离的腔室中。

4.权利要求2所述的病原体检测系统，其中PCR包含在所述免疫捕获腔室中。

5.权利要求2所述的病原体检测系统，其中所述PCR的腔室用于扩增从所需目标物裂解所得到的DNA。

6.权利要求3所述的病原体检测系统，进一步包括蚀刻的毛细管电泳微通道，用于分离和检测PCR扩增子。

7.权利要求6所述的病原体检测系统，进一步包括DNA预浓缩与纯化腔室，用于纯化释放的病原体基因组DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脱盐和预浓缩扩增的DNA。

8.一种病原体检测系统，该系统包括：

集成在微流控装置上的免疫捕获装置，该免疫捕获装置可用于捕获通过微流控通道提供的目标物；

与所述免疫捕获装置相伴随的DNA分析装置，该DNA分析装置集成在所述微流控装置上，所述DNA分析装置可用于对目标物进行DNA分析。

9.权利要求8所述的病原体检测系统，其中所述DNA分析装置包括与所述免疫捕获装置相分离的PCR腔室。

10.权利要求9所述的病原体检测系统，所述PCR的腔室用于扩增从所需目标物裂解所得到的DNA。

11.位于整体装置上的病原体检测系统，该系统包括：

集成在该整体装置上的多个免疫捕获腔室，该免疫捕获腔室可用于捕获通过微流控通道提供给所述免疫捕获腔室的目标物；

与所述免疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构，所述多个DNA分析机构集成在该整体装置上，所述多个DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。

12.权利要求11所述的病原体检测系统，其中所述多个DNA分析机构包括PCR和CE。

13.权利要求11所述的病原体检测系统，其中PCR是在与所述多个免疫捕获腔室相分离的腔室中进行的。

14.权利要求13所述的病原体检测系统，进一步包括多个蚀刻的毛细管电泳微通道，用于分离和检测PCR扩增子。

15.权利要求14所述的病原体检测系统，进一步包括多个集成的DNA预浓缩与纯化腔室，用于纯化释放的病原体基因组DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脱盐和预浓缩扩增的DNA。

16.权利要求11所述的病原体检测系统，其中所述免疫捕获腔室进一步可用于纯化和浓缩目标物。

17.权利要求11所述的病原体检测系统，其中所述多个微细加工的免疫捕获腔室被制成以保持所选择的抗体。

18.权利要求17所述的病原体检测系统，其中所选择的抗体由微珠、熔块、溶胶凝胶、凝胶、或者聚合物整体件所保持。

19.权利要求17所述的病原体检测系统，其中所选择的抗体由直接形成在捕获腔室内的多孔、表面功能化聚合物成型块所保持。

20.权利要求19所述的病原体检测系统，其中所述成型块是通过含有单体和致孔溶剂的前体混合物的光聚合反应而形成的。

21.权利要求17所述的病原体检测系统，其中所述多个免疫捕获腔室被制成径向平行的方式。

22.权利要求21所述的病原体检测系统，进一步包括与所述多个免疫捕获腔室偶联的环形加热器，该环形加热器可用于加热所述多个免疫捕获腔室以释放所捕获的目标物。

23.权利要求17所述的病原体检测系统，其中所述多个免疫捕获腔室在玻璃层上制成。

24.权利要求23所述的病原体检测系统，其中所述玻璃层与整体膜件层偶联。

25.权利要求23所述的病原体检测系统，其中所述玻璃层包括多个蚀刻通道，该蚀刻通道可用于提供流体流动的路径。

26.权利要求25所述的病原体检测系统，其中所述玻璃层和充气层夹着所述膜件层。

27.一种用于病原体分析的方法，该方法包括：

通过集成在整体装置上的微流控通道将流体分析物提供给多个免疫捕获腔室；

在免疫捕获腔室中捕获与所述流体分析物相关的目标物；以及

利用与多个免疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构对所述目标物进行DNA分析，所述多个DNA分析机构集成在所述整体装置上。

28.权利要求27所述的方法，其中所述多个DNA分析机构包括PCR和CE。

29.权利要求27所述的方法，其中PCR机构包含在与所述多个免疫捕获腔室相分离的腔室中。

30.权利要求29所述的方法，其中所述多个DNA分析机构包括PCR的腔室，用于扩增从所需目标物裂解所得到的DNA。

31.权利要求29所述的方法，进一步包括多个蚀刻的毛细管电泳微通道，用于分离和检测PCR扩增子。

32.权利要求31所述的方法，进一步包括多个集成的DNA预浓缩/纯化腔室，用于纯化释放的病原体基因组DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脱盐和预浓缩扩增的DNA。

33.权利要求27所述的方法，其中所述免疫捕获腔室进一步可用于纯化和浓缩目标物。

34.权利要求27所述的方法，其中所述多个微细加工的免疫捕获腔室被制成以保持着所选择的抗体。

35.权利要求34所述的方法，其中所选择的抗体由微珠、熔块、溶胶凝胶、凝胶、或者聚合物整体件所保持。

36.权利要求34所述的方法，其中所选择的抗体由直接形成在捕获腔室内的多孔、表面功能化聚合物成型块所保持。

37.一种用于检测病原体的设备，该设备包括：

通过集成在整体装置上的微流控通道将流体分析物提供给多个免疫捕获腔室的装置；

用于捕获与所述流体分析物相关的目标物的装置；以及

利用与多个免疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构对所述目标物进行DNA分析的装置，所述多个DNA分析机构集成在所述整体装置上。

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