CN111961570A - 全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法 - Google Patents

全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法，属于辅助生殖技术领域。全集成仿生精子筛选芯片，由微流控芯片表层、微加热器和基底固定而成，所述微流控芯片表层包括样品加样区域、趋温性观察区域、趋化性观察区域以及相应连接通道，微加热器为ITO微加热器，微加热器加热芯片表层在趋温性观察区域建立温度梯度，趋化性观察区域包括特性物质加入口、对照物质加入口和二者之间的扩散通道。本发明将温度梯度系统与化学梯度系统结合在一张芯片之上，可以同时观察精子的趋温性及趋化性反应，最大限度模拟体内筛选环境；同时具有结构简单紧凑，适合高通量研究的优点。

Description

全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域，涉及一种全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法。
背景技术
目前临床上所使用的精子优选方法主要是上游法和密度梯度离心法，但是这两种方法与女性生殖道内对精子复杂的筛选机制相差较远，仅仅根据精子的活力进行筛选，并且在长时间的离心环境之下易导致精子DNA损伤和脂质过氧化，损害精子质量，最终影响体外受精成功率。因此提供一种简单快速并且能够模拟人体生殖环境对精子实现优选的新方法已经成为辅助生殖领域的一项迫切需求。微流控芯片因具有可高度集成、可减少人工操作及可实现从尺寸和结构层面对精子筛选环节进行仿生模拟等诸多优势，在辅助生殖领域逐渐显示出较大的潜力和应用前景。
由于体外受精过程绕过了输卵管这一环节，从而造成对精子选择受到限制，因此对女性生殖道筛选环境进行仿生模拟就显得尤为关键。精子进入女性后在宫颈处接受第一次筛选，此次筛选由宫颈处的宫颈粘液完成，只有约70％运动活力较好的精子才能穿过宫颈粘液。之后精子还需要穿过狭窄曲折的子宫输卵管连接处，到达输卵管峡部与输卵管上皮的纤毛细胞结合，形成精子“储存池”，并在此处完成精子获能，但仅有约10％的人类精子能够完成获能，之后精子还需要继续游动2-3cm才能到达受精部位——输卵管壶腹部，并且只有获能后的精子才可能完成最后的受精任务。哺乳动物的精子在复杂的女性生殖道中游走数千倍体长的路程才能到达卵细胞的位置，为了“引导”精子穿过重重阻碍找到卵细胞，女性体内可能存在一系列精子的“导航”机制。据相关文献报道，女性生殖道内对精子的“导航”机制至少有三种：趋流性、趋温性和趋化性，其中趋流性和趋温性引导的作用距离较长，趋流性引导贯穿了精子在女性生殖道中运动全过程，趋温性引导主要由输卵管峡部和输卵管壶腹部存在的温度梯度实现，而趋化性引导是一种短程作用——卵母细胞及其周围的卵丘细胞分泌的化学物质形成的化学梯度进一步帮助精子感知卵细胞的位置。具有趋流性、趋温性和趋化性的精子才可能最终到达卵细胞完成受精，并且相关研究表明具有趋向性的精子其后期的受精成功率可能更高，故利用精子的趋向性进行精子筛选是一条重要思路。事实上，国内外许多研究小组已经致力于将微流控芯片应用到辅助生殖领域的研究中，其中就有很多在微流控芯片上对精子进行趋向性筛选的优秀工作。
公开号为CN102242055A的中国发明申请，公开了一种精子活力评价及筛选的方法及其专用微流控芯片装置。该集成式微流控芯片包括至少一根微流体管道：所述微流体管道包括流体入口池、样品入口池以及设置在所述流体入口池和样品入口池之间的用于分级的至少2个流道大小各异的管道区段；所述管道区段内的流道大小从流体入口池至所述样品入口池是依次增大的，流道最大的所述管道区段与所述样品入口池直接连通。样品(精子)的运动方向与流体方向相反，当精子的前向运动速度与流速相等时被捕获在管道中的相应位置。
公开号为CN107475078A的中国发明申请，公开了一种基于微流控技术的精子筛选与体外受精仿生装置，包括仿生装置本体，所述仿生装置本体由玻片层、硅胶管道层和聚二甲基硅氧烷层组成，所述硅胶管道层中部设有中央池，所述中央池外侧设有入口池、第一出口池和第二出口池，所述中央池与入口池、第一出口池和第二出口池分别通过第一管道、第二管道和第三管道连通，所述第一管道、第二管道和第三管道上还分别设有第一加样口、第二加样口和第三加样口。
公开号为CN111154619A的中国发明申请，公开了一种高质量精子体外筛选装置及使用方法，所述装置包括可相互配合的基底部和上盖部，所述的基底部包括依次连通以构成精子筛选通道的精液加样区、阴道初筛区、宫颈流体分选区、子宫沉积区、输卵管引导区和精子收集区；所述的宫颈流体分选区包括宫颈管本体和宫颈细管，其中，所述的宫颈细管细于所述的宫颈管本体和所述的阴道初筛区，所述宫颈细管的入口端与所述的阴道初筛区连通，所述宫颈细管的出口端与所述的宫颈管本体的入口端连通。
现有技术存在这样一些缺陷：有的筛选因素单一，未全面考虑趋流性、趋温性和趋化性，与精子体内自然筛选过程相差较大；有的装置过于复杂，不适合高通量筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种全集成仿生精子筛选芯片，模拟女性体内生殖环境，实现精子的趋温性及趋化性响应评估，以此研究精子导航机制及其高通量筛选方法。本发明的目的通过以下技术方案实现。
全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，由微流控芯片表层、微加热器和基底固定而成，所述微流控芯片表层包括样品加样区域、趋温性观察区域、趋化性观察区域以及相应连接通道，微加热器加热芯片表层在趋温性观察区域建立温度梯度，趋化性观察区域包括特性物质加入口、对照物质加入口和二者之间的扩散通道。
趋温性：指精子根据温度的梯度更改自身游动方向的行为，被称为趋温性行为。在一定温度范围内，精子向温度高的一侧运动。趋化性：指精子根据化学物质的浓度梯度更改自身游动方向的行为，被称为精子的趋化性行为。在一定化学物质浓度范围内，精子向化学物质浓度较高的一侧运动。
本发明提供的全集成仿生精子筛选芯片，首次将温度梯度系统与化学梯度系统结合在一张芯片之上，可以实现对体内生殖环境的仿生重构，最大限度模拟体内筛选环境；同时具有结构简单紧凑，适合高通量研究的优点。具体而言，温度梯度的构建方式是通过微加热器加热芯片表层，形成所需要的温度梯度效果；化学梯度的构建方式是用双层光刻的方式，制作高度较矮的扩散通道，通过特性物质扩散的方式实现化学梯度的构建。精子通过样品加样区域进入芯片内部，首先会进入趋温性观察区域，随后进入趋化性观察区域，可以据此对精子的趋温性及趋化性响应进行评估，研究精子导航机制，为提出新的辅助生殖技术解决方案奠定基础。
进一步地，所述微加热器为ITO微加热器。ITO(Indium tin oxide)：N型氧化物半导体-氧化铟锡。通过ITO图形化设计，ITO接入外部电压，产生焦耳热，形成所需要的温度梯度效果。
进一步地，所述特性物质为孕酮，所述对照物质为精子清洗溶液、琼脂糖或者明胶。
进一步地，所述基底为PCB板。
进一步地，所述微流控芯片表层和微加热器通过键合固定在一起，键合固定的微流控芯片表层和微加热器通过焊接与PCB板固定在一起。
本发明还提供全集成仿生精子筛选芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计微流控芯片设计图和ITO微加热器设计图；
(2)利用光刻的方法在SU-8基底上涂敷一层光刻胶，曝光显影后得到微流控芯片模版；经过双次甩胶和光刻，得到微流控芯片模具；
(3)利用光刻和湿法刻蚀的方法，制作ITO微加热器；
(4)利用微铸模工艺，将PDMS预聚物与其固化剂按比例混合，浇注在微流控芯片模具上，加热使其固化；
(5)将固化的PDMS层剥离，将芯片区域切割下来，并用打孔器在出入口处进行打孔；将处理过的PDMS芯片和玻璃仔细清洗后吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和ITO微加热器键合；
(6)将键合完成的芯片灭菌；
(7)将灭菌完成的芯片与PCB板焊接固定。
本发明具有以下优点：通过仿生女性体内生殖环境，模拟体内精子筛选流程，通过观察精子运动行为模式的变化，为日后的辅助生殖操作方法提供新的思路；首次将温度梯度系统与化学梯度系统结合在一张芯片之上，可以同时观察精子的趋温性及趋化性反应，最大限度模拟体内筛选环境；同时具有结构简单紧凑，适合高通量研究的优点。
附图说明
图1是ITO微加热器的设计图。
图2是微流控芯片的设计图。
图3是ITO微加热器与PCB板的连接示意图。
图4是ITO微加热器与微流控芯片键合后效果图。
附图标记：1-精子样品入口，2-孕酮加样区，3-另一孕酮加样区，4-对照加样区，5-另一对照加样区，6-趋化性观察区域，7-趋温性观察区域，8-另一趋化性观察区域，9-玻璃基底，10-图像化ITO，11-印刷电路板，12-焊盘，13-微流控芯片，14-导电夹针。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步说明。
全集成仿生精子筛选芯片，通过对体内温度及化学环境的仿生模拟，实现对精子导航机制的探索。具体的实验方法如下：
(1)如图1所示，设计ITO微加热器设计图，ITO微加热器包括玻璃基底9和图像化ITO10。如图2所示，设计微流控芯片设计图，微流控芯片13可以划分为趋化性观察区域6、趋温性观察区域7和另一趋化性观察区域8，包括精子样品入口1、孕酮加样区2、另一孕酮加样区3、对照加样区4、另一对照加样区5以及相应连接通道。
(2)利用光刻的方法在SU-8基底上涂敷一层光刻胶，曝光显影后得到设计的模版；经过双次甩胶和光刻，得到芯片的模具。
(3)利用光刻和湿法刻蚀的方法，制作ITO微加热器。
(4)利用微铸模工艺，将PDMS预聚物与其固化剂按10:1的比例混合，浇注在模具上，80℃烘箱放置1.5h，使其固化。
(5)小心地将固化的PDMS层剥离，仔细地将芯片区域切割下来，并用打孔器在出入口处进行打孔，将处理过的PDMS芯片和玻璃仔细清洗，用氮气吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和ITO进行微加热器键合，键合条件为真空表示数40Pa，时间40s。ITO微加热器与微流控芯片键合后如图4所示。
(6)将键合完成的芯片放进高温烘烤箱中，高温灭菌。
(7)取出灭菌完成的芯片，如图3所示，用导电夹针14通过焊锡的方式将其与印刷电路板11的焊盘12固定。
(8)将0.1g孕酮粉末溶解于适量DMSO中形成原液共计1.0mL，混合均匀后，取出2.5μL原液，加入786μL精子清洗液，并混合均匀，配置成浓度为1mM的孕酮溶液。
(9)将2ml的精子清洗液从精子进样口1加入到芯片内部，充满整个芯片管道。
(10)组装好芯片设备后，通过导线将恒压直流电压源接入，提供ITO微加热器电压，外部控制电压输入为9.6V，能形成较好的温度梯度效果，待1分钟后温度梯度效果稳定。
(11)待温度梯度形成稳定后，将配置好的2μL的1mM孕酮溶液滴加在芯片内，滴加区域为孕酮加样区2和另一孕酮加样区3，同时在对照加样区4和另一对照加样区5加入等量的精子清洗溶液，待13分钟后化学梯度形成稳定。
(12)从精子进样口1中滴加1ml精子样品，通过倒置显微镜观察精子运动状况。

Claims (6)

1.全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，由微流控芯片表层、微加热器和基底固定而成，所述微流控芯片表层包括样品加样区域、趋温性观察区域、趋化性观察区域以及相应连接通道，微加热器加热芯片表层在趋温性观察区域建立温度梯度，趋化性观察区域包括特性物质加入口、对照物质加入口和二者之间的扩散通道。
2.根据权利要求1所述的全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，所述微加热器为ITO微加热器。
3.根据权利要求1所述的全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，所述特性物质为孕酮，所述对照物质为精子清洗溶液、琼脂糖或者明胶。
4.根据权利要求1所述的全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，所述基底为PCB板。
5.根据权利要求4所述的全集成仿生精子筛选芯片，其特征在于，所述微流控芯片表层和微加热器通过键合固定在一起，键合固定的微流控芯片表层和微加热器通过焊接与PCB板固定在一起。
6.根据权利要求1-5任一权利要求所述的全集成仿生精子筛选芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计微流控芯片设计图和ITO微加热器设计图；
(2)利用光刻的方法在SU-8基底上涂敷一层光刻胶，曝光显影后得到微流控芯片模版；经过双次甩胶和光刻，得到微流控芯片模具；
(3)利用光刻和湿法刻蚀的方法，制作ITO微加热器；
(4)利用微铸模工艺，将PDMS预聚物与其固化剂按比例混合，浇注在微流控芯片模具上，加热使其固化；
(5)将固化的PDMS层剥离，将芯片区域切割下来，并用打孔器在出入口处进行打孔；将处理过的PDMS芯片和玻璃仔细清洗后吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和ITO微加热器键合；
(6)将键合完成的芯片灭菌；
(7)将灭菌完成的芯片与PCB板焊接固定。
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