KR102248666B1 - 운동성과 주화성이 뛰어난 정자 선별을 위한 생체모방 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 생체모방 칩, 상기 생체모방 칩의 제조 방법, 및 상기 생체모방 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생체모방 칩은 운동성(sperm motility)과 주화성(chemotaxis)이 동시에 뛰어난 정자의 선별/포집 방법을 제공하며, in vitro 환경에서 생체모방 구조 및 물질을 이용하여 간편하고 신속하게 우수한 정자만을 분류해낼 수 있다. 즉 본 발명은 운동성과 주화성이 뛰어난 정자만을 신속하고 간단하게 분리해낼 수 있는 소형의 저렴한 생체모방 칩을 제공하며, 생체 모방구조 및 모방물질을 이용하여 운동성이 뛰어난 정자를 얻을 수 있을 뿐 아니라, 화학유도물질을 인식하고 이동하는 정자의 주화성을 이용함으로써 운동성과 주화성이 동시에 뛰어난 정자를 효율적으로 선별/포집할 수 있게 한다.

Description

운동성과 주화성이 뛰어난 정자 선별을 위한 생체모방 칩 {Biomimetic chip for screening sperms with high motility and chemotaxis}

본 발명은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 생체모방 칩, 상기 생체모방 칩의 제조 방법, 및 상기 생체모방 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법에 관한 것이다.

불임(infertility)이란 건강한 남녀가 결혼하여 1년 동안 피임하지 않은 상태로 정상적인 성생활을 함에도 불구하고 임신이 되지 않는 경우로 정의된다. 전체 부부의 약 15% 정도가 이에 해당되며, 전체 불임부부 중 1/3에서 남성에게 원인이 있는 것으로 나타난다. 남성 불임 원인에는 다양한 것이 있으며 수정 가능성의 여부를 판정하기 위한 몇 가지 기준이 있다. 세계보건기구(WHO)에 의하면 검사 소견이 적어도 1회 사정 시 정액 양이 2.0 cc 이상, 정자 수가 2천만개/cc 이상, 정상 형태의 정자가 30% 이상, 운동성이 있는 정자가 50% 이상이어야 한다고 명시되어 있다.

이에 따라 정자의 형태나 기능성을 검사하기 위한 진단 방법에는 정자염색법, 컴퓨터 정자 분석법, 항정자 항체검사, 컴퓨터 정자 운동성 검사, 자궁경부점액-정자 상호작용 검사, 정자의 첨체반응검사(acrosome reaction test), 정자의 난자 침투검사 등이 있다. 이들 검사의 용도는 정액 검사에서 수정 능력의 판정이 애매하거나, 정자의 면역학적 이상이 의심되거나, 여성 생식기 내에서 수정에 이르기까지의 정자능력을 알고자 하거나, 적절한 체외수정의 적용 가능성을 알아보기 위함이다. 그러나 각각의 용도가 다르고, 진단상의 한계가 있으므로 목적에 따라 제한적으로 사용된다.

불임으로 진단받은 남성들은 일반적인 방법으로는 수정이 힘들기 때문에 보조생식술(Assisted Reproductive Technology, ART)을 통해 자손을 가질 수 있다. 불임 부부의 성공적인 임신을 돕기 위해 다양한 방법과 기술들이 사용되는데 이를 총칭해 보조생식술이라 하며, 이러한 기법들은 단독으로 또는 조합되어 적용될 수 있고, 치료법과 더불어 전문적인 약물을 함께 사용하기도 한다.

보조생식술은 크게 3가지로 나뉘는데, 먼저 인공수정(Intrauterine Insemination, IUI) 방법은 임신을 위해 남성의 정자를 여성의 배란 시기에 맞추어 채집하여 처리한 뒤 가는 관을 통하여 인공적으로 여성의 자궁 또는 질, 난관 내로 직접 넣어주는 보조생식술로 자연적으로 난자와 정자가 만나 수정됨으로써 임신이 되도록 하는 시술이다. 또한 일반적인 시험관수정(In vitro Fertilization, IVF)은 시험관에 각각 채취한 정자와 난자를 넣은 후, 시험관 내에서 수정이 자발적으로 유도되게 하는 시술법이다. 이러한 인공수정 혹은 시험관 수정은 여성이 불임일 경우에는 수정의 성공률이 높지만, 남성이 불임일 경우에는 성공률이 현저히 떨어진다는 단점이 있다. 따라서 이를 보완하기 위해, 채취한 난자에서 효소를 이용하여 난자를 둘러싸고 있는 세포를 제거한 뒤 미세 조작기에 부착된 미세 유리관을 통하여 난자의 세포질 내로 정자를 직접 주입하는 방법인 세포내 정자 직접주입법(Intracellular Sperm Infection, ICSI)이 개발되었다.

위에서 언급된 불임 치료를 위한 여러 가지 보조생식술의 성공률을 높이기 위해서는 운동성과 주화성이 좋은 정자를 선별하여 시술에 사용하는 정자 처리과정(sperm processing)이 필요하다. 보조생식술 시술 시 죽은 정자나 세포 잔해는 수정 시 방해물질로 작용하기 때문이다. 이에 따라 우수한 정자만을 분리해내는 기술들이 개발되어 왔다. 그러나 기존의 분리법들은 우수한 정자의 회수율이 떨어지거나 정자의 수 또는 정자의 운동성 측면에만 초점을 맞춤으로써 정자의 질에 대한 다각적인 분석이 힘들다는 단점이 있으며, 대부분 일반적인 시험관 수정에만 적용이 가능하고, 정자에 악영향을 미치는 ROS(reactive oxygen species, 활성산소족)나 내부독소가 형성되며 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다.

남성의 불임 문제를 해결하기 위해 도입된 기존의 보조생식술은 정자의 운동성과 주화성을 평가할 때 장시간, 고비용, 노동집약적인 제한점이 있다. 또한 단순히 현미경만으로 정자의 운동성과 주화성을 관찰하여 우수한 정자를 정확히 선별해내기에는 어려운 부분이 있다. 따라서 이를 해결하기 위해 저비용, 단시간 내에 간단히 정자의 질을 평가할 수 있는 시스템의 개발이 필요하다.

또한 기존의 방법들은 정액 양 당 정자 수에 해당하는 농도나 현미경 관찰에 의한 운동성에 관한 평가만 이루어지기 때문에 가장 우수한 정자만을 선별해낸다고는 볼 수 없다. 따라서 정자의 운동성이 뛰어난 정자뿐 아니라 여성 생식기관 내부에서 정자가 어떻게 정확히 난자를 향해 헤엄쳐 가는지, 실제로 최적의 정자가 어떻게 선별되는지에 관한 원리를 이용하여 최적의 정자를 선별해낼 필요가 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점 및 필요성을 해결하기 위한 것으로, 본 발명에 따른 생체모방구조를 프로그램에 의해 고안한 후 이를 토대로 주형(mold)을 만든 뒤, 주형에 투명 탄성중합체인 PDMS 등을 굳혀 만든 칩을 이용하였다. 본 발명은 칩 내에 여성 생식구조를 모방한 생체모방 구조를 형성하였으며, 여기에는 배지 및 정액 시료 주입구와, 운동성이 우수한 정자의 분리를 위한 생체모방 점액 물질 및 이를 위한 주입구, 그리고 정자를 유도할 수 있는 화학유도물질 주입구 및 채널이 존재할 수 있다. 또한 상기 주입구로부터 채널을 따라 이동한 운동성과 주화성이 동시에 뛰어난 정자가 수집되는 정자 포집구와 그렇지 않은 정자가 배출되는 배출구를 구비할 수 있다.

본 발명자들은 자궁의 구조를 모방한 생체모방 칩으로서, 칩 내부의 정자 선별을 위한 생체 모방구조 및 모방 물질을 이용하고, 정자가 칩 내부에 주입된 화학유도물질을 인지하여 이동하는 원리를 토대로 운동성 및 주화성이 뛰어난 정자가 효율적으로 선별되도록 하는 생체모방 칩을 발명하였으며, 일례로 자궁경부 모방 구조 부근에 자궁경부에서 분비되는 점액과 유사한 효과를 내는 히알루론산염 용액을 주입하여 운동성이 좋은 정자를 분리하며, 또한 난자가 분비하는 화학유도물질을 주입함으로써 이를 인식하고 움직이는 정자를 포집함으로써 여성 생식기관을 모방한 칩 내부 구조와 특정 유도 물질을 이용하여 정자의 운동성과 주화성을 동시에 가진 우수한 정자를 간단히 선별/포집할 수 있는 초소형의 생체모방 칩을 발명하였다. 이를 이용해 운동성 및 주화성이 뛰어난 우수한 정자를 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 생체모방 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 생체모방 칩의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 생체모방 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명은 여성 생식기관을 모방한 생체모방 칩 내부 구조의 특성을 가지며, 점성 용매 하에서 뛰어난 운동성(motility)과 난자가 분비하는 화학유도물질에 반응하는 주화성(chemotaxis)을 갖는 정자를 선별하여 기존 보조생식술 시행 시 우수한 정자를 제공할 수 있는 시스템 개발에 관한 것이다. 따라서 운동성과 주화성이 동시에 뛰어난 정자만을 신속하고 간단하게 분류할 수 있는 초소형의 저렴한 생체모방 칩 시스템을 개발하였다.

본 발명에 따른 생체모방 칩은 칩 내부의 정자 선별을 위한 생체 모방구조 및 모방 물질을 이용하고, 정자가 칩 내부에 주입된 화학유도물질을 인지하여 이동하는 원리를 토대로 운동성 및 주화성이 뛰어난 정자를 효율적으로 선별하고자 한다.

이를 위해 생체모방 구조 및 효율적인 정자 분리에 필요한 물질을 포함하는 정자 분리 시스템을 개발하였다. 칩의 전반적인 구조는 정자가 칩 내부를 이동하면서 우수한 정자만 선별될 수 있도록 여성 생식기관인 질, 자궁경부, 자궁 등을 모방하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 정액 시료 주입구; 상기 정액 시료 주입구와 연결된 장애물 구조; 상기 장애물 구조와 연결된, 점성을 갖는 점액이 주입되며 복수의 제1미세기둥에 의해 구분되는 하나 이상의 구획을 포함하는, 점도 기반 선별부; 상기 점도 기반 선별부와 연결된 주화성 기반 선별부; 정자를 유도하는 화학유도물질이 주입되며, 상기 주화성 기반 선별부의 일 측벽으로부터 복수의 제2미세기둥에 의해 구분되는 하나 이상의 구획을 형성하는 농도 구배 형성부; 및 상기 농도 구배 형성부와 연결된 정자 포집구를 포함하는, 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 생체모방 칩을 제공한다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 먼저 정자가 여성의 실제 생식기관(reproductive system) 내에서 난자를 향해 헤엄쳐가는 동안 어떻게 분류되는지 서술하고자 한다. 일반적으로 사정된 정액 내에는 일억 마리 이상의 정자가 포함된다. 이 중 하나의 난자와 성공적으로 수정되는 정자의 수는 단 한 마리이다.

정자들은 질(vagina)을 통해 자궁경부(cervix)로 들어가는데, 많은 정자들은 점성이 높은 자궁경부 점액(cervical mucus)을 제대로 통과하지 못한다. 이를 뚫고 통과하여 자궁에 도달하는 정자는 운동성이 매우 좋고 형태가 정상적인, 단 수천 내지 수만 마리의 정자들뿐이다. 그 중 운동성이 감소하거나 사라진 몇몇 정자들과 자궁 내 백혈구가 생성한 활성 산소 분자의 해로운 영향을 받은 정자들이 자궁 내에서 걸러지면서 수백 마리 정도의 정자들만이 난관(oviduct) 쪽으로 들어갈 수 있다. 정자는 난관 벽의 구조, 액체의 흐름, 점탄성(viscoelasticity)과 같은 물리적 상호작용과 난관 상피세포(oviductal epithelium)와의 분자적 상호작용에 의해 난자와 수정할 수 있는 능력(capacitation)을 획득한 정자만이 남게 된다. 100마리가 넘지 않는 정자들이 난모세포 복합체(culmulus-oocyte-complex; COC)와 만날 수 있으며, 정자의 첨체 반응(acrosome reaction)을 통해 난자를 둘러싸는 투명대(zona pellucida)를 뚫고 마지막으로 통과한 10 내지 20마리의 정자만이 난자 표면에 도달할 수 있다. 즉, 뛰어난 운동성을 갖는 정자만이 실제 난자와 수정을 일으킬 수 있으며, 인공 수정 등의 보조 생식 술에 있어서는 이러한 정자를 선별/포집하는 것이 중요하다.

보다 구체적으로, 정액이 여성의 생식기관을 통해 삽입되면 정자는 먼저 질을 통해 질 원개(vaginal fornix)라고 하는 질과 자궁경부 사이에 위치하는 부분과 만난다. 정자는 자궁경부의 입구가 좁기 때문에 쉽게 진입하지 못하고 자궁경부 진입 전에 존재하는 이 질 원개에 쌓인다. 이렇게 쌓인 정자 중 운동성이 뛰어난 정자는 질 원개를 빠져나와 자궁경부로 들어가고, 그렇지 않은 정자는 질 원개에 그대로 남아 있게 되면서 일차적으로 운동성이 좋은 정자가 선별된다.

질과 연결된 자궁경부(cervix)는 자궁(uterus)의 바로 아래 끝에 존재하는 근육성의 통로로, 실제 길이는 2.5 cm 내지 3.0cm, 지름은 0.7 cm 내지 0.8cm 정도이다. 자궁 경관은 에스트로겐(estrogen), 프로게스테론(progesterone)과 같은 난소호르몬의 영향을 받아 자궁경부점막(endocervix)에 존재하는 자궁와(cervical crypt)에서 자궁경부 점액(cervical mucus)이라는 점액질을 분비한다. 비가임기(infertile phase) 동안에는 프로게스테론(progesterone)의 자극에 의해 두껍고 점성이 높은(viscous) 점액인 프로게스테론성 G 점액(gestogenic G mucus)이 자궁경부 통로(cervical canal)를 채우고 정자가 자궁으로 들어가는 것을 막는 역할을 한다. 가임기(fertile phase)에는 에스트로겐(estrogen)의 자극에 의해 에스트로겐성 L & S 점액(estrogenic L & S mucus)이 분비되는데, 이는 유동성이 있고 깨끗한 알칼리성 점액으로 신축성 및 탄력성이 높다. L-점액(L-mucus)은 정자를 필터링하는 역할을 하고, S-점액(S-mucus)은 정자를 수송하고 영양분을 주며 이는 수정 능력에 있어 필수적인 기능이다.

L 점액은 중간 수치의 에스트로겐 생산에 따라 전반적인 가임기 내내 분비되며, 전체적인 자궁경부 통로(cervical canal)를 따라 분배되지만 통로의 절반 아래에서 주로 분비된다. 알칼리성의 L-형 점액은 산성의 질 분비물들을 중화시켜 정자가 살아남기에 적합한 환경을 만든다. 비가임기에 정자는 질 내의 산성의 환경 내에서 30분 내에 죽지만 가임기의 자궁경부 점액 내에서는 최대 5일까지 살아 있을 수 있다. 또한 L 점액은 S 점액이 정자가 헤엄치는 레인을 잘 만들 수 있도록 도와주는 골격을 제공하며, 점성을 이용하여 결함이 있는 정자를 제거할 수 있는 생물학적 필터 역할을 한다. L 점액이 분비된 후 1일 내지 3일이 지나면 자궁경부의 절반 위쪽에서 S 와(S crypt)로부터 S 점액이 분비되기 시작한다. 에스트로겐 수치가 더 높아졌을 때 이를 자극하며, 에스트로겐 수치가 최대일 때 S 점액의 양도 최대가 된다. S 점액은 매우 유동성이 높기 때문에 정자가 자궁경부 통로에서 매우 빠르게 움직일 수 있다.

배란 전 자궁경부 통로는 좁고 매우 강한 섬유다발을 형성하는 자궁경부 G 점액(cervical G mucus)으로 장벽을 형성한다. 배란기가 되면 자궁경부 벽은 느슨해지고 통로 직경은 넓어지며 와(crypt)의 수가 증가한다. 자궁경부 점액은 더 액화되어 정자가 자유롭게 지나갈 수 있게 되고, 이렇게 자궁경부 통로를 통과하던 중 L 점액이 필터 역할을 하여 형태가 비정상적이거나 운동성이 떨어지는 정자가 유체동적 효과(hydrodynamic effect)에 의해 올라가지 못하고 점액에 걸려 남아 있게 한다. 이러한 간단한 원리는 정상적인 형태이면서 운동성이 좋은 정자들만 자궁경부 점액 장벽을 극복할 수 있게 한다.

실제 자궁경부 점액과 히알루론산염 용액에서의 정자의 이동 거리(migration distance)가 거의 비슷한 것으로 알려져 있으므로(Tang, S., Garrett, C., & Baker, H. G. (1999). HumanReproduction, 14(11), 2812-2817.), 히알루론산염 용액이 정자의 침투성(penetrability)과 관련하여 인간 자궁경부 점액(humancervical mucus)과 충분히 유사하게 사용될 수 있다.

본 발명의 생체모방 칩은 실제 자궁의 크기와 형태를 모방하며 특히 질 원개와 L-점액 유사 물질을 도입하여, 실제 여성의 체내에서 운동성이 뛰어난 정자가 선별되는 방식이 인공 수정 등의 보조 생식 술에서도 구현되도록 한다.

본 발명에서, 상기 "정액 시료 주입구"는 정자를 포함하는 정액 시료가 생체모방 칩 내 채널로 주입될 수 있도록 연결된 입구를 의미한다. 정액 시료 주입구를 통해서는 바람직하게는 정액 시료가 주입될 수 있으나, HAM'S F10 배지에 약 3:1 정도로 희석된 정액이 주입될 수도 있으며 정액의 희석 정도는 국한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 "장애물 구조"는 정액 시료 주입구로부터 점도 기반 선별부로 이어지는 채널 내에서 물리적인 장애물 역할을 하는 구조를 의미하는 것으로서, 실제 자궁에서 자궁경부 진입 전에 존재하는 질 원개와 유사하게, 운동성이 좋은 정자를 일차적으로 선별하는 역할을 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 장애물 구조는 상기 정액 시료 주입구와 점도 기반 선별부 사이의 통로의 폭을 1 mm 내지 2 mm로 제한하는 돌출부를 포함하는 것일 수 있다.

상기 장애물 구조는 질 원개 모방구조일 수 있다. 즉, 상기 "질 원개 모방구조"는 실제 자궁에서 자궁경부 진입 전에 존재하는 질 원개와 유사한 규격 및 형태를 가질 수 있다.

상기 질 원개 모방구조와 정액 시료 주입구 사이에, 질 모방구조에 해당하는 공간이 위치할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 상기 장애물 구조로서, 도 5에 도시된 구조를 참조할 수 있다.

본 발명에서, 상기 "점도 기반 선별부"는 점성을 갖는 점액에 의하여 일정 이상의 운동성을 갖는 정자만을 통과시키는 구조를 의미한다.

상기 점도 기반 선별부는, 실제 자궁에서 자궁경부내 점액(mucus)이 필터 역할을 하여 형태가 비정상적이거나 운동성이 떨어지는 정자가 유체동적 효과(hydrodynamic effect)에 의해 올라가지 못하고 점액에 걸려 남아 있게 되는 원리를 이용할 수 있다. 이러한 간단한 원리는 정상적인 형태이면서 운동성이 좋은 정자들만 자궁경부 점액 장벽을 극복할 수 있게 한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 점도 기반 선별부는 둘 이상의 구획을 포함하며, 각 구획에 서로 점도가 상이한 점액이 주입되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 "제1미세기둥"은 점도 기반 선별부 내의 구획을 구분하는 역할을 하며, 정자는 자유롭게 지나가되 점도가 다른 용액이 섞이는 것을 최대한 억제하여 준다. 또한, 구획에 따라 구분된 용액을 서로 완전히 차단하는 것은 아니므로, 연속된 농도 구배를 나타낼 수 있도록 할 수 있다.

상기 제1미세기둥은 마이크로미터 수준의 기둥(post) 형태일 수 있으며, 구체적으로, 상기 제1미세기둥의 크기는 가로 0.04 mm 내지 0.06 mm이며, 세로 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 기둥 간의 간격은 0.04 mm 내지 0.06 mm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 점도 기반 선별부는 상기 정액 시료 주입구 측으로부터 주화성 기반 선별부 측으로 갈수록 점도가 상승하는 점도 구배를 형성하며, 점도 구배를 극복할 수 있는 운동성을 가진 정자만이 상기 자궁 모방구조로 이동할 수 있도록 하는 것이다.

상기 점액은 자궁경부 점액과 점도가 유사한 물질일 수 있다. 실제 자궁경부 점액와 히알루론산염 용액에서의 정자의 이동 거리(migration distance)가 거의 비슷한 것으로 알려져 있으므로, 상기 점액은 예를 들어 히알루론산염 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 이러한 히알루론산염 용액의 점도를 조절하여 실제 가임기 동안의 자궁경부 내 점액, 즉 L 점액 및 S 점액을 생체모방 칩 내에 구현하였다. 3개의 히알루론산염 용액 주입 채널을 자궁경부 모방 구조 내에 제작하였으며, 정자는 자유롭게 지나가되 각각 용액의 점도가 최대한 섞이지 않도록 마이크로미터 수준의 제1미세기둥을 세워 각 구획을 구분해 주었다.

상기 실시예에서는 정자가 가장 먼저 닿는 정액 시료 주입구 측의 제1점도구획 내의 히알루론산염 용액의 점도를 가장 낮게 설정하였으며 제2점도구획 및 주화성 기반 선별부 측의 제3점도구획의 점도는 점점 증가하도록 설정하였다. 이에 따라 비정상적이거나 운동성이 좋지 않은 정자들은 각 구획에서 다음 구획으로 더 이상 넘어가지 못하고 걸렸으며, 운동성이 뛰어난 정자들은 점도가 있는 용액을 가장 점도가 높은 구획까지 단계적으로 잘 통과하였다.

상기 실시예에서는 3개의 히알루론산염 용액 주입 채널과 이에 연결된 3개의 구획을 언급하였으나, 1개 또는 2개의 주입 채널과 이에 연결된 구획을 갖도록 하는 것도 가능하며, 4개 또는 5개 이상 등, 발명의 취지에 따라 그 개수를 변형할 수 있다.

또한 본 발명의 취지와 범위 내에서 가능한 다양한 점액물질의 선택 또는 농도 변형이 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 3개의 구획으로 점도 구배가 형성된 점도 기반 선별부가 도 6에 도시된다.

상기 점도 기반 선별부는 자궁경부 모방구조일 수 있다. 여기서, 상기 "자궁경부 모방구조"는 실제 자궁경부와 유사한 길이 및 폭을 갖는 형태일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 생체모방 칩 하단부에 있는 자궁경부 모방구조 및 자궁경부 점액 유사물질의 주입에 의한 점액층을 형성시킴으로써 운동성이 우수한 정자의 선별에 필요한 환경을 조성하였다.

정자의 운동성은 자궁경관 점액 통과, 여성 생식관 내 이동과, 방사관 및 투명대의 통과 등을 위해 필요한 능력으로서, 정자의 품질 및 임신가능성을 평가하는 데 있어서 중요한 지표의 하나이다(J. Proteome Res. 2014, 13, 5670-5684 및 Fertility and Sterility, Vol.85, No.3, March 2006). 따라서 정자의 운동성을 평가함으로써 우수한 정자를 효율적으로 선택할 수 있다.

본 발명에서, 상기 "주화성 기반 선별부"는 정자의 화학유도물질에 대한 주화성을 이용하여, 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 구조를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 주화성 기반 선별부는 자궁 모방구조일 수 있다. 이때 상기 "자궁 모방구조"는 실제 자궁과 유사한 길이 및 폭을 갖는 챔버와 양쪽에 실제 자궁의 나팔관에 상응하는 채널이 연결된 형태를 가질 수 있다. 상기 나팔관에 상응하는 채널의 끝에는 주화성 정자를 선별하기 위한 정자 포집구가 연결될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생체모방 칩에서 최종적으로 자궁 모방 구조 한 쪽 부분에 정자를 난자 쪽으로 유도할 수 있는 화학유도물질을 주입하여 화학물질 농도차를 줌으로써 주화성이 뛰어난 정자를 분류해낼 수 있는 구조를 형성하였다.

정자의 주화성은 정자의 품질을 나타내는 마커 중에 하나로 알려져 있으며, 화학물질에 잘 반응하는 정자일수록 편모(flagellum)를 활발하게 움직이는 활동항진 상태의 운동성(hyperactive motility)을 나타내면서 난자와 수정할 수 있는 능력(capacitation)이 뛰어나다(Perez-Cerezales, S., Boryshpolets, S., & Eisenbach, M. (2015). Asian Journal of Andrology, 17(4), 628). 주화성이 뛰어난 정자는 화학유도물질의 농도차를 인식하여 농도가 짙어지는 것을 감지하고 그 방향으로 향하는 성질이 있는 것으로 알려져 있으므로(Armon, L., & Eisenbach, M. (2011). PloS one, 6(12), e28359.), 정자는 농도가 증가하는 방향으로 움직이다가 농도가 감소하면 활동 항진 상태(hyperactivated)가 되면서 운동 방향을 바꾸며, 화학유도물질의 농도가 다시 증가할 때까지 이러한 과정을 반복한다. 즉, 화학유도물질에 대해 뛰어난 주화성을 갖는 정자만이 실제 난자와 수정을 일으킬 수 있으며, 인공 수정 등의 보조 생식 술에 있어서는 이러한 정자를 선별/포집하는 것이 중요하다.

한편, 이러한 화학유도물질 주입부 및 채널은, 주화성이 mm 수준의 짧은 범위 내로만 작용(short-term range)하는 것이므로(Perez-Cerezales, S., Boryshpolets, S., & Eisenbach, M. (2015). Asian Journal of Andrology, 17(4), 628), 정자가 효과적으로 주화성의 영향을 받아 움직일 수 있도록 주화성 기반 선별부 입구의 일 측벽에 농도 구배 형성부를 위치시킬 수 있다. 상기 "농도 구배 형성부"는 상기 주화성 기반 선별부의 일 측벽을 하나의 경계로, 및 복수의 제2미세기둥을 다른 하나의 경계로 하는 하나 이상의 구획을 갖는 채널 형태일 수 있으며, 정자를 유도하는 화학유도물질이 주입된다.

본 발명의 농도 구배 형성부의 일례가 도 4에 도시된다. 도 4의 농도 구배 형성부는 복수의 제2미세기둥을 좌측 경계, 주화성 기반 선별부의 우측 벽을 우측 경계로 하는 채널 형태로서, 하단에 정자를 유도하는 화학유도물질이 주입되는 주입구가 연결되어 있다.

본 발명에서 상기 "제2미세기둥"은 상기 농도 구배 형성부를 형성하는 역할을 하며, 구체적으로, 상기 화학유도물질의 확산을 조절하는 것일 수 있다. 즉, 제2미세기둥의 형태, 크기 및 간격 등을 조절함으로써, 농도 구배 형성부에 주입되는 화학유도물질의 확산을 조절하고, 그에 따라 화학유도물질이 농도 구배를 형성하도록 할 수 있다. 또한, 구획에 따라 구분된 용액간에 완전히 차단하는 것은 아니므로, 연속된 농도 구배를 나타낼 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 제2미세기둥을 통한 확산에 의하여 형성된 화학유도물질의 농도 구배가 도 7에 도시된다.

상기 실시예에서는 1개의 화학유도물질 주입 채널과 이에 연결된 1개의 구획을 언급하였으나, 2개, 3개 이상 등, 발명의 취지에 따라 그 개수를 변형할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 자궁경부 모방 구조를 통과한 운동성이 좋은 정자가 자궁 내로 진입할 때 화학유도물질에 의해 유도될 수 있도록, 화학유도물질 주입 채널을 제작하였다. 화학유도물질 주입 부분은 아래에서 위로 향하게 함으로써 직진성이 있는 정자가 주입부로 빠져 유실되지 않도록 위치시켰으며, 화학유도물질이 흐르는 채널을 마이크로미터 수준의 기둥으로 구분하여 화학유도물질이 너무 빠르게 확산되지 않도록 하였다.

또한 화학유도물질을 구분한 기둥이 끝나는 부근은 따로 막지 않고 정자 포집구로 연결되도록 하여 기둥 사이를 통해 화학유도물질 채널 내로 들어간 정자가 유실되지 않도록 제작했다. 반대쪽도 동일한 채널을 형성하여 화학유도물질이 아닌 기본 배지를 함께 주입함으로써, 정자가 유체의 흐름에 영향을 받아 움직인 것인지 화학유도물질에 의해 유도된 것인지 판별하고자 하였다.

구체적으로, 상기 제2미세기둥의 크기는 가로 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 세로 0.02 mm 내지 0.04 mm이며, 기둥 간의 간격은 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 기둥과 상기 일 측벽 사이의 거리는 0.1 mm 내지 0.3 mm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 화학유도물질은 상기 점도 기반 선별부 측으로부터 상기 정자 포집구 방향으로 흐르는 것일 수 있다.

정자는 난자가 분비해내는 물질을 인식하여 난자에게로 향하는 주화성(chemotaxis)을 지니고 있다. 정자를 유도한다고 밝혀진 화학유도물질은 여러 가지가 있으나, 이중 다수의 연구에서 정자의 주화성을 유도한다고 알려진 프로게스테론(progesterone)과 최근 정자의 주화성 유도와 수정능 획득에 직접적으로 관여한다고 밝혀진 아난다마이드(anandamide)를 선정하였다.

상기 "프로게스테론"은 동물 등의 난소 안에 있는 황체에서 분비되는 여성 호르몬의 일종으로서, 에스트로겐과 함께 생식주기를 조절하는 역할을 하며, 벤젠 고리를 가지고 있는 스테로이드 호르몬이다.

또한, 상기 "아난다마이드"는 N-아라키도노일에탄올아민(N-arachidonoylethanolamine, AEA)으로도 알려져 있는 아라키돈산의 유도체이다.

정자의 주화성 유도를 위해서 이와 관련된 화학유도물질을 분비한다고 알려진 난모세포(oocyte), 특히 난모세포 복합체(culmulus-oocyte-complex; COC)를 칩 내부에 배양한 종래의 연구결과가 있었으나, 동물유래의 세포를 이용했다는 점에 있어 인간 정자의 선별에 적절하지 못하다. 또한 동물유래가 아닌 인간유래 세포를 연구에 사용하는 것은 세포 자체를 획득하기 매우 어려울 뿐 아니라 비용 및 윤리적 문제가 발생할 수 있는 소지가 있다. 본 발명은 간단한 제작 방법과 저렴한 단가를 목표로 하는 칩에 관련된 것이므로, 이러한 문제를 해결하기 위해 동물유래의 세포가 아닌 화학유도물질을 사용하여 정자의 주화성을 유도할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 프로게스테론만 주입한 실험군과 아난다마이드만을 주입한 실험군, 그리고 프로게스테론과 아난다마이드를 다양한 비율로 섞어 주입한 실험군을 이용하여 실험을 진행하였다.

본 발명의 본 발명의 취지와 범위 내에서 화학유도물질의 농도와 비율은 가능한 다양한 변형이 수행될 수 있다.

즉, 상기 화학유도물질은 프로게스테론, 아난다마이드 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 화학유도물질은 프로게스테론 및 아난다마이드는 2:1 내지 1:2의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 비율로 혼합될 경우에 실제 난자가 나타내는 정자 유도 특성과 유사한 정도로 정자가 유도되어 우수한 주화성을 나타내는 정자를 선별하기에 적합하다.

구체적으로, 상기 화학유도물질은 염화칼슘 및 알긴산을 포함하는 젤 형태로 상기 농도 구배 형성부에 주입되는 것일 수 있으며, 상기 젤은 1%의 염화칼슘과 4%의 알긴산을 1:2 내지 1:5의 비율, 구체적으로 1:2 내지 1:4, 보다 구체적으로 1:2.5 내지 1:3.5의 비율로 섞어주었으나 이에 국한되지 않으며, 이 때 화학유도물질을 상기 젤에 포함시켜 준다.

구체적으로, 상기 화학유도물질은 10 pM 내지 1 μM의 농도로 주입될 수 있고, 바람직하게는 프로게스테론은 10 pM 내지 1 nM의 농도로 주입될 수 있고, 아난다마이드는 1 nM 내지 1 μM의 농도로 주입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 생체모방 칩은 상기 주화성 기반 선별부의 타 측벽 및 복수의 제3미세기둥에 의해 형성된 대조 채널을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 정자를 유도하기 위해 화학유도물질을 자궁 모방구조의 하단부에 위치해 있는 한 쪽 주입구를 통하여 농도 구배 형성부에 주입하고, 다른 쪽 주입구를 통해 대조군으로 일반 배지를 대조 채널에 주입하였다. 이를 통해 정자가 유체의 흐름에 영향을 받아 움직인 것인지 화학유도물질에 의해 유도된 것인지 판별할 수 있다.

본 발명에서, 상기 "정자 포집구"는 주화성 기반 선별부로 진입한 정자들 중 화학유도물질에 의해 유도된, 주화성이 우수한 정자가 포집되는 출구를 의미한다. 상기 정자 포집구는 농도 구배 형성부와 연결될 수 있다.

한편, 본 발명의 생체모방 칩은 주화성이 우수하지 못한 정자를 배출하기 위한 정자 배출구를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 분류 칩의 재질은 투명한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 정자 분류 칩의 재질은 PDMS, 유리 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 외의 다양한 폴리머를 포함하는 여러 재료가 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 생체모방 칩의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 정자 분류 칩은 본 발명에 따른 장애물 구조, 점도 기반 선별부, 및 농도 구배 형성부 등을 비롯한 생체모방 구조가 형성된 칩 및 슬라이드를 접착하여 제조될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 생체모방 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자는 인간의 정자인 것이거나, 또는 인간이 아닌 동물의 정자일 수 있다.

상기 "동물"은 축산업에 이용되는 가축을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 상기 동물은 소, 말, 개 또는 돼지인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 특정 실시양태가 인간 정자의 분류에 기준을 두고 서술되더라도, 이들 실시양태가 인간 정자에만 한정되지는 않으며, 필요에 따라 축산업에서 동물 정자의 분류에 이용하여 보다 우수한 품종의 개체를 얻는 목적으로 사용할 수 있다.

동물 정자를 사용하여 본 발명을 동물 인공수정에도 적용할 수 있다. 기존의 동물 인공수정은 숙련된 기술자와 시설이 필요할 뿐 아니라 정액 자체의 유전 형질이 나쁠 경우 잘못하면 질병의 확산에 따른 많은 피해가 우려된다. 그러나 본 개발된 시스템을 적용할 시 간단하고 신속하게 품질이 우수한 동물 정자를 선별해냄으로써 동물 인공수정의 효율을 극대화할 수 있다. 이에 따라 개량 가축의 생산성을 향상시키고 노동력을 절감할 수 있을 뿐 아니라 생물학 연구의 수단으로도 용이하게 한다.

본 발명의 생체모방 칩은 운동성(sperm motility)과 주화성(chemotaxis)이 동시에 뛰어난 정자의 선별/포집 방법을 제공하며, in vitro 환경에서 생체모방 구조 및 물질을 이용하여 간편하고 신속하게 우수한 정자만을 분류해낼 수 있다. 즉 본 발명은 운동성과 주화성이 뛰어난 정자만을 신속하고 간단하게 분리해낼 수 있는 소형의 저렴한 생체모방 칩을 제공하며, 생체 모방구조 및 모방물질을 이용하여 운동성이 뛰어난 정자를 얻을 수 있을 뿐 아니라, 화학유도물질을 인식하고 이동하는 정자의 주화성을 이용함으로써 운동성과 주화성이 동시에 뛰어난 정자를 효율적으로 선별/포집할 수 있게 한다.

본 발명은 불임 남성의 문제를 해결하기 위한 기존의 보조생식술의 단점을 개선할 수 있는 새로운 기술로써, 인공 수정(intrauterine insemination), 세포 내 정자 직접 주입법(ICSI, intracellular sperm injection), 또는 체외수정(IVF, in vitro fertilization) 시술에 필요한 우수한 정자 획득에 매우 적합하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 전체 평면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 전체 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 자궁경부 모방구조를 갖는 점도 기반 선별부 내에, 자궁경부 점액 유사물질을 주입하는 채널 및 제1미세기둥의 확대 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 농도 구배 형성부로서, 화학유도물질 주입 채널 및 제2미세기둥의 확대 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 질 및 질 원개(vaginal fornix) 구조를 모방한 장애물 구조에서 정자의 움직임을 나타낸 모식도이다. 이 과정에서 운동성이 뛰어난 정자는 다음 채널로 이동하고 운동성이 떨어지는 정자는 그 위치에 정체되어 운동성이 뛰어난 정자만이 1차적으로 선별된다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 자궁경부 모방구조를 갖는 점도 기반 선별부에서 정자의 움직임을 나타낸 모식도이다. 이 과정에서 운동성이 뛰어난 정자는 자궁경부 점액 유사물질의 점도를 뚫고 다음 채널로 이동하며, 그렇지 않은 정자와 백혈구 등은 점도가 높은 채널 내에서 더 이상 이동하지 못하기 때문에 운동성이 뛰어난 정자를 다시 선별할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩의 자궁 모방구조를 갖는 주화성 기반 선별부에서 화학유도물질을 주입했을 때의 정자의 움직임을 나타낸 모식도이다. 노란색으로 나타낸 영역은 화학유도물질의 농도 구배를 시각화한 것이며, 주화성 정자는 화학유도물질의 농도 구배를 인식하고 그 방향으로 헤엄친다. 이에 따라 정자는 기둥을 따라 이동하거나 기둥 사이로 통과하여 채널 내로 이동할 수 있으며 정자 포집구로 이동한 정자를 포획할 수 있다. 반면 비주화성 정자는 화학유도물질의 농도 구배를 인식하지 못하고 다른 방향으로 이동하거나 제자리에 정체되어 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 생체모방 칩 내에서 이동하는 정자의 전체적인 움직임과, 운동성 및 주화성이 뛰어난 정자가 어떻게 선별되는지를 설명하는 모식도이다. 상기 설명된 바대로 생체모방 구조와 점성 및 주화성을 이용하여 최종적으로 우수한 정자만을 선별해낼 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명의 실시양태가 기재되었지만, 이들 실시양태가 본 발명의 모든 가능한 형태를 기재하지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 제한하려기보다는 설명을 위한 용어이며, 본 발명의 취지와 범주에서 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1. 본 발명의 생체모방 칩의 제조

본 발명의 생체모방 칩을 제조하기 위한 공정의 일 실시예를 아래에 기술한다.

본 실시예에서의 생체모방 칩은 PDMS(polydimethylsiloxane) 탄성중합체와 유리 슬라이드(slide glass)를 이용하여 제작하였다. PDMS는 광학적으로 투명하며 매우 내구성이 강한 중합체로, 정자의 움직임을 관찰하기 유리하며 생물 친화적이기 때문에 세포에 해를 가하지 않아 바람직하다.

여성의 생식기관 구조를 모방한 생체모방 칩 제작을 위해 먼저 AutoCAD로 칩 구조를 디자인하였으며, PDMS 칩 제작을 위한 주형(mold)을 제작하였다. 실리콘 웨이퍼 위에 네거티브 포토레지스트(PR)인 SU-8을 코팅하여 제작한 주형을 사용하였으며, PDMS 실리콘계 엘라스토머(silicone base elastomer)와 경화제(curingagent)의 비율을 10:1로 섞어 SU-8 주형 위에 부은 뒤 80℃에서 10시간 동안 열처리를 가해 굳혔다. 이를 주형으로부터 분리해낸 후, PDMS를 칩의 크기에 따라 자른 뒤 구멍을 뚫는 기기(펀치)를 이용하여 배지 주입구와 정자 포집구, 및 점액(히알루론산) 주입구의 위치에 따라 각각에 맞는 크기로 구멍을 뚫었다. 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 및 초음파처리(sonication)를 통해 세척한 후 최종적으로 제작된 생체모방 칩 기판과 유리 슬라이드를 플라즈마 산화 처리(plasma oxidation treatment)하여 접착시켰다.

상기와 같이 제조된 미세유체 생체모방 칩의 크기는 가로 33mm, 세로 49mm, 높이 0.75mm이다. 또한 생체모방 칩의 하단부에는 배지 및 정액 시료 주입구가 있으며 직경은 모두 8.0mm이다. 이러한 주입구는 장애물 구조를 포함하는 질 모방구조 및 자궁경부를 모방한 점도 기반 선별부와 연결되며, 질 모방구조의 길이는 6mm, 폭은 9mm이고 자궁경부 모방구조(점도 기반 선별부)의 길이는 6mm, 폭은 2mm이다. 자궁경부를 통과한 정자는 자궁 모방구조(주화성 기반 선별부)를 통해 정자 포집구로 빠져 나간다. 자궁 모방구조의 길이는 약 19mm, 폭은 약 12mm이다. 각 모방구조의 길이 및 폭은 실제 여성 생식기관 내 길이 및 폭을 참고하여 약 1/4 정도로 감소시켰으며 거의 유사하게 제작하였다.

자궁경부 모방구조(점도 기반 선별부)에는 자궁경부 점액 유사물질을 주입하기 위한 주입구가 구조 양쪽에 세 개씩 존재하며 각각의 직경은 모두 1.2mm이다. 또한 점액물질의 점도가 지나치게 섞이지 않게 하기 위해 제1미세기둥 구조를 형성하였으며 기둥의 크기는 가로 0.04 cm 내지 0.06mm, 세로 0.03 cm 내지 0.05mm, 기둥 간의 간격은 0.04 cm 내지 0.06mm 내로 제작된다.

화학유도물질의 주입을 위해 자궁 모방구조(주화성 기반 선별부)의 도입부 좌, 우측 하단부에 주입구를 제작하였으며 마찬가지로 각각의 직경은 모두 1.2mm이다. 또한 화학 유도물질의 점진적인 농도 구배 및 확산을 위해 자궁 모방구조에서 정자 배출구로 향하는 방향의 측면을 따라 제2미세기둥 구조가 존재하며 기둥의 크기는 가로 0.03 cm 내지 0.05mm, 세로 0.02 cm 내지 0.04mm, 기둥 간의 간격은 0.03 cm 내지 0.05mm, 그리고 기둥과 자궁 모방구조의 벽과의 거리는 0.1 cm 내지 0.3mm 범위에서 제작된다.

본 발명의 구체적인 크기 및 길이가 기재되었지만 이러한 실시 형태가 본 발명의 모든 가능한 형태를 제한하지는 않는다. 상기 내용에서 기재된 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이며, 본 발명의 취지와 범위 내에서 가능한 다양한 변형이 수행될 수 있다.

실시예 2. 본 발명의 생체모방 칩을 이용한 정자 선별 실험

위와 같이 제조된 정자의 분리 및 질 평가를 위한 여성 생식기관 생체모방 칩의 실험 방법은 다음과 같다.

먼저 유리 슬라이드와 부착된 PDMS 칩 하단부에 존재하는 배지 주입구를 통해 점도가 있는 배지를 칩 내에 주입한다. 이후 자궁경부 점액 유사물질인 히알루론산염 용액(hyaluronate solution)을 점도 기반 선별부에 있는 주입구에 각각 점도 구배에 맞게 주입함으로써 자궁경부 점액을 모방한다. 정자가 가장 먼저 닿는 채널 내 히알루론산염의 점도가 가장 낮으며, 순차적으로 높아지게 함으로써 L 점액 및 S 점액을 구현하고자 하였다.

또한 화학물질로 정자를 유도하기 위해 화학유도물질을 주화성 기반 선별부의 하단부에 위치해 있는 한 쪽 주입구에 주입하고, 다른 쪽 주입구에는 대조군으로 일반 배지를 주입한다. 이 때 화학유도물질을 염화칼슘과 알긴산을 1:2의 비율로 섞어 고체화시킨 젤(gel) 내에 섞어 주입하면 화학유도물질이 지나치게 칩 내에 빠르게 확산되는 것을 방지할 수 있다.

화학유도물질은 프로게스테론과 아난다마이드를 1 μM 농도부터 10배씩 순차적으로 1 nM 농도까지 희석하여 주입하였으며, 각각의 농도에서 정자의 주화성이 어떻게 유도되는지 관찰하고 정자의 주화성을 최대한 유도할 수 있는 화학유도물질 농도를 선정하였다. 또한 프로게스테론과 아난다마이드를 섞어서 주입할 시 호르몬 칵테일(hormone cocktail)의 비율을 다양하게 시도하여 최적의 농도 비율을 설정하였다.

프로게스테론만 주입한 실험군과 아난다마이드만을 주입한 실험군, 그리고 프로게스테론과 아난다마이드를 다양한 비율로 섞어 주입한 실험군을 이용하여 실험을 진행하였다. 상기 아난다마이드(arachidonylethanolamide, A0580)와 프로게스테론(progesterone, P8783)은 Sigma-Aldrich 사에서 구입할 수 있다.

이후 배지를 주입했던 칩 하단의 주입구에 정액을 주입하면 운동성이 있는 정자는 생체모방 칩 내에 주입한 점성이 있는 배지를 따라 활발하게 이동한다. 정자는 먼저 질 모방구조로 진입한 후 질과 자궁경부 사이의 질 원개(vagianl fornix) 모방구조인 장애물 구조에 걸린다. 이 때 운동성이 뛰어난 정자는 이를 빠져나와 점도 기반 선별부로 진입할 수 있으며 그렇지 않은 정자는 장애물 구조에 그대로 머물며 이로써 1차적으로 운동성이 뛰어난 정자를 분리해낼 수 있다.

장애물 구조를 빠져나온 정자는 자궁경부 구조를 모방한 점도 기반 선별부로 이동하여 자궁경부 점액(cervical mucus)유사물질인 히알루론산염이 존재하는 구간으로 들어간다. 이는 상기 설명되어 있는 바와 같이 실제 체내 자궁경부 내로 들어온 정자 중 운동성이 뛰어난 정자를 선별할 수 있는 것으로 알려져 있다. 운동성이 활발한 정자들은 점성 히알루론산염 점액을 통과하여 주화성 기반 선별부 방향으로 이동하였으며 그렇지 않은 정자들은 히알루론산염 채널 내에 걸려 더 이상 이동하지 못하였다.

자궁 모방구조를 갖는 주화성 기반 선별부에 진입하던 정자들은 화학유도물질에 의해 유도되어 더 높은 화학유도물질 농도를 찾아 움직인다. 젤 내에 존재하는 화학유도물질은 균일한 농도구배를 나타냄에 따라 정자를 정자 포집구 쪽으로 유도할 수 있다. 정자는 화학유도물질의 농도구배가 형성되지 않은 대조군 방향으로는 적은 수가 이동함을 관찰할 수 있었으며 최종적으로 정자가 정자 포집구를 향해 헤엄치는 것을 확인하였다.

상기 실험과정을 거쳐 최종적으로 선별/포집된 정자는 운동성이 뛰어나고 주화성이 우수하며, 일련의 물리적, 생화학적 분석 과정을 거쳐 이를 검증함으로써 발명된 본 시스템이 본 연구의 목적에 따라 작동하였는지 확인하고자 하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

1 : 배지 및 정액샘플 주입구
2 : 질 모방구조 및 장애물 구조
3 : 점액 주입구
4 : 점도 구배 형성을 위한 제1미세기둥
5 : 화학유도물질 주입구
6 : 농도 구배 형성부
7 : 주화성 기반 선별부
8 : 정자 배출구
9 : 생체모방 칩

Claims (21)

1. 정액 시료 주입구;
   상기 정액 시료 주입구와 연결된 장애물 구조;
   상기 장애물 구조와 연결된, 점성을 갖는 점액이 주입되며 복수의 제1미세기둥에 의해 구분되는 하나 이상의 구획을 포함하는, 점도 기반 선별부;
   상기 점도 기반 선별부와 연결된 주화성 기반 선별부;
   정자를 유도하는 화학유도물질이 주입되며, 상기 주화성 기반 선별부의 일 측벽으로부터 복수의 제2미세기둥에 의해 구분되는 하나 이상의 구획을 형성하는 농도 구배 형성부; 및
   상기 농도 구배 형성부와 연결된 정자 포집구를 포함하는,
   운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 생체모방 칩.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 장애물 구조는 상기 정액 시료 주입구와 점도 기반 선별부 사이의 통로의 폭을 1 mm 내지 2 mm로 제한하는 돌출부를 포함하는 것인, 생체모방 칩.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 장애물 구조는 질 원개 모방구조인 것인, 생체모방 칩.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 점도 기반 선별부는 하나 이상의 구획을 포함하며, 둘 이상의 구획을 포함하는 경우 각 구획에 서로 점도가 상이한 점액이 주입되는 것인, 생체모방 칩.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 제1미세기둥의 크기는 가로 0.04 mm 내지 0.06 mm이며, 세로 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 기둥 간의 간격은 0.04 mm 내지 0.06 mm인 것인, 생체모방 칩.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 점도 기반 선별부는 상기 정액 시료 주입구 측으로부터 주화성 기반 선별부 측으로 갈수록 점도가 상승하는 점도 구배를 형성하며, 점도 구배를 극복할 수 있는 운동성을 가진 정자만이 상기 주화성 기반 선별부로 이동할 수 있도록 하는 것인, 생체모방 칩.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 점액은 히알루론산염 용액인 것인, 생체모방 칩.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 제2미세기둥은 상기 화학유도물질의 확산을 조절하는 것인, 생체모방 칩.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 제2미세기둥의 크기는 가로 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 세로 0.02 mm 내지 0.04 mm이며, 기둥 간의 간격은 0.03 mm 내지 0.05 mm이며, 기둥과 상기 일 측벽 사이의 거리는 0.1 mm 내지 0.3 mm인 것인, 생체모방 칩.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 상기 점도 기반 선별부 측으로부터 상기 정자 포집구 방향으로 흐르는 것인, 생체모방 칩.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 프로게스테론, 아난다마이드 또는 이들의 조합인 것인, 생체모방 칩.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 프로게스테론 및 아난다마이드가 2:1 내지 1:2의 비율로 혼합된 것인, 생체모방 칩.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 염화칼슘 및 알긴산을 포함하는 젤 형태로 상기 농도 구배 형성부에 주입되는 것인, 생체모방 칩.
    
14. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 10 pM 내지 1 μM의 농도로 주입되는 것인, 생체모방 칩.
    
15. 제1항에 있어서, 상기 주화성 기반 선별부의 타 측벽 및 복수의 제3미세기둥에 의해 형성된 대조 채널을 추가로 포함하는 것인, 생체모방 칩.
    
16. 제1항에 있어서, 상기 생체모방 칩의 재질은 PDMS, 유리 또는 이들의 조합인 것인, 생체모방 칩.
    
17. 점도 기반 선별부에 점성을 갖는 점액을 주입하는 단계; 및
    농도 구배 형성부에 정자를 유도하는 화학유도물질을 주입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 생체모방 칩의 제조 방법.
    
18. 정자 포집구에 유도된 정자를 선별하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 생체모방 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 정자는 인간의 정자인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    
20. 제18항에 있어서, 상기 정자는 인간이 아닌 동물의 정자인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    
21. 제20항에 있어서, 상기 동물은 소, 말, 개 또는 돼지인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    

Images