CN104815710A - 微流控芯片及其微通道内温度梯度场的建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明针对微流控芯片技术领域，涉及一种微流控芯片及其微通道内温度梯度场的建立方法和应用，所述微流控芯片包括：基底、第一加热单元、第二加热单元，其中，所述第一加热单元设置在所述基底的底部，所述第二加热单元设置在所述基底上，且贯穿所述微通道区域；所述微流控芯片微通道内温度梯度场的建立通过加热所述第一加热单元在微流控芯片基底底部形成均匀的温度场，通过加热所述第二加热单元在基底上的微通道区域形成温度梯度变化，进而形成温度梯度场；以有限元数值分析和温度依赖性荧光染料罗丹明B对微通道内建立的温度梯度场进行表征，本发明制备的微流控芯片能产生连续的温度梯度场，可进行细胞热生物效应研究。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，涉及一种在微流控芯片微通道内建立温度梯度场并进行细胞热生物效应研究的方法。
背景技术
微流控芯片，是当前微全分析系统（Miniaturized Total Analysis Systems）发展的热点领域。微流控芯片分析以芯片为操作平台，同时以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。它的目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，且可以多次使用。目前工作发展的重点应用领域是生命科学领域，创新多集中于分离、检测体系方面；对芯片上如何引入实际样品分析的诸多问题，如样品引入、换样、前处理等有关研究还十分薄弱，它的发展依赖于多学科交叉的发展。
基于微纳米加工工艺制备的微流控芯片分析装置在细胞生物学研究领域业已展现出巨大的应用前景，如细胞灌注式培养、药物高通量筛选、细胞病理生理学机制研究等。另一方面，温度是影响细胞功能的重要参数之一，温度不但能够调控细胞自身相关基因、蛋白表达，而且还影响细胞对外源性物理、生化因子的响应。因此，微流控芯片上进行各种细胞生物学研究应用时应考虑细胞自身的热生物学效应。
传统的细胞热生物效应研究需要将细胞分别放置在不同的温度环境下(如水浴锅)，该方式一方面需要大量细胞和试剂消耗，另一方面需要不同的温度环境，降低了分析并行性且不易动态观察细胞形态学变化。
现有技术中，有些具有温度场微流控芯片一般微通道内只形成单一或几个均匀温度场；其他通过金属微图形化工艺集成微加热器，或在微流控芯片底部不同位置放置外围温度控制元件等方法。北京工业大学报道了面向聚合酶链式反应微流控芯片的多通道智能温控装置（CN 1995319 A），其温控装置主要为三个温度传感器和三个电热膜，只能形成三个均匀温度场不能形成梯度的温度厂，且其工艺集成成本高，芯片键合难度大；北京工业大学还报道了用于生物PCR荧光定量的微流控芯片（CN 103614292 A），其温控装置主要利用的是长金属管的导热性，在不同区域实现均匀的温度，该发明也是形成几个均匀的温度场，而且长金属管直径远远高于微通道长度，因此会影响对微通道内生物样品显微镜光学的观察；中国科学院化学研究所报道了快速恒温微反应器（CN 101096929 A），装置利用导热块和温控元件来对被控单元晶型温度的快速变化和恒温控制，该装置需要外部不断调控来实现被控单元的温度变化。
目前已报道了多种微流控芯片的制备方法为了在微流控芯片上实现不同温度参数的响应，一种策略是在微流控芯片底部不同区域通过金属微图形化工艺集成微加热器和温度测量单元，或在微流控芯片底部不同位置放置外围温度控制元件（如帕尔贴元件），以此用于在微流控芯片上产生不同的温度区域。然而，上述策略要么加工工艺复杂、成本高，要么难以与微流控芯片集成，且影响芯片系统光学观察。同时，该策略还需充分考虑不同温度区域间热传导对温度控制的影响；在微流控芯片上产生不同温度区域的另一种策略是在微流控芯片上形成连续的温度梯度场，将预热和预冷的流体分为注入微流控芯片上的两侧平行微通道，在热传导作用下在两侧微通道之间的不同微通道内获得连续分布的温度梯度场，然而，该类策略需要利用流体灌注设备将外围液体引入微流控芯片，增加了微流控芯片被污染的风险，不利于芯片上进行细胞生物学研究。
基于上述原因和现有的技术，仍然需要进一步开发及优化微流控芯片微通道内建立温度梯度场的方法。
本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供一种在微流控芯片的制备方法，该微流控芯片，避免了污染和干扰，不影响芯片系统光学观察提高了分析通量，极大地降低了细胞和试剂耗量，实现了可设定的温度梯度场。
目的之二在于提供一种在微流控芯片微通道内建立温度梯度场的方法，制备工艺简易，成本低，易集成。
目的之三在于提供用一种利用本发明的微流控芯片进行细胞热生物效应研究的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种微流控芯片，包括基底11，还包括可在所述基底底部形成均匀的温度场的第一加热单元12，以及可在所述基底上的微通道区域生成温度梯度场的第二加热单元13，其中，所述第一加热单元12设置在所述基底的底部，所述第二加热单元13设置在所述基底上，且贯穿所述微通道14区域。
进一步地，所述第一加热单元12为涂覆在所述基底底部的一层铟锡氧化物镀膜。
进一步地，所述第二加热单元12为埋设在所述基底上的电阻微丝，且所述电阻微丝与所述微通道区域内多个并列的微通道14相垂直。
更进一步地，所述电阻微丝的直径小于所述微通道14的长度。
更进一步地，所述微通道14深100μm，宽500μm，长5mm。
更进一步地，所述电阻微丝长10cm。
本发明的目的之二在于提供一种利用本发明所述的微流控芯片建立温度梯度场的方法，具体的，通过所述第一加热单元12加热在微流控芯片基底底部形成均匀的温度场，通过所述第二加热单元13加热在基底上的微通道区域形成温度梯度变化，进而形成温度梯度场。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
所述微流控芯片的制备材料可采用本领域人员所熟知的材料，如：玻璃-聚二甲基硅氧烷（PDMS），温度控制采用了第一加热单元12与第二加热单元13：外围铟锡氧化物(indium tin oxid， ITO)加热器和电阻微丝，具体包括以下步骤：
第一加热单元12加热在微流控芯片底部形成均匀的温度场，第二加热单元13加热在基底上的微通道区域形成温度梯度变化，对两个加热单元进行综合控制形成温度梯度场。
1）微流控芯片ITO加热器温度控制系统的制备：
本发明通过直接在一片矩形ITO镀膜玻璃两长边通过导电银胶连接导线，从而形成具有加热区域面积的加热元件。ITO镀膜玻璃具有良好的透光性和热均匀性，通电产生焦耳热量，可加工各种加热装置集成在微流控芯片上，不影响芯片系统光学观察。
2）在微流控芯片内埋入电阻微丝：
a 将一段电阻微丝在距离微通道阳模上部沿微通道方向垂直固定；
b 将配制好的PDMS预聚物浇铸微通道阳模和电阻微丝上，抽真空除气泡，固化；
c 将固化后的PDMS基片从微通道阳模上剥离，氧等离子表面处理与载玻片进行不可逆键合。
ITO镀膜玻璃作为加热装置形成均匀的温度场，通过设置ITO加热器表面温度达到调节微通道内温度梯度场分布范围的作用；电阻微丝贯穿与整个芯片，与微通道垂直交叉，埋入微流控芯片的电阻微丝在微通道可产生温度场梯度，通过调节施加在电阻微丝上的电压来调节电阻微丝的加热功率，达到控制温度梯度的目的。
包埋在芯片内的电阻微丝通电产生焦耳热量，并通过热传导对下部微通道内溶液样品进行加热。同时，电阻微丝与微通道内液体样品不直接接触，从而最大限度的避免了污染和干扰。由于电阻微丝线径远远低于微通道长度，因此最大限度地避免了电阻微丝对微通道内生物样品显微镜光学观察的影响。
由于微通道深度远远低于微通道宽度和长度，可以近似认为沿微通道深度方向温度分布均匀，在离电阻微丝最近的微通道中部液体样品温度值最高，沿微通道长度方向液体样品温度值逐渐降低，而沿微通道宽度方向温度场分布均匀。因此，本发明建立的温度梯度场只需考虑沿微通道长度方向的温度分布，而不需要考虑沿宽度方向的温度分布，有利于简化微通道内温度梯度场控制。
更进一步，以有限元数值分析和温度依赖性荧光染料罗丹明B对微通道内建立的温度梯度场进行表针。
采用数值有限元分析联合温度依赖性荧光染料实验测量方法在研究微流控芯片系统的温度测量和控制中具有先进性，微流控芯片上温度场梯度分布通过有限元数值模拟进行考察，考虑到微通道内液体样品基本处于静止状态，故近似地认为，芯片内热传递以热传导方式，芯片与外界之间的热传递以对流为主。本研究忽略了热辐射的影响，将理论模型定义为ITO加热器和加热微丝产生的热量在微通道内的液体样品、PDMS和玻璃基底之间的热传导。微流控芯片上微通道内液体样品的温度场分布采用一个3D热传导微分方程来进行描述，控制方程为：
其中，为液体样品密度，为液体样品比热，为介质导热系数，为加热元件产生的热量。为了直观分析微通道内液体样品稳态温度梯度场的建立，采用了商业化有限元分析软件（Ansys 8.0，Ansys公司，美国）进行3D热传导仿真分析并进行结果显示。
微通道内温度场采用具有高度温度依赖性的荧光染料罗丹明B (2-3%/K)进行测量，首先将浓度为20μM的罗丹明B溶液通过加载到微通道内待溶液流动稳定。实验中分别对ITO加热器和加热微丝设置不同的温度和加热功率，待系统温度稳定后通过倒置荧光显微镜获取微通道内罗丹明B荧光图像，将图像中每一个像素减去背景后与23℃室温荧光图像像素值进行归一化处理，并根据前期建立的荧光温度校准曲线将荧光强度值换算为温度值。
本发明的另一目的在于提供用一种利用本发明的微流控芯片进行细胞热生物效应研究的方法。
为实现上述目的，具体方法包括以下步骤：
基于本发明所述的微流控芯片进行细胞热生物效应研究的方法，具体包括以下步骤：
1）将细胞预处理成细胞悬液；
2）将步骤1）所述的细胞悬液加载到预消毒处理的微流控芯片微通道内，放细胞培养箱培养；
3）通过调节微流控芯片第一加热单元与第二加热单元形成温度梯度场；
4）将微通道内细胞在温度梯度场中处理，然后PBS冲洗；
5）PBS冲洗后，在微通道内注入含Calcein AM和ethidium homodier-1(EthD-1)的荧光染料混合液，室温避光孵育后进行细胞热生物效应研究。如采用荧光显微镜下拍照，图像分析软件Image ProPlus 6.0计算细胞数目，细胞存活率定义为活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目）×100%；通过显微镜观察微通道内细胞形态等。
进一步，所述步骤2）中培养箱中细胞融合度达到90%以上后再进行步骤3）的操作。
综上所述，本发明的有益效果在于：提供了一种在微流控芯片微通道内建立温度梯度场的方法及应用，该方法制备工艺简易，成本低，易集成，且该微流控芯片，避免了污染和干扰，不影响芯片系统光学观察，实现了可设定的温度梯度场，用于细胞热生物效应研究。本发明的在含温度梯度场的微流控芯片微通道内进行研究的方法简单且易于观察，能够实现并行地分析细胞对不同温度的响应，提高了分析通量，此外，由于细胞培养和后续分析都在微通道内进行，因此极大地降低了细胞和试剂耗量。
附图说明
图1微流控芯片的结构示意图。
图2玻璃-PDMS微流控芯片微通道内温度梯度场建立的方法示意图。(A)ITO加热器与玻璃-PDMS微流控芯片位置示意图；(B)微流控芯片上电阻微丝显微图。
图3玻璃-PDMS微流控芯片微通道内温度场分布有限元分析结果示意图。(a)温度场二维分布图；(b)ITO加热器温度设置为23℃，电阻微丝施加不同加热功率时沿微通道长度方向的稳态温度分别曲线；(c)ITO加热器温度设置为37℃，电阻微丝施加不同加热功率时沿微通道长度方向稳态温度分别曲线。
图4罗丹明B溶液测量微通道内温度场分布示意图。(a)微通道内温度场的有限元数值分析结；(b)果微通道内罗丹明B荧光图像；(c)微通道沿长度方向温度场分布曲线的实验测量和有限元数值计算。
图5微流控芯片上研究肿瘤细胞T24对温度梯度场不同区域的热生物学效应示意图。(a)微流控芯片上研究T24肿瘤细胞热响应的实验装置实物图；(b)微通道内温度梯度场不同温度区间划分示意图；(c)微通道内T24肿瘤细胞在不同温度区域处理1h后的细胞存活/死亡荧光显微照片，深黑色代表细胞大多死亡，灰色代表存活细胞，标尺：100μm。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1 微流控芯片的制备方法
该微流控芯片包括：基底11，以及可在该基底11底部形成均匀的温度场的第一加热单元12，以及可在该基底11上的微通道区域生成温度梯度场的第二加热单元13，其中，该第一加热单元12设置在基底11的底部，该第二加热单元13设置在基底11上，且贯穿该基底上的微通道区域。
在本实施例中，基底11是玻璃-PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷）。该基底上的微通道采用标准软光刻工艺加工：SU-8光刻胶涂在硅片上，65℃烘烤5min，95℃烘烤15min；紫外线透过含微通道图案的透明胶片掩膜对光刻胶照射30s进行曝光，显影后获得微通道阳模。
在本实施例中，将第一加热单元12铟锡氧化物（ITO）镀膜涂覆一层在基底11底部，将第二加热单元13电阻微丝埋设在基底11上。
ITO加热器及温度控制系统设计与制作为：
通过直接在一片矩形ITO镀膜玻璃两长边通过导电银胶连接导线，从而形成具有加热区域面积的加热元件。放置在微流控芯片底部以便为微流控芯片提供均匀的温度场，通过设置ITO加热器表面温度达到调节微通道内温度梯度场分布范围的作用。
在微流控芯片内埋入集成电阻微丝，具体包括以下步骤：
1）将一段电阻微丝（直径：150μm，材质：Cr15Ni60，）在距离微通道阳模上部500μm沿微通道方向垂直固定；
2）将基质和固化剂按重量10:1混合而成的PDMS预聚物（Dow Corning， Michigan， USA）浇铸SU-8微通道阳模和电阻微丝上，抽真空除气泡，60℃下固化3h；
3）将固化后的PDMS基片从微通道阳模上剥离，利用平头打孔器（直径4mm）在微通道两侧打孔形成储液池，氧等离子表面处理(30w，1min)与载玻片进行不可逆键合。
本发明中在微流控芯片上集成电阻微丝主要目的在于在微通道内产生温度场梯度。
在本实施例中，微通道深100μm，宽500μm，长5mm，微通道深度远远低于微通道宽度和长度如图2(B)所示，电阻微丝长10cm，电阻值为7Ω，其贯穿于整个基底，并与6个微通道垂直交叉。本实施例中，可将通过导线将电阻微丝与可调自流电源相连，通过调节施加在该电阻微丝上的电压来调节其加热功率，从而达到控制温度梯度的目的。即通过控制电阻微丝通电产生焦耳热量，并通过热传导对下方的微通道内溶液样品进行加热。由于该电阻微丝设置在微通道上方500um，即其不会与微通道内液体样品直接接触，从而最大限度的避免了污染和干扰。并且由于电阻微丝的直径远远低于微通道长度，因此最大限度地避免了电阻微丝对微通道内生物样品显微镜光学观察的影响。
实施例2 在微流控芯片微通道内建立温度梯度场
微流控芯片微通道内温度梯度场由两个加热元件产生与控制，两个加热元件与微流控芯片位置关系示意图如图2(A)所示，通过加热设置在基底底部的第一加热单元12，从而在基底底部形成均匀的温度场，并在此基础上加热在基底上的第二加热单元13在微通道区域形成温度梯度变化，进而形成温度梯度场。
在本实施例中，第一加热单元12为铟锡氧化物（ITO）与第二加热单元为电阻微丝，ITO加热器设置在实施例1所述微流控芯片底部，电阻微丝贯穿与整个芯片，与微通道垂直交叉。
其中，ITO加热器及温度控制系统设计与制作为：
通过直接在一片矩形ITO镀膜玻璃两长边通过导电银胶连接导线，从而形成具有加热区域面积的加热元件。放置在微流控芯片底部以便为微流控芯片提供均匀的温度场，通过设置ITO加热器表面温度达到调节微通道内温度梯度场分布范围的作用。
微流控芯片上集成的电阻微丝主要目的在于在微通道内产生温度场梯度。在微流控芯片内埋入集成电阻微丝，具体包括以下步骤：
1）将一段电阻微丝（直径：150μm，材质：Cr15Ni60，）在距离微通道阳模上部500μm沿微通道方向垂直固定；
2）将基质和固化剂按重量10:1混合而成的PDMS预聚物（Dow Corning， Michigan， USA）浇铸SU-8微通道阳模和电阻微丝上，抽真空除气泡，60℃下固化3h；
3）将固化后的PDMS基片从微通道阳模上剥离，利用平头打孔器（直径4mm）在微通道两侧打孔形成储液池，氧等离子表面处理(30w，1min)与载玻片进行不可逆键合。
在本实施例中，微通道深100μm，宽500μm，长5mm，微通道深度远远低于微通道宽度和长度如图2(B)所示，电阻微丝长10cm，电阻值为7Ω，其贯穿于整个基底，并与微通道垂直交叉，电阻微丝的控制采用导线将电阻微丝与可调自流电源相连，通过调节施加在电阻微丝上的电压来调节电阻微丝的加热功率，达到形成温度梯度的目的。
实施例3 微流控芯片微通道内建立温度梯度场的有限元数值模拟
为研究实施例2所述的玻璃-PDMS微流控芯片微通道内建立温度梯度场的参数控制，对不同控制参数下微通道内液体样品温度响应进行了有限元数值分析。
在本实施例中，控制参数设为ITO加热器的表面温度和集成电阻微丝的加热功率，微通道内温度场分布有限元数值分析结果如图3所示。图3(a)为典型的微流控芯片上单条微通道沿长度方向的温度分布云图。该结果可知，在离电阻微丝最近的微通道中部液体样品温度值最高，沿微通道长度方向液体样品温度值逐渐降低，而沿微通道宽度方向温度场分布均匀。因此，本方法建立的温度梯度场只需考虑沿微通道长度方向的温度分布，而不需要考虑沿宽度方向的温度分布，有利于简化微通道内温度梯度场控制。该结果也证实本文提出的在玻璃-PDMS微流控芯片内建立温度梯度场方法的可行性。图3(b)和(c)为ITO加热器温度分布设置为23℃和37℃时，对电阻微丝输入不同的加热功率后沿微通道长度方向获得的稳态温度分布曲线。
实验结果显示，随着电阻微丝加热功率的增大，微通道内每个位置温度值随之增加且沿微通道长度方向温度变化梯度增大；同时，增加ITO加热器表面温度能够整体提升微通道内温度梯度场的温度分布区间，即温度梯度场的最低温度下限值。此外，有限元分析实验结果显示，降低电阻微丝与微通道内液体样品间的间隔距离也能够提高电阻微丝效率，提高对微通道内温度梯度场控制效果。
实施例4 微流控芯片微通道内温度梯度场分布的测量
通过数值有限元分析首先获得实施例2中建立的温度梯度区间分布的温度梯度场的控制参数，在本实施例中设置细胞体外耐受温度范围为37-45℃，所以ITO加热器的表面温度设定为36℃，电阻微丝加热功率设置为1650mW时，有限元数值分析结果如图4(a)所示，此时微通道底部温度分布区间为37.053-43.111℃。为进一步对有限元数值仿真结果进行验证性，本文通过罗丹明B荧光强度温度校准曲线对微通道内温度分布进行实验测试。在上述控制参数下微通道内罗丹明B溶液荧光图像如图4(b)所示，结果发现罗丹明B溶液荧光强度沿微通道长度方向随着离电阻微丝距离增加而增强，而沿微通道宽度方向荧光强度均匀，该结果与有限元数值分析结果趋势吻合。将罗丹明B荧光强度根据荧光温度校准曲线转化为温度值后获得的微通道内液体样品的温度分布曲线如图4(c)所示，微通道内温度梯度分布区间为37.1-44.5℃，与数值分析结果趋势相似，但比数值分析结果值高，其原因可能与数值有限元分析时边界条件设置和实验所处的外界条件之间的差异有关。该结果也进一步强调了发展能够测量微通道温度场分布相关实验技术的必要性。此外，本发明提出的首先通过有限元数值分析初步确定控制参数，然后通过实验测量进行校准的策略非常适合需要对微流控芯片进行热分布和控制的应用领域。
实施例5 利用微流控芯片微通道内温度梯度场，进行细胞热生物效应研究
利用实施例1所述的微流控芯片进行细胞热生物学效应研究，在本实施例中，通道内温度梯度范围为37-45℃，所述细胞为T24细胞，用含10%胎牛血清（杭州四季青），1640培养基（Gibco）常规培养，待细胞生长至对数生长期，0.25%胰酶消化，离心后用含4%葡聚糖（相对分子质量70 000，上海生工）的1640培养液重悬，制成浓度约为5×106cells/mL细胞悬液。
以细胞存活率为指标，考察了T24细胞在微通道内不同温度区域的热生物效应，将微通道内T24细胞在温度梯度场中处理30min后，PBS冲洗2次，在微通道内注入含2μmol/L Calcein AM和4μmol/L ethidium homodier-1(EthD-1)的荧光染料混合液，室温避光孵育30min，荧光显微镜下拍照，图像分析软件Image ProPlus 6.0计算细胞数目，细胞存活率定义为活细胞数目/（活细胞数目+死细胞数目）×100%。
为便于对肿瘤细胞热生物学效应并行研究和动态观察，微流控芯片微通道内建立温度梯度场进行肿瘤细胞热生物效应研究实验装置如图5(a)所示。将ITO加热器和集成了电阻微丝的微流控芯片放置在显微镜载物台上，通过显微镜搭载的CCD能够动态观察和获取微通道内的细胞形态学特征。为建立肿瘤细胞热生物学响应与温度的对应关系，根据实验测量结果在微通道上划分出不同的温度区域，其示意图如图5(b)所示。肿瘤细胞T24在微通道内不同温度区域处理30min后细胞存活/死亡荧光显微图如图5(c)所示。研究发现在同一条微通道内，细胞存活率随着区域温度值上升而下降，在37.1℃的温度区域，细胞存活率为94.8%，而在44.5℃温度区域，细胞存活率降低为1.6%。上述实施例结果与文献报道结果趋势相吻合，说明，本发明在微通道内建立的温度梯度场适宜进行细胞热生物学效应研究。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种微流控芯片，包括基底（11），其特征在于，还包括可在所述基底（11）底部形成均匀的温度场的第一加热单元（12），以及可在所述基底上的微通道（14）区域生成温度梯度场的第二加热单元（13），其中，所述第一加热单元设置在所述基底的底部，所述第二加热单元设置在所述基底上，且贯穿所述微通道（14）区域。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一加热单元（12）为涂覆在所述基底底部的一层铟锡氧化物镀膜。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第二加热单元（13）为埋设在所述基底上的电阻微丝，且所述电阻微丝与所述微通道区域内多个并列的微通道（14）相垂直。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述电阻微丝的直径小于所述微通道（14）的长度。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述微通道（14）深100μm，宽500μm，长5mm。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述电阻微丝长10cm。
7.基于权利要求1-6任一项所述的微流控芯片建立温度梯度场的方法，其特征在于，通过加热所述第一加热单元（12）在微流控芯片基底（11）底部形成均匀的温度场，通过加热所述第二加热单元（13）在基底上的微通道区域形成温度梯度变化，进而形成温度梯度场。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以有限元数值分析和温度依赖性荧光染料罗丹明B对微通道内建立的温度梯度场进行表征。
9.基于权利要求1所述的微流控芯片进行细胞热生物效应研究的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）将细胞预处理成细胞悬液；
2）将步骤1）所述的细胞悬液加载到预消毒处理的微流控芯片微通道（14）内，放细胞培养箱培养；
3）通过加热所述第一加热单元（12）在微流控芯片基底（11）底部形成均匀的温度场，通过加热所述第二加热单元（13）在基底上的微通道区域形成温度梯度变化，进而形成温度梯度场；
4）将微通道（14）内细胞在温度梯度场中处理，然后PBS冲洗；
5）PBS冲洗后，在微通道（14）内注入含Calcein AM和ethidium homodier-1(EthD-1)的荧光染料混合液，室温避光孵育后进行细胞热生物效应研究。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2）中培养箱中细胞融合度达到90%以上后再进行步骤3)的操作。
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| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170315 Termination date: 20180410 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |