CN106140338A - 微流控芯片系统及应用该系统进行等温扩增与检测的方法 - Google Patents

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Abstract

一种微流控芯片系统，包括微流控芯片和温控模块，所述微流控芯片包括基片、结构片和盖片，其中，所述基片位于微流控芯片的底部；所述结构片设置在基片之上，包含反应池；所述盖片上被配置为覆盖于所述结构片上，与结构片之间形成一密封腔，该密封腔下部为所述反应池，所述盖片在构成密封腔的一侧固化有切片石蜡；所述温控模块配置为与所述微流控芯片固定，用于对所述反应池内反应物进行加热、温度测量和温度控制。另外还可以包括检测模块。本发明的微流控芯片系统可以实现等温扩增的定量检测和定性检测。

Description

微流控芯片系统及应用该系统进行等温扩增与检测的方法
技术领域
本发明涉及生命医学检测及疾病诊断领域，尤其涉及一种微流控芯片系统，以及应用该微流控芯片系统进行等温扩增与检测的方法。
背景技术
PCR(Polymerase chain reaction)技术是一种最典型的核酸扩增方法，是分子生物学中最为核心的技术手段之一。它是以扩增周期为单位进行循环，每一个扩增周期包括变性阶段(94度，约15秒)、退火阶段(60度，约30秒)和延伸阶段(72度，约45秒)，扩增过程就是由几十个或更多这样的扩增周期不断循环来完成，一般需要2-3小时完成。PCR技术具有灵敏度高、特异性好的特点，但是存在扩增时间较长，温度控制复杂。
核酸等温扩增技术在恒定温度下就可以实现扩增，没有复杂的温度循环，无需高温变性和低温退火过程，不存在温度变化引起的时间损耗，因此其扩增速度非常快。核酸等温扩增技术中最具有代表性的如环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，它是一种新的核酸扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，在等温条件(60℃-65℃)下，1h内即能扩增1×109拷贝的靶序列。LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、快速和操作简单、耗时短、设备简单等优点。
微流控芯片在微尺度空间下，借助各类功能单元来完成生物化学反应所需的多个反应步骤，为生物医学诊断、分析化学、生命科学等领域提供了一个具有独到优势的技术平台。除了有利于实现整个检测、分析、诊断过程的自动化外，微流控芯片的反应器体积往往要显著小于传统的反应试管，这既节省了反应试剂，同时也有利于减少反应时间。因此，基于微流控芯片的等温扩增方法正日益受到各国科研人员的关注。基于微流控技术，一方面可以减少等温扩增所需的反应时间与试剂消耗，另一方面，有利于实现高通量检测，提高检测效率。因此，基于新型的加热及温控技术实现简化的高通量等温扩增，一方面有利于提高核酸检测的效率，另一方面有利于降低装置复杂度及核酸检测的成本。
目前大多数LAMP反应在离心管里进行，而且检测方法大多都是需要昂贵的、携带不方便的仪器。因此设计一种结合核酸等温扩增技术的、集成本低、可携带、适用于现场检测等特点于一身的微流控芯片系统显得尤为重要。
PCR技术存在扩增时间较长，温度控制复杂等技术缺陷。PCR法具有较高的敏感性和特异性，但它对DNA模板的要求较高，需要昂贵的PCR仪，对操作人员的熟练程度和专业水平的要求较高，这就需要研究新的检测技术。
等温扩增不需要复杂的温度控制，对DNA模板的要求也不太高，是非常好的一种替代PCR的一种新的核酸扩增技术。然而，目前进行环介导等温扩增多利用PCR仪器或者荧光定量PCR仪，但这种设备价格昂贵，体积较大，不适合于现场快速检测。
另一方面，等温扩增的结果检测主要有荧光方法、浊度方法等，荧光方法的检测灵敏度通常比浊度方法高，其系统也相对复杂一些。荧光方法中，实时荧光定量PCR仪就是其中重要的核酸扩增实时检测仪器，不过目前这类仪器主要使用离心管，需要20μL以上反应体系，检测灵敏度通常在1000个核酸分子拷贝数以上，仪器价格也比较昂贵。
目前，利用微流控芯片做等温扩增反应，存在进出口密封处理不太完善的技术缺陷。有报道采用未完全固化的聚二甲基硅氧烷(Poly dimethylsiloxane)PDMS片密封PDMS微流控芯片的进出口。未完全固化的PDMS片不易长期保存，可与未完全固化的PDMS片密封的材料也收到限制，密封效果较好的主要是玻璃和PDMS，特别是各种塑料密封困难。此外，如果在进出口处遗留一点液体将导致密封失败。然后，微流控芯片进出口的严格密封不但对于等温扩增非常必要，而且也防止扩增产物扩散导致下次反应的假阳性测定。目前的芯片的密封方式不利于现场、便携式使用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微流控芯片系统，以及应用该微流控芯片系统进行等温扩增与检测的方法。
根据本发明的一方面，提供一种微流控芯片系统，包括微流控芯片和温控模块，其特征在于：
所述微流控芯片包括基片、结构片和盖片，其中，
所述基片位于微流控芯片的底部；
所述结构片设置在基片之上，包含反应池；
所述盖片被配置为覆盖于所述结构片上，与结构片之间形成一密封腔，该密封腔下部为所述反应池，所述盖片在构成密封腔的一侧固化有切片石蜡；
所述温控模块配置为与所述微流控芯片固定，用于对所述反应池内反应物进行加热、温度测量和温度控制。
根据本发明的一具体实施方案，所述温控模块包括加热单元、测温单元和控温单元，其中，所述加热单元包括电阻加热片，用于对反应池内反应物进行加热；所述测温单元包括温度传感器，用于对所述反应池内反应物进行温度测量；所述控温单元包括PID、继电器和开关电源，用于对所述反应池内反应物进行温度控制。
根据本发明的一具体实施方案，微流控芯片系统还包括检测模块，包括光源、检测器和控制单元，用于对反应池内的反应结果进行检测。
根据本发明的一具体实施方案，所述光源为LED光源，所述检测器为光电二极管，所述控制单元分光镜、检测单元和信号输出部分。
根据本发明的一具体实施方案，微流控芯片系统还包括机械支撑结构，所述机械支撑结构用于将所述检测模块固定在温控模块上，还用于调节检测模块的垂直位移和水平位移。
根据本发明的一具体实施方案，所述微流控芯片的数量为多个。
根据本发明的一具体实施方案，所述切片石蜡的熔点为40-60℃。
根据本发明的一具体实施方案，所述盖片为透明材料。
根据本发明的另一方面，还提供应用以上所述的微流控芯片系统进行等温扩展检测的方法，其中包括：
向反应池中滴加反应液进行等温扩增反应，再滴加液体石蜡；
盖上盖片，将微流控芯片固定在温控模块上；
温控模块加热后，盖片上的切片石蜡融化充满微流控芯片的密封腔；
在反应时，进行实时观测，通过颜色比对判断是否为阳性反应；
反应结束后，停止加热，切片石蜡迅速固化密封。
根据本发明的另一方面，还提供应用以上所述微流控芯片系统进行等温扩展检测的方法，包括：
向反应池中滴加反应液进行等温扩增反应，再滴加液体石蜡；
盖上盖片，将微流控芯片固定在温控模块上；
采用温控模块加热，盖片上的切片石蜡融化充满微流控芯片的密封腔；
在反应时，采用检测模块进行实时荧光检测，获得荧光曲线；
反应结束后，停止加热，切片石蜡迅速固化密封。
通过上述技术方案，可以看出本发明的有益效果在于：
(1)通过提供包括微流控芯片、温控模块、检测模块和机械支撑结构四个部分的系统，可以进行定量检测，对某一微流控芯片上的某一个反应进行全程的实时荧光定量检测，同时在反应结束后，可以对每一个微流控芯片上的每一个反应池进行最终的荧光检测，获得定量的检测结果，实现高通量的LAMP定量荧光检测，满足多样品同时检测的需求；
(2)通过提供温控模块和一次性使用微流控芯片，可以进行定性检测，可直接比对颜色初步判断是否为阳性反应(具体来说，就是通过眼睛观察对比阴性、阳性和待测样品反应的颜色变化，定性判断待测样品反应是否为阳性反应)；
(3)本发明的系统结构简单，适合现场、基层快速检测，检测仪器小巧，非常方便现场使用，同时成本低，社区医院、乡村医院、甚至的家庭都可以使用；
(4)应用该系统进行等温扩增检测，可以非常好的确保LAMP在完全密封的情况下进行，反应结束后，温度变为室温，切片石蜡自动凝固防止液体泄漏，完全避免了扩增产物的泄漏，有效预防假阳性产生。
附图说明
图1是本发明一实施例的微流控芯片系统示意图。
图2是本发明一实施例的微流控芯片剖面示意图。
图3是本发明一实施例的检测模块和微流控芯片的光路与位置示意图。
图4是采用本发明一实施例的微流控芯片系统进行LAMP反应的实时荧光检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。下述参照附图对本发明实施方式的说明旨在对本发明的总体发明构思进行解释，而不应当理解为对本发明的一种限制。
根据本发明总体上的发明构思，提供一种微流控芯片系统，包括微流控芯片，微流控芯片包括结构片和盖片，结构片包含反应池；盖片上被配置为覆盖于所述结构片上，与结构片之间形成一密封腔，该密封腔下部为所述反应池，所述盖片在构成密封腔的一侧固化有切片石蜡；反应池内扩增反应结束后，切断温度，随着温度的下降切片石蜡迅速固化密封，完全避免了扩增产物的泄漏，有效预防假阳性产生。
以下将结合附图对本实施例的微流控芯片系统的各组成部分进行详细说明。
图1为本实施例的微流控芯片系统示意图。包括微流控芯片2和温控模块3，还可以包括检测模块1和机械支撑结构4。
其中，微流控芯片2的结构和组成参见图2所示，其包括基片26、结构片23和盖片21，结构片包括有反应池25和密封腔24，盖片上有切片石蜡22。本实施例中的基片26可以是玻璃、PDMS、塑料、金属等材质，结构上可以是独立结构，也可以与结构片是一个整体结构。
本实施例中的结构片23包括1-4个反应池，容积为6-20微升，优选为10微升，密封腔，容积为30-60微升，优选为40微升。
本实施例中盖片是玻璃、PDMS等透明材质，在对应密封腔的位置固化有切片石蜡(熔点在等温扩增温度之下，即在等温扩增反应与检测时为透明液体，便于检测；常温是固体，便于密封。)熔点小于60摄氏度，优选为48-50摄氏度。目的是在等温扩展反应室熔化成液态，而在反应停止后冷却到一定温度以下后变为固态，起到密封效果。
优选的，在本实施例中可以同时反应1个微流控芯片，也可以同时反应多个微流控芯片。
参见图2所示，本实施例典型的加热片大小为：70mm长×30mm宽，可以同时对3个微流控芯片加热。
但需要说明的是以上只是典型尺寸，可以根据实际情况有所变化。
其中，温控模块3配置为与所述微流控芯片2固定，用于对所述反应池内反应物进行加热、温度测量和温度控制。其包括加热单元、测温单元和控温单元。具体的，温控模块3可包括加热模块，温度传感器，PID、继电器和开关电源组成的控温单元。
本实施例中，典型的加热模块是电阻加热片，典型的温度传感器是贴片式Pt100测温元件。在电子加热片有一套可移动的机械卡栓，用于固定微流控芯片，使其微流控芯片的反应池在检测模块1中的检测窗口的正下方，同时可调节X轴位置。
参见图1所示，整个温控模块的典型尺寸为：210mm长×150mm宽×70mm高。
但需要说明的是以上只是典型尺寸，可以根据实际情况有所变化。其中，检测模块1包括光源、检测器和控制单元，用于对反应池内的反应结果进行检测。具体的可包括光源、检测器和控制单元。
本实施中，典型的光源是LED光源，检测器是光电二极管，控制单元包括分光镜、检测窗口、电源、信号输出等部分，采用软件控制，检测结果直接在电脑上实时显示。
参见图1所示，检测模块的典型尺寸为：60mm长×20mm宽×100mm高。相应的整个系统的典型尺寸为：60mm长×20mm宽×200mm高。
但需要说明的是以上只是典型尺寸，可以根据实际情况有所变化。
其中，机械支撑结构4用于将所述检测模块1固定在温控模块3上，还用于调节检测模块3的垂直位移和水平位移。
本实施例中，机械支撑结构4固定检测模块1在温控模块3上，同时可以通过机械支撑结构4调节检测模块1在Z轴方向的位置，以控制检测窗口与微流控芯片反应池的在Z轴上的距离。可以通过机械支撑结构4调节检测模块1在X和Y轴方向的位置，也可以通过温控模块3中的可移动机械卡栓来调节微流控芯片在X和Y轴方向的位置，也可以二者配合调节，目的是使得检测窗口可以与任何一个微流控芯片中的任何一个反应池相对应。
基于同一发明构思，还提供一种根据上述微流控芯片系统进行等温扩增反应的方法。
图3为本发明一实施例的检测模块和微流控芯片的光路与位置示意图。可以一次检测一个微流控芯片中的一个反应池，可以通过调节加热片上的可移动机械卡栓确定检测某一个微流控芯片上的某一个反应池。将检测器检测到的光信号通过转换输入到电脑中(参见图1所示)，实时显示反应池中的荧光信号。
具体操作中，在微流控芯片中滴加反应液到反应池25中，再滴加液体石蜡(常温液体状态)充满反应池25部分，部分液体石蜡进入密封腔24；然后盖上盖片，将该芯片放置在加热单元的卡槽内固定，打开温控单位，开始加热，恒温在60-65摄氏度范围内。盖片上的切片石蜡22(常温固体，熔点小于60摄氏度，优选为48-50摄氏度)迅速熔化充满微流控芯片的密封腔。扩增反应结束，检测结束后，切断温度，随着温度的下降切片石蜡迅速固化密封。
通过进行实时荧光检测，获得荧光曲线(参见图4所示)。图4是采用本发明一实施例的微流控芯片系统进行LAMP反应的实时荧光检测结果图。圆点表示阳性反应的荧光实时定量检测散点图，在13分钟处起峰，开始迅速扩增；三角表示阴性对照反应的荧光实时定量检测散点图，荧光光强未见明显改变。
上述是本发明的定量检测，下面是可替代技术方案，一种定性检测方案。
对于定性检测，可以不需要检测模块1和机械支撑结构4；温控模块3中的机械卡栓只是用于固定微流控芯片，不需要移动。另外，也不需要电脑，直接温控模块面板控制，肉眼检测，至少同时进行3个反应适用，其中一个是待测反应，另外两个为阳性和阴性对照，直接比对颜色初步判断是否为阳性反应。
上述检测采用环介导等温扩增技术(LAMP)，其能在等温(60～65℃)条件下，在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现109～1010倍的扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片系统，包括微流控芯片(2)和温控模块(3)，其特征在于：
所述微流控芯片(2)包括基片、结构片和盖片，其中，
所述基片位于微流控芯片(2)的底部；
所述结构片设置在基片之上，包含反应池；
所述盖片被配置为覆盖于所述结构片上，与结构片之间形成一密封腔，该密封腔下部为所述反应池，所述盖片在构成密封腔的一侧固化有切片石蜡；
所述温控模块(3)配置为与所述微流控芯片(2)固定，用于对所述反应池内反应物进行加热、温度测量和温度控制。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述温控模块(3)包括加热单元、测温单元和控温单元，其中，
所述加热单元包括电阻加热片，用于对反应池内反应物进行加热；
所述测温单元包括温度传感器，用于对所述反应池内反应物进行温度测量；
所述控温单元包括PID、继电器和开关电源，用于对所述反应池内反应物进行温度控制。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于还包括检测模块(1)，包括光源、检测器和控制单元，用于对反应池内的反应结果进行检测。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述光源为LED光源，所述检测器为光电二极管，所述控制单元分光镜、检测单元和信号输出部分。
5.根据权利要求3或4所述的微流控芯片系统，其特征在于还包括机械支撑结构(4)，所述机械支撑结构(4)用于将所述检测模块(1)固定在温控模块(3)上，还用于调节检测模块(3)的垂直位移和水平位移。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述微流控芯片的数量为多个。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述切片石蜡的熔点为40-60℃。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述盖片为透明材料。
9.应用权利要求1-8任一项所述的微流控芯片系统进行等温扩展检测的方法，其中包括：
向反应池中滴加反应液进行等温扩增反应，再滴加液体石蜡；
盖上盖片，将微流控芯片(2)固定在温控模块(3)上；
温控模块(3)加热后，盖片上的切片石蜡融化充满微流控芯片(2)的密封腔；
在反应时，进行实时观测，通过颜色比对判断是否为阳性反应；
反应结束后，停止加热，切片石蜡迅速固化密封。
10.应用权利要求3-5任一项所述的微流控芯片系统进行等温扩展检测的方法，包括：
向反应池中滴加反应液进行等温扩增反应，再滴加液体石蜡；
盖上盖片，将微流控芯片(2)固定在温控模块(3)上；
采用温控模块(3)加热，盖片上的切片石蜡融化充满微流控芯片(2)的密封腔；
在反应时，采用检测模块(1)进行实时荧光检测，获得荧光曲线；
反应结束后，停止加热，切片石蜡迅速固化密封。
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