CN111662804A - 用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于生命科学、分子生物学及化学的多学科检测技术领域的一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片。该微流控芯片包括：封盖层、密封层、聚二甲基硅氧烷PDMS层以及加热层构成。封盖层包括上下两层由盖玻片组成；密封层粘贴于PDMS的上表面；PDMS层由主通道串联各反应单元腔室组成，各反应腔室位于主通道左右两侧，加热层置于各反应腔室底部组成微流控芯片，用于快速检测食品中的致病微生物的核酸，无需外接驱动系统如电源、泵、阀等，不依赖循环加热仪器设备，检测速度快，特异性强，操作简便，且检测结果直接通过荧光目视方法观察。可应用于基层医疗或资源匮乏的偏远地区推广使用。

Description

用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片
技术领域
本发明属于生命科学、分子生物学及化学的多学科检测技术领域，特别涉及一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片；具体说是基于数字化环介导等温扩增的微流控芯片及在食品中致病微生物快速检测中的应用。
背景技术
食品中的致病微生物，通常是指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。常见食品致病菌主要有致病性大肠杆菌；沙门氏菌；霍乱弧菌；金黄色葡萄球菌；志贺式菌及链球菌等；近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李斯特菌、空肠弯曲菌，阪崎肠杆菌等。
随着现代生活水平的提高，食品安全问题得到了世界各国的普遍关注。每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增，且大部分是有致病微生物所引起。由此可见，食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。所以建立有效的食源性微生物检测体系，快速并且准确地完成对食品中致病菌的检测已成为保障食品安全和防止疾病传染的关键。
目前，对病原微生物检测的早期策略主要是基于病原体的分离和培养，非常耗时耗力，难以满足对突发疫情防控的要求。尽管现在普遍使用的基于免疫方法的病原微生物检测非常简便快速，特别是酶链免疫吸附技术(ELISA)，国内外研究者采用ELISA对不同的细菌进行检测，实验结果表明ELISA法对多种食源性致病菌的灵敏度和特异性较好。但ELISA对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，且对结构类似的化合物有交叉反应。聚合酶链式反应(PCR)的发展给病原微生物检测带来革命性的变化，通过PCR扩增微生物核酸，使高灵敏和高特异性检测单个微生物已成为现实，采用荧光定量PCR与数字PCR技术，甚至还能实现病原微生物的精确定量。然而，以标准品为参照物和对热循环仪的依赖使基于PCR的病原微生物核酸检测仍难以在基层医疗或资源匮乏的偏远地区推广使用。
核酸等温扩增技术突破了核酸检测对热循环设备的依赖，仅需简单的温控装置或在室温下即可实现对靶标核酸高灵敏度检测，这使构建现场快速检测平台更加容易。近年来，微流控技术的突飞猛进也为病原微生物检测提供了一个革命性的变革。通过对微流控芯片结构设计和功能化分区，可以在一块微小芯片上集成核酸提取、等温扩增与产物检测，实现一体化现场快速检测。对于食品中的致病微生物检测来说，依靠单一的手段已不能满足现阶段的检测要求。多种技术联用可大大提高检测灵敏度，并减少检测时间。因此，将微流控芯片技术引入数字化环介导等温扩增中具有重要意义，可轻松实现在分子层面上对食品中致病微生物的快速、准确、高效检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：封盖层、封闭层、聚二甲基硅氧烷PDMS层和加热层构成，封盖层分为上盖玻片1和下盖玻片4；封闭层由一层透明胶带或PET膜2组成，该胶带粘贴于PDMS层3的上表面，PDMS层由主通道串联各反应腔室8组成；各反应腔室8位于主通道左右两侧，芯片进样口6和芯片出样口7位于主通道前后两方，加热层5由陶瓷恒温加热膜片组成。
所述PDMS层的结构是采用软光刻技术制作成具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇筑聚二甲基硅氧烷，固化后形成主通道和各反应腔室；各反应腔室位于主通道两侧，每个腔室可作为独立反应单元，用于环介导等温扩增。
所述反应腔室形状为正方形。
所述封盖层与所述PDMS层可以通过化学键紧密贴合在一起；该化学键是通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基并在界面发生缩合反应生成的化学键。
所述封闭层是在芯片抽取真空后，将透明胶带或PET膜粘贴在PDMS层上面形成。
所述加热层的陶瓷恒温加热膜片置于PDMS层反应腔室底部，其加热温度为60～68℃。
所述微流控芯片通过置于真空中抽取气体，实现由通道内外气压差自发驱动的进样过程。
一种利用数字环介导等温扩增的微流控芯片进行食品中致病微生物核酸检测的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1)将模板与等温扩增反应试剂混合物混合，混合试剂具体包括内引物、外引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液以及钙黄绿素锰络合物；其中dNTPs为脱氧核糖核苷三磷酸；
2)预先将制作好的PDMS层3与下封盖层4键合，并在真空环境中除气20分钟。快速在键合后的PDMS层3表面上粘贴透明胶带或PET膜2，并再次进行抽真空除气；
3)取出芯片，利用注射器针头扎破芯片进样口6处的透明胶带，利用芯片通道和外界存在压强差，使样品溶液自发注入通道和各反应单元腔室8；
4)再次在芯片进样口6加入氟化油溶液，利用芯片通道和外界存在压强差，使氟化铀自发进入通道，将通道中多余的样品溶液冲出主通道，并将样品溶液封锁在各反应腔室8，在芯片出样口7处收集多余样品溶液；
取少量PDMS和固化剂混合液滴加在被刺破透明胶带的进出口处，并在芯片上部盖上上封盖层1；PDMS固化之后即可对芯片进行封闭；
5)将上述芯片置于陶瓷恒温加热片5上，进行核酸扩增；
6)反应结束后，通过肉眼观察颜色变化情况，若反应腔室内无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，则显示为阳性。也可利用荧光显微镜采集芯片上各反应单元的荧光信号，通过软件Image Pro计数阳性反应小室数目进行分析。
本发明的有益效果是提供的数字化环介导等温扩增的微流控芯片上集成了多个微流控结构反应单元，每个反应腔室都能单独进行环介导等温扩增，利用该芯片检测致病菌的核酸，可以省去常规PCR检测的诸多步骤，使加样、扩增、结果显示集于一体化的微流控芯片上进行，具有微型化、集成化、检测灵敏度高等优点，使得非专业人员也可以下实验条件简单的环境下进行核酸检测实验。样品的加样、扩增及结果显示均在芯片中进行，核酸扩增可在恒温环境中进行，检测结果可通过肉眼或荧光显微镜下进行读取。可通过将芯片置于真空中抽取气体，实现压力差自主驱动进样；每个反应腔室可作为一个独立的反应单元，每个反应单元都能单独进行环介导等温扩增，不仅能够进行通量化操作，还大大提高扩增效率。能够有效简化配套仪器结构。本发明具有高灵敏度、特异性、对样本容忍程度高等特点。操作简便，检测通量高，速度快。可应用于基层医疗或资源匮乏的偏远地区推广使用。
附图说明
图1为数字环介导等温扩增的微流控芯片的整体结构示意图。
图2为微流控芯片通道示意图。
附图标记说明：1-上盖玻片；2-透明胶带或PET膜；3-PDMS层；4-下盖玻片；5-陶瓷恒温加热片；6-芯片进样口；7-芯片出样口；8-反应腔室。
具体实施方式
本发明提供一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片。该芯片上集成了多个微流控结构反应单元，每个反应腔室都能单独进行环介导等温扩增，在短时间内得到大量拷贝数的靶基因序列，从而检测样本的阴阳性。利用该芯片检测微生物核酸，使加样、扩增、结果显示都集成于微流控芯片上进行，不依赖其它仪器设备，检测速度快，特异性强，操作简单，检测结果方便读取。下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1所示为数字环介导等温扩增的微流控芯片的整体结构示意图。图中所示微流控芯片包括：封盖层、封闭层、聚二甲基硅氧烷PDMS层和加热层构成，其中封盖层分为上盖玻片1和下盖玻片4；封闭层由一层透明胶带或PET膜2组成，封闭层是在芯片抽取真空后，将透明胶带或PET膜粘粘贴于PDMS层3的上表面，PDMS层由主通道串联各反应腔室8组成；该PDMS层是采用软光刻技术制作成具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇筑聚二甲基硅氧烷，固化后形成主通道和各正方形的反应腔室；各反应腔室8位于主通道左右两侧，芯片进样口6和芯片出样口7位于主通道前后两方(如图2所示)，所述加热层为陶瓷恒温加热膜片5置于PDMS层反应腔室底部，其加热温度为60～68℃。其中每个腔室可作为独立反应单元，用于环介导等温扩增。所述微流控芯片通过置于真空中抽取气体，实现由通道内外气压差自发驱动的进样过程。
所述封盖层与所述PDMS层可以通过化学键紧密贴合在一起；该化学键是通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基并在界面发生缩合反应生成的化学键。
本发明的检测原理是基于环介导等温扩增法(LAMP)，是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增；检测结果无需使用凝胶电泳等方法来观察，只需在反应溶液中预先加入钙黄绿素锰络合物，在扩增过程中dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)析出的焦磷酸根离子与锰结合，可释放出钙黄绿素。通过肉眼观察，出现黄绿色的腔室即为阳性。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，是一种适合现场快速检测的方法。下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明。
实施例1食品中E coli 16s的核酸等温扩增
采用如图1所示的数字化环介导等温扩增的微流控芯片包括：封盖层、封闭层、PDMS层和加热层。
封盖层采用0.17mm厚的盖玻片玻璃作为材料，采用等离子体处理后与PDMS层紧密贴合在一起。
PDMS层采用聚甲基硅氧烷为材料，采用软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇筑固化形成。各反应腔室为正方形(100μm×100μm×50μm)，主通道宽度为100μm。
制作完成的芯片置于真空中抽除气体，取出后用透明胶带或PET膜粘贴并封闭。
加热层采用陶瓷恒温加热膜片置于PDMS层反应腔室底部。
油相液体选用氟化油。
具体检测如下，
样品准备：采用商业化的E.coli 16s rRNA作为模板用来验证芯片性能。将模板稀释到适当浓度并与LAMP反应试剂及钙黄绿素锰络合物混合。按照50μL体系配置LAMP反应混合物：E.coli 16s rRNA模板1μL，引物FIP(40μM)2μL,引物BIP(40μM)2μL，引物F3(5μM)2μL,引物B3(5μM)2μL，dNTPs(2.5mM each)8μL,MgSO4(50mM)6μL,betaine(5mM)10μL,Bst酶2μL，Bst buffer 5μL,钙黄绿素锰络合物混合(50μM)2μL,ddH2O 8μL。
LAMP引物如下：
F3:5’GATGTGCCCAGATGGGATT3’
B3:5’GGCCTTCTTCATACACGCG3’
FIP:5’TGGTCATCCTCTCAGACCAGCTTTTTGCTAGTAGGTGGGGTAACGG3’
BIP:5’TGGAACTGAGACACGCTCCAGATTTTATGGCTGCATCAGGTTG3’
加样：将混合好的样品溶液，采用注射针刺破进样口处的透明胶带，将样品溶液加入进样口，在气压差的驱动下样品溶液自动充满各通道及反应腔室。进一步地，加入氟化油相，使其自发充满主通道去除多余的反应溶液，并将各反应腔室隔离成独立单元。
封闭：取少量的PDMS固化剂堵住进样口和出样口进行封闭。
扩增：将芯片置于陶瓷加热片装置上，加热组件恒温加热60℃，30min。
检测结果：通过稀释样品溶液使反应腔室中最多含有一个核酸分子。待反应结束后，可肉眼观察反应腔室内的颜色变化。如果有核酸分子被分配至单元反应腔室，该腔室在反应后将产生绿色信号；通过对阳性的计数就可以对起始的核酸浓度进行精确定量。

Claims (8)

1.一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：封盖层、封闭层、聚二甲基硅氧烷PDMS层和加热层构成，封盖层分为上盖玻片(1)和下盖玻片(4)；封闭层由一层透明胶带或PET膜(2)组成，该胶带粘贴于PDMS层(3)的上表面，PDMS层由主通道串联各反应腔室(8)组成；各反应腔室(8)位于主通道左右两侧，芯片进样口(6)和芯片出样口(7)位于主通道前后两方，加热层(5)由陶瓷恒温加热膜片组成。
2.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述PDMS层的结构是采用软光刻技术制作成具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇筑聚二甲基硅氧烷，固化后形成主通道和各反应腔室；各反应腔室位于主通道两侧，每个腔室可作为独立反应单元，用于环介导等温扩增。
3.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述反应腔室形状为正方形。
4.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述封盖层与所述PDMS层可以通过化学键紧密贴合在一起；该化学键是通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基并在界面发生缩合反应生成的化学键。
5.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述封闭层是在芯片抽取真空后，将透明胶带或PET膜粘贴在PDMS层上面形成。
6.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述加热层的陶瓷恒温加热膜片置于PDMS层反应腔室底部，其加热温度为60～68℃。
7.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片通过置于真空中抽取气体，实现由通道内外气压差自发驱动的进样过程。
8.一种利用数字环介导等温扩增的微流控芯片进行食品中致病微生物核酸检测的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1)将模板与等温扩增反应试剂混合物混合，混合试剂具体包括内引物、外引物、BstDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液以及钙黄绿素锰络合物；其中dNTPs为脱氧核糖核苷三磷酸；
2)预先将制作好的PDMS层(3)与下封盖层(4)键合，并在真空环境中除气20分钟；快速在键合后的PDMS层(3)表面上粘贴透明胶带或PET膜(2)，并再次进行抽真空除气；
3)取出芯片，利用注射器针头扎破芯片进样口(6)处的透明胶带，利用芯片通道和外界存在压强差，使样品溶液自发注入通道和各反应单元腔室(8)；
4)再次在芯片进样口(6)加入氟化油溶液，利用芯片通道和外界存在压强差，使氟化铀自发进入通道，将通道中多余的样品溶液冲出主通道，并将样品溶液封锁在各反应腔室(8)，在芯片出样口(7)处收集多余样品溶液；
取少量PDMS和固化剂混合液滴加在被刺破透明胶带的进出口处，并在芯片上部盖上上封盖层(1)；PDMS固化之后即可对芯片进行封闭；
5)将上述芯片置于陶瓷恒温加热片(5)上，进行核酸扩增；
6)反应结束后，通过肉眼观察颜色变化情况，若反应腔室内无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，则显示为阳性；也可利用荧光显微镜采集芯片上各反应单元的荧光信号，通过软件Image Pro计数阳性反应小室数目进行分析。
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