CN105505761A - 一种数字等温核酸检测装置及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种数字等温核酸检测装置,其包括微流控芯片、温控系统及压力驱动系统,所述微流控芯片通过基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间;温控系统包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板,所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件;压力驱动系统连接于所述微流控芯片,用于向微流控芯片内通道层施加压力,以使待测液自流入端流入反应区间内。本案公开的数字等温核酸检测装置及检测方法实现微滴制备、核酸扩增检测于一体,具有灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学核酸检测装置,特别涉及一种用于核酸数字等温扩增的微流控装置及其检测方法。
背景技术
当前生物医学研究正从整体和细胞水平深入到分子水平。核酸是细胞内一类重要的生物分子,参与调控细胞的大部分功能,如基因的表达和沉默、细胞器组成以及细胞行为调控等。了解核酸在不同细胞的含量与分布对深入研究其功能及其背后生物学意义至关重要,对恶性肿瘤、艾滋病、遗传性疾病的诊断和治疗具有重要意义。
现有的核酸检测主要采用聚合酶链式反应技术(PCR),PCR方法灵敏度高、特异性好,是目前最常用的基因诊断方法。然而PCR方法操作起来较复杂,对仪器和人员要求比较高,不适合基层或现场快速诊断。而且有些样品稀少无法在实验室培养,样品量不足以进行传统的PCR核酸分析,例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等,这些都是核酸分析遇到的难题。
等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术包括环介导核酸等温扩增技术LAMP、滚环扩增技术RCA、单引物等温扩增SPIA、依赖解旋酶的等温扩增技术HAD、链替代扩增SDA、交叉引物扩增技术CPA等。等温扩增技术具有操作简便、反应时间短、灵敏度高等优点,适合快速诊断领域。但现有的等温扩增技术无法实现样品的准确和绝对定量,限制了其应用。
数字PCR(DigitalPCR)技术是20世纪末由Vogelstein等人提出的一种高灵敏度核酸检测和定量方法。数字PCR通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中,在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),实现“单分子模板PCR扩增”,扩增结束后,通过呈现阳性阴性信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析,可以实现真正意义上的绝对定量分析。现有的数字PCR技术多采用流式检测技术,对仪器要求较高,且检测时间长,无法满足核酸现场快速检测需求。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处,本发明提供一种便携式、快速、灵敏、可绝对定量的数字等温核酸扩增装置。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,本发明通过以下技术方案实现:
一种数字等温核酸检测装置,其包括,
微流控芯片,其通过呈片层结构的基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间;
温控系统,其包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板,所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件,所述温控加热元件为加热片,所述温度传感芯片及所述温控加热元件均贴合于施压面设置;
压力驱动系统,其连接于所述微流控芯片,用于向微流控芯片内通道层施加压力,以使待测液自流入端流入反应区间内。
优选的是,其中,所述压力驱动系统为真空负压系统或由注射泵驱动的正压系统。
优选的是,其中,所述微流控芯片包括依次相连的加样孔、流动相孔、生成微滴乳液的微通道、用于核酸扩增及检测的反应腔及设于所述微流控芯片尾端的的反应腔孔。
优选的是,其中,所述压力驱动系统选用真空负压系统时,真空负压系统通过管路与反应腔孔相连,且所述真空负压系统通过电磁阀控制其与所述反应腔孔之间的连接,所述管路末端与所述反应腔孔之间通过橡胶圈压紧密封;所述真空负压系统与所述反应腔孔之间还设置有缓冲瓶。
优选的是,其中,所述加样孔体积为5μl~50μl;所述流动相孔体积为40μl~200μl;所述微通道宽度为10μm~200μm,所述微通道深度为10μm~200μm;所述反应腔深度为10μm~200μm。
优选的是,其中,所述基板层的材料选用玻璃、聚二甲基硅氧烷/聚甲基丙烯酸甲酯/聚碳酸酯、聚四氟乙烯、耐热透明胶带、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜中的一种;所述通道层的材料选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃或聚四氟乙烯中的一种;所述盖片层的材料选用玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的一种。
优选的是,其中,所述基板层、所述通道层及所述盖片层层合方式为热键合、耐热透明胶带粘合、耐热胶粘合或氧气等离子体处理中的一种,层合后采用0.5~5%含氟硅烷进行表面疏水处理。
优选的是,其中,所述通道层选用聚二甲基硅氧烷制成,所述基板层及所述盖片层表面在层合前需用聚二甲基硅氧烷预先包被处理。
优选的是,其中,所述压力驱动系统为由注射泵驱动的正压系统,所述正压系统通过管路与样品孔和流动相孔分别相连,所述样品孔及所述流动相孔与所述管路连接处通过橡胶圈压紧密封。
进一步地,本发明针对上述数字等温核酸检测装置还提供了以下使用方法,通过以下步骤实现:
步骤1、将目标DNA分子同等温扩增反应试剂混合,加至样品孔中,将含有氟化表面活性剂的氟化油加至流动相孔中;
步骤2、当压力驱动系统为真空负压系统时,将真空负压系统同反应腔连接管路用橡胶圈压紧密封,抽真空,使真空度达到5~50kPa,待真空度稳定后,打开电磁阀;
当压力驱动系统为注射泵正压系统时,将注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连,管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封,打开注射泵开关;
步骤3、样品和氟化油在压力作用下流动并通过流体剪切作用生成微滴,微滴在压力作用下进入反应腔,样品全部生成微滴后,用耐热胶带将进样口和反应腔口密封;
步骤4、调节温控系统使芯片温度达到核酸扩增合适温度,保持合适温度至核酸扩增结束;
步骤5、扩增结束后,对微流控芯片反应腔中微滴进行荧光显微拍照,通过软件计算阳性微滴与阴性微滴数目,计算目标DNA拷贝数。
本发明至少包括以下有益效果:
1)本发明将数字PCR技术同核酸等温扩增技术相结合,克服了传统等温扩增技术无法准确和绝对定量的问题;
2)本发明利用微流控芯片集成化、微型化特点,实现了样品微滴制备、核酸扩增及检测于一体,简化了操作流程,有效防止了外界污染和核酸交叉污染;
3)采用对反应腔中微滴荧光拍照的方式检测,同传统流式检测技术相比,速度更快,对设备要求更低,便于分析设备的便携化和微型化;
4)本发明采用微滴作用核酸扩增和检测单元,同微孔式和微腔式相比,芯片结构简单,降低了芯片设计加工难度;
5)本发明结构操作简单,无需配套PCR仪器和数字PCR检测系统,其应用成本较目前数字PCR仪器大大减少,可用于基层临床检测等。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是本发明一实施例所述的数字等温核酸检测装置结构示意图;
图2是本发明一实施例所述的数字等温核酸检测装置中微流控芯片结构示意图;
图3是本发明一实施例所述的数字等温核酸检测装置荧光显微镜拍照结果;
微流控芯片-1;温控系统-2;压力驱动系统-3;管路-4;温控加热元件-5;温度传感芯片-6;流动相孔-7;加样孔-8;微通道-9、反应腔-10;反应腔孔-11;盖片层-101;通道层-102;基板层-103。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
参见图1,一种数字等温核酸检测装置,其由微流控芯片、压力驱动系统、温控系统、管路组成,温控系统包括温控加热元件和温度传感芯片,其中温控加热元件采用加热片形式,贴合在微流控芯片上下两侧。
压力驱动系统可以采用真空负压系统和注射泵驱动的正压系统。真空负压系统通过管路与反应腔相连并通过电磁阀控制二者之间连接,真空负压系统同反应腔之间设置缓冲瓶,管路末端与反应腔之间通过橡胶圈压紧密封。注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连,管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封。
参见图2所示,所述微流控芯片包含样品孔、流动相孔、微通道、反应腔;其由基板层、通道层和盖片层组成,盖片层设有样品孔和流动相孔,样品孔、流动相孔和反应腔通过微通道相连。微通道中含十字交叉或斜向交叉结构,样品和流动相在压力作用下流过微通道时,通过流体剪切作用实现微滴生成。芯片微通道宽度在10μm到200μm,微通道深度在10μm到200μm之间,加样孔体积在5μl到50μl,流动相孔体积在40μl到200μl之间,反应腔深度在10μm到200μm之间。
通道层以PDMS为材料,具体制作步骤如下:
(1)采用计算机程序流体仿真模拟,设计通道层微通道与反应腔,绘制掩膜板;
(2)利用聚合物软光刻技术,制作SU-8模具;
(3)在SU-8模具表面浇注PDMS溶液,固化后打孔、键合。
基板层选用PMMA、玻璃、PC中的一种,选用玻璃时表面用PDMS预先包被。
将通道层和基板层分别暴露在氧气等离子体下处理2~10min,70~90度条件下热压键合10~30min。
盖片层选用PMMA、玻璃、PC中的一种,选用玻璃时表面用PDMS预先包被。
将通道层和盖片层分别暴露在氧气等离子体下处理2~10min,70~90度条件下热压键合10~30min。
芯片键合完成后用氟硅烷处理通道表面,使其表面具有疏水特性。
使用时,压力控制系统通过真空负压装置或者注射泵正压驱动样品和流动相进入通道,并形成微滴,之后驱动微滴进入反应腔中,当样品完全进入反应腔中后,关闭真空系统电磁阀或者注射泵。
将压力控制系统同芯片断开连接,用耐热胶带密封样品孔、流动相孔和反应腔孔,调节温控系统,进行核酸等温扩增。
本实施例提供的用于数字等温核酸扩增的微流控检测装置的设计与制备方法,包括微流控芯片的设计、加工、键合,温控系统的设计和压力驱动系统的设计。通过采用聚合物软光刻技术,制作基于SU-8模具的PDMS-玻璃纳升级微反应器芯片。利用紫外光刻工艺,和半固化封装键合的方法将PDMS薄层和盖片稳定键合。最后利用氟硅烷处理芯片,以改善通道表面疏水特性。本实施例具有集成化、微型化、自动化特点,适用于基层临床检测。
实施例2
数字等温核酸扩增反应
本实施例采用实施例1中的核酸检测装置,进行后续的数字等温核酸扩增反应。
微流控芯片结构及设计加工同实施例1,采用结核分支杆菌作为反应模板考察装置性能,将模板DNA稀释至适当浓度并与适量的LAMP反应试剂混合:
(1)将结核分枝杆菌DNA溶解稀释为5pg/ul;
(2)按照20ul体系配制LAMP反应混合物:
LAMP引物如下:
FIP:CGTGGTCCTGCGGGCTTTG-GCCAGATGCACCGTCG
BIP:ATCGCTGATCCGGCCACAG-CCCACAGCCGGTTAGGT
F3:CGTGAGGGCATCGAGGT
B3:ACACATAGGTGAGGTCTGCT
加20μl样品至样品孔,加60~120μl氟化油至流动相孔,将真空系统同反应腔连接,抽真空,使真空度达到15~40Kpa。打开真空系统电磁阀,样品在真空负压作用下剪切生成微滴乳液。当样品完全生成微滴后,断开真空系统电磁阀。
用耐热胶带密封样品孔、流动相孔和反应腔孔,将芯片和温控装置贴紧,调节温控装置至60~65度,加热30~50min对核酸进行等温扩增。反应结束后荧光显微镜拍照,如图3所示。
当微滴中包含目标DNA分子时,扩增后微滴呈现阳性荧光信号,通过计算阳性微滴与阴性微滴数字,根据泊松分布可对模板DNA分子精确定量。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
本发明提供的用于数字等温核酸扩增的微流控芯片装置,由芯片、压力驱动系统、温控系统、管路组成。芯片包含加样孔、微通道、反应腔等结构,微通道用于生成微滴乳液,反应腔为核酸扩增区和检测区,温控系统整合在反应腔上下两侧,压力驱动系统通过管路与反应腔或样品孔及流动相孔连接,将待检测核酸扩增反应液加至加样孔中,将流动相油相溶液加至流动相孔中,开启压力驱动系统后,样品在流体剪切作用下被包裹在油相微滴中,微滴在压力作用下流动至反应腔中,调节温控系统进行核酸扩增,反应结束后通过荧光显微镜拍照检测。本发明将数字微滴技术同等温核酸扩增相结合,实现微滴制备、核酸扩增检测于一体,具有灵敏度高、操作简便、便携微型等特点。
一种数字等温核酸检测装置及应用,由芯片、压力驱动系统、温控系统、管路组成。芯片包含加样孔、微通道、反应腔等结构,微通道用于生成微滴乳液,反应腔为核酸扩增区和检测区,温控系统整合在反应腔下部,压力驱动系统通过管路与反应腔或样品孔及流动相孔连接。
微流控芯片微通道宽度在10um到200um,微通道深度在10um到200um之间,加样孔体积在5ul到50ul,流动相孔体积在40ul到200ul之间,反应腔深度在10um到200um之间。
微流控芯片中中包含微流道、加样孔腔、反应腔。
微流控芯片由基板层、通道层和盖片组成。通道层的材料选用PDMS、PMMA、PC、玻璃或聚四氟乙烯中的一种。基板层的材料选用玻璃、PDMS/PMMA/PC、聚四氟乙烯、耐热透明胶带、PET膜中的一种。盖片的材料选用玻璃、PMMA、PC等材料。
基板层、通道层与盖片的键合方法选用热键合、耐热透明胶带、耐热胶粘合和氧气等离子体处理的键合方法。
当通道层选用PDMS材料时,基板层和盖片表面在键合前需用PDMS预先包被处理。
芯片键合完成后采用0.5~5%含氟硅烷进行表面疏水处理。
温控装置包括温控加热元件和温度传感芯片,其中温控加热元件采用加热片形式,贴合在微流控芯片上下两侧。
压力驱动系统可以采用真空负压系统和注射泵驱动的正压系统。真空负压系统通过管路与反应腔相连并通过电磁阀控制二者之间连接,真空负压系统同反应腔之间设置缓冲瓶管路末端与反应腔之间通过橡胶圈压紧密封。注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连,管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封。
本发明的另一个目的是提供所述微流控芯片装置在数字等温核酸检测中的应用,可应用于微滴制备、核酸扩增与检测,具体通过以下步骤实现:
(1)将目标DNA分子同等温扩增反应试剂混合,加至样品孔中,将含有氟化表面活性剂的氟化油加至流动相孔中;
(2)当压力驱动系统为真空负压系统时,将真空负压系统同反应腔连接管路用橡胶圈压紧密封,抽真空,使真空度达到5~50kPa。待真空度稳定后,打开电磁阀;
当压力驱动系统为注射泵正压系统时,将注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连,管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封,打开注射泵开关;
(3)样品和氟化油在负压作用下流动并通过流体剪切作用生成微滴,微滴在负压作用下进入反应腔。样品全部生成微滴后,用耐热胶带将进样口和反应腔口密封;
(4)调节温控系统使芯片温度达到核酸扩增合适温度,保持合适温度至核酸扩增结束;
(5)扩增结束后,对微流控芯片反应腔中微滴进行荧光显微拍照,通过软件计算阳性微滴与阴性微滴数目,计算目标DNA拷贝数。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种数字等温核酸检测装置,其特征在于,包括,
微流控芯片,其通过呈片层结构的基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间;
温控系统,其包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板,所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件,所述温控加热元件为加热片,所述温度传感芯片及所述温控加热元件均贴合于施压面设置;
压力驱动系统,其连接于所述微流控芯片,用于向微流控芯片内通道层施加压力,以使待测液自流入端流入反应区间内。
2.根据权利要求1所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述压力驱动系统为真空负压系统或由注射泵驱动的正压系统。
3.根据权利要求2所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述微流控芯片包括依次相连的加样孔、流动相孔、生成微滴乳液的微通道、用于核酸扩增及检测的反应腔及设于所述微流控芯片尾端的的反应腔孔。
4.根据权利要求3所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述压力驱动系统选用真空负压系统时,真空负压系统通过管路与反应腔孔相连,且所述真空负压系统通过电磁阀控制其与所述反应腔孔之间的连接,所述管路末端与所述反应腔孔之间通过橡胶圈压紧密封;所述真空负压系统与所述反应腔孔之间还设置有缓冲瓶。
5.根据权利要求4所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述加样孔体积为5μl~50μl;所述流动相孔体积为40μl~200μl;所述微通道宽度为10μm~200μm,所述微通道深度为10μm~200μm;所述反应腔深度为10μm~200μm。
6.根据权利要求1所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述基板层的材料选用玻璃、聚二甲基硅氧烷/聚甲基丙烯酸甲酯/聚碳酸酯、聚四氟乙烯、耐热透明胶带、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜中的一种;所述通道层的材料选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃或聚四氟乙烯中的一种;所述盖片层的材料选用玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的一种。
7.根据权利要求6所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述基板层、所述通道层及所述盖片层层合方式为热键合、耐热透明胶带粘合、耐热胶粘合或氧气等离子体处理中的一种,层合后采用0.5~5%含氟硅烷进行表面疏水处理。
8.根据权利要求7所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述通道层选用聚二甲基硅氧烷制成,所述基板层及所述盖片层表面在层合前需用聚二甲基硅氧烷预先包被处理。
9.根据权利要求3所述的数字等温核酸检测装置,其特征在于,所述压力驱动系统为由注射泵驱动的正压系统,所述正压系统通过管路与样品孔和流动相孔分别相连,所述样品孔及所述流动相孔与所述管路连接处通过橡胶圈压紧密封。
10.一种采用权利要求3、4、5或9中任一项所述的数字等温核酸检测装置进行检测方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
步骤1、将目标DNA分子同等温扩增反应试剂混合,加至样品孔中,将含有氟化表面活性剂的氟化油加至流动相孔中;
步骤2、当压力驱动系统为真空负压系统时,将真空负压系统同反应腔连接管路用橡胶圈压紧密封,抽真空,使真空度达到5~50kPa,待真空度稳定后,打开电磁阀;
当压力驱动系统为注射泵正压系统时,将注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连,管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封,打开注射泵开关;
步骤3、样品和氟化油在压力作用下流动并通过流体剪切作用生成微滴,微滴在压力作用下进入反应腔,样品全部生成微滴后,用耐热胶带将进样口和反应腔口密封;
步骤4、调节温控系统使芯片温度达到核酸扩增合适温度,保持合适温度至核酸扩增结束;
步骤5、扩增结束后,对微流控芯片反应腔中微滴进行荧光显微拍照,通过软件计算阳性微滴与阴性微滴数目,计算目标DNA拷贝数。
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