CN107159330A - 一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法，这种薄膜式核酸扩增微流控芯片包括依次贴合的底片、中间层和盖片，所述中间层设有通道和反应池，所述通道与反应池连接，所述盖片设有进口和出口，所述进口和出口均为通孔，所述进口、出口分别与所述通道连接，所述底片、中间层和盖片均为薄膜，所述底片、中间层和盖片均为高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃类共聚物或热塑性弹性体中的至少一种，本发明还提供了一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，这种薄膜式核酸扩增微流控芯片的温控效率高、密封性好、生物兼容性好、生产工艺简单高效，能适应不同的应用领域。

Description

一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增检测技术领域，尤其涉及一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法。

背景技术

微流控芯片是以微机电加工技术为基础，由微管路在芯片上形成网络，以可控微流体贯穿整个系统并完成各种生物和化学过程的一种技术。在微流控芯片技术发展早期，蛋白免疫芯片是市场主流；近年来，随着分子诊断市场的成熟，临床医院客户和检验检疫用户均对核酸扩增微流控芯片提出了迫切需求。

当前的检测用芯片有多种，如CN1996009B、CN101590389A、US6627159、US20050199500A1、US2004120856A1、US6919058B2、US20030166265A1、 WO9533986A1。但这些芯片均不是专用核酸扩增微流控芯片，很难满足临床用户需求。

常见的核酸扩增方法有聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）等，这些方法均涉及温度循环或温度控制，芯片需要能够随外部温控模块快速升降温。

如聚合酶链式反应(PCR)，其原理是先加热使待测双链DNA解开螺旋得到模板DNA，在退火温度条件下，引物同模板DNA进行杂交，在Taq DNA聚合酶、Mg2+ 和合适的pH缓冲液等条件下延伸引物，重复“解螺旋→杂交→延伸→解螺旋”的循环过程，重复进行25-40个PCR循环，使待测样品中的核酸拷贝数呈指数级扩大。其中，解螺旋、杂交、延伸阶段均需要温度控制，一个PCR循环就是一个温度循环过程。这就要求了核酸扩增微流控芯片必须能够快速地升降温，完成PCR的温度循环过程。

为满足临床客户对核酸扩增微流控芯片提出了温控效率高的要求，需要尽量把芯片的厚度降低，方便外界的加热装置对芯片进行温控。但是目前芯片的生产工艺主要利用注塑工艺，这种注塑工艺只能加工板式的、具备一定厚度的芯片，当芯片的厚度降低到一定程度时，由于芯片具备通道、反应池等复杂精细的结构，注塑工艺无法对其进行精密加工。由于这种生产工艺的不足，始终无法生产大批量、生产成本低、具备精细结构的薄膜式芯片。

临床上还对核酸扩增微流控芯片提出了以下要求：

1、密封性好。在核酸扩增反应期间（需承受100℃高温）不能有变形或泄露，否则核酸试剂容易形成气溶胶污染。

2、生物兼容性好。核酸扩增使用的生物试剂通常包括引物、酶等成分，芯片材质需要兼容这些成分，以确保扩增效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法，提供一种温控效率高、密封性好、生物兼容性好、生产工艺简单高效的薄膜式核酸扩增微流控芯片。

本发明是这样实现的：一种薄膜式核酸扩增微流控芯片，包括依次贴合的底片、中间层和盖片，所述中间层设有通道和反应池，所述通道与反应池连接，所述盖片设有进口和出口，所述进口和出口均为通孔，所述进口、出口分别与所述通道连接，所述底片、中间层和盖片均为薄膜，所述底片、中间层和盖片均为高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃类共聚物或热塑性弹性体中的至少一种。

采用这种薄膜式核酸扩增微流控芯片，由于其厚度小，因此可以通过外加的加热装置实现温度的快速传导，温控效率高；由于其为三层薄膜的结构，柔性好，在一定角度范围内可以能任意变形，因此可以被加工而不容易卷翘或断裂，密封性好，使用时试剂不容易泄漏。

核酸扩增反应过程中使用的生物试剂通常包括引物、酶等成分，芯片材质需要兼容这些成分，以确保扩增效率。采用上述技术方案，所述底片、中间层和盖片可以是同一种高分子材料，也可以是不同的高分子材料，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片为高分子材料，能使其与生物试剂兼容，生物兼容性良好。

进一步的，所述中间层设有镂空结构，所述镂空结构包括所述通道和所述反应池。由于镂空结构的上方和下方均为薄膜，薄膜的透明度高，在对底片、中间层和盖片进行激光焊接时，薄膜较少吸收激光，因此通道和反应池的内表面在激光焊接后仍能保持光滑，保证后续核酸扩增反应的进行。

进一步的，所述中间层为热塑性弹性体。对芯片进行激光焊接是一种简单高效的生产工艺，但对于薄膜式的芯片，激光焊接的难点在于这三层薄膜贴合后，在薄膜之间很容易形成气穴，气穴不仅造成激光焊接强度不够，而且容易形成不规则的烧痕，严重影响产品美观。而采用热塑性弹性体的中间层，由于具有弹性，薄膜之间在外界压力下不会产生气穴，避免了出现烧痕。气穴是指由于贴合不紧密，在焊接后形成的块状缺陷，缺陷内部包裹气体。

进一步的，所述底片和盖片为环烯烃类共聚物。环烯烃类共聚物的一种高透明性的高分子材料，其光线透过率可达90%以上。由于镂空结构的上方和下方均为薄膜，薄膜的透明度高，而优选为环烯烃类共聚物的透明度更高，在对底片、中间层和盖片进行激光焊接时，薄膜极少吸收激光，因此通道和反应池的内表面在激光焊接后仍能保持光滑，保证后续核酸扩增反应的进行。

进一步的，所述中间层为黑色热塑性弹性体，所述底片、盖片均为透明环烯烃类共聚物。由于激光焊接要求芯片的某一层能够吸收激光能量，一般采用两种方式 ：第一种是采用掺杂炭黑的黑色材质制成的中间层，或在中间层上涂覆吸光涂料。本发明采用黑色热塑性弹性体是使用了第一种方式，优点是不再需要涂覆工艺步骤；采用透明环烯烃类共聚物，其透明度更高，在激光焊接时候不容易吸收激光，减少了对激光对位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。

进一步的，所述底片的厚度为0.05~1mm，所述盖片的厚度为0.05~1mm，所述中间层的厚度为0.2~2mm。采用此技术方案，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的温控效率高，而且薄膜的底片和盖片，中间层更加透明，不容易吸收激光，对生产工艺的要求难度低，材料易得。采用此技术方案，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的温控效率高，满足了大部分核酸扩增反应检测的需要。

进一步的，所述通道或反应池内设有用于固态试剂，所述固态试剂包括干粉试剂和凝胶试剂。采用此技术方案，事先将反应所需酶和引物加入到所述固态试剂中，使核酸扩增反应的全过程不需要外加反应物，保证了反应的连续发生，提高检测效率。

本发明的另一个目的是提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备底片、盖片和中间层，所述底片、盖片和中间层均为薄膜；

步骤S2，在所述中间层上切/削出通道和反应池；

步骤S3，在所述盖片上加工出进口和出口；

步骤S4，将所述底片、中间层和盖片依次对位，使所述进口、出口分别与所述通道连接，使所述底片、中间层、盖片贴合压紧后进行封接；

步骤S5，封接完成，获得所述薄膜式核酸扩增微流控芯片。

现有技术中一般采用注塑工艺来生产芯片，当使用注塑工艺加工精细结构时，经常出现低平面度、熔接痕、浇口断裂等问题，很难达到设计要求；对于薄膜式芯片来说，其厚度很小，反应池和通道的结构非常精细，注塑工艺无法完成如此精细的结构，使得薄膜式芯片的生产工艺成为一个难题。

为避免注塑工艺产生的上述问题，本发明使用先切/削后封接的生产工艺：先在中间层切/削获得切口平整、结构精细的通道和反应池；再将所述底片、中间层和盖片封接贴合在一起。由于薄膜在一定角度范围内能任意变形，因此封接不容易卷翘或者断裂，密封性好。

采用上述先切/削后封接的技术方案，生产工艺简单、高效，采用这种工艺生产的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高温控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片边缘被加工后不容易卷翘或者断裂，密封性好。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，所述切/削方式包括机器冲切、机加工、裁剪、激光切割的一种或多种方式；所述步骤S3中，所述加工方式包括冲切、机加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一种或多种方式；所述步骤S4中，所述封接方式包括激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。

采用此技术方案，可以根据工厂的设备情况，采用多种方式组合进行生产加工，如采用焊接的方式进行封接，可以提高封接效率。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，所述切/削采用机器冲切方式；所述步骤S4中，先使所述底片、中间层、盖片贴合压紧，放入激光焊接设备中，再通过线激光扫描进行焊接，激光焊接时候不需掩膜。

采用机器冲切的优点是：冲切表面光滑、生产效率高、成本低。由于涉及核酸扩增反应，通道或反应池的侧壁也尽量光滑，减少生物分子吸附，提高扩增效率。机器冲切使用冲床，切口光滑，符合需求。冲切工艺是机械加工行业标准工艺，工艺成熟度高，配套厂家多，批量生产成本很低，只需使用相应的冲切模具，就能快速生产。采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。

采用热塑性弹性体的中间层，其在激光焊接时的优点是：激光焊接的难点在于薄膜对位后，在薄膜之间很容易形成气穴，气穴不仅造成激光焊接后强度不够，而且形成不规则的烧痕，严重影响产品美观。而采用弹性材料的中间层，由于具有弹性，薄膜之间在外界压力下不会产生气穴，避免了出现烧痕。

采用环烯烃类共聚物的底片和盖片，以及采用镂空结构的中间层，其在激光焊接时的优点是：激光焊接时不再需要掩膜辅助。线扫描式激光焊接设备，通常需要金属掩膜辅助，掩膜会保护通道或反应池等流体区域，激光只焊接非保护区域。但是由于光学折射、机械定位等原因，掩膜的设计位置和芯片结构位置很容易发生偏差，此时激光就会照射通道或反应池等关键区域，造成反应区域表面的粗糙化，极大影响了生物反应效率。中间层设有镂空结构，由于镂空结构的上方和下方均为薄膜，薄膜的透明度高，而优选为环烯烃类共聚物的透明度更高，因此在对底片、中间层和盖片进行激光焊接时，薄膜极少吸收激光，使通道和反应池的内表面在激光焊接后仍能保持光滑，保证后续核酸扩增反应的进行。

本发明还提供了一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的使用方法，包括当单独使用时，使用配套框架将所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的两侧固定后使用；当与提取芯片一起使用时，将所述薄膜式核酸扩增微流控芯片镶嵌入提取芯片内使用。核酸扩增检测流程包含四大模块：前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析，因此如果将所述薄膜式核酸扩增微流控芯片与提取芯片结合使用，就能使核酸扩增检测过程的芯片更加一体化、方便快速。

尽管所述薄膜式核酸扩增微流控芯片是针对核酸应用开发的，但也可用于免疫、细胞等应用。

与现有技术相比，这种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法的有益效果是：

1、密封无泄漏，薄膜式的芯片结构，并采用激光焊接的封接方式，封接面不卷翘或者断裂，能确保核酸扩增反应检测过程中试剂无泄漏。

2、温控效率高，薄膜式核酸扩增微流控芯片，热传递损耗小，升降温速度快。

3、生物兼容性，采用高分子材料，机器冲切加工后表面光滑，利于核酸扩增反应的进行。

4、生产工艺简单高效，采用先机器冲切后激光焊接的加工方式，避免注塑工艺难点，无需精密加工设备，生产效率高；底片和中间层为环烯烃类共聚物，中间层为热塑性弹性体，并采用镂空结构，这样激光焊接无气穴、无需掩膜辅助，生产合格率大大提高。

5、适用性强，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片既适合分子诊断应用，也适合免疫检测、细胞检测等应用。

附图说明

图1是一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的俯视图。

图2是一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的正视图。

图3是一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的中间层的俯视图。

图4是一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的使用方法示意图。

图5是一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的结构示意图。

附图说明：1-底片，2-中间层，21-通道，22-反应池，3-盖片，31-通孔。

具体实施方式

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，芯片制作技术和使用方法均为微流控芯片领域和生物检测领域的常规技术和方法。

实施例1

一种薄膜式核酸扩增微流控芯片，包括依次贴合的底片、中间层和盖片，所述中间层设有通道和反应池，所述通道与反应池连接，所述盖片设有进口和出口，所述进口和出口均为通孔，所述进口、出口分别与所述通道连接，所述底片、中间层和盖片均为薄膜，所述底片、中间层和盖片均为高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃类共聚物或热塑性弹性体中的至少一种。

进一步的，所述底片、中间层和盖片可以是同一种高分子材料，也可以是不同的高分子材料。

在实施例1中，薄膜的材质也可以选自下述任意一种、任意几种组成的复合体或任意几种组成的混合体：金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡胶和硅铝酸盐化合物。

采用实施例1的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其优点是：

1、温控效率高，核酸扩增芯片由于涉及温度循环，需要芯片尽量薄，降低芯片内试剂与仪器温控模块的温度差。薄膜芯片的底片、盖片均能紧密贴合温控模块，温控效率高，升降温速度很快。

2、密封性好，避免封接翘曲问题，常见的微流控芯片为板式，在封接时，封接之后的芯片经常存在翘曲现象，翘曲会引发板式微流控芯片封接面断裂，并导致试剂泄漏、流路中断等问题。而采用薄膜式芯片，在一定角度范围内芯片能够任意变形，封接牢固，不影响正常使用，这就大大降低了封接难度。

3.生物兼容性好，核酸扩增反应过程中使用的生物试剂通常包括引物、酶等成分，芯片材质需要兼容这些成分，以确保扩增效率。上述的高分子材料能使该薄膜式核酸扩增微流控芯片与生物试剂兼容，生物兼容性良好。

实施例2

在实施例1的基础上， 进一步的，所述中间层设有镂空结构，所述镂空结构包括所述通道和所述反应池。

进一步的，所述底片和盖片均为环烯烃类共聚物，优选为透明环烯烃类共聚物。

进一步的，所述中间层为热塑性弹性体，优选为黑色热塑性弹性体。

进一步的，所述底片的厚度为0.05~1mm，盖片的厚度为0.05~1mm，中间层的厚度为0.2~2mm。

实验研究发现，当底片或盖片的厚度低于0.05mm时，材料不容易选择，加工过程中也容易破损，厚度高于1mm时，在封接过程中较容易发生卷翘。当中间层的厚度低于0.2mm时，中间层很难起到支撑作用；厚度高于2mm时，封接后的芯片过厚，温控效率降低，也不利于使用和存放。经过测试发现，在底片的厚度为0.05~1mm，盖片的厚度为0.05~1mm，中间层的厚度为0.2~2mm时，此厚度的材料批量采购方便、适合批量加工，成品芯片厚度适中，不影响实际使用中的温控效率，芯片保存也很方便。

进一步的，所述通道或反应池内设有用于固态试剂，所述固态试剂在核酸扩增过程中参与反应，所述固态试剂包括干粉试剂和凝胶试剂。采用此技术方案，事先将反应所需酶和引物加入到所述固态试剂中，使核酸扩增反应的全过程不需要外加反应物，保证了反应的连续发生，提高检测效率。

所述中间层采用镂空结构，所述底片和盖片均为环烯烃类共聚物的优点是：

环烯烃类共聚物的一种高透明性的高分子材料，其光线透过率可达90%以上。中间层设有镂空结构，由于镂空结构的上方和下方均为薄膜，薄膜的透明度高，而优选为环烯烃类共聚物的透明度更高，在对底片、中间层和盖片进行激光焊接时，薄膜极少吸收激光，因此通道和反应池的内表面在激光焊接后仍能保持光滑，保证后续核酸扩增反应的进行。

所述中间层材质优选为热塑性弹性体，其优点为：

1、形成通道、反应池等主要结构，完成扩增反应。

2、避免产生气穴，对芯片进行激光焊接是一种简单高效的生产工艺，但对于薄膜式的芯片，激光焊接的难点在于这三层薄膜贴合后，在薄膜之间很容易形成气穴，气穴不仅造成激光焊接强度不够，而且容易形成不规则的烧痕，严重影响产品美观。而采用热塑性弹性体的中间层，由于具有弹性，薄膜之间在外界压力下不会产生气穴，避免了出现烧痕。

进一步的，所述中间层为黑色热塑性弹性体，所述底片、盖片均为透明环烯烃类共聚物的优点是：

由于激光焊接要求芯片的某一层能够吸收激光能量，一般采用两种方式 ：第一种是采用掺杂炭黑的黑色材质作为中间层，第二种是在中间层上涂覆吸光涂料。本发明采用黑色热塑性弹性体是使用了第一种方式，优点是不再需要涂覆工艺步骤；采用透明环烯烃类共聚物，其透明度更高，在激光焊接时候不容易吸收激光，减少了对激光对位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。

实施例3

一种如实施例1或实施例2所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备底片、盖片和中间层，所述底片、盖片和中间层均为薄膜；

步骤S2，在所述中间层上切/削出通道和反应池；

步骤S3，在所述盖片上加工出进口和出口；

步骤S4，将所述底片、中间层和盖片依次对位，使所述进口、出口分别与所述通道连接，使所述底片、中间层、盖片贴合压紧后进行封接；

步骤S5，封接完成，获得所述薄膜式核酸扩增微流控芯片。

现有技术中一般采用注塑工艺来生产芯片，当使用注塑工艺加工精细结构时，经常出现低平面度、熔接痕、浇口断裂等问题，很难达到设计要求；对于薄膜式芯片来说，其厚度很小，反应池和通道的结构非常精细，注塑工艺无法完成如此精细的结构，使得薄膜式芯片的生产工艺成为一个难题。

为避免注塑工艺产生的上述问题，本发明使用先切/削后封接的生产工艺：先在中间层切/削获得切口平整、结构精细的通道和反应池；再将所述底片、中间层和盖片封接贴合在一起。由于薄膜在一定角度范围内能任意变形，因此封接不容易卷翘或者断裂，密封性好。

采用上述先切/削、后封接的技术方案，生产工艺简单、高效，采用这种工艺生产的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高温控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片边缘被加工后不容易卷翘或者断裂，密封性好。

实施例4

在实施例3的基础上，进一步的，所述步骤S2中，所述切/削方式包括机器冲切、机加工、裁剪、激光切割的一种或多种方式；所述步骤S3中，所述加工方式包括冲切、机加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一种或多种方式；所述步骤S4中，所述封接方式包括激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。

采用此技术方案，可以根据工厂的设备情况，采用多种方式组合进行生产加工，如采用焊接的方式进行封接，可以提高封接效率。

进一步的，所述步骤S2中，所述切/削采用机器冲切方式；所述步骤S4中，先使所述底片、中间层、盖片贴合压紧，放入激光焊接设备中，再通过线激光扫描进行焊接。

采用机器冲切的优点是：冲切表面光滑、生产效率高、成本低。由于涉及核酸扩增反应，通道或反应池的侧壁也尽量光滑，减少生物分子吸附，提高扩增效率。机器冲切使用冲床，切口光滑，符合需求。冲切工艺是机械加工行业标准工艺，工艺成熟度高，配套厂家多，批量生产成本很低，只需使用相应的冲切模具，就能快速生产。

采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。

采用热塑性弹性体的中间层进行激光焊接的优点是：激光焊接的难点在于薄膜对位后，在薄膜之间很容易形成气穴，气穴不仅造成激光焊接后强度不够，而且形成不规则的烧痕，严重影响产品美观。而采用弹性材料的中间层，由于具有弹性，薄膜之间在外界压力下不会产生气穴，避免了出现烧痕。

采用环烯烃类共聚物的底片和盖片，以及采用镂空结构的中间层的基础上进行激光焊接的优点是：激光焊接时不再需要掩膜辅助。线扫描式激光焊接设备，通常需要金属掩膜辅助，掩膜会保护通道或反应池等流体区域，激光只焊接非保护区域。但是由于光学折射、机械定位等原因，掩膜的设计位置和芯片结构位置很容易发生偏差，此时激光就会照射通道或反应池等关键区域，造成反应区域表面的粗糙化，极大影响了生物反应效率。中间层设有镂空结构，由于镂空结构的上方和下方均为薄膜，薄膜的透明度高，而优选为环烯烃类共聚物的透明度更高，因此在对底片、中间层和盖片进行激光焊接时，薄膜极少吸收激光，使通道和反应池的内表面在激光焊接后仍能保持光滑，保证后续核酸扩增反应的进行。

实施例5、实施例6分别是两个优选的实施例，进一步对实施例1-4中的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备方法进行说明。

实施例5

如图1-4所示的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片，包括依次贴合的底片1、中间层2和盖片3，所述中间层2设有镂空结构，所述镂空结构包括一个通道21和一个反应池22，所述通道21与反应池22连接，所述盖片3设有一个进口和一个出口，所述进口和出口均为通孔31，所述进口、出口分别与所述通道连接，所述底片1、中间层2和盖片3均为薄膜高分子材料。

进一步的，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的长为75mm，宽为25mm；所述通道宽2mm，反应池宽5mm；所述进样口和出样口的直径均为2mm。

进一步的，所述底片为0.1mm，盖片的厚度为0.05mm，所述底片和盖片均为环烯烃类共聚物；所述中间层的厚度为0.5mm，材质为黑色热塑性弹性体。

上述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法为，包括以下步骤：

步骤S1，制备底片、盖片和中间层，所述底片、盖片和中间层均为薄膜；

步骤S2，在所述中间层上采用机器冲切的方式冲切出一个通道和一个反应池；

步骤S3，在所述盖片上采用机器冲切的方式加工出一个进口和一个出口；

步骤S4，将所述底片、中间层和盖片依次对位，使所述进口、出口分别与所述通道连接，使所述底片、中间层、盖片贴合压紧后，放入激光焊接设备中，进行线激光扫描焊接，焊接时无需掩膜辅助；需正反两次焊接；焊接时激光的功率为：300W，激光扫描速度为：80mm/s；

步骤S5，封接完成，获得所述薄膜式核酸扩增微流控芯片。

上述实施例使用的机器型号如下：冲床型号为Q35Y系列联合冲剪机，生产厂家为北京市巨星锻压机床厂。激光焊接设备型号为Work Station AT system，生产厂家为莱丹塑料焊接技术（上海）有限公司。

实施例5所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的使用方法是：如图4所示的配套框架的设有固定件（图中未示出），所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的两侧通过固定件与所述配套框架连接，然后放入配套检测仪器中使用。

采用实施例5的技术方案，得到一种用于简单反应检测的微流控芯片，这种芯片的厚度小，温控效率高，密封性好，生物兼容性好，生产工艺简单高效。

实施例6

如图5所示的另一种薄膜式核酸扩增微流控芯片，包括底片、中间层和盖片三层，所述底片、中间层和盖片依次贴合，所述中间层设有镂空结构，所述镂空结构包括一个通道21和十五个反应池22，所述通道21与反应池22连接，所述盖片上设有一个进样口和一个出样口，所述进样口、出样口均为通孔31，所述进样口、出样口分别与所述通道21连接，所述底片、中间层和盖片均为高分子材料。

进一步的，所述薄膜式核酸扩增微流控芯片的长为75mm，宽为45mm；所述通道宽1mm，反应池为圆形，直径2.5mm；所述进样口和出样口的直径均为2mm；

进一步的，所述底片的厚度为0.5mm，盖片的厚度为0.5mm，中间层的厚度为2mm；所述底片和盖片均为透明环烯烃类共聚物；所述中间层为黑色环烯烃类共聚物。

进一步的，所述反应池内有固态试剂，为固定剂包裹的Taq酶和引物。固定剂在50-60℃时可以分解，释放出酶和引物。其中，Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus (Taq )中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。

上述薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法为，包括以下步骤：

步骤S1，制备底片、盖片和中间层，所述底片、盖片和中间层均为薄膜；

步骤S2，先在中间层上用激光切割的方式切割出一个通道；再用机器冲切的方式冲切出十五个反应池。这样反应池的侧壁仍然为光滑，能减少生物吸附；

步骤S3，在所述盖片上采用激光切割的方式加工出一个进口和一个出口；

步骤S4，将所述底片、中间层和盖片依次对位，使所述进口、出口分别与所述通道连接，使所述底片、中间层、盖片贴合压紧后，放入激光焊接设备中，进行线激光扫描焊接，焊接时无需掩膜辅助；需正反两次焊接。焊接时激光的功率为：300W，激光扫描速度为：50mm/s；

步骤S5，封接完成，获得所述薄膜式核酸扩增微流控芯片。

上述实施例使用的机器型号如下：冲床型号为Q35Y系列联合冲剪机，生产厂家为北京市巨星锻压机床厂；激光焊接设备型号为Work Station AT system，生产厂家为莱丹塑料焊接技术（上海）有限公司。激光切割机器型号为LF1390，生产厂家为济南金威刻科技发展有限公司。

实施例5所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的使用方法是，包括以下步骤：

步骤A1，向所述薄膜式核酸扩增微流控芯片内加入液态反应试剂，封闭进口和出口。

步骤A2，将所述薄膜式核酸扩增微流控芯片放入配套检测仪器，底部贴近所述配套检测仪器的温控模块。

步骤A3，控制温度为50℃，保持5分钟，使得薄膜式核酸扩增微流控芯片内的固态试剂与加入的液态反应试剂混合均匀。

步骤A4，进行温度循环，扩增参数为：变性95℃ 50s，退火45℃ 30s，延伸74℃60s，进行45个循环。同时实时荧光检测。

步骤A5，反应完毕，得到实时荧光扩增曲线，与软件内预置的标准浓度曲线，对比得到各反应池内指标的浓度、阴阳性信息。

以下为检测结果：

表1 菌种检测结果

序号	菌种指标	阴阳性	浓度cfu/ml
				1	金黄色葡萄球菌	阴性	-
2	沙门氏菌	阳性	1000
				3	艰难梭菌	阴性	-
4	布鲁氏菌	阳性	100
				5	阪崎肠杆菌	阳性	1000-
6	大肠杆菌	阴性	-
				7	单核细胞增生李斯特菌	阴性	-
8	副溶血弧菌	阳性	1000
				9	铜绿假单胞菌	阴性	-
10	空肠弯曲杆菌	阳性	10000
				11	志贺氏菌	阳性	10000
12	霍乱弧菌	阴性	-
				13	溶藻弧菌	阴性	-

这里使用的配套检测仪器指的是实时荧光PCR核酸扩增仪，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术是在PCR反应体系中加热特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。

采用实施例6的薄膜式核酸扩增微流控芯片，在检测过程中，未发生泄漏，温控效率高，采用常规技术的配套检测仪器就可以实现精确的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片，包括依次贴合的底片、中间层和盖片，所述中间层设有通道和反应池，所述通道与反应池连接，所述盖片设有进口和出口，所述进口和出口均为通孔，所述进口、出口分别与所述通道连接，其特征在于，所述底片、中间层和盖片均为薄膜，所述底片、中间层和盖片均为高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃类共聚物或热塑性弹性体中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述中间层设有镂空结构，所述镂空结构包括所述通道和所述反应池。

3.根据权利要求2所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述中间层为热塑性弹性体。

4.根据权利要求3所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述底片和盖片为环烯烃类共聚物。

5.根据权利要求4所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述中间层为黑色热塑性弹性体，所述底片和盖片均为透明环烯烃类共聚物。

6.根据权利要求5所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述底片的厚度为0.05~1mm，所述盖片的厚度为0.05~1mm，所述中间层的厚度为0.2~2mm。

7.根据权利要求6所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片，其特征在于，所述通道或反应池内设有固态试剂，所述固态试剂包括干粉试剂和凝胶试剂。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1，制备底片、盖片和中间层，所述底片、盖片和中间层均为薄膜；

步骤S2，在所述中间层上切/削出通道和反应池；

步骤S3，在所述盖片上加工出进口和出口；

步骤S4，将所述底片、中间层和盖片依次对位，使所述进口、出口分别与所述通道连接，使所述底片、中间层、盖片贴合压紧后进行封接；

步骤S5，封接完成，获得所述薄膜式核酸扩增微流控芯片。

9.根据权利要求8所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述切/削采用包括机器冲切、机加工、裁剪、激光切割的一种或多种方式；

所述步骤S3中，所述加工采用包括机器冲切、机加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一种或多种方式；

所述步骤S4中，所述封接采用包括激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。

10.根据权利要求9所述的薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述切/削采用机器冲切方式；

所述步骤S4中：先使所述底片、中间层、盖片贴合压紧，放入激光焊接设备中，再通过线激光扫描进行焊接。