CN111607506A - 一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备和应用方法,涉及生物分子检测技术领域,包括多个通过通道连接的反应腔;反应腔包括由裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔;所述裂解腔上设有进样口,并与所述纯化腔上连通;所述纯化腔分别连通有预装核酸纯化液的第一储液腔和预装核酸洗脱液的第二储液腔;所述纯化腔内预封装有二氧化硅包被的磁珠并与所述预扩增腔连通;所述预扩增腔连通有预装核酸扩增稀释液的第三储液腔,并与所述扩增腔连通;解决了现有技术中的无法将裂解、纯化和扩增过程完整集成在同一芯片上,操作繁琐且在操作过程中容易被污染的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子检测技术领域,尤其涉及一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备和应用方法。
背景技术
基于核酸的诊断技术是目前分子诊断技术中最具潜力的方向之一,在疾病检测、食品安全等领域中都具有广泛的应用。在核酸的检测方法中,聚合酶链反应(PCR)技术是通过扩增特定核酸片段从而实现特定目标核酸片段检测的目的。通常情况下,核酸的检测需要经过三个步骤:核酸提取、核酸扩增以及核酸检测。
传统的核酸检测方法这三个步骤都是分立的,存在着制备和分析时间长、易受污染、灵敏度限制、程序和操作复杂等问题,通过微流体技术将核酸提取、扩增以及检测的集成有助于解决在实际应用中核酸检测相关的技术和分析限制。
目前在研究中采用的微流控芯片大多仅仅用于核酸扩增,无法将裂解、纯化和扩增过程完整集成在同一芯片上,在操作过程中需要预先进行处理后通过进样口进入芯片中进行核酸扩增和检测,或需要在操作过程中手动增加稀释液等试剂,操作繁琐且在操作过程中容易被污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备和应用方法,提供一种一体化集成的薄膜微流控芯片,用于解决现有技术中的无法将裂解、纯化和扩增过程完整集成在同一芯片上,操作繁琐且在操作过程中容易被污染的问题。
为实现上述目的,本发明提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,包括多个通过通道连接的反应腔;
所述反应腔包括由裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔;
所述裂解腔上设有进样口,并与所述纯化腔上通过第一通道连通;
所述纯化腔通过第二通道和第三通道分别连通有预装核酸纯化液的第一储液腔和预装核酸洗脱液的第二储液腔;
所述纯化腔内预封装有二氧化硅包被的磁珠并通过第四通道与所述预扩增腔连通;
所述预扩增腔通过第五通道连通有预装核酸扩增稀释液的第三储液腔,并通过第六通道与所述扩增腔连通。
进一步的,所述第二通道、第三通道与第五通道上均设有限制测试样品运动的隔离部;
所述各个通道上均设有控制测试样品流动的控制阀。
进一步的,所述扩增腔上还连通有至少一个冗余液体腔。
进一步的,所述裂解腔、所述纯化腔、所述预扩增腔以及所述扩增腔竖向依次设置。
进一步的,所述第一储液腔设置在所述纯化腔第一侧;所述第二储液腔设置在所述纯化腔第二侧。
进一步的,所述扩增腔内设有带有多个通孔的反应板;
所述反应板一侧为封闭第一薄膜,另一侧为带有小孔的第二薄膜,所述通孔与两侧薄膜层形成反应池;
所述小孔与所述通孔一一对应;
所述反应池设置至少两组,每一组至少包括三个。
进一步的,所述芯片由至少两层薄膜密封形成。
进一步的,所述薄膜为透明柔性高分子材料,所述高分子材料为聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或热塑性弹性体材料中的一种。
进一步的,所述隔离部为物理隔离带、单向膜或单向阀中的一种或几种。
进一步的,所述冗余液体腔设置两个且对应设置在所述扩增腔两侧。
进一步的,所述第一通道、第四通道分别连接到所述纯化腔顶侧和底侧。
为实现上述目的,本发明还提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法,用于制备上述任意一种所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,采用两层或两层以上的薄膜密封制成,所述密封方式采用激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。
为实现上述目的,本发明还提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,使用上任一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,包括以下步骤:
步骤一:将测试样品通过进样口进入芯片中进入裂解腔,对测试样品进行裂解,并使裂解后的测试样品进入到纯化腔;
步骤二:控制预埋在第一储液腔中的核酸纯化液挤压进入纯化腔与裂解后的测试样品混合,释放测试样品中的核酸分子;
步骤三:采用预装在第二储液腔中的核酸洗脱液进入纯化腔进行核酸提取,获得带有核酸分子的液体;
步骤四:将带有核酸分子的液体挤压进入预扩增腔,在预设温度环境下进行预扩增;
步骤五:将第三储液腔预存的核酸稀释液通入核酸预扩增腔获得混合溶液,再控制所述混合液体进入扩增腔,进行核酸扩增反应。
进一步的,所述步骤二中通过反复挤压纯化腔和第一储液腔使混合液体在纯化腔和第一储液腔内来回运动来混合核酸纯化液、测试样品和磁珠,释放测试样品中的核酸分子。
进一步的,所述步骤四中提取核酸通过挤压纯化腔和第二储液腔控制液体来回运动使核酸洗脱液溶解磁珠表面吸附的核酸分子。
进一步的,所述步骤五将混合液体挤压进入扩增腔后,各个反应腔内预先埋设有内参靶标或检测靶标,待混合液体将各个反应池填充后,控制多余液体进入冗余液体腔中。
进一步的,所述所述步骤五完成核酸扩增后采用荧光光源激发并根据各个反应池中荧光强度定性或定量判断特定靶标。
本发明提供的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片及其制备和应用方法,通过薄膜制成的芯片,由上而下依次设置的裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔;在该芯片使用过程中,样品进入裂解腔后使得芯片内部形成封闭空间,依次进行裂解、纯化、扩增反应,解决现有技术中的无法将裂解、纯化和扩增过程完整集成在同一芯片上,操作繁琐且在操作过程中容易被污染的问题,可以实现样品进结果出,整个检测过程仅需要加一次样,减小人为因素的干扰。
附图说明
图1为本发明一种薄膜式核酸扩增微流控芯片实施例一的结构示意图;
图2为本发明一种薄膜式核酸扩增微流控芯片实施例一中反应板的结构示意图;
图3为本发明一种薄膜式核酸扩增微流控芯片应用方法的实施例三流程图;
图4为本发明一种薄膜式核酸扩增微流控芯片应用方法的实施例三实例中用于体现气动活塞作用的结构图。
附图标记:
1、裂解腔 2、纯化腔 3、预扩增腔 4、扩增腔
5、第一储液腔 6、第二储液腔 7、第三储液腔 8、冗余液体腔
9、控制阀 10、隔离部 12、封闭帽 42、带有小孔的薄膜层
43、反应板 44、封闭薄膜层
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
应理解,尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件,但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此,“第一”元件可以被称为“第二”元件,而不背离本实施方案的教导。
需要说明的是,下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向,词语“底面”和“顶面”、“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
还需要注意的是,下述实施方式中所述样品意指细胞、细胞裂解产物或细胞提取物、细胞材料或病毒材料(例如多肽或核酸)的一种或多种分子的溶液;或含有非天然存在的核酸(如cDNA),也可以是任何可能含有或不含有病原体细胞、细胞组分或核酸的外部溶液。
实施例一:
在一个具体的实施方式中,提供一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,参阅图1,所述芯片由至少两层薄膜密封形成,包括多个通道连接的反应腔,在本具体实施方式中,采用两层或三层塑料薄膜制成,采用薄膜制备芯片,区别于现有研究中采用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片以及在实际产品中采用的塑料芯片,更容易控制芯片中样品的流动方向,以实现核酸提取和核酸扩增的整个过程。
在一个优选的实施方式中,所述薄膜为透明柔性高分子材料,所述高分子材料为聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或热塑性弹性体材料中的一种,需要特别注意的是,需要是透明柔性材料,透明主要便于技术人员在操作过程中直观追踪样品的反应状态,柔性主要是便于后述在于控制系统配合使用过程中通过在反应腔和通道上施加压力,示例性地气动压力,使样品和试剂混合液在各个反应腔之间移动,相应地,在采用压力的实施方案中,所述“柔性”在本方案中定义为使用一定压力挤压反应腔和通道使其变形,而不破裂、开裂等等。
在本实施方式中,所述反应腔包括由上而下依次设置的裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔;各个反应腔可以设置为任何形状,优选为球形,以减少在后续使用过程中由于外力作用下导致的破损风险,所述裂解腔、所述纯化腔、所述预扩增腔以及所述扩增腔竖向依次设置,既能提高空间利用率,同时在反应过程中辅助重力作用加快液体流动速度,所述裂解腔上设有带有封闭帽的进样口,并与所述纯化腔上通过第一通道连通,在该芯片使用过程中,样品进入裂解腔后使得芯片内部形成封闭空间,依次进行裂解、纯化、扩增反应。
所述纯化腔通过第二通道和第三通道分别连通有预装核酸纯化液的第一储液腔和预装核酸洗脱液的第二储液腔;所述第一储液腔设置在所述纯化腔第一侧;所述第二储液腔设置在所述纯化腔第二侧,即第一储液腔和第二储液腔相对设置在所述纯化腔两侧,这样有利于后续操作中分别控制核酸纯化液、核酸洗脱液进入纯化腔,减少两个过程之间的干扰;所述纯化腔内预封装有二氧化硅包被的磁珠并通过第四通道与所述与扩增腔连通,该二氧化硅包被的磁珠用于吸附核酸分子,在后续操作过程中,先将核酸纯化液与测试样品混合获得吸附有核酸分子的磁珠再使用核酸洗脱液对磁珠进行清洗实现核酸的提取;所述与扩增腔通过第五通道连通有预装核酸扩增稀释液的第三储液腔,并通过第六通道与所述扩增腔连通。
在本实施方式中,所述扩增腔上还连通有至少一个冗余液体腔,冗余液体腔主要用于收集扩增腔中多余的液体,减少大量液体滞留在扩增腔内影响核酸扩增反应过程,在本具体实施方式中,所述冗余液体腔设置两个且对应设置在所述扩增腔两侧,以便于后续操作过程中两侧同时收集进入扩增腔中多余的混合液体,进一步有利于缩短反应过程的总时间。
需要说明的是,上述第二通道、第三通道与第五通道上均设有限制测试样品运动的隔离部,主要用于阻止预装的核酸纯化液、核酸洗脱液、核酸扩增稀释液的运动,并控制各个液体在反应的各个阶段参与反应,在一个优选的实施方式中,上述隔离部为物理隔离带、单向膜或单向阀中的一种或几种。所述各个通道上均设有控制测试样品流动的控制阀,在本具体实施方式中,为了在不同的反应腔中混合两个体积的液体,密封连接通道的控制阀被启动,并且反应腔被交替加压,迫使液体来回通过通道进入各个反应腔内,以混合在其中的液体,控制阀可以具有各种形状和尺寸,可以是各种物理阀,例如蝶形阀和球阀。本实施方式中的芯片一般与控制设备配合使用,可通过气动控制设备来对各个隔离部、控制阀及反应腔进行压力作用,但应理解,还可使用其它方式向反应腔提供压力,包括各种机电致动器等。
利用热压带、单向隔离膜或者单向阀形成物理隔离部可实现试剂在薄膜芯片中的预埋,在反应需要时可借助气动控制活塞,通过挤压将隔离部挤破,连通两个物理隔离的两个区域,实现薄膜芯片中试剂预埋。
在一个优选的实施方式中,参阅图3,所述扩增腔内设有带有多个通孔的反应板;所述反应板一侧为封闭薄膜层,另一侧为带有小孔的薄膜层,所述通孔与两侧薄膜层形成反应池;所述小孔与所述通孔一一对应;所述反应池设置至少两组,每一组至少包括三个,在本具体实施方式中,反应池设置为五组,每组包括三个,相邻两组反应池相对平行排列,每一组内均埋设有预设靶标以及扩增反应需要的酶和引物,其中任一组内埋设有内参靶标,其他每组反应池内可以预埋相同的测试靶标,也可以是不同的测试靶标,用于实现多种病菌检测。
在上述实施方式中,小孔用于使带有测试样品核酸的液体进入到反应池内,并在一定程度上限制进入到反应池内的液体流出,同时可防止不同通孔之间的液体的交互,进一步确保扩增反应的顺利进行,设置三个反应池为一组并预埋相同的测试靶标,减少由于外部因素影响反应过程,而造成的后续测试结果不准确的情况发生。
在一个优选的实施方式中,上述第一通道、第四通道分别连接到所述纯化腔顶侧和底侧,即如图所示,第一通道、第四通道均设置成倒“L”形,在上述实施方式中,上述设置主要是为了阻止液体在不施加外力的情况下直接在裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔之间的通道中流动,给予液体流动一定的限制,有利于控制芯片中液体的流向,同时当给与各个反应腔压力使液体流动时由于重力作用液体流速更快,进一步节约反应时间,提高工作效率。
上述实施方式中所述的芯片在同一薄膜芯片上集成核酸提取、纯化以及扩增功能,可实现一体化的核酸检测,该一体化集成薄膜芯片主要包括裂解、纯化、预扩增以及扩增与检测四个功能区域,且四个功能区域由上而下依次设置,这样的结构设计使得芯片可以实现细胞或者致病菌的裂解、细胞或者致病菌核酸的纯化富集以及核酸的扩增,更简单,还可以缩短样品的检测时间,实现样品进结果出,整个检测过程仅需要加一次样,减小人为因素的干扰。
实施例二:
本申请提供了一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法,用于制备上述实施例一中所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,具体的,采用两层或两层以上的薄膜密封制成,所述密封方式采用激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。
在密封前还可对薄膜进行切/削处理,便于更合理的控制薄膜式核酸微流控芯片的厚度,进而有利于提高温控效率;由于薄膜的柔性较好,使得芯片边缘被加工后不容易卷翘或者断裂,密封性好,可以根据实际生产的设备情况,采用多种方式组合进行生产加工,如采用焊接的方式进行封接,可以提高封接效率,相较于现有技术中其他的一体化检测芯片结构来说这样设计的结构加工工艺更为简单,加工成本也能大大降低。
实施例三:
本申请提供一种种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,参阅图2,使用实施例一种任一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,并在检测过程中可与控制系统配合使用,包括以下步骤:
步骤一:将测试样品通过进样口进入芯片中进入裂解腔,对测试样品进行裂解,并使裂解后的测试样品进入到纯化腔;
具体的,芯片放入控制系统中,控制活塞或隔离部关闭相应的流体通道。可以通过配套的注射器将样品从进样口注入一体化薄膜芯片中,样品注入后利用封闭帽密封整个芯片,此时芯片内形成一用于反应的封闭空间,测试样品进入裂解腔内。上述步骤中对测试样品进行裂解过程中可以通过控制温度或挤压裂解腔的方式实现。
步骤二:打开第二通道上的隔离区,将预埋在第一储液腔中的核酸纯化液挤压进入纯化腔,待核酸纯化液进入纯化腔后并充分混合,释放测试样品中的核酸分子,并挤压混合液体进入第一储液腔并关闭第二通道上的隔离区;
作为本发明的进一步改进,所述步骤三中通过反复挤压纯化腔和第一储液腔使混合液体在纯化腔和第一储液腔内来回运动来充分混合核酸纯化液、测试样品和磁珠,释放测试样品中的核酸分子,使核酸分子吸附在磁珠上。
在上述实施方式中,通过挤压薄膜的方式实现反应液体的运动,进而实现液体与磁珠的充分混合,使磁珠能充分吸附核酸分子,进而实现对核酸分子的充分释放,这种往复运动的方式区别于现有技术中设置多个纯化腔的方式,既节约了芯片的使用空间,又确保纯化过程的顺利实现。
步骤三:打开第三通道上的隔离区,将预装在第二储液腔中的核酸洗脱液挤压进入纯化腔,溶解磁珠表面吸附的核酸分子,进行核酸提取,获得带有核酸分子的液体;
作为本发明的进一步改进,所述步骤三中溶解磁珠表面吸附的核酸分子,通过挤压纯化腔和第二储液腔使混合液体来回运动。
在上述实施方式中,步骤二将核酸分子吸附在磁珠表面,步骤三则是将吸附出的核酸分子溶解获得含有核酸分子的溶液以便与后续扩增反应,采用与步骤二中类似的来回混合的方式,操作简便,提高效率。
步骤四:打开第四通道上的控制阀,将带有核酸分子的液体挤压进入预扩增腔在预设温度环境下进行预扩增,完成预扩增;
在上述实施方式中,预扩增采用预设温度环境下热循环预扩增的方式实现。
步骤五:打开第五通道上的隔离区,将第三储液腔预存的核酸稀释液通入核酸预扩增腔,混合后,打开第六通道上的控制阀,将混合液体挤压进入扩增腔,进行核酸扩增反应。
上述步骤五种扩增腔中的各个反应池中预埋有PCR反应的引物、DNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸))以及反应所需的酶,以便于满足在反应池中完成核酸扩增的反应条件。
在上述实施方式中,所述步骤六将混合液体挤压进入扩增腔后,各个反应腔内预先埋设有内参靶标或检测靶标,待混合液体将各个反应腔均填充满后,挤压扩增腔使多余液体进入冗余液体腔中。
所述步骤五完成核酸扩增后采用荧光光源激发并根据各个反应池中荧光强度定性或定量判断特定靶标。
在上述实施方式中,可以利用荧光定量PCR技术来实现对核酸检测结果的定量判断,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术是在PCR反应体系中加热特异性的荧光染料或探针,荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加,通过检测荧光信号达到定量的目的;扩增腔中每种靶标设有3个反应腔,并保证相同的靶标检测反应可同时重复3次,此外,扩增腔中同时设定一种内参靶标,判断内参靶标对应的三个反应池中扩增的荧光强度,只有当内参靶标的三个位置的荧光强度有两个以上达到所设定的阈值后,才能确定该次检测过程有效。针对每种特定的检测靶标,只有该靶标的三个反应池的荧光强度有两个或两个以上达到所设定的阈值后才能判定样品中存在该靶标。如三个反应腔的荧光强度中仅有一个达到所设定的阈值后,则判定该样品为疑似,这样的设置可以为检测结果的准确性提供保证。
定量标准可以具有不同的正向或反向引物或者相同的正向和反向引物,并且作为举例而非限定的,采用具有特定的荧光探针或其它可鉴定的标签,本申请中荧光激发包括例如化学发光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光、机械发光、结晶发光、热致发光、声致发光、和其它形式的光致发光、酶促、放射性等等。
具体上述芯片与控制系统配合使用,控制各个反应腔内液体进出或运动可以是通过气动活塞挤压的方式实现。
具体以检测呼吸道感染的病菌为例,参阅图1和图4,检测过程如下:
分别在裂解腔、第一储液腔、第二储液腔、第三储液腔内预埋裂解液、核酸纯化液、核酸洗脱液、扩增稀释液;在扩增腔内第一组反应池中预埋酵母或者噬菌体作为内参靶标,在其他组反应池中预埋百日咳杆菌、肺炎衣原体或肺炎支原体等作为检测靶标;纯化腔内设有若干磁珠,还假设每一反应腔上均有气动控制活塞控制挤压或被挤压。
通过配套的注射器将样品通过进样口注入一体化薄膜芯片中,样品注入后利用封闭帽密封整个芯片并将芯片放入控制系统中,当样品进入裂解腔1中,控制裂解腔1与纯化腔2之间的控制阀关闭,在裂解腔中反应实现裂解,裂解完成后,控制控制阀打开,启动气动活塞11将已裂解的样品挤压进入纯化腔2中,打开控制气动活塞51将预埋在第一储液腔5中的核酸纯化液挤压进入纯化腔2,在挤压过程中隔离部被打开,待核酸纯化液进入纯化腔2后与二氧化硅包被的磁珠混合后,关闭控制气动活塞51,打开气动活塞21,重新将样品挤入第一储液腔51,通过对气动活塞21以及气动活塞51的启动与关闭控制,将裂解的样品与磁珠的混合液在第一储液腔5和纯化腔2中回来挤压混合,待样品与二氧化硅包被的磁珠充分混合后,打开纯化腔2处的电磁铁,使得磁珠停留在纯化腔2中,将液体挤入第一储液腔5,关闭第一储液腔5与纯化腔2之间的控制阀,打开第二储液腔6与纯化腔2之间的隔离部,通过气动活塞61将预装在第二储液腔6中的核酸洗脱液挤压进入纯化腔2,通过气动活塞21和气动活塞61将磁珠与核酸洗脱液充分混合,待磁珠表面吸附核酸分子被完全溶解后,保留液体在纯化腔2中,关闭第二储液腔6与纯化腔2之间的控制阀,打开气动活塞21和纯化腔2与预扩增腔3之间的控制阀,将液体挤压进入预扩增腔3中,待液体进入预扩增腔3后,关闭控制阀,将带有测试样品的液体在预扩增腔3中进行热循环预扩增,预扩增完成后,打开预扩增腔3与第三储液腔7之间的隔离部,通过第三储液腔7上的气动活塞71将核酸稀释液通入核酸预扩增腔3,通过气动活塞71和气动活塞31将稀释液与预扩增产物来回晃动充分混合,混合完成后,打开预扩增腔3与扩增腔4之间的控制阀,将混合液通入扩增腔4,待溶液将各个反应池填充满后,打开扩增腔4上的气动活塞41,再将冗余液体挤入冗余液体腔8。在反应池内进行热循环扩增,扩增完成后,通过荧光光源激发,通过摄像头或者CCD(荷藕合器件图像传感器)记扩增腔4中各个孔中的荧光强度,根据特定位置设定的靶标种类确定样品中是否存在特定的检测靶标。
需要说明的是,裂解1上对应设置有气动活塞11,纯化腔2上对应设置有气动活塞21;预扩增腔3上对应设置有气动活塞31;扩增腔4上对应设置有气动活塞41;第一储液腔5、第二储液腔6、第三储液腔上对应设置有气动活塞51、61、71;以上打开各个反应腔上对应设置的气动活塞均可给予各个反应腔压力,关闭则撤去施加的压力。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述,不代表实施例的优劣。
通过以上的实施方式的描述,本领域的技术人员可以清楚地了解到上述实施例方法可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现,当然也可以通过硬件,但很多情况下前者是更佳的实施方式。
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (17)
1.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
包括多个通过通道连接的反应腔;
所述反应腔包括由裂解腔、纯化腔、预扩增腔以及扩增腔;
所述裂解腔上设有进样口,并与所述纯化腔上通过第一通道连通;
所述纯化腔通过第二通道和第三通道分别连通有预装核酸纯化液的第一储液腔和预装核酸洗脱液的第二储液腔;
所述纯化腔内预封装有二氧化硅包被的磁珠并通过第四通道与所述预扩增腔连通;
所述预扩增腔通过第五通道连通有预装核酸扩增稀释液的第三储液腔,并通过第六通道与所述扩增腔连通。
2.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述第二通道、第三通道与第五通道上均设有限制测试样品运动的隔离部;
所述各个通道上均设有控制测试样品流动的控制阀。
3.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述扩增腔上还连通有至少一个冗余液体腔。
4.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述裂解腔、所述纯化腔、所述预扩增腔以及所述扩增腔竖向依次设置。
5.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述第一储液腔设置在所述纯化腔第一侧;所述第二储液腔设置在所述纯化腔第二侧。
6.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述扩增腔内设有带有多个通孔的反应板;
所述反应板一侧为封闭第一薄膜,另一侧为带有小孔的第二薄膜,所述通孔与两侧薄膜层形成反应池;
所述小孔与所述通孔一一对应;
所述反应池设置至少两组,每一组至少包括三个。
7.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述芯片由至少两层薄膜密封形成。
8.根据权利要求7所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述薄膜为透明柔性高分子材料,所述高分子材料为聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或热塑性弹性体材料中的一种。
9.根据权利要求2所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述隔离部为物理隔离带、单向膜或单向阀中的一种或几种。
10.根据权利要求3所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述冗余液体腔设置两个且对应设置在所述扩增腔两侧。
11.根据权利要求1所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
所述第一通道、第四通道分别连接到所述纯化腔顶侧和底侧。
12.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的制备方法,用于制备上述权利要求1-11中任意一种所述的一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于:
采用两层或两层以上的薄膜密封制成,所述密封方式采用激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。
13.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,使用上述权利要求1-11所述的任一种薄膜式核酸扩增微流控芯片,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:将测试样品通过进样口进入芯片中进入裂解腔,对测试样品进行裂解,并使裂解后的测试样品进入到纯化腔;
步骤二:控制预埋在第一储液腔中的核酸纯化液挤压进入纯化腔与裂解后的测试样品混合,释放测试样品中的核酸分子;
步骤三:采用预装在第二储液腔中的核酸洗脱液进入纯化腔进行核酸提取,获得带有核酸分子的液体;
步骤四:将带有核酸分子的液体挤压进入预扩增腔,在预设温度环境下进行预扩增;
步骤五:将第三储液腔预存的核酸稀释液通入核酸预扩增腔获得混合溶液,再控制所述混合液体进入扩增腔,进行核酸扩增反应。
14.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,其特征在于:
所述步骤二中通过反复挤压纯化腔和第一储液腔使混合液体在纯化腔和第一储液腔内来回运动来混合核酸纯化液、测试样品和磁珠,释放测试样品中的核酸分子。
15.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,其特征在于:
所述步骤四中提取核酸通过挤压纯化腔和第二储液腔控制液体来回运动使核酸洗脱液溶解磁珠表面吸附的核酸分子。
16.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,其特征在于:
所述步骤五将混合液体挤压进入扩增腔后,各个反应腔内预先埋设有内参靶标或检测靶标,待混合液体将各个反应池填充后,控制多余液体进入冗余液体腔中。
17.一种薄膜式核酸扩增微流控芯片的应用方法,其特征在于:
所述步骤五完成核酸扩增后采用荧光光源激发并根据各个反应池中荧光强度定性或定量判断特定靶标。
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