CN114768894B - 一种检测芯片及检测方法 - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明提供一种检测芯片及检测方法，该检测芯片包括气道层、弹性膜层、流体层及底层。本发明的检测芯片集成了样品前处理和PCR核酸扩增功能，可应用于病原微生物等的检测，其中，芯片借助外部气压控制芯片中的微阀开合，活塞驱动微流道中的液体流动，外设加热设备可实现与芯片相连的PCR管的加热。该芯片能够实现病原微生物检测所需的所有功能，包括：细胞裂解、裂解溶液和PCRmix混合、混合液平均分配到与芯片相连的多个PCR管中、PCR扩增、荧光检测器实时记录PCR过程。一体化、自动化的操作流程使用方便、避免操作人员感染、提高了结果的准确性。本发明可望加速病原微生物检测技术的发展，在医院得到广泛使用。

Description

一种检测芯片及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种检测芯片及检测方法。
背景技术
病原微生物造成的感染性疾病是人类的一大杀手。病原微生物包括病毒、支原体、细菌、真菌和寄生虫等。目前，感染性疾病医治的重难点在于病原微生物的诊断，迫切需要快速准确的方法检测分析病原微生物信息。
传统的培养法是病原微生物检测的“金标准”，具体是把人的痰液、血液等用特定的培养基进行培养，使病原微生物长成肉眼可见的状态，利用经验判断病原微生物种类。这种方法的缺点主要是耗时长，同时还存在漏检漏筛等问题。
新兴的病原微生物检测技术能够克服培养法的缺点，它主要分为三类：分子诊断技术、免疫学检测和化学发光法检测。目前使用最多的是分子诊断技术，包括杂交、PCR(聚合酶链式反应)技术、恒温扩增、CRISPR和高通量测序。其中最广泛应用的是PCR技术，特别是荧光定量实时PCR技术，具有快速、准确和高灵敏等优点。然而，在样本进行PCR扩增之前，需要对样本进行多步前处理，包括核酸的提取、纯化和浓缩，最后核酸与PCR试剂混合后分配到合适的容器中进行核酸扩增反应。该过程繁琐，存在人员操作偏差，样本容易被污染，特别是增加了操作人员感染的风险。因此，建造一个样本进、结果出的一体化自动化平台非常重要。微流控芯片技术在解决这个问题上具有巨大优势。
微流控芯片技术利用微细加工技术制作微结构芯片，并对芯片中的流体和微环境进行精细操控，从而能将生化反应的多步操作集成在一块芯片上完成，还可以进一步集成检测传感器，实现生化反应和检测的高度自动化。当前，市场上已有的商业化的基于微流控芯片和PCR技术的检测病原微生物的产品各有优劣，但都存在结构复杂，价格昂贵的缺点。
因此，如何提供一种新的检测芯片及检测方法，以简化检测芯片结构，降低成本，成为本领域技术人员亟待解决的一个重要技术问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测芯片及检测方法，用于解决现有技术中检测芯片结构复杂、成本较高的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测芯片，包括：
气道层，包括多个气道接口、多个微阀气腔结构及多条气道，所述气道接口自所述气道层的上表面开口，所述微阀气腔结构自所述气道层的下表面开口，所述气道埋设于所述气道层中，且所述气道的两端分别与所述气道接口及所述微阀气腔结构连通；
弹性膜层，位于所述气道层背面，并遮盖所述微阀气腔结构；
流体层，与所述弹性膜层的背面连接，所述流体层包括至少一第一储液池、至少一第二储液池、至少一外设部件接头、至少一第一PCR管接口、至少一吸管、至少一第二PCR管接口、至少一通气口、多个微阀液腔结构及微流道组，所述弹性膜层遮盖所述微阀液腔结构及所述微流道组，所述微流道组包含多条流道，多个所述微阀气腔结构、所述弹性膜层及多个所述微阀液腔结构组成微阀组件，所述微阀组件包括多个微阀以控制液体在所述微流道组中的流动路径，所述第一储液池、所述第二储液池及所述外设部件接头均设于所述流体层的正面，所述第一PCR管接口设于所述流体层背面并通过第一连通孔与所述第一储液池连通，所述吸管与所述第一PCR管接口连接并通过第二连通孔与所述微流道组连通，所述第二储液池及所述外设部件接头均与所述微流道组连通，所述第二PCR管接口设于所述流体层背面并与所述微流道组及所述通气口连通；
底层，位于所述流体层的背面并遮盖所述微流道组。
可选地，所述气道层中设有至少一第一夹具定位孔，所述弹性膜层中设有至少一第二夹具定位孔，所述流体层中设有至少一第三夹具定位孔，所述第一夹具定位孔、所述第二夹具定位孔及所述第三夹具定位孔在垂直方向上位于一条直线上。
可选地，所述流体层还包括至少一第三PCR管接口，所述第三PCR管接口设于所述流体层背面，且不与所述微流道组连通。
可选地，所述第一储液池的底部开口自上而下逐渐缩小，所述第二储液池的底部开口自上而下逐渐缩小。
可选地，所述微阀气腔结构采用弧底圆腔。
可选地，所述微阀液腔结构包括第一过液孔、第二过液孔、储液腔及中心柱，所述中心柱的顶面与所述流体层的正面齐平，所述第一过液孔在垂直方向上贯穿所述中心柱，所述储液腔凹设于所述流体层正面并环设于所述中心柱外围，所述第二过液孔在垂直方向上贯穿所述储液腔的底部与所述流体层的背面。
可选地，所述流体层还包括至少一导液管，所述导液管与所述第二PCR管接口连接。
可选地，所述外设部件接头包括鲁尔接头。
可选地，所述外设部件接头通过导管与注射泵模块连接，所述注射泵模块包括与所述导管连通的注射器，所述注射器的活塞的抽拉配合所述微阀的开闭。
可选地，所述弹性膜层包括聚二甲基硅氧烷膜，所述底层包括压敏膜。
可选地，所述气道层的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种，所述流体层的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种。
本发明还提供一种检测方法，包括以下步骤：
装配PCR管步骤：提供如上任意一项所述的检测芯片，在所述第一PCR管接口、所述第二PCR管接口处分别装配PCR管；
裂解步骤：通过所述第一储液池及所述第一PCR管接口施加样本溶液及第一试剂于第一PCR管中，并通过外设加热设备加热所述第一PCR管以对样本进行热裂解；
混合步骤：通过所述吸管、所述微流道组及所述微阀组件抽吸所述第一PCR管中的溶液至与所述外设部件接头连接的外设部件中，并将所述外设部件中的溶液注入一所述第二储液池中以与预混液混合，再将所述第二储液池中的溶液抽吸至所述外设部件中；
溶液分配步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的溶液分配至与所述第二PCR管接口相连的第二PCR管中；
试剂加入步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件抽吸第二试剂至所述外设部件中，并将所述外设部件中的第二试剂注入所述第二PCR管中；
PCR热循环步骤：通过外设加热设备加热所述第二PCR管以进行PCR热循环；
荧光信号检测步骤：从所述第二PCR管侧面检测荧光信号。
可选地，在所述裂解步骤与所述溶液分配步骤之间，重复所述混合步骤至少一次。
可选地，在所述溶液分配步骤中，先通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中预设量的混合溶液抽吸至一所述第二储液池中，再通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的混合溶液推入所述第二PCR管中。
可选地，在所述试剂加入步骤之前，清空所述第二试剂至所述第二PCR管流路上的溶液。
如上所述，本发明的检测芯片集成了样品前处理和PCR核酸扩增功能，可应用于病原微生物等的检测，其中，芯片借助外部气压控制芯片中的微阀开合，活塞驱动微流道中的液体流动，外设加热设备可实现与芯片相连的PCR管的加热。该芯片能够实现病原微生物检测所需的所有功能，包括：细胞裂解、裂解溶液和PCRmix混合、混合液平均分配到与芯片相连的多个PCR管中、PCR扩增、荧光检测器实时记录PCR过程。一体化、自动化的操作流程使用方便、避免操作人员感染、提高了结果的准确性。本发明可望加速病原微生物检测技术的发展，在医院得到广泛使用。
附图说明
图1显示为本发明的检测芯片的分解结构示意图。
图2显示为本发明的检测芯片中气道层的立体结构示意图。
图3a显示为本发明的检测芯片中流体层的俯视图。
图3b显示为本发明的检测芯片中流体层的仰视图。
图3c显示为本发明的检测芯片中流体层的立体结构示意图。
图4显示为本发明的检测芯片中微阀的剖面结构示意图。
元件标号说明
1 气道层
101 气道接口
102 微阀气腔结构
103 气道
104 第一夹具定位孔
2 弹性膜层
201 第二夹具定位孔
3 流体层
301 第一储液池
302a、302b、302c 第二储液池
303 外设部件接头
304 第一PCR管接口
305 吸管
306a、306b、306c、306d 第二PCR管接口
307 埋设部分
308 微阀液腔结构
308a 第一过液孔
308b 第二过液孔
308c 储液腔
308d 中心柱
309a 第一微流道
309b 第二微流道
309c 第三微流道
309d 第四微流道
309e 第五微流道
309f 第六微流道
309g 第七微流道
309h 第八微流道
309i 第九微流道
309j 第十微流道
310 第三PCR管接口
311 第一连通孔
312 第二连通孔
313 第三夹具定位孔
314a 第一微阀
314b 第二微阀
314c 第三微阀
314d 第四微阀
314e 第五微阀
314f 第六微阀
314g 第七微阀
314h 第八微阀
315 导液管
316a、316b、316c、316d、316e 通气口
317a、317b、317c、317d、317e、317f PCR 管
4 底层
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
请参阅图1至图4。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
实施例一
本实施例中提供一种检测芯片，请参阅图1，显示为该检测芯片的分解结构示意图，包括气道层1、弹性膜层2、流体层3及底层4，其中，所述弹性膜层2位于所述气道层1与所述流体层3之间，所述底层4位于所述流体层3的背面。
作为示例，所述气道层1中设有至少一第一夹具定位孔104，所述弹性膜层2中设有至少一第二夹具定位孔201，所述流体层3中设有至少一第三夹具定位孔313，所述第一夹具定位孔104、所述第二夹具定位孔201及所述第三夹具定位孔313在垂直方向上位于一条直线上。
具体的，请参阅图2，显示为所述气道层1的立体结构示意图，其中，所述气道层1包括多个气道接口101、多个微阀气腔结构102及多条气道103，其中，所述微阀气腔结构102被位于所述气道层1背面的所述弹性膜层2所遮盖。
作为示例，所述气道接口101自所述气道层1的上表面开口，所述微阀气腔结构102自所述气道层1的下表面开口，所述气道103埋设于所述气道层1中，各所述气道103之间独立设置，且所述气道103的两端分别与所述气道接口101及所述微阀气腔结构102连通。
具体的，请参阅图3a至图3c，其中，图3a显示为所述流体层3的俯视图，图3b显示为所述流体层3的仰视图，图3c显示为所述流体层3的立体结构示意图，其中，所述流体层3与所述弹性膜层2的背面连接，所述流体层3包括至少一第一储液池301、至少一第二储液池、至少一外设部件接头303、至少一第一PCR管接口304、至少一吸管305、至少一第二PCR管接口、至少一通气口、多个微阀液腔结构308及微流道组，所述弹性膜层2从所述流体层3的正面遮盖所述微阀液腔结构308及所述微流道组，所述底层4从所述流体层3的背面遮盖所述微流道组。
具体的，所述微流道组包含多条流道，多个所述微阀气腔结构102、所述弹性膜层2及多个所述微阀液腔结构308组成微阀组件，所述微阀组件包括多个微阀以控制液体在所述微流道组中的流动路径。
作为示例，请参阅图4，显示为所述微阀的剖面结构示意图。本实施例中，所述微阀气腔结构102采用弧底圆腔，所述微阀液腔结构308包括第一过液孔308a、第二过液孔308b、储液腔308c及中心柱308d，所述中心柱308d的顶面与所述流体层3的正面齐平，所述第一过液孔308a在垂直方向上贯穿所述中心柱308d，所述储液腔308c凹设于所述流体层1正面并环设于所述中心柱308d外围，所述第二过液孔308b在垂直方向上贯穿所述储液腔308c的底部与所述流体层3的背面。
作为示例，所述气道层1的所述气道接口101可与外围气压泵模块相连，所述气道103中的气压在正负压之间切换，引起所述弹性膜层2向下或向上形变，从而控制所述微阀的闭合和开启。具体的，当所述气道层1中所述微阀气腔结构102中的压强为大气压时，所述弹性膜层2无形变，紧贴所述流体层3中的所述中心柱308d；当所述气道层1中所述微阀气腔结构102中的压强低于大气压时，所述弹性膜层2向上形变，溶液可以从所述中心柱308d内的所述第一过液孔308a进入所述储液腔308c，即微阀开启；当所述气道层1中所述微阀气腔结构102中的压强大于大气压时，所述弹性膜层2向下形变，封堵住所述中心柱308d内的所述第一过液孔308a，即微阀关闭。
请回头参见图1、图3a至图3c，所述第一储液池301、所述第二储液池及所述外设部件接头303均设于所述流体层3的正面，所述第一PCR管接口304设于所述流体层3背面并通过第一连通孔311与所述第一储液池301连通，所述吸管305与所述第一PCR管接口304连接并通过第二连通孔312与所述微流道组连通，所述第二储液池及所述外设部件接头303均与所述微流道组连通，所述第二PCR管接口设于所述流体层3背面并与所述微流道组及所述通气口连通。
具体的，所述第一PCR管接口304及所述第二PCR管接口用于套接PCR管，其中，所述第一储液池301中的溶液可由所述第一连通孔311进入与所述第一PCR管接口304套接的PCR管，该PCR管中的溶液可通过所述吸管305进入所述微流道组
具体的，所述第二PCR管接口亦用于套接PCR管，与所述第二PCR管接口套接的PCR管可接收来自所述微流道组的液体。
作为示例，所述流体层3还包括至少一导液管315，所述导液管315与所述第二PCR管接口连接，便于所述微流道组流出的溶液沿PCR管的管壁流下。
作为示例，所述第一储液池301的底部开口自上而下逐渐缩小，所述第二储液池的底部开口自上而下逐渐缩小，锥形收口可便于让储液池中的溶液全部流入微流道。
作为示例，所述外设部件接头303包括但不限于鲁尔接头。所述外设部件接头303通过导管与注射泵模块连接，所述注射泵模块包括与所述导管连通的注射器，所述注射器的活塞的抽拉配合所述微阀的开闭可实现所述流体层中液体的按需流动。
本实施例中，所述外设部件接头303的数量为一个；所述第一储液池301的数量为一个；所述第二储液池的数量为3个，分别是第二储液池302a、第二储液池302b及第二储液池302c；所述第一PCR管接口304的数量为一个；所述第二PCR管接口的数量为4个，分别是第二PCR管接口306a、第二PCR管接口306b、第二PCR管接口306c及第二PCR管接口306d，其中，所述第二PCR管接口306a内部与通气口316a连通，所述第二PCR管接口306b内部与通气口316b连通，所述第二PCR管接口306c内部与通气口316c连通，所述第二PCR管接口306d内部与通气口316d连通。
本实施例中，所述流体层3还包括第三PCR管接口310，所述第三PCR管接口310设于所述流体层3背面，且不与所述微流道组连通，所述第三PCR管接口310内部与通气口316e连通。
作为示例，各个通气口可以是自所述流体层3背面开口的凹槽，其形状可以根据需要进行调整。
需要指出的是，在其它实施例中，所述外设部件接头303的数量、所述第一储液池301的数量、所述第二储液池的数量、所述第一PCR管接口304的数量、所述第二PCR管接口的数量及所述第三PCR管接口310的数量均可以根据需要进行调整，此处不应过分限制本发明的保护范围。
本实施例中，所述微流道组包括与所述外设部件接头303连通的第一微流道309a、与所述第二连通孔312连通的第二微流道309b、与所述第二储液池302a连通的第三微流道309c、与所述第二储液池302b连通的第四微流道309d及与所述第二储液池302c连通的第五微流道309e，其中，所述第二微流道309b的通路上设有第一微阀314a以控制所述第二微流道309b的通断，所述第三微流道309c的通路上设有第二微阀314b以控制所述第三微流道309c的通断，所述第四微流道309d的通路上设有第三微阀314c以控制所述第四微流道309d的通断，所述第五微流道309e的通路上设有第四微阀314d以控制所述第五微流道309e的通断。
作为示例，所述第二微流道309b的一部分埋设于流体层3内，其余部分自所述流体层3的背面开口，所述第二微流道309b的埋设部分307与所述第二连通孔312相连。所述第一微流道309a、所述第三微流道309c、所述第四微流道309d及所述第五微流道309e均自所述流体层3的背面开口。
本实施例中，所述微流道组还包括第六微流道309f，其中，所述第一微流道309a、所述第二微流道309b、所述第三微流道309c、所述第四微流道309d及所述第五微流道309e均连通至所述第六微流道309f。
作为示例，所述第六微流道309f自所述流体层3的背面开口。
本实施例中，所述微流道组还包括两端分别与所述第六微流道309f及所述第二PCR管接口306a连通的第七微流道309g、两端分别与所述第六微流道309f及所述第二PCR管接口306b连通的第八微流道309h、两端分别与所述第六微流道309f及所述第二PCR管接口306c连通的第九微流道309i、两端分别与所述第六微流道309f及所述第二PCR管接口306d连通的第十微流道309j，其中，所述第七微流道309g的通路上设有第五微阀314e以控制所述第七微流道309g的通断，所述第八微流道309h的通路上设有第六微阀314f以控制所述第八微流道309h的通断，所述第九微流道309i的通路上设有第七微阀314g以控制所述第九微流道309i的通断，所述第十微流道309j的通路上设有第八微阀314h以控制所述第十微流道309j的通断。
作为示例，所述气道层1的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种，所述流体层3的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种。其中，三维打印时，可使用医用光敏树脂或其它合适的材料。精密雕刻时，可使用聚碳酸酯(PC)或其它合适的材料。注塑成型时，可使用PC、聚丙烯(PP)或其它合适的材料。三维打印可直接制作出所述气道层1和所述流体层3。若采用精密雕刻或注塑成型法，所述气道层1需分解为两层结构分别制作，然后采用胶粘层(例如图案化的双面胶)对准贴合以形成埋在层中的气道；所述流体层3上的储液池、接口、导液管和吸管等零件需要通过胶(例如紫外胶)固定到流体层相应位置。
作为示例，芯片的气道层1、弹性膜层2和流体层3之间的组装可通过胶粘层对准贴合完成，所述胶粘层包括但不限于图案化的双面胶，其中，图案化的双面胶可通过模切或激光雕刻制作。所述弹性膜层2的材质包括但不限于聚二甲基硅氧烷膜(PDMS)，所述底层4包括但不限于压敏膜，可通过按压与所述流体层3贴合。
本实施例提供了一种样本进、结果出的集成样品前处理和PCR核酸扩增功能的检测芯片，可用于病原微生物或其它样品的检测，其中，芯片可借助外部气压控制芯片中的微阀开合，外接注射泵的活塞可驱动微流道中的液体流动，外设加热设备(例如外部加热套管)可实现与芯片相连的PCR管的加热。该芯片能够实现病原微生物检测所需的所有功能，包括：细胞裂解、裂解溶液和预混液混合、混合液平均分配到与芯片相连的多个PCR管中、PCR扩增、荧光检测器实时记录PCR过程。一体化、自动化的操作流程使用方便、避免操作人员感染、提高了结果的准确性。
实施例二
本实施例中提供一种检测方法，包括以下步骤：
S1：装配PCR管步骤：提供如实施例一中所述的检测芯片，在所述第一PCR管接口、所述第二PCR管接口处分别装配PCR管。
S2：裂解步骤：提供如实施例一中所述的检测芯片，通过所述第一储液池及所述第一PCR管接口施加样本溶液及第一试剂于第一PCR管中，并通过外设加热设备加热所述第一PCR管以对样本进行热裂解；
S3：混合步骤：通过所述吸管、所述微流道组及所述微阀组件抽吸所述第一PCR管中的溶液至与所述外设部件接头连接的外设部件中，并将所述外设部件中的溶液注入一所述第二储液池中以与预混液(例如PCR mix)混合，再将所述第二储液池中的溶液抽吸至所述外设部件中；
S4：溶液分配步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的溶液分配至与所述第二PCR管接口相连的第二PCR管中；
S5：试剂加入步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件抽吸第二试剂至所述外设部件中，并将所述外设部件中的第二试剂注入所述第二PCR管中；
S6：PCR热循环步骤：通过外设加热设备加热所述第二PCR管以进行PCR热循环；
S7：荧光信号检测步骤：从所述第二PCR管侧面检测荧光信号。
作为示例，当所述检测芯片包括所述第三PCR管接口时，在所述第三PCR管接口处也装配PCR管，在一示例中，装配于所述第二PCR管接口处的第二PCR管中预先装有PCR反应所需的引物和探针的冻干粉，装配于所述第三PCR管接触处的第三PCR管中装有不含样本的PCR反应溶液(包含引物和探针、第一试剂和第二试剂)。在所述PCR热循环步骤中，同时加热所述第二PCR管和所述第三PCR管。在所述荧光信号检测步骤中，从所述第二PCR管和所述第三PCR管侧面检测荧光信号
作为示例，在所述裂解步骤与所述溶液分配步骤之间，重复所述混合步骤至少一次。
作为示例，在所述溶液分配步骤中，先通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中预设量的混合溶液抽吸至一所述第二储液池中，再通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的混合溶液推入所述第二PCR管中。
作为示例，在所述试剂加入步骤之前，清空所述第二试剂至所述第二PCR管流路上的溶液。
作为示例，所述检测芯片及所述检测方法可用于检测多种病原微生物，下面以肺炎支原体检测为例说明所述检测芯片的操作流程：
(1)芯片储液池和流体层所有通道加入1％BSA，浸泡半小时后，清水冲洗一次后晾干芯片。
(2)芯片套接PCR管。不同PCR管含不同引物和探针的冻干粉，对应关系如下：PCR管317a-空管，PCR管317b-野生型，PCR管317c-2063位突变，PCR管317d-2064位突变，PCR管317e-阳性对照，PCR管317f-阴性对照。其中，所述PCR管317f加入水和PCRmix后套接。
(3)芯片固定在基座上，连通气道。套接PCR管正好卡入外围的金属加热槽中。流体层的流道通过所述外设部件接头303与注射泵控制的注射器相连。
(4)样本溶液和矿物油依次从所述第一储液池301的底部开孔加入PCR管317a，PCRmix和矿物油分别加入所述第二储液池302a、第二储液池302b。
(5)加热所述PCR管317a，对样本进行热裂解。
(6)所述PCR管317a停止加热，开启所述第一微阀314a，抽吸所述PCR管317a一定量的溶液到与所述外设部件接头303连接的注射器中。
(7)开启所述第二微阀314b，关闭所述第一微阀314a。将鲁尔接头连接管中溶液注入所述第二储液池302a，接着抽吸所述第二储液池302a的溶液到与所述外设部件接头303连接的注射器中，如此重复3次，混匀溶液。
(8)开启所述第四微阀314d，关闭所述第二微阀314b。将少量与所述外设部件接头303连接的注射器中的溶液注入所述第二储液池302c。此时，从所述外设部件接头303到所述第四微阀314d之间的微流道被溶液充满。
(9)开启所述第五微阀314e、所述第六微阀314f、所述第七微阀314g及第八微阀314h，关闭所述第四微阀314d。将与所述外设部件接头303连接的注射器中的溶液推入所述PCR管317b、所述PCR管317c、所述PCR管317d及所述PCR管317e中。
(10)关闭所述第五微阀314e、所述第六微阀314f、所述第七微阀314g及第八微阀314h，开启所述第四微阀314d。将残余的溶液推入所述第二储液池302c，清空所述外设部件接头303到所述第五微阀314e之间的微流道。
(11)开启所述第三微阀314c，关闭所述第四微阀314d。抽吸所述第二储液池302c中的矿物油到与所述外设部件接头303连接的注射器中。
(12)开启所述第五微阀314e、所述第六微阀314f、所述第七微阀314g及第八微阀314h，关闭所述第三微阀314c。将与所述外设部件接头303连接的注射器中的矿物油推入所述PCR管317b、所述PCR管317c、所述PCR管317d及所述PCR管317e中。
(13)对所述PCR管317b、所述PCR管317c、所述PCR管317d、所述PCR管317e及所述PCR管317f进行PCR热循环。同时可以从PCR管侧面实时检测各管中荧光信号的变化。
(14)反应结束。芯片不再重复使用。
本实施例的检测方法利用实施例一中的检测芯片可实现病原微生物样本前处理和PCR扩增的一体化流程，其功能包括样本裂解、裂解溶液和PCRmix混合、混合液平均分配到与芯片相连的多个PCR管中、PCR扩增，扩增时的荧光信号能够被实时检测。
综上所述，本发明的检测芯片集成了样品前处理和PCR核酸扩增功能，可应用于病原微生物等的检测，其中，芯片借助外部气压控制芯片中的微阀开合，活塞驱动微流道中的液体流动，外设加热设备可实现与芯片相连的PCR管的加热。该芯片能够实现病原微生物检测所需的所有功能，包括：细胞裂解、裂解溶液和PCRmix混合、混合液平均分配到与芯片相连的多个PCR管中、PCR扩增、荧光检测器实时记录PCR过程。一体化、自动化的操作流程使用方便、避免操作人员感染、提高了结果的准确性。本发明可望加速病原微生物检测技术的发展，在医院得到广泛使用。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (14)

1.一种检测芯片，其特征在于，包括：
气道层，包括多个气道接口、多个微阀气腔结构及多条气道，所述气道接口自所述气道层的上表面开口，所述微阀气腔结构自所述气道层的下表面开口，所述气道埋设于所述气道层中，且所述气道的两端分别与所述气道接口及所述微阀气腔结构连通；
弹性膜层，位于所述气道层背面，并遮盖所述微阀气腔结构；
流体层，与所述弹性膜层的背面连接，所述流体层包括至少一第一储液池、至少一第二储液池、至少一外设部件接头、至少一第一PCR管接口、至少一吸管、至少一第二PCR管接口、至少一通气口、多个微阀液腔结构及微流道组，所述弹性膜层遮盖所述微阀液腔结构及所述微流道组，所述微流道组包含多条流道，多个所述微阀气腔结构、所述弹性膜层及多个所述微阀液腔结构组成微阀组件，所述微阀组件包括多个微阀以控制液体在所述微流道组中的流动路径，所述第一储液池、所述第二储液池及所述外设部件接头均设于所述流体层的正面，所述第一PCR管接口设于所述流体层背面并通过第一连通孔与所述第一储液池连通，所述吸管与所述第一PCR管接口连接并通过第二连通孔与所述微流道组连通，所述第二储液池及所述外设部件接头均与所述微流道组连通，所述第二PCR管接口设于所述流体层背面并与所述微流道组及所述通气口连通；
底层，位于所述流体层的背面并遮盖所述微流道组；
其中，所述外设部件接头通过导管与注射泵模块连接，所述注射泵模块包括与所述导管连通的注射器，所述注射器的活塞的抽拉配合所述微阀的开闭。
2.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述气道层中设有至少一第一夹具定位孔，所述弹性膜层中设有至少一第二夹具定位孔，所述流体层中设有至少一第三夹具定位孔，所述第一夹具定位孔、所述第二夹具定位孔及所述第三夹具定位孔在垂直方向上位于一条直线上。
3.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述流体层还包括至少一第三PCR管接口，所述第三PCR管接口设于所述流体层背面，且不与所述微流道组连通。
4.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述第一储液池的底部开口自上而下逐渐缩小，所述第二储液池的底部开口自上而下逐渐缩小。
5.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述微阀气腔结构采用弧底圆腔。
6.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述微阀液腔结构包括第一过液孔、第二过液孔、储液腔及中心柱，所述中心柱的顶面与所述流体层的正面齐平，所述第一过液孔在垂直方向上贯穿所述中心柱，所述储液腔凹设于所述流体层正面并环设于所述中心柱外围，所述第二过液孔在垂直方向上贯穿所述储液腔的底部与所述流体层的背面。
7.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述流体层还包括至少一导液管，所述导液管与所述第二PCR管接口连接。
8.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述外设部件接头包括鲁尔接头。
9.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述弹性膜层包括聚二甲基硅氧烷膜，所述底层包括压敏膜。
10.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于：所述气道层的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种，所述流体层的制作方法包括三维打印、精密雕刻或注塑成型法中的至少一种。
11.一种检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
装配PCR管步骤：提供如权利要求1-10任意一项所述的检测芯片，在所述第一PCR管接口、所述第二PCR管接口处分别装配PCR管；
裂解步骤：通过所述第一储液池及所述第一PCR管接口施加样本溶液及第一试剂于第一PCR管中，并通过外设加热设备加热所述第一PCR管以对样本进行热裂解；
混合步骤：通过所述吸管、所述微流道组及所述微阀组件抽吸所述第一PCR管中的溶液至与所述外设部件接头连接的外设部件中，并将所述外设部件中的溶液注入一所述第二储液池中以与预混液混合，再将所述第二储液池中的溶液抽吸至所述外设部件中；
溶液分配步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的溶液分配至与所述第二PCR管接口相连的第二PCR管中；
试剂加入步骤：通过所述微流道组及所述微阀组件抽吸第二试剂至所述外设部件中，并将所述外设部件中的第二试剂注入所述第二PCR管中；
PCR热循环步骤：通过外设加热设备加热所述第二PCR管以进行PCR热循环；
荧光信号检测步骤：从所述第二PCR管侧面检测荧光信号。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：在所述裂解步骤与所述溶液分配步骤之间，重复所述混合步骤至少一次。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：在所述溶液分配步骤中，先通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中预设量的混合溶液抽吸至一所述第二储液池中，再通过所述微流道组及所述微阀组件将所述外设部件中的混合溶液推入所述第二PCR管中。
14.根据权利要求13述的检测方法，其特征在于：在所述试剂加入步骤之前，清空所述第二试剂至所述第二PCR管流路上的溶液。
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