JP2007139501A - マイクロチップへの試薬の充填方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】液漏れを起こさない枠部材でマイクロチップ表面の試薬供給部の開口周辺を取り囲み、その内側に供給すべき液体の試薬を入れた後、エアポンプと連通するエアポンプ接続部を設けたを上記の枠に被せて密閉し、該エアポンプから空気を送り込み、上記の試薬にまず試薬供給部を通過し始めるために必要な圧力をかけ、続いて試薬収容部の末端に設けられた撥水バルブの液体保持力以下の圧力をかけることにより、試薬収容部に試薬を供給する。
【選択図】図2
Description
ンサーなど)を微細化して1チップ上に集積化したシステムが開発されている(特許文献
1)。これは、μ−TAS(Micro total Analysis System:マイクロ総合分析システム
)、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ(Lab-on-chips)、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。現実には遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
液漏れを起こさない枠部材でマイクロチップ表面の該試薬供給部の開口周辺を取り囲み、その内側に供給すべき液体の試薬を入れた後、
エアポンプと連通するエアポンプ接続部を設けたを上記の枠に被せて密閉し、該エアポンプから空気を送り込み、
上記の試薬にまず試薬供給部を通過し始めるために必要な圧力をかけ、続いて撥水バル
ブの液体保持力以下の圧力をかけることにより、試薬収容部に試薬を供給する。
本発明のマイクロ分析システムは、
上記の方法を用いて試薬が充填されたマイクロチップと、システム装置本体とを備えるマイクロ総合分析システムであって、
そのシステム装置本体は、少なくとも、チップ接続部およびマイクロポンプを含むマイクロポンプユニットと、該マイクロポンプユニットの機能を制御する制御装置とを備え、
該マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第1流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第1流路よりも小さい第2流路と、第1流路および第2流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備える
ことを特徴とするマイクロ総合分析システムである。
本発明のマイクロチップには、化学分析、各種検査、試料の処理・分離、化学合成などを行うための、微小な溝状の流路(微細流路)および機能部品(流路エレメント)が、用途に応じた適当な態様で配設されている。微細流路には、例えば検体液を収容する検体収容部、試薬類を収容する試薬収容部などが設けられており、場所や時間を問わず迅速に検査ができるよう、試薬収容部には必要とされる試薬類、洗浄液、変性処理液などがあらかじめ収容されている。
マイクロチップは、加工成形性、非吸水性、耐薬品性、耐熱性、廉価性などに優れていることが望まれており、チップの構造、用途、検出方法などを考慮して、チップの材料を適切に選択することが求められる。その材料としては従来公知の様々なものが使用可能であり、個々の材料特性に応じて通常は1以上の材料を適宜組み合わせて、基板および流路エレメントが成形される。
マイクロチップの微細流路には、例えば、各収容部(試薬収容部、検体収容部など)および廃液貯留部などの液溜部;ポンプ接続部;弁基部、送液制御部(撥水バルブなど)、逆流防止部(逆止弁、能動弁など)、試薬定量部、混合部などの送液を制御するための部位;反応部;検出部などの構造部およびそれらを連通する流路が含まれている。このような微細流路はマイクロメーターオーダーで形成されており、例えば幅は数十〜数百μm、好ましくは50〜100μm、深さは25〜200μm程度、好ましくは50〜100μmである。流路幅が50μm未満であると、流路抵抗が増大し、流体の送出および検出上不都合である。幅500μmを超える流路ではマイクロスケール空間の利点が薄まる。なお、試薬類などの収容部、反応部および検出部は、容量の大きい広幅の液溜め状になっていることもある。
図2は、一実施態様における試薬収容部周辺の概要を表した断面図である。以下、この図を参照しながら説明を行う。なお、これはまだ蓋部材57が被せられる前の状態であり、蓋部材57を被せた後に試薬40の注入が開始される。
上述したような、微細流路における試薬収容部と、該試薬収容部の上面に設けられた試薬供給部と、該試薬収容部の少なくとも下流側末端に設けられた撥水バルブとを有するマイクロチップへの、本発明の試薬の充填方法は、
液漏れを起こさない枠部材でマイクロチップ表面の該試薬供給部の開口周辺を取り囲み、その内側に供給すべき液体の試薬を入れた後、
エアポンプと連通するエアポンプ接続部を設けたを上記の枠部材に被せて密閉し、該エアポンプから空気を送り込み、
上記の試薬にまず試薬供給部を通過し始めるために必要な圧力をかけ、続いて撥水バルブの液体保持力以下の圧力をかけることにより、試薬収容部に試薬を供給することを特徴とすることを特徴とする。
以下、再び図2を参照しながら説明を行う。試薬の充填の際には、まず、液漏れを起こさない枠部材56でマイクロチップ表面の該試薬供給部32の開口周辺を取り囲み、つぎに、上記の枠部材56で囲まれた内部に供給すべき液体の試薬40を入れる。このとき、枠部材56とマイクロチップ2表面とを密着させることなどにより、試薬が漏れ出さないような構造
とすることが望ましい。枠部材56で取り囲む範囲の面積は、後述するエアポンプによる注入が可能な範囲において、枠部材56の高さや、供給すべき試薬40の量などにより適宜調整される。枠部材56の材質は、上記のようなマイクロチップとの密着性などの観点から適宜選択すればよい。形状も特に制限されないが、一例としてリング状の部材とすることが挙げられる。
枠部材56の内側に試薬40が入れられたら、つづいて、試薬液面全体を覆うよう、蓋部材57を枠部材56に被せる。後述するエアポンプによる加圧が試薬40液面に効率的に伝わるよう、空気が外部に漏れ出ない密閉された空間を創出するような構造であれば、蓋部材57の形状および材質は特に制限されない。
上記の工程の後、エアポンプより空気を送り込み、試薬に圧力を加える。マイクロチップ表面が疎水性である場合、試薬供給部32の開口上部に試薬40を載せた状態で大気圧が加
わる程度では、試薬40は開口から試薬収容部31に入りにくいが、さらに加圧することにより試薬40が連続的に注入される。撥水バルブにおける説明と同様に、一度注入が開始されれば、開始時の圧力よりも低い圧力(これを「充填圧力」とよぶ。)にて注入が続く。
となく充填することができる。
マイクロチップには試薬収容部が複数存在する場合が多いが、それぞれの試薬収容部に対して、試薬供給部の周囲に枠部材および蓋部材を設置し、さらにエアポンプを接続し、上記のような操作により試薬を充填すればよい。ここで、複数の蓋部材のエアポンプ接続部のエアポンプ接続部と単一のエアポンプとを分岐したチューブなどで接続するようにし、複数の試薬液面に同時に圧力を加え、試薬収容部に試薬を一度に供給することが可能である。これにより、複数箇所への試薬の供給が、短時間で効率よく、簡便に行うことができる。この際の充填圧力の条件は前述と同様である。
れる。続いて、枠基板開口部63の位置に蓋基板窪み64が合うように蓋基板62を重ね合わせる。その後、枠基板開口部66に接続されたエアポンプ(図示せず)より空気を送り込めば、前述と同様にして試薬収容部31に試薬40を供給することができる。他の部位の試薬収容部にも、これと同様にして試薬が供給される。
以上の方法によりマイクロチップに試薬を充填した後は、その試薬の蒸発、漏失、汚染または変性もしくは気泡の混入を防止するため、マイクロチップ表面に残された余分な試薬を除去し、開口をシール部材などで直ちに封止することが望ましい。
図1は、本発明のマイクロ総合分析システムの一実施形態における構成を示した概念図である。図示したように、かかる実施形態では、マイクロチップ2とともに、このチップ
を収容する装置として、システム装置本体1がある。この装置は、反応のために用いられ
るペルチェ3(冷却装置)と、ヒーター4(加熱装置)と、送液用のマイクロポンプ11、駆動液タンク10およびチップ接続部を有するマイクロポンプユニットと、それらの送液、温度、反応の各制御に関わる制御装置(図示せず)と、光学検出系(ホトダイオード5、L
ED6など)を含み、測定データの収集および処理をも受け持つ検出処理装置(図示せず
)とを備えている。マイクロ総合分析システムは、マイクロチップ2以外の構成要素を一
体化してシステム装置本体1とし、マイクロチップ2をこのシステム装置本体1に着脱する
ように構成することが望ましい。
とも称されるものと同等である。通常、このチップの縦横のサイズは数十mm、高さは数mm程度である。そこには、微細加工技術により微細流路が形成されている。微細流路に連通している試薬収容部内、検体収容部内にある各種の液体は、マイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12を介して各収容部に連通された上記マイクロポンプ11によって送液される。
クロポンプがシステム装置本体1に組み込まれる。これら複数のマイクロポンプと、マイ
クロチップ2に連通させるための流路開口を有するチップ接続部とを含むマイクロポンプ
ユニットが、システム装置本体1のベース本体内に配置されている。図示したように、マ
イクロチップ2をシステム装置本体1に装着し、面同士で重ね合わせることにより、該チップのポンプ接続部をマイクロポンプユニットにあるチップ接続部に接続するようになっている。マイクロポンプ11により駆動液をマイクロチップ2の微細流路に送り込み、検体や
試薬などの流体を押し出して、微細流路内の流体の送液を行う。
ンプ接続部12をマイクロポンプユニットのチップ接続部に接続させた場合に作動制御させるようにしてもよい。
少なくとも前記のマイクロポンプユニットの機能を制御する制御装置(図示せず)が、本発明システムの装置本体に組み込まれている。この制御装置は、さらに、加熱装置および/または冷却装置による温度調節を管理する機能、検出処理装置における測定データの記録および処理機能などを統合して担い、システムを統括的に制御支配するようにしてもよい。マイクロポンプ11による送液の順序、容量、タイミングの制御、あるいは加熱装置および/または冷却装置による温度制御などの諸条件は、あらかじめプログラムの内容として設定しておき、マイクロ総合分析システムに搭載されたマイクロコンピュータ等のソフトウェアに従ってそれらの制御を行うことができる。
ンプ11、検出処理装置および制御装置などが一体化されたシステム装置本体1にチップを装着することにより行なわれる。試料および試薬類の送液、前処理、混合に基づく所定の反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される形態が望ましい。
本発明のシステム装置本体は、ベース本体とともに、そのベース本体内に配置され、マイクロチップに連通させるための流路開口を有するチップ接続部と、複数のマイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットを構成単位として有している。マイクロポンプは、例えば複数のマイクロポンプがフォトリソグラフィ技術などにより形成されたチップ状のポンプユニットとして、システム装置本体に組み込まれていてもよい。
素子44を駆動するための駆動部(図示せず)とが設けられている。この駆動部と、圧電素子44表面上の2つの電極とは、フレキシブルケーブルなどによる配線で接続されており、かかる接続を通じて当該駆動部の駆動回路によって圧電素子44に特定波形の電圧を印加する構成となっている。図6の(a)(b)には図示されていないが、第1液室48には、駆動液タンク10につながるポート72が設けられており、その第1液室は、「リザーバ」の役割を演じ、ポート72で駆動液タンク10から駆動液の供給を受けている。第2液室49はマイクロポンプユニットの流路を形成し、その流路の先にチップ接続部のポート73があり、マイクロチップの「ポンプ接続部」12とつながる。
ポート73を介してマイクロチップ2のポンプ接続部12と連通する。例えば、ポート72、73が穿孔された基板74と、マイクロチップのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプをマイクロチップ2に接続することができる。また、前述したように、
1枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、マイクロチップ2と接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンク10が接続されていることが
望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されてもよい。
ステム装置本体1に属し、駆動液タンク10と連通している。マイクロポンプ11は、マイク
ロチップ2とは、両者が互いに所定の形態で接合したときに、マイクロポンプユニットに
あるチップ接続部のポート73と、マイクロチップにあってマイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12とが連結してマイクロチップの流路と連通するようになる。
本発明のマイクロ分析システムは、特に遺伝子または核酸(DNA、RNA)の検査に好適に用いることができる。その場合、マイクロチップの微細流路は、PCR法またはICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification)法による遺伝子増幅に適した構成とされるが、遺伝子検査以外の生体物質についても基本的な流路構成はほぼ同一になるといえる。通常は検体前処理部、試薬類、プローブ類を変更すればよく、その場合、送液エレメントの配置、数などは変化するであろう。当業者であれば、例えばイムノアッセイ法のために必要な試薬類などをマイクロチップに搭載し、若干の流路エレメントの変更、仕様の変更を含む修正を施すことにより、分析の種類を容易に変更することができる。ここにいう遺伝子以外の生体物質とは、各種の代謝物質、ホルモン、タンパク質(酵素、抗原なども含む)などをいう。
検体もしくは検体から抽出したアナライト(例えば、DNA、RNA、遺伝子)が注入される検体収容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部と、
プローブ結合反応、検出反応(遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む)などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ(例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ)が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、が設けられている。
ローブ収容部21fに収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合(またはハイブリダイゼーション)させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行う。また、ポジティブコントロール収容部21hに収容されたポジティブコントロールおよび
ネガティブコントロール収容部21iに収容されたネガティブコントロールについても、上
記と同様にして反応および検出を行う。
マイクロチップの検体収容部は、検体注入部に連通し、検体の一時収容および混合部への検体供給を行う。検体収容部への検体の注入は、例えば検体収容部の上面に設けられた検体注入部から行われる。この検体注入部は、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサン(PDMS)などの樹脂、強化フィルムで覆われていることが望ましい。例えば、当該ゴム材質の栓を突き刺したニードルまたは蓋付き細孔を通したニードルでシリンジ内の検体を注入する。なお、マイクロチップへの検体の注入は、システム装置本体に装着する前にあらかじめ行っておいてもよいし、装着してから行うようにしてもよい。
マイクロチップの試薬収容部には、目的とする反応方法や検出方法に応じた必要な試薬類が予め所定の量だけ封入されている。したがって使用時にその都度、試薬を必要量充填
する必要はなく、即使用可能の状態になっている。チップ内に内蔵される試薬類は、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その収容部の表面が密封処理されている。
マイクロポンプから駆動液を供給することにより各収容部から検体液および試薬液を押し出してこれらを合流させることによって、遺伝子増幅反応、アナライトのトラップまたは抗原抗体反応といった分析に必要な反応が開始される。
DNA増幅方法としては、改良点も含めて各種文献などに記載され、多方面で盛んに利用されているPCR法を使用することができる。PCR法においては、3つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、適切な装置を使用してマイクロチップの温度制御を行えばよい。マイクロチップにおいては、微細流路において熱サイクルを高速に切り替えることが可能であり、DNAの増幅を手作業で行うよりもはるかに短時間で行うことができる。また、近年開発されたICAN法(タカラバイオ(株)、登録商標)は、50〜65℃における任意の一定温度の下にDNA増幅を短時間で実施できるため(特許第3433929号)、本発明システムにおいても好適な増幅技術である。
マイクロチップの微細流路における反応部位よりも下流側には、アナライト、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部の基板は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
アナライトまたは目的遺伝子のDNAを分析する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行われる。
たRNAから逆転写反応により合成したcDNAと、5’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。
(2) 上記微細流路内にFITCに特異的に結合する抗FITC抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化したアナライト・抗体反応物のFITCに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたFITC修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
(3) 上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
2 マイクロチップ
3 ペルチェ(冷却装置)
4 ヒーター(加熱装置)
5 ホトダイオード
6 LED
10 駆動液タンク
11 マイクロポンプ
12 ポンプ接続部
13 送液制御部
15 微細流路
15a〜15d 微細流路
16 逆止弁
17a 試薬貯留部
17b 検体貯留部
18 試薬収容部
18a〜18c 試薬収容部
20 検体収容部
21a 反応停止液収容部
21b 変性液収容部
21c ハイブリダイゼーションバッファー収容部
21d 洗浄液収容部
21e 金コロイド収容部
21f プローブDNA収容部
21g インターナルコントロール用プローブDNA収容部
21h ポジティブコントロール収容部
21i ネガティブコントロール収容部
21jバッファー収容部
22 検出部
23 廃液貯留部
31,31a,31b 試薬収容部
32,32a,32b 試薬供給部
33a 上流側微細流路
33b 下流側微細流路
34a,34b 撥水バルブ
38 被覆基板
39 溝形成基板
40,40a,40b 試薬
41 上側基板
42 基板
43 振動板
44 圧電素子
45 加圧室
46 第1流路
47 第2流路
48 第1液室
49 第2液室
56,56a,56b 枠部材
57,57a,57b 蓋部材
58,58a,58b エアポンプ接続部
59 エアポンプ連通部材
61 枠基板
62 蓋基板
63 枠基板開口部
64 蓋基板窪み
65 蓋基板溝
66 蓋基板開口部
71 シリコン基板
72 ポート
73 ポート
Claims (7)
- 微細流路における試薬収容部と、該試薬収容部の上面に設けられた試薬供給部と、該試薬収容部の少なくとも下流側末端に設けられた撥水バルブとを有するマイクロチップへの試薬の充填方法であり、
液漏れを起こさない枠部材でマイクロチップ表面の該試薬供給部の開口周辺を取り囲み、その内側に供給すべき液体の試薬を入れた後、
エアポンプと連通するエアポンプ接続部を設けた蓋部材を上記の枠に被せて密閉し、該エアポンプから空気を送り込み、
上記の試薬にまず試薬供給部を通過し始めるために必要な圧力をかけ、続いて撥水バルブの液体保持力以下の圧力をかけることにより、試薬収容部に試薬を供給することを特徴とする、マイクロチップへの試薬の充填方法。 - 単一のエアポンプと複数の蓋部材のエアポンプ接続部とを連通させることにより、複数の試薬供給部に対して同時に試薬の供給を行うことを特徴とする、請求項1に記載のマイクロチップへの試薬の充填方法。
- 上記の試薬収容部が微細流路の途中に形成され、該試薬収容部の上流側末端および下流側末端に撥水バルブが設けられていることを特徴とする、請求項1または2に記載にマイクロチップへの試薬の充填方法。
- 微細流路における試薬収容部と、該試薬収容部の上面に設けられた試薬供給部と、該試薬収容部の下流側末端に設けられた撥水バルブとを有し、
液漏れを起こさない枠部材でマイクロチップ表面の該試薬供給部の開口周辺を取り囲み、その内側に供給すべき液体の試薬を入れた後、
エアポンプと連通するエアポンプ接続部を設けたを上記の枠に被せて密閉し、該エアポンプから空気を送り込み、
上記の試薬にまず試薬供給部を通過し始めるために必要な圧力をかけ、続いて撥水バルブの液体保持力以下の圧力をかけることにより、試薬収容部に試薬が充填されることを特徴とするマイクロチップ。 - 単一のエアポンプと複数の蓋部材のエアポンプ接続部とが連通されることにより、複数の試薬供給部に対して同時に試薬が供給されることを特徴とする、請求項4に記載のマイクロチップ。
- 上記の試薬収容部が微細流路の途中に形成され、該試薬収容部の上流側末端および下流側末端に撥水バルブが設けられていることを特徴とする、請求項4または5に記載にマイクロチップ。
- 請求項4〜6のいずれかに記載のマイクロチップと、システム装置本体とを備えるマイクロ総合分析システムであって、
そのシステム装置本体は、少なくとも、チップ接続部およびマイクロポンプを含むマイクロポンプユニットと、該マイクロポンプユニットの機能を制御する制御装置とを備え、
該マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第1流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第1流路よりも小さい第2流路と、第1流路および第2流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備える
ことを特徴とするマイクロ総合分析システム。
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