JPWO2006109397A1 - 逆流防止構造、それを用いた検査用マイクロチップおよび検査装置 - Google Patents

Abstract

二つの流路が合流する合流部において、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定した。

Description

本発明は、例えば、遺伝子検査などにおいて、マイクロリアクタとして利用可能な検査用マイクロチップおよびそれを用いた検査装置に関する。

最近では、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段、例えば、ポンプ、バルブ、流路、センサーなどを、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使して微細化することによって、１チップ上に集積化したシステムが開発されている。

このようなシステムは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野などでその応用が期待されている。

特に、遺伝子検査の場合のように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間などの低減できるだけではなく、時間と場所を選ばない分析が可能であり、その効果は非常に大きいものである。

この場合、臨床検査を始めとする各種検査を行う現場では、場所を選ばず、迅速に結果を出すことができるチップタイプのマイクロリアクタを用いた測定の際にも、その定量性、解析の精度などが重要視されている。

しかしながら、このようなチップタイプのマイクロリアクタのような分析チップでは、そのサイズ、形態の点から厳しい制約があるため、シンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題となる。そのため、精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。本発明者等は、特許文献１（特開２００１−３２２０９９号公報）、特許文献２（特開２００４−１０８２８５号公報）において、既に、このような要求を満足するマイクロ流体制御素子として好適なマイクロポンプシステムを提案している。

また、特許文献３（特願２００４−１３８９５９号）において、本発明者等は、検体を収容する検体収容部と、試薬が収容される試薬収容部と、検体収容部に収容された検体と、試薬収容部に収容された試薬とを合流させて、所定の反応処理を行う反応流路を有する反応部と、反応部の反応で得られた反応処理物質に対して、所定の検査を行う検査流路を有する検査部とを備え、これらの検体収容部と、試薬収容部と、反応部と、検査部とが一連の流路で、上流側から下流側に連続的に流路によって接続された検査用マイクロチップ（マイクロリアクタ）を、既に提案している。

この特許文献３（特願２００４−１３８９５９号）のマイクロリアクタには、その流路において、二つの流路が合流する合流部において、液体の逆流を防止する逆流防止部が多数設けられている。この逆流防止部は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、または弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して開口部を閉止する能動弁から構成されているものである。

具体的には、図１０（ａ）の逆止弁では、微小球１６７を弁体として、基板１６２に形成した開口１６８をこの微小球１６７の移動により開閉することによって、液体の通過を許容および遮断している。

すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって微小球１６７が基板１６２から離反して開口１６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、微小球１６７が基板１６２に着座して開口１６８が閉止されるので、液体の通過が遮断されるように構成されている。

また、図１０（ｂ）の逆止弁では、基板１６２上に積層され、その端部が開口１６８の上側に延び出した可撓性基板１６９が、液圧により開口１６８の上側を上下動することにより開口１６８を開閉している。

すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって可撓性基板１６９の端部が基板１６２から離反して開口１６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、可撓性基板１６９が基板１６２に密着して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断されるようになっている。

さらに、図１１（ａ）に示した能動弁では、下方に突出した弁部１６４が形成された可撓性基板１６３が、開口１６５が形成された基板１６２の上に積層されている。

閉弁時には、図１１（ｂ）に示したように、可撓性基板１６３を上側から空気圧、油圧、水圧ピストンや圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどの弁体変形手段により押圧することによって、弁部１６４を基板１６２に対して開口１６５を覆うように密着させ、これによりＢ方向への逆流を遮断するようにしている。

また、この能動弁では外部の駆動装置により作動するものに限らず、弁体が自ら変形して流路を塞ぐ構成とする構成として、例えば、図１２に示したように、バイメタル１８１を使用して通電加熱により変形するようにした構造が、また、図１３に示したように、形状記憶合金1８２を使用して通電加熱により変形する構造が開示されている。

しかしながら、このような従来の検査用マイクロチップにおける逆流防止部を構成する図１０〜図１３に示したような逆支弁ではいずれも、基板１６２で区画して、流路を検査用マイクロチップの厚さ方向に多層構造にして流路を構成しなければならず、流路を検査用マイクロチップの厚さが厚くなってしまい、検査用マイクロチップが大型化してしまうことになる。

また、図１０（ａ）の逆止弁では、微小球１６７を弁体とする必要があり、流路に開口１６８を形成し、微小球１６７を配置しなければならず、その構成が複雑であり、製造工程が複雑化して、コストが高くつくことになる。

また、図１０（ｂ）の逆止弁においても、基板１６２上に積層され、その端部が開口１６８の上側に延び出した可撓性基板１６９を構成しなければならないため、その構成が複雑であり、製造工程が複雑化して、コストが高くつくことになる。

さらに、図１１に示した能動弁では、下方に突出した弁部１６４が形成された可撓性基板１６３を配置して、可撓性基板１６３を上側から空気圧、油圧、水圧ピストンや圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどの弁体変形手段により押圧する必要があるため、別途駆動機構が必要であり、その構成が複雑であり、製造工程が複雑化して、コストが高くつくことになるとともに、検査用マイクロチップが大型化してしまうことになる。

さらに、図１２および図１３に示したように、バイメタル１８１、形状記憶合金1８２を配置して通電加熱により変形する必要があるため、通電機構が別途必要であり、その構成が複雑であり、製造工程が複雑化して、コストが高くつくことになるとともに、検査用マイクロチップが大型化してしまうことになる。
特開２００１−３２２０９９号公報 特開２００４−１０８２８５号公報 特願２００４−１３８９５９号 「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質 核酸 酵素」４３巻、１３号（１９９８年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行

本発明は、このような現状に鑑み、検査用マイクロチップの二つの流路が合流する合流部において、液体の逆流を防止する逆流防止部を構成する逆流防止構造であって、別途の駆動機構が不要であり、簡単な構造で、検査用マイクロチップが大型化することなく、製造コストも低減することが可能で、しかも、確実に液体の逆流を防止することができ、正確な検査を実施でき、信頼性に優れる検査用マイクロチップおよびそれを用いた検査装置を提供することを目的とする。

本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、本発明の逆流防止構造は、
二つの流路が合流する合流部において、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、
前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定したことを特徴とする。

また、本発明の検査用マイクロチップにおける逆流防止構造は、
検査用マイクロチップにおける逆流防止構造であって、
二つの流路が合流する合流部において、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、
前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定したことを特徴とする。

また、本発明の検査用マイクロチップは、
検体を収容する検体収容部と、
試薬が収容される試薬収容部と、
前記検体収容部に収容された検体と、試薬収容部に収容された試薬とを合流させて、所定の反応処理を行う反応流路を有する反応部と、
前記反応部の反応で得られた反応処理物質に対して、所定の検査を行う検査流路を有する検査部とを備え、
これらの検体収容部と、試薬収容部と、反応部と、検査部とが一連の流路で、上流側から下流側に連続的に流路によって接続された検査用マイクロチップであって、
二つの流路が合流する合流部において、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、
前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定したことを特徴とする。

図１は、本発明の検査用マイクロチップと、検査用マイクロチップを脱着自在に装着する検査装置本体から構成される本発明の検査装置の実施例を示す斜視図である。 図２は、図１の検査用マイクロチップに形成された流路全体のみを示す上面図である。 図３は、図２の流路の試薬収容部を示す部分拡大図である。 図４は、図２の流路の試薬収容部から分岐した流路の全体を示す部分拡大図である。 図５（ａ）は、ピエゾポンプを用いたマイクロポンプ１１の一例を示した断面図、図５（ｂ）は、その上面図、図５（ｃ）は、マイクロポンプ１１の他の実施例を示した断面図である。 図６は、試薬定量部の構成を示した概略上面図である。 図７は、本発明の逆流防止部の構成を示す検査用マイクロチップの流路の実施例を模式的に示す概略図である。 図８は、本発明の逆流防止部の実施例の構成を模式的に示す概略図である。 図９は、本発明の逆流防止部の実施例の構成を模式的に示す概略図である。 図１０は、逆流防止部の構成を模式的に示す断面図である。 図１１は、逆流防止部の構成を模式的に示す断面図である。 図１２は、逆流防止部の構成を模式的に示す断面図である。 図１３は、逆流防止部の構成を模式的に示す断面図である。

符号の説明

１ 検査装置
２ 検査用マイクロチップ
３ 検査装置本体
１１ マイクロポンプ
１２ ポンプ接続部
１３ 送液制御部
１３ａ 送液制御部
１３ｂ 送液制御部
１５ａ〜１５ｈ 流路
１６ 逆流防止部
１７ａ 貯留部
１７ｂ 貯留部
１８ 試薬収容部
１８ａ 試薬収容部
２０ 検体収容部
２１ａ 停止液収容部
２１ｂ 変性液収容部
２１ｃ ハイブリダイゼーションバッファー収容部
２１ｄ 洗浄液収容部
２１ｅ 金コロイド収容部
２１ｆ プローブＤＮＡ収容部
２１ｇ インターナルコントロール用プローブＤＮＡ収容部
２１ｈ ポジティブコントロール収容部
２１ｉ ネガティブコントロール収容部
２２ａ 検出部
２２ｂ 検出部
２３ 廃液貯留部
２５ 駆動液
３１ 試薬
４１ 上側基板
４２ 基板
４３ ダイヤフラム（振動板）
４４ 圧電素子
４５ 加圧室
４６ 第１流路
４７ 第２流路
４８ 第１液室
４９ 第２液室
５０ 検査用マイクロチップ
５１ 送液ポンプ
５２ 検体供給流路
５３ 送液ポンプ
５４ 第１の試薬流路
５５ 送液ポンプ
５６ 第２の試薬流路
５７，５８ 合流部
５９ 試薬供給流路
６０ 反応流路
６１ 空気抜き流路
６２ 送液制御部
６８ 開口
７０ 逆流防止手段
７１ シリコン基板
７２ ポート
７３ ポート
８０ 流路
８２ 逆流防止流路
８４ 邪魔板部材
８６ 細径部分
１６２ 基板
１６３ 可撓性基板
１６４ 弁部
１６５ 開口
１６７ 微小球
１６８ 開口
１６９ 可撓性基板
１８１ バイメタル
１８２ 形状記憶合金

このように逆流を防止する一方の流路において、逆流防止手段よりも上流側の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定している。

従って、他方の流路から送液すべき液体を合流流路に送液する際には、この逆流防止手段の流路抵抗が、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなっているので、逆流防止手段よりも上流側の一方の流路に液体が逆流するのを確実に防止することができる。

また、一方の流路から送液すべき液体を合流流路に送液する際には、この逆流防止手段の流路抵抗による圧力降下を補い得るような大きいポンプ圧力で送液することによって、この一方の流路から逆流防止手段を通過して、送液すべき液体を合流流路に送液することができる。

従って、一方の流路への送液ポンプのポンプ圧を、他方の流路への送液ポンプ圧よりも大きいポンプ圧に設定して、これらの送液ポンプを切り替えることによって、一方の流路および他方の流路から選択的に送液すべき液体を合流流路に確実に送液することができるとともに、逆流を防止すべき一方の流路への合流流路からの液体が逆流するのを確実に防止することができる。

しかも、このように送液ポンプを切り替えることによって、一方の流路からの液体と他方の流路からの液体が層流となり、合流流路内においてこれらの液体の混合が効率的に行われることになる。

従って、例えば、検査用マイクロチップにおいて、一方の流路を試薬が収容される試薬収容部に連通する試薬流路として用い、他方の流路を検体を収容する検体収容部に連通する検体流路として、本発明の逆流防止構造を適用することができる。

これにより、試薬流路への送液ポンプのポンプ圧を、検体流路への送液ポンプのポンプ圧よりも大きいポンプ圧に設定して、これらの送液ポンプを切り替えることによって、試薬流路からの試薬、検体流路からの検体などを選択的に合流流路に確実に送液することができるとともに、逆流を防止して、試薬収容部の汚染を防止すべき試薬流路への合流流路からの合流液体などが逆流するのを確実に防止することができる。

しかも、このように送液ポンプを切り替えることによって、試薬流路からの試薬と検体流路からの検体が層流となり、合流流路内においてこれらの試薬と検体との混合が効率的に行われることになり、正確な検査を実施でき、信頼性に優れる検査用マイクロチップを提供することができる。

また、本発明では、前記一方の流路から、試薬、検体、あるいはそれらの混合液、処理液などを合流部の下流へ送液して下流の流路にその液体を溜めたあとに、他方の流路の液体によって前記の液体をさらに下流に押し出すように構成したことを特徴とする。

このように構成することによって、逆流防止手段を境に、その上流と下流とでの液体の流れの相互作用を断ち切れるので、より精密な送液が可能となる。

また、このとき、一方の流路への送液ポンプを駆動していなければ、（逆流防止手段の流路抵抗があるものの）他方の流路の液体圧力によって、一方の流路へ僅かながら逆流が生じる。それを防止するために、一方の流路の送液ポンプを、他方の流路の送液ポンプよりも弱い圧力で駆動することで、前記のわずかな逆流も防止することができる。

なお、この場合、他方の流路の液体は、試薬や検体ではなく、それらを押し出すための駆動液であっても良い。

また、本発明では、前記逆流防止手段が、下流側の流路断面積よりも流路断面積が小さい逆流防止流路から構成されていることを特徴とする。

このように構成することによって、下流側の断面積の大きい（大径の）流路から、流路断面積の小さい（小径の）逆流防止流路への流路抵抗が大きくなって、下流側の合流流路から、逆流防止流路を通過して、逆流防止流路よりも上流側の流路への逆流を確実に防止することができる。

従って、このような逆流防止流路を、検査用マイクロチップの流路の所定の箇所に配設して、マイクロポンプからのポンプ圧を制御するとともに、ポンプを切り替えることによって、選択的に二つの流路からの液体の停止と通過を制御して、送液のタイミングを制御することができる。

これにより、例えば、試薬と検体とが、適切な時期に合流し、また、所定の混合比率で合流して反応することになり、所定の検査を正確に実施することができる。

また、本発明では、前記逆流防止手段が、流路内に配置した邪魔板部材を備えた逆流防止流路から構成されていることを特徴とする。

このように構成することによって、流路内に配置した邪魔板部材によって、逆流防止流路の抵抗が大きくなり、下流側の合流流路から、逆流防止流路を通過して、逆流防止流路よりも上流側の流路への逆流を確実に防止することができる。

従って、このような逆流防止流路を、検査用マイクロチップの流路の所定の箇所に配設して、マイクロポンプからのポンプ圧を制御するとともに、ポンプを切り替えることによって、選択的に二つの流路からの液体の停止と通過を制御して、送液のタイミングを制御することができる。

これにより、例えば、試薬と検体とが、適切な時期に合流し、また、所定の混合比率で合流して反応することになり、所定の検査を正確に実施することができる。

また、本発明の検査用マイクロチップは、前記検体収容部が、検体と検体前処理液を合流させて、検体前処理を行う検体前処理部を備えることを特徴とする。

このように構成することによって、例えば、分析対象物（アナライト）の分離または濃縮、除タンパクなどの検体に対して増幅反応に適した前処理を行うことができ、効率良く且つ迅速に、所定の検査を実施することが可能な検査用マイクロチップを提供することができる。

さらに、本発明の検査装置は、上記の検査用マイクロチップを脱着自在に装着して、検査用マイクロチップの検査部における検査を実施するように構成したことを特徴とする。

このように構成することによって、携帯に便利で、取り扱いに優れた検査用マイクロチップを検査装置に装着するだけで、特別な技術、複雑で煩雑な操作を必要とすることなく、正確にかつ迅速に所定の検査を実施することが可能である。

以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。

図１は、本発明の検査用マイクロチップと、検査用マイクロチップを脱着自在に装着する検査装置本体から構成される本発明の検査装置の実施例を示す斜視図、図２は、図１の検査用マイクロチップに形成された流路全体のみを示す上面図、図３は、図２の流路の試薬収容部を示す部分拡大図、図４は、図２の流路の試薬収容部から分岐した流路の全体を示す部分拡大図である。

図１において、１は、全体で、本発明の検査装置を示しており、検査装置１は、検査用マイクロチップ２と、この検査用マイクロチップ２を脱着自在に装着して、所定の検査を実施する検査装置本体３とを備えている。

検査用マイクロチップ２は、図１に示したように、略矩形のカード形状であり、例えば、樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどで作製される一枚のチップから構成されるものである。

そして、検査用マイクロチップ２内には、図２に示したように、一連の流路が形成されている。

なお、以下の説明については、遺伝子検査用の検査用マイクロチップ２を例にして、説明するが、もちろん、検査用マイクロチップ２は、これに限定されるものではなく、様々な検体を検査するために用いられるものである。また、以下に述べる流路構成については、その配置、形状、寸法、大きさなどは、検体の種類、検査項目などに応じて、種々変更可能である。

すなわち、この実施例の検査用マイクロチップ２は、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）により増幅反応を行うものであり、検査用マイクロチップ２内で、血液もしくは喀痰から抽出した検体と、検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼを含む試薬とにより、遺伝子増幅反応を行うものである（特許第３４３３９２９号参照）。

そして、反応液は、変性処理した後にストレプトアビジンを吸着させた流路に送液され、増幅された遺伝子が流路に固定化される。

次に、末端をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で修飾したプローブＤＮＡと、固定化した遺伝子とをハイブリダイゼーションさせる。そして、ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイドを、固定化した遺伝子にハイブリダイズしたプローブに吸着させ、金コロイドの濃度を光学的に測定することにより、増幅された遺伝子を検出するものである。

図１に示した検査用マイクロチップ２は、樹脂製の一枚のチップからなり、血液などの検体を注入することにより、検査用マイクロチップ２内で、遺伝子増幅反応およびその検出を自動的に行い、多項目について同時に遺伝子診断ができるように構成されている。

検査用マイクロチップ２は、例えば、縦横の長さが数ｃｍのチップに、２〜３μｌ程度の血液検体を滴下するだけで、図１に示した検査装置本体３に、検査用マイクロチップ２を装着することによって、増幅反応とその検出ができるようになっている。

検査用マイクロチップ２には、図２に示したように、遺伝子増幅反応に用いる試薬を収容する試薬収容部１８が形成されている。

すなわち、図３に示したように、検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼなどの試薬が、試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃに収容されている。

この場合、これらの試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃには、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬が収容されていることが望ましい。検査用マイクロチップ２内に内蔵される試薬類などは、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃの表面が密封処理されている。

さらに、検査用マイクロチップ２の保管時に、試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃから試薬が微細流路内に勝手に漏出して試薬が反応してしまうことなどを防止するために、冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となる物質、例えば、油脂などの封止材により封入されている。

そして、これらの試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃの上流側にはそれぞれ、マイクロポンプ１１が、ポンプ接続部１２で接続されている。これらのマイクロポンプ１１により、試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃから、下流側の流路１５ａへ試薬が送液されるようになっている。

なお、この場合、マイクロポンプ１１としては、検査用マイクロチップ２とは別途の検査装置本体３に組み込まれており、検査用マイクロチップ２を検査装置本体３に装着することによって、ポンプ接続部１２から検査用マイクロチップ２に接続されるようになっている。しかしながら、マイクロポンプ１１を検査用マイクロチップ２の流路に予め組み込んでおくことも可能である。

また、このようなマイクロポンプ１１として、ピエゾポンプを用いるのが望ましい。図５（ａ）は、ピエゾポンプを用いたマイクロポンプ１１の一例を示した断面図、図５（ｂ）は、その上面図である。

このマイクロポンプ１１には、第１液室４８と、第１流路４６と、加圧室４５と、第２流路４７と、第２液室４９が形成された基板４２を備えている。そして、この基板４２上に積層された上側基板４１と、上側基板４１上に積層された振動板４３と、振動板４３の加圧室４５と反対側に積層された圧電素子４４と、圧電素子４４を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。

図５（ｃ）は、このマイクロポンプ１１の他の実施例を示した断面図である。この実施例では、マイクロポンプ１１を、シリコン基板７１と、圧電素子４４と、図示しないフレキシブル配線から構成している。シリコン基板７１は、シリコンウエハを公知のフォトリソグラフィー技術により所定の形状に加工したものであり、エッチングにより加圧室４５と、振動板４３と、第１流路４６と、第１液室４８と、第２流路４７と、第２液室４９が形成されている。第１液室４８には、ポート７２が、第２液室４９には、ポート７３がそれぞれ設けられ、このポートを介して検査用マイクロチップ２のポンプ接続部１２と連通するように構成されている。

このように構成されたマイクロポンプ１１によれば、ポンプの駆動電圧と周波数を変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。

このように構成されるマイクロポンプ１１によって、図３に示したように、試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃから、送液制御部１３を介して、下流側の流路１５ａへ試薬が送液され、流路１５ａ内で混合状態が安定した後に、試薬混合液が、３本に分岐した流路１５ｂ、１５ｃ、１５ｄへ送液されるようになっている。

すなわち、流路１５ｂは、図２に示した左側の流路を構成する検体との反応、検出系へ連通している。また、流路１５ｃは、図２の中央の流路を構成するポジティブコントロールとの反応、検出系へ連通している。さらに、流路１５ｄは、図２の右側の流路を構成するネガティブコントロールとの反応、検出系へ連通している。

以下については、図２および図４を参照して、流路１５ｂの流路について主として説明する。

流路１５ｂに送液された試薬混合液は、図４に示したように、貯留部１７ａに充填される。なお、図６に示したように、貯留部１７ａの上流側の逆流防止部（逆止弁）１６と、下流側の送液制御部１３ａとの間で、試薬充填流路が構成され、駆動液を送液するマイクロポンプ１１に連通する分岐流路に設けられた送液制御部１３ｂとともに、試薬定量部を構成している。

すなわち、試薬定量部は、逆止弁から構成される逆流防止部１６と、送液制御部１３ａとの間の流路（試薬充填流路１５ａ）には、所定量の試薬混合液が充填される。また、この試薬充填流路１５ａから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ１１に連通する分岐流路１５ｂが設けられている。

そして、試薬の定量送液は、次のように行われる。最初に、逆流防止部１６側から、送液制御部１３ａから先へ試薬３１が通過しない送液圧力で、試薬充填流路１５ａに試薬３１を供給することにより試薬３１を充填する。

次に、送液制御部１３ａから先へ試薬３１が通過することを許容する送液圧力で、マイクロポンプ１１により、分岐流路１５ｂから試薬充填流路１５ａに向かう方向へ、駆動液２５を送液することにより、試薬充填流路１５ａ内に充填された試薬３１を送液制御部１３ａから先へ押し出し、これにより試薬３１を定量的に送液する。なお、試薬充填流路１５ａに、大容積の貯留部１７ａを設けることによって、定量のバラツキが小さくなるようになっている。

一方、図４に示したように、血液もしくは喀痰から抽出した検体は、検体収容部２０から注入され、貯留部１７ｂに充填されるようになっている。なお、この検体収容部２０は、図示しないが、検体と検体前処理液を合流させて、検体前処理を行う検体前処理部を備えるようにしても良い。

そして、この検体収容部２０は、上記の試薬定量部とほぼ同じ機構で、マイクロポンプ１１により、検体が定量に充填され、後続する流路１５ｅへ定量送液されるようになっている。

すなわち、貯留部１７ａに充填された検体と、貯留部１７ｂに充填された試薬混合液は、Ｙ字流路を介して、流路１５ｅに送液され、この流路１５ｅ内で混合およびＩＣＡＮ反応が行われる。

なお、検体と試薬との送液は、例えば、交互に各マイクロポンプ１１を駆動して、流路１５ｅへ輪切り状に検体と試薬混合液とを交互に導入し、迅速に検体と試薬とが拡散、混合するようにすることが望ましい。

また、図４に示したように、停止液収容部２１ａには、予め反応停止液が収容されており、マイクロポンプ１１により、反応停止液を流路１５ｆに送液して、ビオチン修飾したプライマーを用いて増幅反応させた後の反応液と停止液とを混合することにより、増幅反応が停止されるようになっている。

次に、図４に示したように、反応停止処理を行った混合液に対して、変性液収容部２１ｂの変性液を流路１５ｇで混合して、増幅された遺伝子を一本鎖に変性させる。その後、ハイブリダイゼーションバッファー収容部２１ｃに収容されたバッファー液を流路１５ｈで混合し、得られた混合液を目的物質検出用およびインターナルコントロール検出用の２つの検出部２２ａ，２２ｂに分割して送液する。これによって、一本鎖に変性された遺伝子は、検出部２２ａ，２２ｂに吸着されたストレプトアビジンにより検出部２２ａ，２２ｂに固定化される。

この検出部２２ａ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｆ、２１ｅに収容された洗浄液、プローブＤＮＡ溶液、およびＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。同様に、検出部２２ｂ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｇ、２１ｅに収容された洗浄液、インターナルコントロール用プローブＤＮＡ溶液、およびＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。

このようにして、末端をＦＩＴＣで蛍光標識したプローブＤＮＡを検出部２２ａ，２２ｂに固定化された一本鎖の増幅遺伝子にハイブリダイズさせ、その後ＦＩＴＣを介して金コロイドを結合させる。この結合した金コロイドを、例えばＬＥＤから測定光を照射し、フォトダイオード、光電子増倍管などの光検出手段で透過光もしくは反射光を検出することによって、増幅の有無または増幅効率を測定する。

なお、図２および図３に示したように、流路１５ｃは、図２の中央の流路を構成するポジティブコントロールとの反応、検出系へ連通しており、流路１５ｄは、図２の右側の流路を構成するネガティブコントロールとの反応、検出系へ連通している。試薬混合液をこれらの流路１５ｃ、１５ｄに送液することにより、上述した流路１５ｂの検体の反応、検出系における場合と同様に、試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応が検出されるようになっている。

ところで、図２〜図４に示したように、検査用マイクロチップ２の上記したような流路には、二つの流路が合流する合流部において、液体の逆流を防止する逆流防止部１６が多数設けられている。この逆流防止部１６は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、または弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して開口部を閉止する能動弁から構成されているものである。

この場合、従来の検査用マイクロチップにおける逆流防止部としては、特許文献３（特願２００４−１３８９５９号）に開示されているように、図１０〜図１３に示したような構造の逆止弁が提案されている。

しかしながらこのような構造の逆止弁は前述の問題がある。

このため、本願発明では、この逆流防止部を、図７に示したような構成にしている。

図７は、このような逆流防止部の構成を示す検査用マイクロチップの流路の実施例を模式的に示す概略図である。

図７に示したように、この検査用マイクロチップ５０では、送液ポンプ５１の駆動により、図示しない検体収容部から検体が送液される検体供給流路５２を備えている。

一方、送液ポンプ５３の駆動により、図示しない第1の試薬収容部から、第1の試薬を送液する第１の試薬流路５４と、送液ポンプ５５の駆動により、図示しない別の第２の試薬収容部から、第２の試薬を送液する第２の試薬流路５６とを備えている。

これらの第１の試薬流路５４と第２の試薬流路５６とは合流部５７を介して、試薬供給流路５９に連通している。

そして、検体供給流路５２と試薬供給流路５９とは、合流部５８を介して、反応流路６０に連通するように構成されている。

そして、合流部５７より上流の第２の試薬流路５６には、逆流防止手段７０が配設されている。

なお、図中、符号６１は、空気抜き、符号６２は、送液制御部をそれぞれ示している。なお、上記の構成は、符号が相違するが、前述の図１〜図６に示した各構成部分と同様な構成となっているので、その詳細な説明は省略する。

このような構成の検査用マイクロチップ５０では、下記のような流路抵抗の関係となるように設定されている。

すなわち、図７に示したように、逆流防止手段７０の流路抵抗をＲ１、第１の試薬流路５４の流路抵抗をＲ２、試薬供給流路５９の流路抵抗をＲ３、反応流路６０の流路抵抗をＲ４とする。

この時に、第２の試薬流路５６の逆流防止手段７０の流路抵抗Ｒ１が、第１の試薬流路５４における合流部５７、５８の上流および下流の流路である、第１の試薬流路５４の流路抵抗Ｒ２、試薬供給流路５９の流路抵抗Ｒ３、反応流路６０の流路抵抗Ｒ４の流路抵抗の合計の全流路抵抗（Ｒ２＋Ｒ３＋Ｒ４）よりも大きくなるように設定されている。

すなわち、Ｒ１＞（Ｒ２＋Ｒ３＋Ｒ４）となるように流路抵抗が設定されている。

このように逆流を防止する第２の試薬流路５６（一方の流路）において、逆流防止手段７０よりも上流側の流路抵抗Ｒ１を、第１の試薬流路５４（他方の流路）における合流部５７、５８の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗（Ｒ２＋Ｒ３＋Ｒ４）よりも大きくなるように設定している。

従って、第１の試薬流路５４から送液すべき液体を試薬供給流路５９に送液する際には、この逆流防止手段７０の流路抵抗が、第１の試薬流路５４における合流部５７、５８の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗（Ｒ２＋Ｒ３＋Ｒ４）よりも大きくなっているので、逆流防止手段７０よりも上流側の第２の試薬流路５６に液体が逆流するのを確実に防止することができる。

また、第２の試薬流路５６から送液すべき液体を試薬供給流路５９に送液する際には、この逆流防止手段７０の流路抵抗Ｒ１よりも大きいポンプ圧力Ｐ２で送液することによって、この第２の試薬流路５６から逆流防止手段７０を通過して、送液すべき液体を試薬供給流路５９に送液することができる。

従って、第２の試薬流路５６への送液ポンプ５５のポンプ圧Ｐ２を、第１の試薬流路５４への送液ポンプ５３のポンプ圧Ｐ１よりも大きいポンプ圧に設定して、これらの送液ポンプ５３、５５を切り替えることによって、第１の試薬流路５４および第２の試薬流路５６から選択的に送液すべき液体を試薬供給流路５９に確実に送液することができるとともに、逆流を防止すべき第２の試薬流路５６への試薬供給流路５９からの液体が逆流するのを確実に防止することができる。

しかも、このように送液ポンプ５３、５５を切り替えることによって、第１の試薬流路５４からの液体と第２の試薬流路５６からの液体が層流となり、試薬供給流路５９内においてこれらの液体の混合が効率的に行われることになる。

この場合、上記の逆流防止効果を考慮すれば、Ｒ１は、（Ｒ２＋Ｒ３＋Ｒ４）よりも、１〜１００倍、好ましくは５〜３０倍大きくなるように設定するのが望ましい。

また、逆流防止手段７０の流路抵抗がある第２の試薬流路５６（一方の流路）から、第２の試薬を下流の流路の合流部である試薬供給流路５９に送液してその液体を溜めた（充填した）後に、第１の試薬流路５４（他方の流路）の第１の試薬によって、混合試薬をさらに下流に押し出すようにしてもよい。

このように構成することによって、逆流防止手段７０を境に、その上流と下流とでの液体の流れの相互作用を断ち切れるので、より精密な送液が可能となる。

また、このとき、第２の試薬流路５６（一方の流路）への送液ポンプ５５を駆動していなければ、逆流防止手段７０の流路抵抗がある第１の試薬流路５４（他方の流路）の液体圧力によって、第２の試薬流路５６（一方の流路）へ僅かながら逆流が生じる。それを防止するために、第２の試薬流路５６（一方の流路）の送液ポンプ５５を、第１の試薬流路５４（他方の流路）の送液ポンプ５３よりも弱い圧力で駆動することで、前記のわずかな逆流も防止することができる。

すなわち、逆流防止手段の流路抵抗がある一方の流路から、試薬、検体、あるいはそれらの混合液、処理液などを合流部の下流へ送液して下流の流路にその液体を溜めたあとに、他方の流路の液体によって前記の液体をさらに下流に押し出すように構成しても良い。

このように構成することによって、逆流防止手段を境に、その上流と下流とでの液体の流れの相互作用を断ち切れるので、より精密な送液が可能となる。

また、このとき、一方の流路への送液ポンプを駆動していなければ、（逆流防止手段の流路抵抗があるものの）他方の流路の液体圧力によって、一方の流路へ僅かながら逆流が生じる。それを防止するために、一方の流路の送液ポンプを、他方の流路の送液ポンプよりも弱い圧力で駆動することで、前記のわずかな逆流も防止することができる。

なお、この場合、他方の流路の液体は、試薬や検体ではなく、それらを押し出すための駆動液であっても良い。

なお、上記の実施例では、逆流を防止する一方の流路を第２の試薬流路５６とし、他方の流路を、第１の試薬流路５４としたが、何らこれらの組み合わせに限定されるものではなく、従って、例えば、検査用マイクロチップにおいて、一方の流路を試薬が収容される試薬収容部に連通する試薬流路として用い、他方の流路を検体を収容する検体収容部に連通する検体流路として、本発明の逆流防止構造を適用することもできる。

これにより、試薬流路への送液ポンプのポンプ圧を、検体流路への送液ポンプ圧よりも大きいポンプ圧に設定して、これらの送液ポンプを切り替えることによって、試薬流路からの試薬、検体流路からの検体を選択的に合流流路に確実に送液することができるとともに、逆流を防止して、試薬収容部の汚染を防止すべき試薬流路への合流流路からの合流液体などが逆流するのを確実に防止することができる。

しかも、このように送液ポンプを切り替えることによって、試薬流路からの試薬と検体流路からの検体などが層流となり、合流流路内においてこれらの試薬と検体との混合が効率的に行われることになり、正確な検査を実施でき、信頼性に優れる検査用マイクロチップを提供することができる。

この場合、「流路抵抗」とは、流体が流路を通って流れる時の圧力損失の係数に相当するものである。

すなわち、流量をＱ、流体が流路を流れることによる圧力損失をΔＰとした時に、流路抵抗Ｒ（Ｎ・ｓ／ｍ⁵）は、Ｒ＝ΔＰ／Ｑである。ここで、Ｎは、力（Ｎｅｗｔｏｎ）、ｓは時間（ｓｅｃｏｎｄ）である。

従って、「流路抵抗」の値は、流路の入口に圧力をかけて流体を流した時の流量を測定して、その圧力をその流量で割ることにより求めることができる。

例えば、送液ポンプ５５の実効的な内部流路抵抗Ｒ２は、所定の駆動電圧での流量Ｑと発生圧力Ｐとを求めることにより、Ｒ２＝Ｐ／Ｑで決定することができる。

特に、本発明の検査用マイクロチップのような細かくて長い流路内で、層流が支配的である場合には、流路抵抗Ｒは、

である。ここで、ηは粘度、Ｓは断面積、φは等価直径、Ｌは流路長さである。なお、流路の断面形状が長方形の場合には、流路の幅をａ、高さをｂとすると、

である。

従って、この数式１、数式２から明らかなように、断面積Ｓを小さくし、流路長さＬを大きくすることによって、流路抵抗を大きくすることができる。

従って、逆流防止手段７０は、例えば、図８（ａ）に示したように、下流側の流路８０の流路流路断面積Ｓ１よりも、流路断面積Ｓ２が小さい逆流防止流路８２から構成するとともに、その流路長さを長くすることができる。

この場合、図８（ｂ）に示したように、下流側の流路８０の流路流路断面積Ｓ１よりも、流路断面積Ｓ２が小さい逆流防止流路８２を湾曲させるなどして、逆流防止流路８２の流路長さを長くすることによって、流路抵抗を大きくすることも可能である。

また、図９（ａ）に示したように、逆流防止手段７０として、下流側の流路８０の流路流路断面積Ｓ１よりも、流路断面積Ｓ２が小さくなるように、邪魔板部材８４を設けた逆流防止流路８２とすることもできる。

さらに、図９（ｂ）に示したように、逆流防止手段７０として、下流側の流路８０の流路流路断面積Ｓ１よりも、流路断面積Ｓ２が小さくなるように、蛇腹状の細径部分８６を設けた逆流防止流路８２とすることもできる。

なお、逆流防止手段７０としては、流路抵抗を変更するために、下流側流路を形成する材料の流路抵抗よりも、流路抵抗が大きい材料からなる逆流防止流路から構成するようにしてもよい。

このように構成することによって、下流側の流路抵抗の小さい材料からなる流路から、流路抵抗の大きい材料からなる逆流防止流路への流路抵抗が大きくなって、下流側の合流流路から、逆流防止流路を通過して、逆流防止流路よりも上流側の流路への逆流を確実に防止することができる。

以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、遺伝子検査用の検査用マイクロチップとしてＩＣＡＮ法について説明したが、その配置、形状、寸法、大きさなどは、検体の種類、検査項目などに応じて、種々変更可能であるなど本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。

Claims (10)

1. 二つの流路が合流する合流部と、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定したことを特徴とする逆流防止構造。
2. 前記逆流防止手段が、下流側の流路断面積よりも流路断面積が小さい逆流防止流路から構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の逆流防止構造。
3. 前記逆流防止手段が、流路内に配置した邪魔板部材を備えた逆流防止流路から構成されていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の逆流防止構造。
4. 当該逆流防止構造が、検査用マイクロチップにおける逆流防止構造であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の逆流防止構造。
5. 検体を収容する検体収容部と、試薬が収容される試薬収容部と、前記検体収容部に収容された検体と、試薬収容部に収容された試薬とを合流させて、所定の反応処理を行う反応流路を有する反応部と、前記反応部の反応で得られた反応処理物質に対して、所定の検査を行う検査流路を有する検査部とを備え、これらの検体収容部と、試薬収容部と、反応部と、検査部とが一連の流路で、上流側から下流側に連続的に流路によって接続された検査用マイクロチップであって、二つの流路が合流する合流部と、合流部より上流の一方の流路に設けられた逆流防止手段を備え、前記逆流防止手段の流路抵抗を、他方の流路における合流部の上流および下流の流路抵抗の合計の全流路抵抗よりも大きくなるように設定したことを特徴とする検査用マイクロチップ。
6. 前記一方の流路から、試薬、検体、あるいはそれらの混合液、処理液などを合流部の下流へ送液して下流の流路にその液体を溜めたあとに、他方の流路の液体によって前記の液体をさらに下流に押し出すように構成したことを特徴とする請求の範囲第５項に記載の検査用マイクロチップ。
7. 前記逆流防止手段が、下流側の流路断面積よりも流路断面積が小さい逆流防止流路から構成されていることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の検査用マイクロチップ。
8. 前記逆流防止手段が、流路内に配置した邪魔板部材を備えた逆流防止流路から構成されていることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の検査用マイクロチップ。
9. 前記検体収容部が、検体と検体前処理液を合流させて、検体前処理を行う検体前処理部を備えることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の検査用マイクロチップ。
10. 請求の範囲第５項に記載の検査用マイクロチップを脱着自在に装着して、検査用マイクロチップの検査部における検査を実施するように構成したことを特徴とする検査装置。