CN112844505B - 一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片及方法。该立式微流控芯片包括开设有腔室的本体，本体上还开设有样本腔、试剂腔及第二扩增腔及分别与上述腔室连通的液流通道；还包括：第一旋转活塞，其可转动地设置于本体中，样本腔和试剂腔位于其上方，第一扩增腔位于其下方，第一旋转活塞上设有能够将样本腔的液流通道和试剂腔的液流通道连通的试剂连通槽，第一旋转活塞上还设有能够将样本腔的液流通道和第一进液通道连通的核酸转移槽；第二旋转活塞，其可转动地设置于本体中，第二旋转活塞上设有能够将第一出液通道和第二扩增腔的液流通道连通的扩增连通槽。本发明能够进行核酸提取扩增，结构简洁且试剂定量较为精准。

Description

一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片及方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片及方法。

背景技术

微流控是一种精确控制和操控微尺度流体的技术，其具体为将生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的微流控芯片上，自动完成分析全过程的技术。目前，微流控芯片已应用于PCR核酸扩增领域，如中国专利CN111760601A公开的一种集成液路切换阀的微流控芯片，其包括微流控芯片本体、试剂通道、液路切换阀、废液存储腔、样本存储腔、第一清洗液存储腔、第二清洗液存储腔、扩增液存储腔、核酸提取和扩增检测腔，整体形成一个全集成核酸检测微流控芯片；不同存储腔与核酸提取和扩增检测腔之间的连接使用液路切换阀进行切换；核酸提取和扩增检测时，液路切换阀需要切换到不同的位置，导通不同的试剂存储腔与核酸提取和扩增检测腔，外接动力源与不同存储腔的压帽相互对接。目前的核酸检测用的微流控芯片大多为卧式芯片，需要设置较多与外界动力源相接配合的部件，结构复杂且检测精度有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片，其结构简洁且试剂定量较为精准。

本发明的另一个目的是提供一种用于核酸提取扩增的方法，其操作简便且试剂定量较为精准。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片，包括开设有腔室的本体，所述腔室包括：

样本腔，其用于盛放核酸样本；

试剂腔，其用于存放核酸提取所需的试剂；

第一扩增腔，其用于对提取后的核酸进行第一轮扩增；及

第二扩增腔，其用于对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增；

所述本体上还开设有分别和所述样本腔、所述试剂腔及所述第二扩增腔连通的液流通道，所述本体上开设有与所述第一扩增腔连通的第一进液通道及第一出液通道；

所述立式微流控芯片还包括：

第一旋转活塞，其可绕一水平延伸的转动轴心线转动地设置于所述本体中，所述样本腔和所述试剂腔位于所述第一旋转活塞的上方，所述第一扩增腔位于所述第一旋转活塞的下方，所述第一旋转活塞上设有能够将所述样本腔的液流通道和所述试剂腔的液流通道连通的试剂连通槽，所述第一旋转活塞上还设有能够将所述样本腔的液流通道和所述第一进液通道连通的核酸转移槽；

第二旋转活塞，其可绕一水平延伸的转动轴转动地设置于所述本体中，所述第一扩增腔位于所述第二旋转活塞的上方，所述第二扩增腔位于所述第二旋转活塞的下方，所述第二旋转活塞上设有能够将所述第一出液通道和所述第二扩增腔的液流通道连通的扩增连通槽。

优选地，所述样本腔中设有用于吸附核酸的磁珠。

更优选地，所述本体的靠近所述样本腔的部位处设置有磁性体。

优选地，所述腔室还包括位于所述第一旋转活塞上方的废液腔，所述本体上开设有和所述废液腔连通的废液通道，所述第一旋转活塞上还设有能够将所述样本腔的液流通道和所述废液通道连通的废液连通槽。

更优选地，所述样本腔、所述试剂腔及所述废液腔沿所述第一旋转活塞的轴向间隔排列。

优选地，所述试剂腔的数量为多个并沿所述第一旋转活塞的轴向间隔排列，每个所述试剂腔分别对应设有一个所述液流通道，所述第一旋转活塞上对应开设有多个所述试剂连通槽。

更优选地，多个所述试剂腔包括用于存放裂解液的第一试剂腔、用于存放蛋白酶的第二试剂腔、用于存放漂洗液的第三试剂腔和第四试剂腔、及用于存放洗脱液的第五试剂腔，所述第一旋转活塞上对应设有五个所述试剂连通槽，五个所述试剂连通槽沿所述第一旋转活塞的周向间隔设置于所述第一旋转活塞的外圆周面上。

更优选地，至少部分所述试剂连通槽自至少一个非目标试剂腔下方经过而具有位于非目标的试剂腔的液流通道下方以避免连通该液流通道的曲线段。

进一步地，多个所述试剂连通槽沿所述第一旋转活塞的圆周方向并列设置。

优选地，所述核酸转移槽设于所述第一旋转活塞的外圆周面上，所述核酸转移槽的起始端和终止端之间的圆心角大于零。

优选地，所述第一旋转活塞包括第一本体及包覆于所述第一本体上的第一密封层，所述试剂连通槽和所述核酸转移槽开设于所述第一密封层上或开设于所述第一本体上并贯通所述第一密封层。

更优选地，所述第一旋转活塞具有用于和动力源接合的驱动端部。

优选地，所述腔室还包括用于接收所述第一扩增腔的扩增产物的缓冲腔，所述缓冲腔位于所述第一旋转活塞和所述第二旋转活塞之间，所述第一出液通道能够通过所述的缓冲腔和所述扩增连通槽连通。

更优选地，所述本体上开设有与所述缓冲腔连通的第二进液通道及第二出液通道，所述第一旋转活塞上还设有能够连通所述第一出液通道和所述第二进液通道的移液连通槽，所述扩增连通槽能够连通所述第二出液通道和所述第二扩增腔的液流通道。

更优选地，所述第一扩增腔腔中设置有扩增试剂。

更优选地，当所述移液连通槽将所述第一出液通道和所述第二进液通道连通时，所述核酸转移槽将所述样本腔的液流通道和所述第一进液通道连通。

更优选地，所述缓冲腔通过气流通道与一开设于所述本体中的定量腔连通，所述立式微流控芯片还包括可滑动地设置于所述定量腔中的定量活塞。

优选地，所述扩增连通槽设于所述第二旋转活塞的外圆周面上。

更优选地，所述扩增连通槽具有起始端和终止端，所述起始端和所述终止端之间的圆心角大于零。

进一步地，所述圆心角为180度。

更优选地，所述第二旋转活塞包括第二本体及包覆于所述第二本体上的第二密封层，所述扩增连通槽开设于所述第二密封层上或开设于所述第二本体上并贯通所述第二密封层。

更优选地，所述第二扩增腔的数量为多个，每个所述第二扩增腔设有一个液流通道，每个所述第二扩增腔对应一个所述扩增连通槽，多个所述扩增连通槽沿所述第二旋转活塞的圆周方向并列设置。

更优选地，各所述扩增连通槽的起始端间隔排列于所述第二旋转活塞的同一圆周位置。

进一步地，各所述扩增连通槽的长度互不相同，任意两个相邻扩增联通的终止端在所述第二旋转活塞的轴向上和周向上均间隔一段距离。

优选地，所述立式微流控芯片还包括用于向所述样本腔提供正压和负压的正负压泵，所述样本腔和所述正负压泵相互连通。

更优选地，所述本体的上部设有用于连接所述正负压本的接口，所述接口和所述样本腔连通。

优选地，所述立式微流控芯片还包括能够移动或转动而将所述样本腔中的物料混匀的混匀活塞。

更优选地，所述混匀活塞可移动或转动地设置于所述样本腔中，或所述混匀活塞可移动或转动地设置于所述本体中并和所述样本腔连通。

优选地，所述样本腔和所述试剂腔分别具有设于所述本体上端部的孔。

本发明还采用如下技术方案：

一种用于核酸提取扩增的方法，采用如上所述的立式微流控芯片，所述方法包括如下步骤：

A、将核酸样本加入所述样本腔中；

B、转动所述第一旋转活塞，使试剂连通槽将所述试剂腔和所述样本腔连通，使试剂转移至所述样本腔中并混匀进行反应；

C、转动所述第一旋转活塞，使核酸连通槽将所述样本腔和所述第一扩增腔连通，将所述样本腔中的核酸提取液转移至所述第一扩增腔中；

D、转动所述第一旋转活塞，将所述样本腔和所述第一扩增腔之间的微通道关闭，进行第一轮扩增反应；

E、转动所述第二旋转活塞，使扩增连通槽和所述第二扩增腔连通，将第一轮扩增产物转移至所述第二扩增腔中。

优选地，所述方法还包括步骤B之后的如下步骤：转动所述第一旋转活塞，使其上的废液连通槽将所述样本腔和设于所述本体上的废液腔连通，将反应后的废液转移至所述废液腔中。

优选地，所述方法还包括步骤D之后的如下步骤：转动所述第一旋转活塞，使其上的移液连通槽将所述第一扩增腔和一设于所述本体上的缓冲腔连通，将扩增产物转移所述缓冲腔中；

所述步骤D中，所述第一旋转活塞将所述第一扩增腔和所述缓冲腔之间的微通道关闭；

所述步骤E中，所述扩增连通槽将所述缓冲腔和所述第二扩增腔连通。

优选地，所述步骤E具体实施如下：

步骤E1、转动第二旋转活塞，使得第一个扩增连通槽和与之对应的第一个第二扩增腔连通，移动与缓冲腔连通的定量腔中的定量活塞，将缓冲腔的扩增产物定量推送至该第一个第二扩增腔中；

步骤E2、继续转动第二旋转活塞，使得第二个扩增连通槽和与之对应的第二个第二扩增腔连通，移动与缓冲腔连通的定量腔中的定量活塞，将缓冲腔的扩增产物定量推送至该第二个第二扩增腔中；

重复上述步骤，依次将扩增产物推送至各第二扩增腔中。

本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：

本发明的用于核酸提取扩增的微流控芯片及方法，能够实现核酸提取、扩增及检测，可进行PCR巢式扩增，采用立式结构，有效消除气泡影响，使液体进量准确，可实现液体精准定量；通过旋转活塞实现微流控芯片的液体通路的切换，操作方便可控，易于自动化；结构紧凑简洁，易于批量化；无气溶胶污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为根据本发明实施例的一种立式微流控芯片的立体示意图；

图2为根据本发明实施例的一种立式微流控芯片的侧视图；

图3为根据本发明实施例的一种立式微流控芯片的内部透视图；

图4a、图4b和图4c分别为根据本发明实施例的一种第一旋转活塞在不同视角下的示意图；

图5为根据本发明实施例的一种第一旋转活塞沿其长度方向的剖视图；

图6a和图6b分别为根据本发明实施例的一种第二旋转活塞在不同视角下的示意图；

图7为根据本发明实施例的一种第二旋转活塞沿其长度方向的剖视图。

其中，

1、本体；11、混匀活塞；12、磁性体；13、接口；14、定量活塞；15、封盖；

100、孔；101、样本腔；102、试剂腔；103、废液腔；104、第一扩增腔；105、缓冲腔；106、定量腔；107、第二扩增腔；108、液流通道；109、废液通道、110、第一进液通道；111、第一出液通道；112、第二进液通道；113、第二出液通道；

2、第一旋转活塞；21、试剂连通槽；22、废液连通槽；23、核酸转移槽；24、移液连通槽；200、曲线段；201、第一本体；202、第一密封层；203、连接孔；

3、第二旋转活塞；31、扩增连通槽；300、转角段；301、第二本体；302、第二密封层；303、连接孔。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。

需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本发明中所使用的上、下、左、右等描述仅仅是相对于附图中本发明各组成部分的相互位置关系来说的。

进一步可以理解的是，本公开中“多个”是指两个或两个以上，其它量词与之类似。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。

进一步可以理解的是，术语“第一”、“第二”等用于描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开，并不表示特定的顺序或者重要程度。实际上，“第一”、“第二”等表述完全可以互换使用。例如，在不脱离本公开范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。

参照图1至图7所示，根据本发明的一个实施例，一种立式微流控芯片，具体是一种实现PCR检测的集核酸提取、扩增及检测于一体的立式微流控芯片，包括开设有腔室的本体1，本体1整体呈竖向设置的板状。该立式微流控芯片还包括整体分别呈圆柱状的第一旋转活塞2和第二旋转活塞3；第一旋转活塞2可转动地插设于本体1中，第二旋转活塞3位于第一旋转活塞2的正下方并可转动地插设于本体1中。第一旋转活塞2和第二旋转活塞3能够分别绕一水平延伸的转动轴心线转动，二者的转动轴心线相互平行并位于同一竖直平面内，也就是说，二者的转动轴心线分别沿图3中的左右方向水平延伸。两个旋转活塞的长径比大于1，优选为大于5。该立式微流控芯片被第一旋转活塞2和第二旋转活塞3划分为三个功能区域，第一旋转活塞2及其之上的部分为核酸提取纯化区，核酸样本在该区域完成核酸提取和纯化；第一旋转活塞2及第二旋转活塞3之间的部分为第一扩增区，提取纯化后的活塞在该区域进行第一轮PCR扩增；第二旋转活塞3之下的部分为第二扩增区，第一轮PCR扩增后的扩增产物在该区域进行第二轮PCR扩增，并在该区域中通过PCR仪的荧光检测装置测量其荧光信号。

如图3所示，核酸提取纯化区的腔室(即位于第一旋转活塞2上方的腔室)包括并列地设于本体1上部的样本腔101、试剂腔102和废液腔103，其中试剂腔102的数量为多个且并列设于左侧的样本腔101和右侧的废液腔103之间，即样本腔101、多个试剂腔102和废液腔103沿第一旋转活塞2的轴向间隔排列布置。样本腔101和试剂腔102分别具有设于本体1的上端部(优选为本体1的上端面)的孔100，通过这些孔100可向这些腔室中加入样本或灌装试剂，还可藉由这些孔100连通外界大气，以利于移液。在该立式微流控芯片尚未使用时，本体1上端部的这些孔100通过一密封膜封闭；在使用时，将该密封膜移除；在样本腔101中加入核酸样本后，通过封盖15将样本腔101上的孔100封住，该封盖15可移除。样本腔101用于盛放核酸样本；试剂腔102用于存放核酸提取所需的试剂，如裂解液、漂洗液、洗脱液等；废液腔103用于存放核酸提取纯化过程中产生的废液。具体到本实施例中，试剂腔102的数量为五个，自左至右依次存放有裂解液、蛋白酶、漂洗液、漂洗液和洗脱液。对应地，多个试剂腔102包括用于存放裂解液的第一试剂腔、用于存放蛋白酶的第二试剂腔、用于存放漂洗液的第三试剂腔和第四试剂腔、及用于存放洗脱液的第五试剂腔。

上述各腔室通过设于第一旋转活塞2上的微通道连通或断开。如图3所示，本体1上还开设有分别和样本腔101、各试剂腔102连通的液流通道108，本体1上也还开设有和废液腔103连通的废液通道109。第一旋转活塞2能够选择性地将液流通道108和废液通道109中的两个连通，而将其他的通道断开；随着第一旋转活塞2旋转一定角度，第一旋转活塞2将液流通道108和废液通道109中的另两个连通，而将其他的通道断开。具体通过设于第一旋转活塞2的外表面上的连通槽将其中两个腔室连通。

第一旋转活塞2上的连通槽的布局参见图4a至图4c所示。如图4a至图4c所示，第一旋转活塞2上设有能够将样本腔101的液流通道108和试剂腔102的液流通道108连通的试剂连通槽21，第一旋转活塞2上还设有能够将样本腔101的液流通道108和废液通道109连通的废液连通槽22。每个试剂腔102分别对应设有一个液流通道108，因而，第一旋转活塞2上对应开设有多个试剂连通槽21。各试剂连通槽21和上述废液连通槽22整体分别沿第一旋转活塞2的轴向延伸，且多个试剂连通槽21和上述废液连通槽22沿第一旋转活塞2的圆周方向并列设置。各试剂连通槽21和上述废液连通槽22的起始端均能够和样本腔101的液流通道108对齐相接以实现和样本腔101的连通，因而各试剂连通槽21和上述废液连通槽22的起始端均位于第一旋转活塞2的同一圆周位置上，即其轴向距离为零。各试剂连通槽21的终止端能够与相应的试剂腔102的液流通道108对齐相接以实现和试剂腔102的连通，废液连通槽22的终止端能够和废液通道109对齐相接以实现和废液腔103的连通，因而，各试剂连通槽21的终止端和废液连通槽22的终止端分别位于第一旋转活塞2的不同圆周位置上，即任意两个终止端的轴向距离大于零。至少部分的试剂连通槽21和上述的废液连通槽22分别具有一或多个曲线段200，该曲线段200对应所需经过的非目标试剂腔102的液流通道108并位于该液流通道108下方，以避开该液流通道108，从而避免和该液流通道108相接。试剂连通槽21和上述的废液连通槽22的除曲线段200以外的部分分别沿直线延伸，且相互平行。本文中的“非目标试剂连通槽”解释如下：例如，对于连通存放洗脱液的第五试剂腔和样本腔101的试剂连通槽21来说，位于二者之间的第一至第四试剂腔即为非目标试剂腔；对于废液连通槽22来说，所有试剂腔都是非目标试剂腔；以此类推。

结合图1和图2所示，该立式微流控芯片还包括用于向样本腔101提供正压和负压的正负压泵，样本腔101和正负压泵相互连通。核酸提取纯化区仅样本腔101和正负压泵连接，通过一个正负压泵即可提供核酸提取、纯化、核酸提取液转移至第一扩增区过程中液体流通的动力。本体1的上端部(优选为本体1的上端面)设有用于连接正负压本的接口13，接口13通过设于本体1中的微通道和样本腔101连通。正负压泵向样本腔101提供正压时，可将样本腔101中的液体推入废液腔103或第一扩增区的腔室中；正负压泵向样本腔101提供负压时，可将试剂腔102中的试剂吸入样本腔101内。

结合图1至图3所示，该立式微流控芯片还包括能够移动或转动而将样本腔101中的物料混匀的混匀活塞11。混匀活塞11可移动或转动地设置于样本腔101中，或混匀活塞11可移动或转动地设置于本体1中并和样本腔101连通。通过往复移动混匀活塞11，可对样本腔101中的试剂等进行扰动，促使物料混匀。

样本腔101中设有用于吸附核酸的磁珠(图中未示出)。结合图2和图3所示，本体1的靠近样本腔101的部位处设置有磁性体12，磁性体12具体嵌设在本体1的磁铁孔中。该磁性体12优选为电磁铁，当电磁铁通电时，磁珠能够吸附核酸；当电磁铁断电时，磁珠将核酸释放。在另一实施例中，磁性体12也可以为磁铁，该磁铁可移除。

如图3所示，第一扩增区的腔室(即位于第一旋转活塞2和第二旋转活塞3之间的腔室)包括第一扩增腔104，第一扩增腔104用于对提取后的核酸进行第一轮PCR扩增。第一扩增腔104腔中预先设置有扩增试剂。本体1上开设有与第一扩增腔104连通的第一进液通道110及第一出液通道111。第一扩增腔104位于第一旋转活塞2的下方，第一旋转活塞2上还设有能够将样本腔101的液流通道108和第一进液通道110连通的核酸转移槽23。核酸转移槽23设于第一旋转活塞2的外圆周面上，核酸转移槽23的起始端和终止端之间的圆心角大于零，优选大于90度。第一旋转活塞2旋转到某一位置时，核酸转移槽23的起始端和上方的样本腔101的液流通道108对齐相接，终止端和下方的第一进液通道110对齐相接，正负压泵向样本腔101提供正压，将核酸提取液自样本腔101转移至第一扩增腔104中。

第一扩增区的腔室还包括用于接收第一扩增腔104的扩增产物的缓冲腔105，第一扩增腔104可通过缓冲腔105和第二扩增区内的第二扩增腔连通。缓冲腔105位于第一旋转活塞2和第二旋转活塞3之间。本体1上开设有与缓冲腔105连通的第二进液通道112及第二出液通道113。第一旋转活塞2上还设有能够连通第一出液通道111和第二进液通道112的移液连通槽24，移液连通槽24沿第一旋转活塞2的轴向直线延伸，并整体位于核酸转移槽23的终止端的右侧。当移液连通槽24将第一出液通道111和第二进液通道112连通时，核酸转移槽23将样本腔101的液流通道108和第一进液通道110连通。

结合图4a至图5所示，第一旋转活塞2包括第一本体201及包覆于第一本体201上的第一密封层202。试剂连通槽21、废液连通槽22、核酸转移槽23和移液连通槽24开设于第一密封层202上；或，试剂连通槽21、废液连通槽22、核酸转移槽23和移液连通槽24开设于第一本体201上并贯通第一密封层202，试剂连通槽21、废液连通槽22、核酸转移槽23和移液连通槽24的四周分别被第一密封层202包围。第一密封层202由柔性材料制成，如橡胶。

缓冲腔105通过气流通道与一开设于本体1中的定量腔106连通，立式微流控芯片还包括可滑动地设置于定量腔106中的定量活塞14。通过移动该定量活塞14可将第一扩增腔104中的扩增产物抽吸至缓冲腔105中，还可将缓冲腔105中的扩增产物定量分配至第二扩增区中。

如图3所示，第二扩增区的腔室(即位于第二旋转活塞3下方的腔室)包括多个第二扩增腔107，第二扩增腔107用于对第一轮扩增的产物进行第二轮PCR扩增。多个第二扩增腔107沿第二旋转活塞3的轴向自左至右并列设置。本体1上设有分别和各第二扩增腔107连通的液流通道108。

缓冲腔105的第二出液通道113和各第二扩增腔107的液流通道108的连通和断开由设于第二旋转活塞3上的连通槽实现。参照图6a和图6b所示，第二旋转活塞3上设有能够将第一出液通道111和第二扩增腔107的液流通道108连通的扩增连通槽31。具体地，第一出液通道111藉由缓冲腔105的第二出液通道113和扩增连通槽31连通。扩增连通槽31能够连通第二出液通道113和第二扩增腔107的液流通道108。第二旋转活塞3能够选择性地将第二出液通道113和其中一个第二扩增腔107的液流通道108连通，而将其他的液流通道108断开；随着第二旋转活塞3转动一定角度，第二旋转活塞3将第二出液通道113和另一个第二扩增腔107的液流通道108连通，而将其他的液流通道108断开。

第二旋转活塞3上的扩增连通槽31的布局参见图6a和图6b所示。如图6a和图6b所示，扩增连通槽31设于第二旋转活塞3的外圆周面上，每个第二扩增腔107对应一个扩增连通槽31。扩增连通槽具有起始端和终止端，起始端和终止端之间的圆心角大于零；具体地，圆心角为180度。多个扩增连通槽31沿第二旋转活塞3的圆周方向并列布置。每个扩增连通槽31包括依次相接三个直线段，相邻直线段相互垂直且二者之间圆弧过渡以形成转角段300。各扩增连通槽31的起始端沿第二旋转活塞3的周向间隔排列，位于第二旋转活塞3的同一圆周位置上。各扩增连通槽31的长度互不相同，任意两个相邻扩增连通槽31的终止端在第二旋转活塞3的轴向上和周向上均间隔一段距离。

参照图6a至图7所示，第二旋转活塞3包括第二本体301及包覆于第二本体301上的第二密封层302。扩增连通槽31开设于第二密封层302上；或，扩增连通槽31开设于第二本体301上并贯通第二密封层302，扩增连通槽31的四周分别被第二密封层302包围。第二密封层302由柔性材料制成，如橡胶。

第一旋转活塞2和第二旋转活塞3可分别由动力源驱动转动，动力源具体可以是电机。参照图2所示，第一旋转活塞2具有用于和动力源接合的驱动端部，该驱动端部具有可供电机的输出轴插入并连接的为多边形孔或异形孔的连接孔203。第二旋转活塞3具有用于和动力源接合的驱动端部，该驱动端部具有可供电机的输出轴插入并连接的为多边形孔或异形孔的连接孔303。

本实施例还提供一种用于核酸提取扩增的方法，其采用如上的立式微流控芯片。该方法包括如下步骤：

S1、将核酸样本加入样本腔101中；

S2、转动第一旋转活塞2，使试剂连通槽21将试剂腔102和样本腔101连通，使试剂转移至样本腔101中并混匀进行反应；

S3、转动第一旋转活塞2，使其上的废液连通槽22将样本腔101和设于本体1上的废液腔103连通，将反应后的废液转移至废液腔103中；

重复步骤S2和S3，依次将裂解液、蛋白酶、漂洗液及洗脱液加入样本腔101中进行反应，并在每次反应后将废液排至废液腔103中；

S4、转动第一旋转活塞2，使核酸连通槽将样本腔101和第一扩增腔104连通，将样本腔101中的核酸提取液转移至第一扩增腔104中；

S5、转动第一旋转活塞2，将样本腔101和第一扩增腔104之间的微通道关闭，进行第一轮扩增反应；具体为，第一旋转活塞2将第一扩增腔104和缓冲腔105之间的微通道关闭；

S6、转动第一旋转活塞2，使其上的移液连通槽24将第一扩增腔104和一设于本体1上的缓冲腔105连通，将扩增产物转移缓冲腔105中；

S7、转动第二旋转活塞3，使扩增连通槽31和第二扩增腔107连通，将第一轮扩增产物转移至第二扩增腔107中。具体地，扩增连通槽31将缓冲腔105和第二扩增腔107连通。

步骤S7具体实施如下：

步骤S7-1、转动第二旋转活塞3，使得第一个扩增连通槽31和与之对应的第一个第二扩增腔107连通，移动与缓冲腔105连通的定量腔106中的定量活塞14，将缓冲腔105的扩增产物定量推送至该第一个第二扩增腔107中；

步骤S7-2、继续转动第二旋转活塞3，使得第二个扩增连通槽31和与之对应的第二个第二扩增腔107连通，移动与缓冲腔105连通的定量腔106中的定量活塞14，将缓冲腔105的扩增产物定量推送至该第二个第二扩增腔107中；

重复上述步骤S7-1和S7-2，依次将扩增产物推送至各第二扩增腔107中。

本实施例的PCR核酸提取扩增微流控芯片的使用过程描述如下。

一、核酸提取纯化操作步骤

1、打开封盖15，通过样本腔101上方的孔向样本腔101中加入样本，然后盖上封盖15。

2、转动第一旋转活塞2使其旋转一定角度，将第一试剂腔102与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生负压将第一试剂腔102的裂解液转移到样本腔101，然后驱动混匀活塞11将裂解液和核酸样本混匀并进行反应。

3、磁性体12开始产生磁场，使磁珠吸附，再使第一旋转活塞2继续旋转一定角度，将样本腔101和废液腔103连通，通过正负压泵产生正压将样本腔101中未吸附于磁珠上的废液排至废液腔103中。

4、转动第一旋转活塞2使其旋转一定角度，将第二试剂腔102与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生负压将第二试剂腔102中的蛋白酶转移到样本腔101，与此同时磁性体12停止产生磁场使磁珠停止吸附，然后驱动混匀活塞11进行混匀反应。

5、磁性体12开始产生磁场，使磁珠吸附，再使第一旋转活塞2继续旋转一定角度，将样本腔101和废液腔103连通，通过正负压泵产生正压将样本腔101中未吸附于磁珠上的废液排至废液腔103中。

6、转动第一旋转活塞2使其旋转一定角度，将第三试剂腔102与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生负压将第三试剂腔102中的漂洗液转移到样本腔101，与此同时磁性体12停止产生磁场使磁珠停止吸附，然后驱动混匀活塞11进行混匀反应，对核酸进行第一次漂洗。

7、磁性体12开始产生磁场，使磁珠吸附，再使第一旋转活塞2继续旋转一定角度，将样本腔101和废液腔103连通，通过正负压泵产生正压将样本腔101中未吸附于磁珠上的废液排至废液腔103中。

8、转动第一旋转活塞2使其旋转一定角度，将第四试剂腔102与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生负压将第四试剂腔102中的漂洗液转移到样本腔101，与此同时磁性体12停止产生磁场使磁珠停止吸附，然后驱动混匀活塞11进行混匀反应，对核酸进行第二次漂洗。

9、磁性体12开始产生磁场，使磁珠吸附，再使第一旋转活塞2继续旋转一定角度，将样本腔101和废液腔103连通，通过正负压泵产生正压将样本腔101中未吸附于磁珠上的废液排至废液腔103中。

10、转动第一旋转活塞2使其旋转一定角度，将第五试剂腔102与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生负压将第五试剂腔102中的洗脱液转移到样本腔101，与此同时磁性体12停止产生磁场使磁珠停止吸附，然后驱动混匀活塞11进行混匀反应，将提取出的核酸洗脱下来形成核酸提取物。

二、第一轮PCR扩增操作步骤

1、转动第一旋转活塞2，将第一扩增腔104与样本腔101接通，然后通过正负压泵产生正压将样本腔101的核酸提取物排到第一扩增腔104内。

2、转动第一旋转活塞2将微通道关闭，进行第一轮PCR扩增反应。

3、转动第一旋转活塞2，将第一扩增腔104与缓冲腔105接通，然后定量活塞14将液体转移到缓冲腔105内进行混匀。

三、第二轮PCR扩增操作步骤

1、转动第二旋转活塞3，将缓冲腔105与第一个第二扩增腔107(腔体L1)接通，然后通过定量活塞14将液体转移到腔体L1内。

2、转动第二旋转活塞3，依次将液体转移到腔体L2—L12内。

3、进行第二轮PCR扩增。

本实施例可实现PCR巢式扩增，集核酸提取扩增检测于一体；可同时实现1-48个基因位点的PCR实时荧光检测；采用立式结构，有效消除气泡影响，使液体进量准确，可实现液体精准定量；结构紧凑简洁，易于批量化。通过旋转活塞实现微流控芯片的液体通路的切换，操作方便可控，易于自动化。实现了全密封无气溶胶污染，不需额外设置气路。仅需要控制一个正负压泵和一个定量活塞即可提供整个操作过程中液体的流动的动力，操作方便，结构简单。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于核酸提取扩增的立式微流控芯片，包括开设有腔室的本体，其特征在于，所述腔室包括：

样本腔，其用于盛放核酸样本；

试剂腔，其用于存放核酸提取所需的试剂；

第一扩增腔，其用于对提取后的核酸进行第一轮扩增；及

第二扩增腔，其用于对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增；

所述本体上还开设有分别和所述样本腔、所述试剂腔及所述第二扩增腔连通的液流通道，所述本体上开设有与所述第一扩增腔连通的第一进液通道及第一出液通道；

所述立式微流控芯片还包括：

第一旋转活塞，其可绕一水平延伸的转动轴心线转动地设置于所述本体中，所述样本腔和所述试剂腔位于所述第一旋转活塞的上方，所述第一扩增腔位于所述第一旋转活塞的下方，所述第一旋转活塞上设有能够将所述样本腔的液流通道和所述试剂腔的液流通道连通的试剂连通槽，所述第一旋转活塞上还设有能够将所述样本腔的液流通道和所述第一进液通道连通的核酸转移槽；

第二旋转活塞，其可绕一水平延伸的转动轴转动地设置于所述本体中，所述第一扩增腔位于所述第二旋转活塞的上方，所述第二扩增腔位于所述第二旋转活塞的下方，所述第二旋转活塞上设有能够将所述第一出液通道和所述第二扩增腔的液流通道连通的扩增连通槽；

其中，所述第二扩增腔的数量为多个，多个所述第二扩增腔沿所述第二旋转活塞的轴向自左至右并列设置；所述扩增连通槽设于所述第二旋转活塞的外圆周面；每个所述第二扩增腔设有一个液流通道，每个所述第二扩增腔对应一个所述扩增连通槽，多个所述扩增连通槽沿所述第二旋转活塞的圆周方向并列设置；各所述扩增连通槽分别具有起始端和终止端，各所述扩增连通槽的起始端间隔排列于所述第二旋转活塞的同一圆周位置。

2.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述样本腔中设有用于吸附核酸的磁珠，所述本体的靠近所述样本腔的部位处设置有磁性体；所述立式微流控芯片还包括用于向所述样本腔提供正压和负压的正负压泵，所述样本腔和所述正负压泵相互连通；和/或，所述立式微流控芯片还包括能够移动或转动而将所述样本腔中的物料混匀的混匀活塞；和/或，所述样本腔和所述试剂腔分别具有设于所述本体上端部的孔。

3.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述腔室还包括位于所述第一旋转活塞上方的废液腔，所述本体上开设有和所述废液腔连通的废液通道，所述第一旋转活塞上还设有能够将所述样本腔的液流通道和所述废液通道连通的废液连通槽。

4.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述试剂腔的数量为多个并沿所述第一旋转活塞的轴向间隔排列，每个所述试剂腔分别对应设有一个所述液流通道，所述第一旋转活塞上对应开设有多个所述试剂连通槽，多个所述试剂连通槽沿所述第一旋转活塞的圆周方向并列设置。

5.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述核酸转移槽设于所述第一旋转活塞的外圆周面上，所述核酸转移槽的起始端和终止端之间的圆心角大于零。

6.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述第一旋转活塞包括第一本体及包覆于所述第一本体上的第一密封层，所述试剂连通槽和所述核酸转移槽开设于所述第一密封层上或开设于所述第一本体上并贯通所述第一密封层；和/或，所述第二旋转活塞包括第二本体及包覆于所述第二本体上的第二密封层，所述扩增连通槽开设于所述第二密封层上或开设于所述第二本体上并贯通所述第二密封层。

7.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述腔室还包括用于接收所述第一扩增腔的扩增产物的缓冲腔，所述缓冲腔位于所述第一旋转活塞和所述第二旋转活塞之间，所述第一出液通道能够通过所述的缓冲腔和所述扩增连通槽连通，所述本体上开设有与所述缓冲腔连通的第二进液通道及第二出液通道，所述第一旋转活塞上还设有能够连通所述第一出液通道和所述第二进液通道的移液连通槽，所述扩增连通槽能够连通所述第二出液通道和所述第二扩增腔的液流通道，所述第一扩增腔腔中设置有扩增试剂。

8.根据权利要求7所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述缓冲腔通过气流通道与一开设于所述本体中的定量腔连通，所述立式微流控芯片还包括可滑动地设置于所述定量腔中的定量活塞。

9.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，所述起始端和所述终止端之间的圆心角大于零。

10.根据权利要求1所述的立式微流控芯片，其特征在于，各所述扩增连通槽的长度互不相同，任意两个相邻扩增联通的终止端在所述第二旋转活塞的轴向上和周向上均间隔一段距离。

11.一种用于核酸提取扩增的方法，其特征在于，采用如权利要求1至10任一项所述的立式微流控芯片，所述方法包括如下步骤：

A、将核酸样本加入所述样本腔中；

B、转动所述第一旋转活塞，使试剂连通槽将所述试剂腔和所述样本腔连通，使试剂转移至所述样本腔中并混匀进行反应；

C、转动所述第一旋转活塞，使核酸连通槽将所述样本腔和所述第一扩增腔连通，将所述样本腔中的核酸提取液转移至所述第一扩增腔中；

D、转动所述第一旋转活塞，将所述样本腔和所述第一扩增腔之间的微通道关闭，进行第一轮扩增反应；

E、转动所述第二旋转活塞，使扩增连通槽和所述第二扩增腔连通，将第一轮扩增产物转移至所述第二扩增腔中。