CN111088161A - 一种用于核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法，该芯片包括基底层、盖板层以及换向阀，盖板层设置有进样口、纯化浓缩腔室、废液出口、预混合腔通孔以及出口通孔，进样口通过流道经纯化浓缩腔室后分别连接到废液出口和预混合腔通孔，纯化浓缩腔室内预置嵌有免疫磁珠的多孔材料，换向阀设置在纯化浓缩腔室出口侧流道上以控制纯化浓缩腔室内的液体流至废液出口或预混合腔通孔，预混合腔通孔用于添加反应物以与来自纯化浓缩腔室的液体混合，基底层设置有混合流道和具有透明区域的恒温扩增腔室，预混合腔通孔经混合流道与恒温扩增腔室相连。使用本芯片可一步实现核酸的纯化、浓缩、恒温扩增以及实时荧光检测，快速、简便、可靠地获得一种或多种目标物检测结果。

Description

一种用于核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法

技术领域

本发明涉及分子诊断技术，特别是一种用于核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法。

背景技术

自Manz和Widmer于20世纪90年代首次提出微型全分析系统 Miniaturized TotalAnalyze Systems,μTAS的概念，微流控技术在微电子、微机械、生物工程和纳米技术的基础上发展起来。在此后的数十年，该领域迅速发展成为当前世界最前沿的科技领域之一，而目前其核心技术就是以微流控技术为基础的微流控芯片，又称芯片实验室Lab on chip。微流控芯片因为具有低消耗、低成本、高通量、自动化操作等优势，广泛用于生物医学领域，其中一个重要的应用就是基于微流控芯片的分子诊断技术。

临床上，分子诊断被广泛应用于感染性疾病、肿瘤以及遗传性疾病的检测。随着生命科学、生物技术、微加工技术取得重大突破，高尖端核酸分子检测的相关产业成为全球未来竞争的新领域。

分子诊断是包括多种扩增技术的精细探测方法，其中，实时荧光核酸恒温扩增检测技术simultaneous amplification and testing，简称SAT，是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有反应快速、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。然而，跟常规的核酸检测技术一样，该技术摆脱不了样品准备耗时长、操作繁琐等缺点，不满足快速、低成本的临床诊断需要。

发明内容

本发明的目的在于克服上述的至少一个缺点，提供一种用于核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于核酸扩增检测的微流控芯片，包括基底层、盖板层以及换向阀，所述基底层与所述盖板层层叠压合，所述盖板层设置有进样口、纯化浓缩腔室、废液出口、预混合腔通孔以及出口通孔，所述进样口通过流道经所述纯化浓缩腔室后分别连接到所述废液出口和所述预混合腔通孔，所述纯化浓缩腔室内预置嵌有免疫磁珠的多孔材料，所述换向阀设置在所述纯化浓缩腔室出口侧流道上以切换控制所述纯化浓缩腔室内的液体流至所述废液出口或所述预混合腔通孔，所述预混合腔通孔用于添加反应物以与来自所述纯化浓缩腔室的液体混合，所述基底层设置有混合流道和用于核酸恒温扩增及荧光检测的恒温扩增腔室，所述预混合腔通孔经所述混合流道与所述恒温扩增腔室相连，所述恒温扩增腔室具有透明区域，所述恒温扩增腔室与所述出口通孔相连。

进一步地：

所述废液出口上设置有废液池。

所述换向阀包括圆柱形的换向阀阀体，所述盖板层设置有与所述换向阀阀体相互配合的圆柱形通孔，所述基底层对应设置有与所述换向阀阀体相互配合的圆形腔，所述换向阀阀体上开有三通流道，通过旋转所述换向阀阀体使所述纯化浓缩腔室通过所述三通流道择一选通所述废液出口或所述预混合腔通孔。

所述三通流道为T形，流道的开口截面为方形。

具有多组所述预混合腔通孔与所述恒温扩增腔室，各所述预混合腔通孔与所述恒温扩增腔室通过对应的流动连接，所述换向阀与各所述预混合腔通孔通过分流流道的对应分支相连。

所述预混合腔通孔用于加入预混入特异性引物的缓冲液和DNA聚合酶并用于施加外部驱动压力。

形成所述多孔材料的支架材料为可3D打印的、对核酸没有吸附作用的、可通过冷冻干燥技术制备成多孔结构的有机或者无机材料。

所述多孔材料是将对核酸没有吸附作用的打印材料混合在1,4二氧六环中，制备成浓度为5％-20％的溶液，然后将溶液和免疫磁珠按质量比 4-10:1进行混合，之后通过低温沉积3D打印得到的多孔材料，优选地，所述打印材料为PLGA，优选地，所述免疫磁珠的直径为100nm-5μm。

所述基底层、所述盖板层和所述换向阀阀体的材料为聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC或ABS。

一种用于核酸扩增检测的检测方法，使用所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片进行核酸扩增检测，包括如下步骤：

从所述进样口灌注待测样品到所述纯化浓缩腔室，废液经所述换向阀门流向所述废液池；

从所述进样口灌注洗涤液对所述纯化浓缩腔室进行洗涤，废液流向废液池；

从所述进样口灌注洗脱液，缓慢流过所述纯化浓缩腔室；在即将从所述纯化浓缩腔室排液时，切换所述换向阀，使洗脱下来的核酸流入所述预混合腔通孔；

向所述预混合腔通孔注入混有引物的缓冲溶液和DNA聚合酶，然后立即驱动所述预混合腔通孔中的流体进入所述混合流道，然后进入所述恒温扩增腔室；

控制所述恒温扩增腔室的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种能够进行核酸纯化浓缩以及实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法，使用本发明的微流控芯片，可以在芯片上一步实现核酸的自动化纯化、浓缩、恒温扩增以及实时荧光检测，快速、简便、可靠地得到一种或多种目标物检测结果。本发明的微流控芯片可以实现自动化加样、反应及检测，其结构简单，控制方便，该芯片可批量化、低成本加工。在该芯片上检测核酸的过程中，可以准确控制试剂用量，降低试剂消耗，同时可以检测多项指标，保证检测结果的可靠、稳定以及可快速获得。该芯片可以广泛用于核酸分子快速诊断领域，降低检测成本，简化人员操作进而提高检测效率。

附图说明

图1为本发明一种实施例的集成核酸纯化浓缩和实时荧光核酸恒温扩增的核酸检测芯片的分解结构示意图；

图2为图1中所示的基底层1的结构示意图；

图3为图1中所示的盖板层2的结构示意图；

图4为图1中所示的换向阀阀体3的结构示意图；

图5为本发明一种实施例的核酸检测芯片组装后的结构及其俯视图；

图6为本发明一种实施例的换向阀的两种换向模式的示意图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。另外，连接既可以是用于固定作用也可以是用于电路/ 信号连通作用。

需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多该特征。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

参阅图1至图6，本发明实施例提出一种用于核酸扩增检测的微流控芯片，包括基底层1、盖板层2以及换向阀，所述基底层1与所述盖板层2 层叠压合，所述盖板层2设置有进样口7、纯化浓缩腔室8、废液出口、预混合腔通孔13以及出口通孔14，所述进样口7通过流道经所述纯化浓缩腔室8后分别连接到所述废液出口和所述预混合腔通孔13，所述纯化浓缩腔室内预置嵌有免疫磁珠的多孔材料，所述换向阀设置在所述纯化浓缩腔室8出口侧流道上以切换控制所述纯化浓缩腔室8内的液体流至所述废液出口或所述预混合腔通孔13，所述预混合腔通孔13用于添加反应物以与来自所述纯化浓缩腔室的液体混合，所述基底层1设置有混合流道5和恒温扩增腔室6，所述预混合腔通孔13经所述混合流道5与所述恒温扩增腔室6相连，所述恒温扩增腔室6用于核酸恒温扩增及荧光检测，所述恒温扩增腔室6具有透明区域以便检测，所述恒温扩增腔室6与所述出口通孔 14相连。

其中，所述进样口可以通过外接流体驱动装置，在纯化浓缩腔室中依次通入待浓缩核酸样品、洗涤液以及洗脱液等，废液经过所述换向阀门流到废液池，洗脱下来的核酸溶液通过切换所述换向阀门流到下一个单元。

所述恒温扩增腔室的温度可通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。

在优选的实施例中，所述废液出口上设置有废液池10。

在优选的实施例中，所述换向阀包括圆柱形的换向阀阀体3，所述盖板层2设置有与所述换向阀阀体3相互配合的圆柱形通孔11，所述基底层 1对应设置有与所述换向阀阀体3相互配合的圆形腔4，所述换向阀阀体上开有三通流道，通过旋转所述换向阀阀体使所述纯化浓缩腔室8通过所述三通流道择一选通所述废液出口或所述预混合腔通孔13。

在优选的实施例中，所述三通流道为T形，流道的开口截面为方形。

在优选的实施例中，具有多组所述预混合腔通孔13与所述恒温扩增腔室6，各所述预混合腔通孔13与所述恒温扩增腔室6通过对应的流动连接，所述换向阀与各所述预混合腔通孔13通过分流流道12的对应分支相连。

在优选的实施例中，所述预混合腔通孔13用于加入预混入特异性引物的缓冲液和DNA聚合酶并用于施加外部驱动压力。

在优选的实施例中，形成所述多孔材料的支架材料为可3D打印的、对核酸没有吸附作用的、可通过冷冻干燥技术制备成多孔结构的有机或者无机材料。

在优选的实施例中，所述多孔材料是将对核酸没有吸附作用的打印材料混合在1,4二氧六环中，制备成浓度为5％-20％的溶液，然后将溶液和免疫磁珠按质量比4-10:1进行混合，之后通过低温沉积3D打印得到的多孔材料，优选地，所述打印材料为PLGA，优选地，所述免疫磁珠的直径为 100nm-5μm。

在优选的实施例中，所述基底层、所述盖板层和所述换向阀阀体的材料为聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC或 ABS。

本发明实施例还提出一种核酸扩增检测方法，使用前述任一实施例所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片进行核酸扩增检测，包括如下步骤：

1)从所述进样口灌注待测样品到所述纯化浓缩腔室，废液经所述换向阀门流向所述废液池；

2)从所述进样口灌注洗涤液对所述纯化浓缩腔室进行洗涤，废液流向废液池；

3)从所述进样口灌注混有Mg+的洗脱液，缓慢流过所述纯化浓缩腔室；在即将从所述纯化浓缩腔室排液时，切换所述换向阀，使洗脱下来的核酸流入所述预混合腔通孔；

4)向所述预混合腔通孔注入混有引物的缓冲溶液和DNA聚合酶，然后立即驱动所述预混合腔通孔中的流体进入所述混合流道，然后进入所述恒温扩增腔室；

5)控制所述恒温扩增腔室的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。所述核酸检测方法基于实时荧光核酸扩增检测技术。

与传统技术相比，本发明实施例实现将核酸的纯化浓缩与实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合到同一个微流控芯片中，将极大减少人员操作，缩短检测时间，快速、简便、可靠地得到一种或多种目标物检测结果，同时也能发挥出微流控芯片技术本身的低成本、高通量、自动化等优势，满足临床中快速诊断的需要。

以下结合附图进一步描述本发明具体实施例的检测装置及检测过程。

本发明具体实施例提供一种集成核酸纯化浓缩和实时荧光核酸恒温扩增的核酸检测芯片。如图1所示为该核酸检测芯片的分解结构示意图，芯片包括基底层1、盖板层2以及嵌入两层中的换向阀阀体3。

如图2所示，基底层1包括与换向阀阀体3相互配合的圆形腔4，多组混合流道5和恒温扩增腔室6以及若干相互连通的流道。

如图3所示，盖板层2包括进样口7、纯化浓缩腔室8、与换向阀阀体3相互配合的圆柱形通孔11、废液池10、分流流道12、多个预混合腔通孔13以及多个与恒温扩增腔室6末端流道对应的通孔14。

如图4所示为换向阀阀体3的结构示意图，下端开有截面是方形的T 型通道15，连通方向与阀体旋转头上的箭头16指向一致。

基底层、盖板层以及换向阀阀体的材料采用常见的医用塑料，比如聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC、ABS，采用模压热塑成型、注塑成型等多种塑料成型方式；比如采用注塑成型的方法，预先加工出模具，然后将聚丙烯PP材料在恒温料筒中以220-280℃融化，然后加压800-140MPa将融化后的PP材料注入模具，之后保压、冷却成型。在芯片组装前，需要在纯化浓缩腔室8中通过3D打印的方式打印出混有直径100nm-5μm的免疫磁珠的PLGA支架，其中，PLGA支架由PLGA 混合在1,4二氧六环中，制备成浓度为5％-20％的溶液，然后将溶液和免疫磁珠按质量比4-10:1进行混合，之后在低温沉积打印机中进行打印得到；然后将盖板层2放入冷冻干燥机中冷冻干燥，形成嵌有免疫磁珠的多孔支架9。之后将基底层1和含有多孔支架9的盖板层2在塑料热压合机中组装，然后将换向阀阀体3直接嵌入芯片，形成如图5所示组装后的芯片17。

如图6所示，换向阀阀门初始状态22连通纯化浓缩腔室8和废液池 10，逆时针旋转换向阀阀体390°到换向状态23，连通纯化浓缩腔室8和分流流道12。

在图5所示的芯片俯视面18中，芯片按照功能被划分为三个单元：核酸纯化浓缩单元19、反应物混合单元20和核酸恒温扩增及检测单元21。核酸纯化浓缩单元中预包埋多孔材料，多孔材料中嵌入免疫磁珠；反应物混合单元包括多个预混合腔通孔和混合流道，可用于多种反应物添加以及混合，混合流道直接与核酸恒温扩增及检测单元相连通；核酸恒温扩增及检测单元包括多个恒温扩增腔室，涉及恒温控制、荧光检测等外部设备；芯片上个单元之间通过流道连通，通过集成在芯片上的阀门以及外加驱动，驱使流体依次流经各个单元。所述预混合腔通孔可收集从核酸纯化浓缩单元流过来的核酸溶液，并通过排枪依次加入预混入特异性引物的缓冲液和 DNA聚合酶，之后混合物立即经过所述混合流道充分混合后进入下一单元；混合液体的驱动方式可以采用低速离心、外加压力驱动等多种方式，优选高通量流体驱动方法。

优选地，核酸检测步骤具体包括：

1)使用注射枪以200μL/min的速度从核酸纯化浓缩单元19的进样口7灌注待测样品500μL到纯化浓缩腔室8，废液经所述换向阀门流向废液池；

2)在核酸纯化浓缩单元19以200μL/min的速度灌注洗涤液100μL 进行洗涤，废液流向废液池；

3)在核酸纯化浓缩单元19以50μL/min的速度灌注混有Mg+的洗脱液50μL，让洗脱液缓慢流过纯化浓缩腔室8；在即将排出残留洗涤液时，将换向阀门打到换向状态23，洗脱下来的核酸流入反应物混合单元20，经分流流道12流向各个预混合腔通孔13；复位换向阀门到初始状态22；

4)使用排枪在反应物混合单元的各个预混合腔通孔13分别快速注入混有引物的缓冲溶液和DNA聚合酶，然后通过排枪在各个预混合腔通孔13 的上方加载压力，让流体快速流入混合流道5，并进入核酸恒温扩增及检测单元21中的恒温扩增腔室6；

5)控制所述核酸恒温扩增及检测单元的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

本发明将实时荧光核酸恒温扩增及检测技术结合于微流控芯片上，同时将核酸的纯化浓缩过程也集成在芯片上，可快速、简便、可靠地得到一种或多种目标物检测结果，大大简化了繁琐的人员操作，还能充分利用微流控芯片技术低成本、低试剂消耗、高通量、自动化过程等优势，同时发挥荧光核酸恒温扩增及检测技术快速、简单、稳定、可靠等优势，满足临床、疫病检测等快速检测的需求。

本发明的背景部分可以包括关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包括的内容并不是申请人对现有技术的承认。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包括于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。

Claims (10)

1.一种用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，包括基底层、盖板层以及换向阀，所述基底层与所述盖板层层叠压合，所述盖板层设置有进样口、纯化浓缩腔室、废液出口、预混合腔通孔以及出口通孔，所述进样口通过流道经所述纯化浓缩腔室后分别连接到所述废液出口和所述预混合腔通孔，所述纯化浓缩腔室内预置嵌有免疫磁珠的多孔材料，所述换向阀设置在所述纯化浓缩腔室出口侧流道上以切换控制所述纯化浓缩腔室内的液体流至所述废液出口或所述预混合腔通孔，所述预混合腔通孔用于添加反应物以与来自所述纯化浓缩腔室的液体混合，所述基底层设置有混合流道和用于核酸恒温扩增及荧光检测的恒温扩增腔室，所述预混合腔通孔经所述混合流道与所述恒温扩增腔室相连，所述恒温扩增腔室具有透明区域，所述恒温扩增腔室与所述出口通孔相连。

2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，所述废液出口上设置有废液池。

3.根据权利要求1或2所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，所述换向阀包括圆柱形的换向阀阀体，所述盖板层设置有与所述换向阀阀体相互配合的圆柱形通孔，所述基底层对应设置有与所述换向阀阀体相互配合的圆形腔，所述换向阀阀体上开有三通流道，通过旋转所述换向阀阀体使所述纯化浓缩腔室通过所述三通流道择一选通所述废液出口或所述预混合腔通孔。

4.根据权利要求3所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，所述三通流道为T形，流道的开口截面为方形。

5.根据权利要求1至4任一项所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，具有多组所述预混合腔通孔与所述恒温扩增腔室，各所述预混合腔通孔与所述恒温扩增腔室通过对应的流动连接，所述换向阀与各所述预混合腔通孔通过分流流道的对应分支相连。

6.根据权利要求1至5任一项所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，所述预混合腔通孔用于加入预混入特异性引物的缓冲液和DNA聚合酶并用于施加外部驱动压力。

7.根据权利要求1至6任一项所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，形成所述多孔材料的支架材料为可3D打印的、对核酸没有吸附作用的、可通过冷冻干燥技术制备成多孔结构的有机或者无机材料。

8.根据权利要求1至7任一项所述的核酸纯化浓缩单元，其特征在于，所述多孔材料是将对核酸没有吸附作用的打印材料混合在1,4二氧六环中，制备成浓度为5％-20％的溶液，然后将溶液和免疫磁珠按质量比4-10:1进行混合，之后通过低温沉积3D打印得到的多孔材料，优选地，所述打印材料为PLGA，优选地，所述免疫磁珠的直径为100nm-5μm。

9.根据权利要求1至8任一项所述的一种用于核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，所述基底层、所述盖板层和所述换向阀阀体的材料为聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC或ABS。

10.一种用于核酸扩增检测的检测方法，其特征在于，使用根据权利要求1至9任一项所述的用于核酸扩增检测的微流控芯片进行核酸扩增检测，包括如下步骤：

从所述进样口灌注待测样品到所述纯化浓缩腔室，废液经所述换向阀门流向所述废液池；

从所述进样口灌注洗涤液对所述纯化浓缩腔室进行洗涤，废液流向废液池；

从所述进样口灌注洗脱液，缓慢流过所述纯化浓缩腔室；在即将从所述纯化浓缩腔室排液时，切换所述换向阀，使洗脱下来的核酸流入所述预混合腔通孔；

向所述预混合腔通孔注入混有引物的缓冲溶液和DNA聚合酶，然后立即驱动所述预混合腔通孔中的流体进入所述混合流道，然后进入所述恒温扩增腔室；

控制所述恒温扩增腔室的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

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