CN112375669A - 一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片，包含顶盖层、中间流道层和底部分液层，所述顶盖层包含进样口、进反应液口及废样池通气孔，所述中间流道层包含核酸提取纯化腔室、废样池、混合流道及中空通道，所述底部分液层包含混合腔室、多个分离通道以及多个核酸检测腔室，所述进样口连接所述核酸提取纯化腔室，所述核酸提取纯化腔室分别连接所述废样池和所述混合流道，所述废样池连接所述废样池通气孔，所述进反应液口连接所述混合流道，所述混合流道通过所述中空通道连接所述混合腔室，所述混合腔室通过所述多个分离通道对应地连接所述多个核酸检测腔室。本发明的微流控芯片用于核酸提取纯化与检测，可减少人为操作，方便高效，缩短检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术和分子诊断等领域，特别是涉及一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片。
背景技术
微流控技术在过去的几十年中飞速的发展，该技术是微尺度流体力学，材料学，生命科学，化学等学科交叉的技术。在药物筛选、分子诊断、水质检测等领域得到了快速的应用。近年来，埃博拉病毒，非洲猪瘟，新型冠状病毒等传染病在全球范围内大肆传播，严重威胁到人类的正常生活，因此能够实现核酸快速检测亟待解决。而微流控技术便是一个很好的工具，在生化领域有巨大潜力，若能在微流控芯片上实现核酸检测，便能高效地进行核酸检测工作。
微流控技术起源毛细管内完成的电泳分离，之后微流控技术得到快速发展，从最初的分析化学平台逐渐应用与各个领域如生化医疗诊断，食品商品检验等。微流控体系驱动系统最常用的有主动式和被动式两种，主动式主要采用外界驱动力如机械压力、磁场、电场等，而被动式主要靠流道的设计来实现流体的流动，被动式相对于主动式结构简单，更加容易小型化，但被动式驱存在着不稳定的缺陷。主动和被动驱动方式各有利弊。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述背景技术的缺陷，提供一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片，减少人为操作，方便高效，缩短检测时间。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片，包含顶盖层、中间流道层和底部分液层，所述顶盖层包含进样口、进反应液口及废样池通气孔，所述中间流道层包含核酸提取纯化腔室、废样池、混合流道及中空通道，所述底部分液层包含混合腔室、多个分离通道以及多个核酸检测腔室，所述进样口连接所述核酸提取纯化腔室，所述核酸提取纯化腔室分别连接所述废样池和所述混合流道，所述废样池连接所述废样池通气孔，所述进反应液口连接所述混合流道，所述混合流道通过所述中空通道连接所述混合腔室，所述混合腔室通过所述多个分离通道对应地连接所述多个核酸检测腔室。
进一步地：
所述底部分液层还包括废液池，所述顶盖层还包含所述废液池通气孔，所述废液池连接所述废液池通气孔。
所述底部分液层还包含设置在对应地设置在所述多个分离通道入口处的多个分液腔室，所述混合腔室连接所述多个分液腔室，所述多个分液腔室可在所述微流控芯片进行低速离心运动时从所述混合腔室收存混合液，并在所述微流控芯片进行高速离心运动时将收存的混合液通过对应的所述分离通道释放至对应的所述核酸检测腔室。
所述多个分液腔室沿圆周向呈弧线型排列。
所述混合腔室为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为水滴形。
所述分液腔室为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为漏斗形。
所述多个分液腔室为等量储液的分液腔室。
所述核酸提取纯化腔室中含有修饰过的用于吸附核酸的微阵列结构。
所述混合流道为蜿蜒曲折延伸的蛇形混合流道。
所述顶盖层、所述中间流道层以及所述底部分液层的材料为聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或ABS。
本发明具有如下有益效果：
本发明的微流控芯片可用于实时荧光核酸恒温扩增及检测，同时将核酸的提取纯化浓缩过程也集成在该微流控芯片上，极大地减少人为操作，缩短检测时间，同时也发挥出微流控芯片技术本身的优势(低成本、高通量、自动化等)，满足临床中快速诊断的需要。优选的方案中，基于本发明，可以将主动式驱动与离心驱动结合使用来进行可控的液体驱动及分配，利用每种驱动方式的优势高效方便地实现核酸检测过程；同时，本发明优选方案中的底部分液层结构可利用离心力可以将混合液均匀分液在每个检测孔，不浪费试剂，实现高通量检测。
附图说明
图1为本发明一种实施例的用于高通量核酸提取纯化以及实时荧光核酸扩增检测的多层微流控芯片的结构示意图；
图2为图1中的顶盖层的结构示意图；
图3为图1中的中间流道层的结构示意图；
图4为图1中的底部分液层的结构示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式做详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。另外，连接既可以是用于固定作用也可以是用于耦合或连通作用。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多该特征。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
参阅图1至图4，本发明实施例提供一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片，包含顶盖层1、中间流道层2和底部分液层3，所述顶盖层1包含进样口6、进反应液口8及废样池通气孔4，所述中间流道层包含核酸提取纯化腔室9、废样池10、混合流道11及中空通道12，所述底部分液层3包含混合腔室13、多个分离通道15以及多个核酸检测腔室16，所述进样口6连接所述核酸提取纯化腔室9，所述核酸提取纯化腔室9分别连接所述废样池10和所述混合流道11，所述废样池10连接所述废样池通气孔4，所述进反应液口8连接所述混合流道11，所述混合流道11通过所述中空通道12连接所述混合腔室13，所述混合腔室13通过所述多个分离通道15对应地连接所述多个核酸检测腔室16。本发明实施例的微流控芯片可以在芯片上一步实现核酸的纯化、浓缩、扩增和检测，快速得到多种目标物检测结果。该芯片可以广泛用于核酸分子快速诊断领域，降低检测成本，简化人为操作进而提高检测效率。
在优选的实施例中，所述底部分液层还包括废液池17，所述顶盖层1还包含所述废液池通气孔7，所述废液池17连接所述废液池通气孔7。
在优选的实施例中，所述底部分液层3还包含设置在对应地设置在所述多个分离通道15入口处的多个分液腔室，所述混合腔室13连接所述多个分液腔室14，所述多个分液腔室14可在所述微流控芯片进行低速离心运动时从所述混合腔室13收存混合液，并在所述微流控芯片进行高速离心运动时将收存的混合液通过对应的所述分离通道15释放至对应的所述核酸检测腔室16。
在更优选的实施例中，所述多个分液腔室14沿圆周向呈弧线型排列。
在更优选的实施例中，所述混合腔室13为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为水滴形。
在更优选的实施例中，所述分液腔室14为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为漏斗形。
在优选的实施例中，所述多个分液腔室14为等量储液的分液腔室。
基于本发明上述优选实施例，可以将主动式驱动与离心驱动结合使用来进行可控的液体驱动及分配，利用每种驱动方式的优势高效方便地实现核酸检测过程；同时，本发明优选实施例中的底部分液层结构可利用离心力可以将混合液均匀分液在每个检测孔，不浪费试剂，实现高通量检测。
在优选的实施例中，所述核酸提取纯化腔室9中含有修饰过的用于吸附核酸的微阵列结构。
在优选的实施例中，所述混合流道为蜿蜒曲折延伸的蛇形混合流道。
在一些实施例中，所述顶盖层2、所述中间流道层2以及所述底部分液层3的材料选自聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或ABS。
以下进一步描述本发明的一些具体实施例。
一种集成核酸提取纯化功能的高通量实时荧光核酸扩增检测微流控芯片，芯片结构包含顶盖层、中间流道层以及底部分液层，每层之间可采用层压的技术进行封合。从功能上划分，芯片包括核酸提取纯化单元、反应物混合单元和核酸恒温扩增及检测单元。核酸检测采用实时荧光核酸扩增检测技术。核酸提取纯化单元中可使用微阵列结构进行核酸吸附。反应物混合单元包含多个腔室和混合流道，用于多种反应物添加以及混合。核酸恒温扩增及检测单元包括多个恒温扩增腔室，涉及恒温控制、荧光检测等外部设备。
具体地，核酸提取纯化单元可以包括一个进样口，一个核酸提取纯化腔室，一个废样池以及一个通气孔。样本从进样口流入，流经核酸提取纯化腔室，后续洗脱液也从进样口流入，将核酸提取纯化腔室中的核酸洗脱下来流向混合流道。相关流道或者入口分布在中间流道层。进样口通过外力驱动进行加样，样本流经核酸提取纯化腔室，废样流入废样池，通气孔用于提供压力差，驱动流体向低压单元流动。核酸提取纯化腔室中含有修饰过的微阵列结构，微阵列结构可通过机加工实现，后续经过紫外光照射，使其表面更易缠绕DNA，吸附核酸的效率高。
反应物混合单元包括一个进反应液口，一段蛇形混合流道，一个中空通道，反应液从进反应液口进入，与洗脱液经过蛇形混合流道进行混合，后续混合液通过中空通道进入第三层分液结构，可通过离心的驱动方式将混合液均匀分夜在核酸检测腔室中进行后续检测；核酸检测腔室中提前包埋引物。混合腔室分布在底部分液层，混合流道分布在中间流道层。
核酸恒温扩增及检测单元包含多个恒温扩增腔室及若干流道。恒温扩增腔室的温度可通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。作为核酸检测腔室的恒温扩增腔室分布于基底层。
顶盖层、中间流道层以及底部分液层的材料可以但不限于采用聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS等常见的医用塑料。顶盖层、中间流道层以及底部分液层可以但不限于采用模压热塑成型等多种成型方式。
一些实施例的用于核酸扩增及检测的芯片的使用方法包括如下步骤：
(1)使用例如注射器等气压驱动的方式将样品从进样口加入，多余的废液流向废样池；
(2)核酸提取纯化单元的进样口灌注洗涤液进行洗涤，废液流向废样池；
(3)核酸提取纯化单元的进样口灌注例如混有Mg+的洗脱液，缓慢流过核酸提取纯化腔室，将核酸提取纯化腔室中的核酸洗脱下来；
(4)反应物混合单元的进反应液口灌注含有酶的反应液，与洗脱液在蛇形流道进行混合；
(5)混合液流入到混合腔室，先进行低速离心将混合液分配到各个分液腔室，再进行高速离心，将混合液均匀分离到每个核酸检测腔室与引物；
(6)控制核酸恒温扩增及检测单元的温度例如为65℃，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。
本发明实施例的微流控芯片，可用于进行核酸的自动化纯化浓缩、恒温扩增以及实时荧光检测。在芯片上可以实现自动化加样、反应及检测，结构简单，控制方便，芯片可批量化、低成本加工。在芯片上检测核酸的过程中，可以准确控制试剂用量，降低试剂消耗，同时可以检测多项指标，保证检测结果的可靠、稳定以及可快速获得。
参阅图1至图4，示例性地，一个具体实施例提供一种高通量核酸提取纯化以及实时荧光核酸扩增检测的多层微流控芯片。
如图1所示为核酸检测芯片的结构示意图，芯片包括顶盖层1、中间流道层2以及底部分液层3。
如图2所示，顶盖层1包含废样池通气孔4、装配定位孔5、进样口6、废液池通气孔7、进反应液口8以及若干相互连通的流道。
如图3所示，中间流道层包含微阵列核酸提取纯化腔室9、废样池10、混合流道11、中空通道12。
如图4所示，底部分液层3包含混合腔室13、等量分液腔室14、分离通道15、核酸检测腔室16、废液池17以及废液池通气孔18。
顶盖层、中间流道层以及底部分液层的材料采用常见的医用塑料，比如聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯PC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、ABS，采用模压热塑成型、注塑成型等多种塑料成型方式；比如采用注塑成型的方法，预先加工出模具，然后将聚丙烯(PP)材料在恒温料筒220-280℃中融化，然后加压800-140MPa将融化后的PP材料注入模具，之后保压、冷却成型。芯片中核酸提取单元使用机加工的方式，在该腔室加工一定形状的微阵列，经过表面处理之后可达到吸附核酸的作用。
核酸检测步骤具体为：
1、使用注射枪以20μL/min的速度从核酸提取纯化单元1的进样口6灌注待测样品50μL到核酸提取纯化腔室9，样品中核酸被吸附，剩余废液流向废样池10；
2、使用注射枪以200μL/min的速度从核酸提取纯化单元1的进样口6灌注洗涤液100μL进行洗涤，废液流向废样池10；
3、使用注射枪以50μL/min的速度从核酸提取纯化单元1的进样口6灌注混有Mg+的洗脱液50μL，让洗脱液缓慢流过核酸提取纯化腔室9；此时将废样池的通气孔关闭，洗脱的核酸流向混合腔室。同时使用注射枪以50μL/min的速度从进反应液口8灌注混有酶的反应液50μL，使其流向混合流道。
4、待混合液流至底部的混合腔室，先进行低速离心，将混合液均匀分至等量分液腔室14，再进行高速离心，将液体通过各自的分离通道15流至核酸检测腔室16。
5、控制所述核酸恒温扩增及检测单元的温度为65℃，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。
本发明实施例将核酸的纯化浓缩与实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合到同一个微流控芯片中，将极大减少人为操作，缩短检测时间，同时也发挥出微流控芯片技术本身的优势(低成本、高通量、自动化等)，满足临床中快速诊断的需要。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
Claims (10)
1.一种用于核酸提取纯化与检测的微流控芯片，其特征在于，包含顶盖层、中间流道层和底部分液层，所述顶盖层包含进样口、进反应液口及废样池通气孔，所述中间流道层包含核酸提取纯化腔室、废样池、混合流道及中空通道，所述底部分液层包含混合腔室、多个分离通道以及多个核酸检测腔室，所述进样口连接所述核酸提取纯化腔室，所述核酸提取纯化腔室分别连接所述废样池和所述混合流道，所述废样池连接所述废样池通气孔，所述进反应液口连接所述混合流道，所述混合流道通过所述中空通道连接所述混合腔室，所述混合腔室通过所述多个分离通道对应地连接所述多个核酸检测腔室。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述底部分液层还包括废液池，所述顶盖层还包含所述废液池通气孔，所述废液池连接所述废液池通气孔。
3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述底部分液层还包含设置在对应地设置在所述多个分离通道入口处的多个分液腔室，所述混合腔室连接所述多个分液腔室，所述多个分液腔室可在所述微流控芯片进行低速离心运动时从所述混合腔室收存混合液，并在所述微流控芯片进行高速离心运动时将收存的混合液通过对应的所述分离通道释放至对应的所述核酸检测腔室。
4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述多个分液腔室沿圆周向呈弧线型排列。
5.如权利要求3或4所述的微流控芯片，其特征在于，所述混合腔室为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为水滴形。
6.如权利要求3至5任一所述的微流控芯片，其特征在于，所述分液腔室为朝向出液方向尺寸逐渐缩小的形状，优选为漏斗形。
7.如权利要求3至6任一所述的微流控芯片，其特征在于，所述多个分液腔室为等量储液的分液腔室。
8.如权利要求1至7任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸提取纯化腔室中含有修饰过的用于吸附核酸的微阵列结构。
9.如权利要求1至8任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述混合流道为蜿蜒曲折延伸的蛇形混合流道。
10.如权利要求1至9任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述顶盖层、所述中间流道层以及所述底部分液层的材料选自聚氯乙烯PVC，聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或ABS。
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