CN105316224A - 全自动核酸提取与pcr扩增微流控芯片及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，包括至少一个主体，沿芯片圆周等距分布，所述主体包括：核酸提取单元，其位于所述主体上，用于在离心力和毛细力的驱动下顺序进行核酸的萃取、清洗、洗脱；PCR扩增单元，用于PCR反应扩增；废液单元，其包括废液腔体，用于存储废液；以及排气单元，其包括排气孔和多条排气流道，所述多条排气流道与核酸提取单元、PCR扩增单元、废液单元连通，用于排放气体。本发明提出了一种利用离心力、毛细力以及虹吸现象来实现全自动核酸提取与PCR反应的微流控芯片，该微流控芯片上无任何集成的泵、阀设备，大大降低了芯片的制造难度和成本，并提高了芯片的可靠性。

Description

全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片及其应用方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域。更具体地说，本发明涉及一种全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片及核酸提取与PCR扩增方法。

背景技术

流控芯片在核酸提取与PCR扩增中已经有了很多应用，但大多数的应用还停留在实验室阶段。原因是为了实现血样或组织的裂解、核酸绑定、清洗、洗脱等过程，这些核酸提取与PCR扩增微流控芯片上都集成有很多的微泵和微阀，增加了微流控芯片的复杂性、制造难度、成本，降低了可靠性。同时，外部驱动这些泵、阀所需要的设备和装置也比较复杂，限制了这些芯片向临床的应用。

由此，本发明摒弃现有核酸检测PCR芯片上集成的泵和阀，提出利用旋转器械的离心力作为驱动，并辅助以毛细力和虹吸现象来实现全部流体的功能操控。整个核酸提取、纯化和PCR反应过程中的流体操控只需要一台旋转离心设备即可完成。整个微流控芯片上无任何集成的泵、阀设备，大大降低了芯片的制造难度和成本，并提高了芯片的可靠性，对于核酸提取与PCR扩增的临床应用具有积极意义。

发明内容

本发明的目的是提出了一种利用离心力、毛细力以及虹吸现象来实现全自动核酸提取与PCR反应的微流控芯片，该微流控芯片上无任何集成的泵、阀设备，大大降低了芯片的制造难度和成本，并提高了芯片的可靠性。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，包括至少一个主体，沿芯片圆周等距分布，所述主体包括：

核酸提取单元，其位于所述主体上，用于在离心力和毛细力的驱动下顺序进行核酸的萃取、清洗、洗脱；

PCR扩增单元，其位于所述主体上，其与所述核酸提取单元通过三叉流道相连，用于PCR反应扩增；

废液单元，其包括废液腔体，与所述核酸提取单元通过三叉流道相连，用于存储废液；

以及排气单元，其包括排气孔和多条排气流道，所述多条排气流道与核酸提取单元、PCR扩增单元、废液腔体连通，用于排放气体。

优选的是，所述核酸提取单元包括：

加样装置，其位于主体的左上端，所述加样装置包括加样腔体及设置在加样腔体上的加样孔，所述加样装置用于加入和存放样品与裂解液、绑定液的混合物；

清洗装置，其位于主体的中上端，所述清洗装置包括清洗液加样孔和清洗液腔体，所述清洗装置用于加入和存放清洗液；

洗脱装置，其位于主体的右上端，所述洗脱装置包括洗脱液加样孔和洗脱液腔体，所述洗脱装置用于加入和存放洗脱液；

以及核酸固相萃取装置，其包括核酸固相萃取腔体，所述核酸固相萃取腔体内设置有核酸固相萃取材料；

其中所述加样腔体通过第一流道与所述核酸固相萃取腔体连通，所述清洗液腔体通过第二流道与所述核酸固相萃取腔体连通，所述洗脱液腔体通过第三流道与核酸固相萃取腔体所述连通。

优选的是，所述PCR扩增单元包括：

核酸定量流道，其与核酸固相萃取单元通过三叉流道连通；

核酸定量腔体，其与核酸定量流道连通，用于定量核酸；

PCR反应腔体，其与核酸定量腔体通过第六流道连通，所述PCR腔体为封闭腔体，内部放置有PCR反应所需引物及试剂；

以及多余核酸腔体，其与核酸定量流道连通，用于存储多余的核酸。

本发明的另一个目的是提供全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片的应用方法，包括如下步骤；

步骤1)：将全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片安装在离心机上，再经加样孔向加样腔体中加入样品与裂解液、绑定液的混合物，向清洗液腔体中加入清洗液，向洗脱液腔体中加入洗脱液。

步骤2)：顺时针旋转离心，转速1200～1600rpm，时间3～5分钟。样品与裂解液、绑定液混合物将经第一流道后进入固相萃取腔体，清洗液将经第四流道、清洗液二级腔体、第三流道后既进入固相萃取腔体；而洗脱液将在离心力作用下进入洗脱液二级腔体中，溶液达到第二流道的虹吸管后，由于强大的离心力大于毛细力，洗脱液无法经第二流道进入固相萃取腔体；

同时，由于第一流道相对于第三流道具有更低的流体阻力，可以使得在样品与裂解液、绑定液的混合物完全流出固相萃取腔体时，清洗液依然没有到达固相萃取腔体，进而实现萃取与清洗的顺序执行；

由于为顺时针高速离心，在科里奥利力的作用下，使得样品与裂解液、绑定液的混合物以及清洗液都将经三叉流道流向废液腔体，而不会流向核酸定量流道。

步骤3)：速至0后逆时针低俗旋转，转速20～80rpm，时间20～60s，此时由于离心较小，使得洗脱液可以由毛细力充满整个第二流道。

步骤4)：逆时针高速离心，转速1200～1600rpm，时间60～120s，在离心力的作用下，利用虹吸现象将洗脱液经第二流道后流向固相萃取腔体，并在科里奥利力的作用下将洗脱完的核酸经三叉流道后流向定量流道，并依次充满核酸定量腔体，多余的核酸流入废液腔体，完成核酸的洗脱；此时由于第六流道具有较小的横截面尺寸，且PCR反应腔体为封闭腔体，使得离心力不足以克服第六流道的毛细力与样品腔体的内压力，而核酸无法进入PCR反应腔体。

步骤5)：进一步提高转速，1800～2500rpm，时间20～40s，在更为强大的离心力作用下，洗脱完的核酸经定量腔体后进入PCR反应腔体，并与PCRmix、引物的结合，在外部温控的控制下完成PCR扩增，所述转速优选2500rpm。

优选的是，所述PCR反应所需的试剂或引物包含PCRmix、PCR引物，所述试剂或者引物以冻干或风干形式存放于PCR反应腔体内。

优选的是，所述固相萃取腔体具有细长结构，且长度方向指向芯片中心，以保证在离心力作用下，流体能有较少残留；所述固相萃取腔体具有长方形横截面，其等效直径1mm～2mm，长度5mm～15mm；所述固相萃取材料选自硅胶膜、硅胶柱中的一种。

优选的是，所述清洗液腔体包括清洗液一级腔体和清洗液二级腔体，清洗液一级腔体和清洗液二级腔体通过第四流道连通，所述洗脱液液腔体包括洗液不会进入清洗液二级腔体，更不会进入第三流道，进而提前进入固相萃取腔体；所述方案增加了一个洗脱液二级腔体，此设计的优点在于，由于第五流道的存在，在毛细力和表面张力的存在，洗脱液不会进入洗脱液二级腔体，更不会第二流道，进而提前进入固相萃取腔体。

优选的是，所述第二流道为虹吸流道，所述洗脱液二级腔体经虹吸流道连接到固相萃取腔体，此设计的优点在于，由于虹吸流道的存在，使得在第一次顺时针离心下，洗脱液不会经虹吸流道提前进入固相萃取腔体；只有在第二次反向离心时，洗脱液才会经虹吸流道进入固相萃取腔体；所述虹吸流道的等效直径为0.8mm～1.5mm，以保证其具有较小的流体阻力；所述虹吸流道距离芯片中心的最小距离小于洗脱液二级腔体距离芯片中心最小处的距离；所述第三流道具有局部增加流体阻力流道结构，所述流道结构具有较小的等效直径，且为”S”型；所述第四流道和所述第五流道具有等效直径0.4mm～0.8mm；以保证其具有合适的毛细力和流体阻力，在静止时溶液不会流出，在离心时溶液可以快速流出。

优选的是，所述第六流道具有等效直径0.1mm～0.2mm；所述的加样腔体具有体积500～800μl；所述的清洗液腔体、清洗液二级腔体具有体积500～800μl；所述的洗脱液腔体、洗脱液二级腔体具有体积150～200μl；所述核酸定量腔体具有体积40μl；所述PCR反应腔体具有体积35μl。

优选的是，本方案所述主体还可以具有多个清洗液一级腔体和清洗液二级腔体，以满足可以用多种不同的清洗液进行清洗，或者更多量的同一种清洗液清洗；可以包含多个核酸定量腔体与PCR反应腔体，各个PCR腔体中放置有不同的核酸反应试剂，以便于检测多个不同的靶标；本方案芯片可以包含多个这样的核酸提取与PCR反应的结构，以便于同时检测几个不同的样本，其沿芯片圆周等距分布。

本发明所述芯片适用于可实现旋转离心的设备上，利用旋转产生的离心力与毛细力、虹吸现象，将加入样品腔体的样品与裂解液、绑定液混合物、加入清洗液腔体的清洗液、加入洗脱液腔体的洗脱液依次流经固相萃取腔体，达到核酸裂解、吸附、洗脱的目的。洗脱完的核酸经定量腔体定量后流入PCR反应腔体，并在这里与PCR试剂、引物、探测等进行结合完成PCR反应。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明的微流控芯片利用离心力、毛细力以及虹吸现象来实现全自动核酸提取与PCR反应的，没有集成微泵和微阀，使得其制造难度与成本相对于现有技术具有显著降低，同时又提高了芯片的可靠性，对于提高芯片的产率和可靠性及检测精度、降低制作成本具有重要意义；同时，本发明对核酸检测进入临床是一个推力，对于扩大核酸的临床应用、改善现有的病毒、肿瘤检测能力与效率，进而对于改善人们的医疗检测条件、提高人民身体素质具有非常积极的意义；

(2)本发明的微流控芯片集核酸提取、PCR扩增为一体，方便了实验操作，缩短了实验时间。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本阀门的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明核酸检测芯片结构图；

图2为本发明核酸检测芯片顺时针与逆时针旋转方向示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

结合图1和图2说明本实施方式，全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，包括安装孔2、定位槽3和4个主体1，主体1沿芯片圆周等距分布，每个主体1包括：位于主体1上的加样腔体34、加样孔4、清洗液加样孔8、清洗液一级腔体10、清洗液二级腔体12、洗脱液加样孔7、洗脱液一级腔体6、洗脱液二级腔体16、核酸固相萃取腔体29、核酸固相萃取材料28、废液腔体19、核酸定量腔体23、多余核酸存放腔体24、PCR反应腔体20、PCR反应所需引物及试剂21，以及用于连接加样腔体34与固相萃取腔体29的第一流道30、用于连接清洗液一级腔体10与清洗液二级腔体12的第四流道11、用于连接清洗液二级腔体12与固相萃取腔体29的第三流道14、用于连接洗脱液一级腔体6与洗脱液二级腔体16的第五流道13、用于连接洗脱液二级腔体16与固相萃取腔体29之间的第二流道31、用于连接固相萃取腔体29与废液腔体19和核酸定量流道25之间的三叉流道17、用于连接核酸定量腔体23与PCR反应腔体20之间的第六流道22、用于排气的多条流道26、流道33、流道5和流道18以及排气孔35和9。

本实施方式中一种利用离心力、毛细力以及虹吸现象来实现全自动核酸提取与PCR反应的微流控芯片，材质为亚克力，芯片直径80mm，厚度3mm，通过CNC直接加工而成，其基本尺寸结构参数为：

加样腔体34具有体积400μl；清洗液一级腔体10和清洗液二级腔体体积为800μl，洗脱液一级腔体6与洗脱液二级腔体16体积为150μl，定量腔体23体积为40μl，PCR反应腔体体积为35μl，多余核酸腔体24体积为60μl，废液腔体19体积为1500μl。芯片具有一个清洗液一级腔体10和清洗液二级腔体12。

第二流道31为虹吸流道，虹吸流道为方槽型，横截面为边长1mm的正方型，第四流道14具有局部增加流体主力的呈“S”型流道结构15；三叉流道17为宽度1mm，深度0.5mm，第六流道22的宽度0.1mm，深度0.1mm。芯片具有三个核酸定量腔体23与PCR反应腔体20，内部放置有冻干的PCR试剂、引物及探针。

具体实施方式二，本实施方式为具体实施方式一所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片的应用过程：

步骤1：将全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片的安装孔2安装在离心机上，并通过定位槽3与离心机转轴固定，再经加样孔4向将向加样腔体34中加入样品与裂解液、绑定液的混合物300μl，向清洗液腔体10中加入清洗液700μl，向洗脱液腔体中加入洗脱液130μl。

步骤2：顺时针旋转离心，离心速度1500rpm，时间5分钟。样品与裂解液、绑定液混合物将经第一流道30后进入固相萃取腔体29，实现核酸的吸附，并在科里奥利力的作用下经三叉流道17流入废液腔体19；随后，清洗液将经第四流道11、清洗液二级腔体12、第三流道14后开始进入固相萃取腔体29，冲洗:完的废液进入废液腔体19。

步骤3：减速至0后逆时针旋转，转速40rpm，时间20s，洗脱液由毛细力充满整个第二流道31。

步骤4：逆时针高速离心，转速1500rpm，时间60s，洗脱液经第二流道31后流向固相萃取腔体29并将核酸洗脱，在科里奥利力的作用下经三叉流道17后流向流道25，并依次充满核酸定量腔体23，多余的核酸流入废液腔体19。

步骤5：进一步提高转速至2000rpm，洗脱完的核酸经定量腔体23后进入PCR反应腔体，并与PCR试剂、引物的结合，在外部温控的控制下完成PCR扩增。

本领域技术人员可以根据实际使用情况在上述芯片的主体上设有多个清洗液一级腔体10和清洗液二级腔体12或多个清洗装置，以满足可以用多种不同的清洗液进行清洗，或者更多量的同一种清洗液清洗。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，包括至少一个主体，沿芯片圆周等距分布，其特征在于，所述主体包括：

核酸提取单元，其位于所述主体上，用于在离心力和毛细力的驱动下顺序进行核酸的萃取、清洗、洗脱；

PCR扩增单元，其位于所述主体上，其与所述核酸提取单元通过三叉流道相连，用于PCR反应扩增；

废液单元，其包括废液腔体，与所述核酸提取单元通过三叉流道相连，用于存储废液；

以及排气单元，其包括排气孔和多条排气流道，所述多条排气流道与核酸提取单元、PCR扩增单元、废液单元连通，用于排放气体。

2.如权利要求1所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述核酸提取单元包括：

加样装置，其位于主体的左上端，所述加样装置包括加样腔体及设置在加样腔体上的加样孔，所述加样装置用于加入和存放样品与裂解液、绑定液的混合物；

清洗装置，其位于主体的中上端，所述清洗装置包括清洗液加样孔和清洗液腔体，所述清洗装置用于加入和存放清洗液；

洗脱装置，其位于主体的右上端，所述洗脱装置包括洗脱液加样孔和洗脱液腔体，所述洗脱装置用于加入和存放洗脱液；

以及核酸固相萃取装置，其包括核酸固相萃取腔体，所述核酸固相萃取腔体内设置有核酸固相萃取材料；

其中所述加样腔体通过第一流道与所述核酸固相萃取腔体连通，所述清洗液腔体通过第二流道与所述核酸固相萃取腔体连通，所述洗脱液腔体通过第三流道与核酸固相萃取腔体所述连通。

3.如权利要求2所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述PCR扩增单元包括：

核酸定量流道，其与核酸固相萃取单元通过三叉流道连通；

核酸定量腔体，其与核酸定量流道连通，用于定量核酸；

PCR反应腔体，其与核酸定量腔体通过第六流道连通，所述PCR腔体为封闭腔体，内部放置有PCR反应所需引物及试剂；

以及多余核酸腔体，其与核酸定量流道连通，用于存储多余的核酸。

4.如权利要求3所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述清洗液腔体包括清洗液一级腔体和清洗液二级腔体，清洗液一级腔体和清洗液二级腔体通过第四流道连通，所述洗脱液液腔体包括洗脱液一级腔体和洗脱液二级腔体，洗脱液一级腔体和洗脱液二级腔体通过第五流道连通。

5.如权利要求4所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述固相萃取腔体具有细长结构，且长度方向指向芯片中心，以保证在离心力作用下，流体能有较少残留；所述固相萃取腔体具有长方形横截面，其等效直径1mm～2mm，长度5mm～15mm；所述固相萃取材料选自硅胶膜、硅胶柱的一种。

6.如权利要求5所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述第二流道为虹吸流道，所述虹吸流道的等效直径为0.8mm～1.5mm，所述虹吸流道距离芯片中心的最小距离小于洗脱液二级腔体距离芯片中心最小处的距离；所述第三流道具有局部增加流体阻力的呈”S”型的流道结构；所述第四流道和所述第五流道具有等效直径0.4mm～0.8mm，所述第六流道具有等效直径0.1mm～0.2mm。

7.如权利要求6所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述的加样腔体具有体积500～800μl；所述的清洗液一级腔体、清洗液二级腔体具有体积500～800μl；所述的洗脱液一级腔体、洗脱液二级腔体具有体积150～200μl；所述核酸定量腔体具有体积40μl；所述PCR反应腔体具有体积35μl。

8.如权利要求7所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述核酸定量腔体为多个，所述PCR反应腔体与所述核酸定量腔体个数相同。

9.如权利要求8所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片，其特征在于，所述PCR反应所需的试剂或引物包含PCRmix、PCR引物，所述试剂或者引物以冻干或风干形式存放于PCR反应腔体内。

10.一种利用如权利要求1～9任一项所述的全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片核酸提取与PCR扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤；

步骤1)：将全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片安装在离心机上，向加样腔体中加入样品与裂解液、绑定液的混合物，向清洗液腔体中加入清洗液，向洗脱液腔体中加入洗脱液；

步骤2)：顺时针旋转离心，转速1200～1600rpm，时间3～5分钟，完成核酸的萃取与清洗的顺序进行；

步骤3)：速至0后逆时针低俗旋转，转速20～80rpm，时间20～60s，洗脱液可以由毛细力充满整个第二流道，所述第二流道为虹吸流道；

步骤4)：逆时针高速离心，转速1200～1600rpm，时间60～120s，在离心力的作用下，利用虹吸现象将洗脱液经第二流道后流向固相萃取腔体，并在科里奥利力的作用下将洗脱完的核酸经三叉流道后流向定量流道，并依次充满核酸定量腔体，多余的核酸流入废液腔体，完成核酸的洗脱；

步骤5)：进一步提高转速，1800～2500rpm，时间20～40s，在更为强大的离心力作用下，洗脱完的核酸经定量腔体后进入PCR反应腔体，并与PCRmix、引物的结合，在外部温控的控制下完成PCR扩增。