CN108424850A - 一种用于核酸提取的离心力微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种离心力微流控核酸提取芯片及利用该芯片的核酸提取方法，利用集成有无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细微阀）的PDMS和相应电路的芯片，实现了样品引入、杂质清洗、核酸被吸附和洗脱等样品提取的一体化全过程。该方法具有快速、高效、节省资源等优点。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及一种用于核酸提取的离心力微流控芯片。
背景技术
生物大分子核酸的分离与纯化技术是进行分子生物学研究的基础，是生命科学研究与应用的关键技术。核酸获取的效率和质量，直接影响后续实验结果。目前实验室常常使用核酸提取试剂盒提取核酸，大部分使用离心柱法，需要多部离心，对外界设备要求比较高，同时需要的样品量相对大，也容易造成样品流失；耗时繁琐的提取步骤极大地降低了实验的效率。因此，开发集成化、无需平台外离心操作、试剂消耗少及分析时间短的核酸提取平台已经成为一个迫切的需求。
离心力微流控芯片平台将核酸提取技术带入了一个崭新的阶段，在芯片上，由网络化的微通道控制流体样品引入、杂质清洗、核酸吸附和洗脱等样品提取的全过程。基于该平台的方法用于核酸提取具有如下优点：由于整个过程是在相对封闭的体系中，所以人为影响小、省人力；由于芯片体积小，所以相对于实验室的离心柱法，可以降低样品或者试剂的消耗，并且实现快速混合，缩短反应时间等等。
发明内容
本发明的目的是开发一种用于核酸提取的离心力微流控芯片及利用该芯片的核酸提取方法，具体涉及样品引入、杂质清洗、核酸被吸附和洗脱等样品提取的一体化全过程。
所述的离心力微流控芯片，利用集成有无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）的PDMS和相应电路的芯片，带动整个芯片的离心平台，通过无线操控石蜡阀来控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合，通过无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）的组合来控制核酸收集和废液收集。并且利用独有的硅胶膜结构来实现样品到结果的一体化过程。
所述离心力微流控芯片为4层结构，分别为液体反应层、包含加热电阻的被控电路层、主控电路层和供电层四部分；所述被控电路层在液体反应层下方，所述主控电路层在被控电路层下方，所述供电层在主控电路层下方；
所述液体反应层包括7个石蜡阀和1个其他微阀（优选毛细阀），硅胶膜放置区域，过滤膜放置区域（优选），还包括蛋白酶、裂解液、第一步漂洗液、第二步漂洗液、洗脱液的储存腔，还有液体通道，第一级反应腔，第二级反应腔，核酸收集腔，废液腔以及每个腔相应的入口或者出口，向相应储存腔中分别相应加入蛋白酶、裂解液、第一步漂洗液、第二步漂洗液、洗脱液，将血液样品加入第一级反应腔，将乙醇加入第二级反应腔，然后一一通过无线控制使得石蜡阀打开，经液体通道进入反应腔，经过两次漂洗和洗脱，进入到核酸收集腔，废液腔通过其他微阀（毛细阀）收集每一步产生的多余液体；
所述包含加热电阻的被控电路层电阻放置的位置与反应层石蜡阀的位置一致；
所述的7个石蜡阀、1个其他微阀（毛细阀），具体描述如下：1#石蜡阀，2#石蜡阀，3#石蜡阀，4#石蜡阀，5#石蜡阀，6#石蜡阀，分别位于蛋白酶储存腔、裂解液储存腔、第一级反应腔、第一步漂洗液储存腔、第二步漂洗液储存腔、洗脱液储存腔的下方，控制液体进入下一个腔，7#石蜡阀位于核酸收集腔的上方，作为控制核酸进入收集腔的开关。唯一的其他微阀（优选毛细阀）则位于废液腔的上方，用作收集废液的开关；
所述硅胶膜放置区域，具体描述如下：硅胶膜放置的位置在第二级反应腔与石蜡阀7#、其他微阀（优选毛细阀）之间。
硅胶膜放置区域即放置了一张自制硅胶膜，硅胶膜的主要成分是二氧化硅，核酸的磷酸基团能够与二氧化硅表面硅烷醇基团之间形成氢键，由于数量巨大，因此核酸能够牢固地吸附在硅膜上。
所述过滤膜放置区域，为优选方案，具体描述如下:过滤膜放置的位置在第一级反应腔和第二级反应腔之间。
过滤膜放置区域即放置了一张滤纸，其孔径在0.1微米到120微米。
一种利用该芯片的核酸提取方法，按照如下步骤：
A.引入血液样品；
B.先加入蛋白酶混合后加入裂解液，接着56度温育10min，而后经乙醇处理；
C.经过两次漂洗和洗脱液获得核酸；
A.B利用无线电控制的石蜡阀，实现酶和裂解液自动进入第一级反应腔。酶的加入，消化缠绕在核酸上的组蛋白；裂解液的加入，使得红细胞和白细胞裂解，释放核酸，同时，调节整个液体环境的酸碱度，使其保持在高浓度盐分条件，便于后续核酸能够吸附在硅胶膜上。混合液体进入第二级反应腔。
所述步骤C包括：
C1经过第一步漂洗液；
C2经过第二步漂洗液；
C3经过洗脱液。
两种漂洗液的加入将吸附在硅胶膜的杂质带走，再通过洗脱液的加入，使吸附在硅胶膜上纯的核酸脱离硅胶膜，随着洗脱液进入核酸收集腔。
蛋白酶，用于消化缠绕在核酸上的组蛋白；裂解液用于裂解白细胞和红细胞，同时其含有的高浓度的盐酸胍可以使蛋白质变性，并提供高盐离子环境，促使核酸特异性吸附在硅胶膜上；乙醇，用于夺去核酸周围的水分子，使得核酸失水而易于聚合；第一步漂洗液，用于洗掉硅胶膜上吸附的蛋白质；第二步漂洗液，用于洗掉硅胶膜上的杂质盐分；洗脱液，用于洗脱核酸。
本发明的优点：
1.本发明将无线控制的石蜡阀用于液体的操控，通过控制电阻放热来实现石蜡阀的顺序开启和液体的顺序加载，且将石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）结合，实现对核酸和废液的可控分类收集，无线电控制的石蜡阀耗能小，效率高，能够灵活控制液体的自动引入和混合，真正做到高效、快速。
2.本发明可以同时处理多个样品提取核酸的过程。
3.本发明将整个核酸提取过程完全一体化，避免了人为的误差，并且节省了时间和成本。
4.本发明所需样品量极小，与经典的离心柱提取核酸实验相比，既节省了资源，又提高了效率和准确率。
附图说明：
图1为本离心力微流控芯片设计提取核酸芯片的平面结构图。1-1为液体反应层，1-2为被控电路层、1-3为主控电路层，1-4为供电层，1-5为电机。
图2为液体反应层设计，也是本芯片设计的核心部分。1. 蛋白酶储存腔，2. 裂解液储存腔，3. 第一级反应腔，4. 第一步漂洗液储存腔，5. 第二步漂洗液储存腔，6. 洗脱液储存腔，7. 第二级反应腔，8. 核酸收集腔，9.废液腔，10.硅胶膜放置区域，11.过滤膜放置区域（优选）。
图3为一个芯片可以同时处理4个样品过程的设计。
图4为7个石蜡阀、1个其他微阀（优选毛细阀）、气孔、加液口的标识。
图5为石蜡阀控制的样品引入和样品混合的结构。
图6为无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）的组合来控制核酸收集和废液收集的结构。
图7为用NanoDrop 2000超微量分光光度计所测的7组实验的数据表格。
图8为用NanoDrop 2000超微量分光光度计所测的7组实验的曲线图。
具体实施方式：
一种离心力微流控芯片，利用集成有无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）的PDMS和相应电路的芯片，带动整个芯片的离心平台，通过无线控制的石蜡阀来控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合，通过无线控制的石蜡阀和其他微阀（优选毛细阀）的组合来控制核酸收集和废液收集。并且利用独有的硅胶膜结构来实现样品到结果的一体化过程。
所述离心力微流控芯片为4层结构，分别为液体反应层、包含加热电阻的被控电路层、主控电路层和供电层四部分；所述被控电路层在液体反应层下方，所述主控电路层在被控电路层下方，所述供电层在主控电路层下方。
所述液体反应层包括7个石蜡阀和1个其他微阀（优选毛细阀），还包括蛋白酶储存腔1、裂解液储存腔2、第一级反应腔3、第一步漂洗液储存腔4、第二步漂洗液储存腔5、洗脱液储存腔6、第二级反应腔7、核酸收集腔8、废液腔9、硅胶膜放置区域10、过滤膜放置区域（优选）11。向相应储存腔中分别相应加入蛋白酶、裂解液、第一步漂洗液、第二步漂洗液、洗脱液，并向第二级反应腔中加入乙醇，然后一一通过无线控制使得石蜡阀打开，经液体通道进入反应腔，经过两次漂洗和洗脱，进入到核酸收集腔，废液腔通过其他微阀（优选毛细阀）收集每一步产生的多余液体。
所述包含加热电阻的被控电路层电阻放置的位置与反应层石蜡阀的位置一致。
所述的7个石蜡阀、1个其他微阀（优选毛细阀），具体描述如下：1#石蜡阀，2#石蜡阀，3#石蜡阀，4#石蜡阀，5#石蜡阀，6#石蜡阀，分别为蛋白酶储存腔1、裂解储存腔2、第一级反应腔3、第一步漂洗液4、第二步漂洗液5、洗脱液储存腔6的通道下方，控制液体进入下一个腔，7#石蜡阀位于核酸收集腔8的上方，控制核酸进入收集腔开关。1个其他微阀（优选毛细阀）位于废液腔9的上方，用作收集废液的开关。
所述的石蜡阀的具体操作方式如下所述：
电源接通后，供电层1-4开始发射高频电磁波，主控电路层1-3中接收电磁波后进行稳压，供电给其他电学器件，无线通信芯片开始工作，等候接收指令，石蜡阀初始化状态为关闭状态。终端发出开启指令后，主控电路1-3中的无线通信芯片接收到开启指令，并传递给单片机，将石蜡阀对应位置的加热电阻中的电流打开，使得加热电阻进行工作，温度迅速升高至60度，温敏电阻测得此时温度，并通过PID算法，反馈给单片机，控制电流开关，使得温度控制在60度，上下最大波动1度，此时，液体反应层中石蜡阀中的石蜡在10秒钟后完全融化。在离心力的作用下，相应的液体进入液体通道，冲开融化的石蜡，接着进入之后的反应腔，石蜡在液体通道两侧冷却凝结，不进入反应腔，整个开启过程10秒内完成，到此，完成一个石蜡阀的关闭与打开。
通过无线打开1#石蜡阀，使蛋白酶存腔1与第一级反应腔3之间的通道连通；打开2#石蜡阀，使裂解液储存腔2与第一级反应腔3之间的通道连通；打开3#石蜡阀,使第一级反应腔3与第二级反应腔7连通；打开4#石蜡阀，使第一步漂洗液储存腔4与第二级反应腔7连通；打开5#石蜡阀，使第二步漂洗液储存腔5与第二级反应腔7连通；打开6#石蜡阀，使洗脱液储存腔6与第二级反应腔连通；打开7#石蜡阀，使第二级反应腔7与核酸收集腔8连通。
所述的其他微阀（优选毛细阀），以毛细阀为例，具体操作方式如下所述：
当需要液体进入废液腔9时，增大电机1-5旋转速度，当速度大于液体突破毛细阀速度800rpm，由于此时7#石蜡阀处于关闭状态，液体全部通过毛细阀进入废液腔9；当需要液体进入核酸收集腔8时，调整电机1-5转动速度，速度低于毛细阀突破速度800rpm，液体无法突破毛细阀，通过终端发送指令，开启7#石蜡阀，对应的被控电路层的加热电阻开始工作，5s后，终端发出指令关闭石蜡阀，即加热电阻停止加热，但此时7#石蜡阀的石蜡全部融化，液体在离心力的作用下，冲开石蜡，进入核酸收集腔8，7#石蜡阀中的石蜡冷却凝结在液体通道两侧，未进入核酸收集腔8，过程中液体无损耗。至此，完成了毛细阀和7#石蜡阀的组合来控制核酸收集和废液收集。
即加大离心转速达到某一速度值来打开毛细阀，使第二级反应腔7与废液收集腔9连通。
所述的硅胶膜放置区域，具体描述如下：硅胶膜放置的位置在第二级反应腔与石蜡阀7#、其他微阀（优选毛细阀）之间。
所述的硅胶膜的具体操作方式如下所述：
硅胶膜放置区域即放置了一张自制硅胶膜，硅胶膜的主要成分是二氧化硅，核酸的磷酸基团能够与二氧化硅表面硅烷醇基团之间形成氢键，由于数量巨大，因此核酸能够牢固地吸附在硅膜上。
所述过滤膜放置区域，为优选方案，也可不设置该区域，但对结果有影响。具体描述如下:过滤膜放置的位置在第一级反应腔和第二级反应腔之间。
过滤膜放置区域即放置了一张滤纸，其孔径在0.1微米到120微米。
一种利用该芯片的核酸提取方法，按照如下步骤：
A.引入血液样品；
B.先加入蛋白酶混合后加入裂解液，接着56度温育10min，而后经乙醇处理；
C.经过两次漂洗和洗脱液获得核酸。
具体过程为：
唯一的其他阀，以最优阀也就是毛细阀为例。
本发明所用缓冲液主要成分为：
（1）蛋白酶：proteinase K；
（2）裂解液：含有高浓度的盐酸胍裂解液；
（3）第一步漂洗液：含高浓度的盐酸胍和氯化钠；
（4）第二步漂洗液：Tris-Hcl、水和乙醇；
（5）洗脱液：水。
取2份相同的加入抗凝剂的血液，一份用来在离心柱中提取核酸作为对照，另一份用来做接下来的实验。
在步骤A中，将20µl血液样品注入到第一级反应腔3中；
将2µl蛋白酶加入到储存腔1中，将20µl裂解液加入到储存腔2中，将20µl的乙醇加入到第二级反应腔7中，将50µl的第一步漂洗液加入到储存腔4，将50µl的第二步漂洗液加入到储存腔5，将20µl的洗脱液加入到储存腔6。连通离心力平台，使平台以300rpm的转速顺时针转动。
步骤B中，终端发出开启1#石蜡阀的指令，主控电路1-3中的无线通信芯片接收到开启指令，并传递给单片机，将1#石蜡阀对应位置的加热电阻中的电流打开，使得加热电阻进行工作，温度迅速升高至60度，温敏电阻测得此时温度，并通过PID算法，反馈给单片机，控制电流开关，使得温度控制在60度左右，此时，液体反应层中石蜡阀中的石蜡（该石蜡熔点为60℃）在10秒钟后完全融化。在离心力的作用下，蛋白酶冲开融化的石蜡，进入第一级反应腔3，石蜡在液体通道两侧冷却凝结，不进入第一级反应腔3，通过终端发出指令使得离心平台逆时针转动3圈，顺时针转3圈，反复3次。使得样品充分混合、反应；同理，通过终端发射指令打开2#石蜡阀，在离心力作用下，裂解液进入第一级反应腔3中，调节离心平台逆时针3圈，顺时针转3圈，反复3次；调节离心力平台转速，使平台以300rpm的转速顺时针转动，终端发射指令打开3#石蜡阀,保持3#石蜡阀打开状态10min，也就是保证样品在56度左右温育10min，而后在离心力作用下，第一级反应腔3中的混合液经由微流管道，如所经由的微流管道中设置有过滤膜，则也要通过过滤膜，进入第二级反应腔7。然后调节离心平台逆时针转3圈，顺时针转3圈，反复3次，使得来自第一级反应腔3中的混合液与第二级反应腔7中的乙醇充分反应。
步骤C中，同理，通过终端发射指令打开4#石蜡阀，在离心力作用下第一步漂洗液进入第二级反应腔7，充分反应；终端发出指令将离心平台转速调至800rpm，即速度大于液体突破毛细阀的速度，从而使得毛细阀打开，由于此时7#石蜡阀处于关闭状态，在离心力作用下，废液全部进入废液腔9；接着，同样地，终端发射指令，转速调回至300rpm，打开5#石蜡阀，在离心力作用下，第二步漂洗液进入第二级反应腔7，充分反应；调节离心平台转速至800rpm从而使得毛细阀打开，在离心力作用下，废液进入废液收集腔9；转速调回至300rpm，打开6#石蜡阀，在离心力作用下，洗脱液进入第二级反应腔7，洗脱液与硅胶膜充分接触2min后，使吸附在硅胶膜上的核酸脱离硅胶膜，而随着洗脱液进入到核酸收集腔8；打开7#石蜡阀，在离心力作用下，反应得到的核酸进入核酸收集腔8。
我们用NanoDrop 2000超微量分光光度计测所得的包含有核酸的洗脱液，即可得到图7和图8。
上述具体过程作为实验的第一组，分别改变其中两个条件再做5组实验进行对比。
第二组，将离心力平台转速由300rpm提高至500rpm，将洗脱液加入量由20µl提高至30µl，其他条件不变；
第三组，将离心力平台转速由300rpm降低至200rpm，将裂解液加入量由20µl提高至30µl，其他条件不变；
第四组， 将乙醇加入量由20µl降低至15µl，将第二步漂洗液加入量由50µl提高至70µl，其他条件不变；
第五组，取20µl的血液样品，将离心力平台转速由300rpm降低至250rpm，其他条件不变；
第六组，取50µl的血液样品，将第一步漂洗液加入量由50µl降低至40µl，其他条件不变。
由图7可得，由表格中每组数据260/280的值均在1.8到2.0之间，表明核酸的存在，且在图8曲线图中，每组实验数据曲线在波长260nm处均有明显的峰，表明不同条件下的芯片成功提取了核酸。
Claims (8)
1.一种用于核酸提取的离心力微流控芯片，包括可调节转动速度的转动平台、芯片体，转动平台设置有转轴，其特征在于，芯片体上每个提取单元设置有蛋白酶储存腔、 裂解液储存腔、第一级反应腔、第一步漂洗液储存腔、第二步漂洗液储存腔、洗脱液储存腔、第二级反应腔、核酸收集腔、废液腔、硅胶膜，芯片体上从转动平台近转轴端到远转轴端，依次设置第一级反应腔、第二级反应腔、核酸收集腔、废液腔，裂解液储存腔、蛋白酶储存腔设置于第一级反应腔近转轴端，所述裂解液储存腔、蛋白酶储存腔通过微流管道与所述第一级反应腔连接，所述微流管道上设置有石蜡阀；第一级反应腔、第一步漂洗液储存腔、第二步漂洗液储存腔、洗脱液储存腔设置于第二级反应腔近转轴端，且分别通过微流管道与所述第二级反应腔连接，每条微流管道上设置有石蜡阀；第二级反应腔远转轴端连接有微流管道，所述微流管道中设置有硅胶膜，所述微流管道末端通过毛细微阀与废液腔相连，通过石蜡阀与核酸收集腔相连。
2.根据权利要求1所述用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，在第一级反应腔和第二级反应腔之间的微流管道上还设置有过滤膜。
3.根据权利要求1或2所述的用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，反应腔和/或存储腔上设置有加液孔和/或气孔。
4.根据权利要求1或2所述的用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，在芯片体大小允许的情况下，将多个提取单元布置在一个微流控芯片上，实现多个样品的同时提取。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，还在所述芯片体下方依次设置包含加热电阻的被控电路层、主控电路层、供电层，在每个石蜡微阀下方对应位置的“含加热电阻的被控电路层”上设置加热电阻。
6.根据权利要求1或2所述的用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，融化石蜡微阀中石蜡所使用的温度为60摄氏度，上下波动1摄氏度。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用于核酸提取的离心力微流控芯片，其特征在于，所述蛋白酶为proteinase K；裂解液含有高浓度的盐酸胍裂解液；第一步漂洗液含高浓度的盐酸胍和氯化钠；第二步漂洗液含Tris-Hcl、水和乙醇；洗脱液为水。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述用于核酸提取的离力心微流控芯片提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在第一级反应腔中加入待测血液样品，在蛋白酶储存腔中加入蛋白酶，在裂解液储存腔中加入裂解液；在第二级反应腔中加入乙醇，在第一步漂洗液储存腔中加入第一步漂洗液，在第二步漂洗液储存腔中加入第二步漂洗液，在洗脱液储存腔中加入洗脱液；
（2）控制蛋白酶储存腔后石蜡微阀的温度，融化该位置的石蜡，借助离心力使蛋白酶经由微流管道进入第一级反应腔；
（3）控制裂解液储存腔后石蜡微阀的温度，融化该位置的石蜡，借助离心力使裂解液经由微流管道进入第一级反应腔；
（4）控制第一级反应腔后石蜡微阀的温度，融化该位置的石蜡，借助离心力使经蛋白酶处理过并被裂解后的待测样品经由微流管道，如所经由的微流管道中设置有过滤膜，则也要通过过滤膜，进入第二级反应腔；
（5）核酸在第二级反应腔中在乙醇存在的条件下析出，形成沉淀，液体借助离心力突破微流管道末端的毛细微阀，进入废液腔，核酸沉淀及少量杂质沉淀附着在硅胶膜上；
（6）控制第一步漂洗液储存腔后石蜡微阀的温度，融化该位置的石蜡，借助离心力使第一步漂洗液漂洗附着在硅胶膜上的核酸沉淀及少量杂质，并突破微流管道末端的毛细微阀，进入废液腔；
（7）控制第二步漂洗液储存腔后石蜡微阀的温度，融化该位置的石蜡，借助离心力使第二步漂洗液漂洗附着在硅胶膜上的核酸沉淀及少量杂质，并突破微流管道末端的毛细微阀，进入废液腔；
（8）降低芯片转速，液体在该离心力条件下不足以突破所述毛细微阀，控制洗脱液储存腔后石蜡微阀的温度，及核酸收集腔口的石蜡阀的温度，融化这两个位置的石蜡，借助离心力使洗脱液经由微流管道、第二级反应腔、微流管道，溶解并洗脱硅胶膜上的核酸，并使核酸溶液进入核酸收集腔。
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