CN108380252B - 一种集成dna提取及pcr扩增的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种集成DNA提取及PCR扩增的微流控芯片，基于二元制技术在片上同时实现了DNA提取和PCR扩增的功能。

Description

一种集成DNA提取及PCR扩增的微流控芯片
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种集成DNA提取及PCR扩增的微流控芯片。
背景技术
DNA检测是生物医学研究的重要组成部分，也是进行基因诊断和遗传学研究的重要途径。实现DNA检测有两个必要的步骤，DNA提取及PCR扩增。现阶段一般采用常规仪器设备分别完成这两个的操作过程。近年来也有采用微流控技术的DNA提取和扩增芯片，主要是常规操作过程的微型化和规模集成，或者是少数功能单元的组合，可实现不同的样品处理，反应和检测功能，已部分体现了微流控芯片分析技术微型化、集成化等特点。
DNA提取和PCR扩增步骤复杂，现有微流控芯片都是在单芯片上实现DNA提取或者扩增功能，很难将DNA的提取和扩增集成到一块芯片上。
在我们之前申请获得授权的发明专利（1）“CN201410432846 .2 ，一种微流控芯片上的液滴逻辑控制装置”，及（2）“CN201410433196 .3 ，一种微流控芯片上的多态操控装置”的基础上，本发明结合二元制技术，在芯片上集成了DNA提取和PCR扩增，实现了高度集成。
发明内容
本发明旨在提供一种用于DNA提取及PCR扩增的微流控芯片，基于二元制技术，该芯片能够完成DNA提取及PCR扩增的集成。
本发明基于二元制技术，二元制技术是一种微流控芯片上的多态操控技术，包括可调节转动速度的转动平台、微流控芯片和至少一条微流管道，其特征在于，还包括副转轴和限位结构（如图6所示），微流控芯片能围绕副转轴转动，通过转动平台的转动加速度来调整微流管道方向与转动平台径向之间夹角，使得微流管道中的液滴流向发生变化；限位结构用于使微流控芯片锁定在预设的至少 2 个不同角度状态。限位结构为两个锁位阀，两个锁位阀分别设置在微流控芯片的两侧，当微流控芯片围绕副转轴转动时，微流控芯片被锁位阀锁定在两个状态上，如图6所示左态、右态两个状态。
离心力方向为芯片主轴指向芯片副轴的方向，定义芯片顶端为芯片靠近芯片主轴的一端，芯片方向为芯片顶端指向芯片副轴的方向。当芯片方向逆时针旋转一个锐角与离心力方向相同时，芯片的状态为右态；当芯片方向顺时针旋转一个锐角与离心力方向相同时，芯片的状态为左态。
根据我们之前申请获得授权的发明专利“CN201410432846 .2 ，一种微流控芯片上的液滴逻辑控制装置”中的图2、图3所示：
α定义为射线O 'O逆时针旋转至射线O 'C的夹角，表示管道相对于副转轴的摆角。β定义为射线OO '顺时针旋转至射线OC的夹角，表示相对于主轴的转角。θ0定义为射线AB顺时针旋转至射线O 'C的夹角，表示管道方向与芯片径向的夹角。θ定义为射线BA顺时针旋转至射线OC的夹角，离心力方向与管道方向的夹角。当θ∈(0 ,π/2)∪(3π/2 ,2π)时，管道中液体的流向为B→A，当θ∈(π/2 ,3π/2)时，管道中液体的流向为A→B，当θ=π/2或3π/2时，管道中液体不流动。因此，可以得到离心力方向与管道方向的夹角θ＝θ0+α+β。当芯片在不同的状态切换时，α+β发生变化，因此θ也随之发生变化，从而液体在管道中的流向也可能发生变化。在两种状态下，根据θ的取值不同或者管道中液体流向的不同可以分为三类管道，分别是径向常通管道、横向可逆管道和单通管道。其中单通管道又存在两个流动规律相反的两种管道。
本发明采用以下技术方案：
根据本发明提出的一种集成DNA提取及PCR扩增的微流控芯片，其结构如图１所示，包括３个功能单元，分别是顺序加载单元，分流单元及双向流单元。其中顺序加载单元与分流单元相连，分流单元与双向流单元相连。所述顺序加载单元如图２所示，其形状一般为Ｚ型或“之”型微流管道，微流管道的顶点处有液体室，其功能在于，当芯片状态切换至右态时，位于微流管道左侧的液体室内液体会流至芯片下一个右侧液体室，当芯片切换至左态时，位于微流管道右侧的液体室内液体会流至芯片下一个左侧液体室，从而位于芯片液体室内的液体，可以顺序加载至单元末端，进入分流单元。所述分流单元如图３所示，其形状一般为Ｘ型。其功能在于，当芯片处于左态时，位于单元右下方的液体室与单元左上方的液体室相通，液体可以从右下方的液体室流至左上方的液体室。当芯片处于右态时，位于单元左下方的液体室与单元右上方的液体室相通，液体可以从左下方的液体室流至右上方的液体室。所述双向流单元如图4所示，其结构包括两个反应室和连接两个反应室的微流管道，其功能在于，当芯片处于左态时，右室中的液体可以流至左室，当芯片处于右态时，左室中的液体可以流至右室。
微流控芯片的具体结构如图5所示，其所实现的功能为：首先，芯片处于右态，使混合室（11）内的液体充分混合，开启样品加热区（19），对混合室内的液体加热；使芯片处于右态，低速转动打开毛细阀一（8），乙醇室（7）内的乙醇进入混合室（11），使其充分混合。使芯片处于右态，加速开启毛细阀三（14），混合室（11）内的液体经过膜（12）和毛细阀三（14），进入废液室（15）。芯片切换至左态，低速转动，位于洗液室一（2）的洗液流至缓冲室一（4），位
于洗液室二（5）的洗液流至缓冲室二（6），由于毛细阀二（10）的作用，位于洗脱液室（9）的洗脱液保持不变。芯片切换至右态，位于缓冲室一（4）的洗液流至洗液室二（5），位于缓冲室二（6）的洗液流至混合室（11），并通过膜（12）和毛细阀三（14），流至废液室（15）。芯片切换至左态，低速转动，位于洗液室二（5）的洗液流至缓冲室二（6），由于毛细阀二（10）的作用，位于洗脱液室（9）的洗脱液仍保持不变。芯片切换至右态，位于缓冲室二（6）的洗液流至混合室（11），并通过膜（12）和毛细阀三（14）流至废液室（15）。芯片切换至左态，高速转动，位于洗脱液室（9）的洗脱液将突破毛细阀二（10），进入混合室（11），由于毛细阀四（13）的作用，洗脱液将停留在混合室（11）。保持芯片左态，切换至更高转速，此时混合室（11）中的洗脱液将突破毛细阀四（13），进入双向流单元左室（17）。开启PCR左右加热区（20 ,21），使双向流单元的左右室温度满足PCR温度要求，芯片切换至右态，双向流单元左室（17）中的液体将流至右室（18），再切换至左态，双向流单元右室（18）中的液体将流至左室（17），开始PCR反应。加热区可通过芯片体内设置加热电阻、或在转动平台相应位置设置加热模块等方式实现温度控制。
所述的硅胶膜（12）放置区域，具体描述如下：硅胶膜（12）放置的位置在混合腔（11）和毛细阀（13 ,14）之间。
硅胶膜放置区域即放置了一张自制硅胶膜，硅胶膜的主要成分是二氧化硅，核酸的磷酸基团能够与二氧化硅表面硅烷醇基团之间形成氢键，由于数量巨大，因此核酸能够牢固地吸附在硅膜上。
本发明的有益效果：
1 .利用二元制技术，在芯片上实现了DNA提取功能，
2 .利用二元制技术，在芯片上集成了PCR功能。
附图说明
图1为芯片结构示意图；
图2为顺序加载单元示意图；
图3为分流单元示意图；
图4位双向流单元示意图；
图5所示为芯片总体结构示意图，其中：
1气孔；2洗液室一；3微流管道；4缓冲室一；5洗液室二；6缓冲室二；7乙醇室；8毛细阀一；9洗脱液室；10毛细阀二；11混合室；12二氧化硅膜；13毛细阀四；14毛细阀三；15废液室；16副转轴；17PCR左室；18PCR右室；19样品加热区；20 PCR左加热区；21 PCR右加热区。
图6为芯片状态切换示意图；
图7所示为PCR结果图，其中：
虚线为采用本芯片实验得到的结果，实线为采用Roche LightCycler Nano所得的结果。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明作进一步的描述：
所用的DNA提取试剂来自于血液DNA小量提取试剂盒（QIAprep® DNA Blood MiniKit）。所用PCR试剂来自于韩国Bioneer公司。
1 .依次向混合室（11）中加入2uL QIAGEN蛋白酶，20uL血液，20uL Buffer AL，向乙醇室（7）加入20uL 乙醇。取50uL Buffer AW1加入洗液室二（5），50uL Buffer AW2加入洗液室一（2），20uL Buffer AE加入洗脱液室（9）。在PCR左室（17）装入25μLPCR反应混合液，包括10×Buffer 2 .5μL、上下游引物（0 .25μmoL/L）各0 .25μL、4种dNTP（0 .25mmoL/L）2μL、MgCl2（25mmoL/L）2 .5μL、Taq酶（1u/μL）0 .75μL、荧光染料SYBR greenⅠ2 .5μL，水11 .25μL。
2 .使芯片处于右态，加速度200RPM/min2，，转速300RPM/min，不断加速减速1min，使混合室内的QIAGEN蛋白酶、血液、Buffer AL混合充分，使芯片静止。
3 .打开样品加热区（19）使温度保持56℃孵育10min，关闭加热区（19）。
4 .使芯片处于右态，加速度300RPM/min2，转速600RPM/min，位于乙醇室（7）的乙醇
突破毛细阀一（8），进入混合室（11）。
5 .使芯片处于右态，加速度200RPM/min2，转速300RPM/min，不断加速减速1min，使混合室（11）内的液体与乙醇混合充分。
6 .使芯片处于右态，加速度300RPM/min2，转速900RPM/min，混合室（11）的液体流过二氧化硅膜（12），突破毛细阀三（14），进入废液室（15），其中DNA吸附在二氧化硅膜（12）上。
7 .切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速300RPM/min，Buffer AW2由洗液室一（2）流至缓冲室一（4），Buffer AW1由洗液室二（5）流至缓冲室二（6），由于毛细阀一（8）作用，Buffer AE仍停留在洗脱液室（9）。
8 .切换芯片到右态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，Buffer AW1由缓冲室二（6）流至混合室（11），经过二氧化硅膜（12），进入废液室（15），Buffer AW2由缓冲室一（4）流至洗液室二（5）。
9 .切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速300RPM/min，Buffer AW2由洗液室二（5）流至缓冲室二（6），由于毛细阀一（8）作用，Buffer AE仍停留在洗脱液室（9）。
10 .切换芯片到右态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，Buffer AW2由缓冲室二（6）流至混合室（11），经过二氧化硅膜（12），进入废液室（15）。
11 .切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，此时位于洗脱液室（9）的Buffer AE突破毛细阀二（10），流至混合室（11），由于毛细阀四（13）的作用，洗脱液将停留在混合室（11）并浸没二氧化硅膜（12），保持该状态2分钟。
12 .芯片仍处于左态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，此时混合室（11）内的液体将突破毛细阀四（13），进入PCR左室（17）。
13 .通过PCR左加热区（20）加热使PCR左室（17）温度65℃，PCR右加热区（21）加热使PCR右室（18）温度95℃。
14 .使液体在PCR左室（17）停留1分钟，使芯片加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，切换至右态，液体流至PCR右室（18），停留4分钟，使芯片加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，再切换左态。
15 .重复步骤11，完成PCR扩增过程。
从图7 所示的PCR结果图可以看出，采用本芯片所得的PCR结果与Roche LightCycler Nano所得到的PCR结果几乎完全相同，说明本芯片能够实现DNA提取及PCR扩增的集成化。

Claims (5)

1.一种微流控芯片，包括可调节转动速度的转动平台、转动平台转轴、微流控芯片体、副转轴、限位结构，微流控芯片能围绕副转轴转动，通过转动平台的转动加速度来调整微流管道方向与转动平台径向之间夹角，使得微流管道中的液滴流向发生变化，限位结构用于使微流控芯片锁定在预设的至少2个不同角度状态，其特征在于，芯片体上设置有：洗液室一、洗液室二、缓冲室一、缓冲室二、洗脱液室、乙醇室、混合室、废液室、微流管道、毛细阀、芯片副转轴、二氧化硅膜、PCR左室、PCR右室，所述洗液室一、缓冲室一、洗液室二、缓冲室二通过Z形微流管道连接，并依次以转动平台转轴为参照由近而远设置于微流控芯片体上Z形微流管道的转折处；所述混合室设置于缓冲室二的远转动平台转轴端，通过微流管道相连；所述乙醇室、洗脱液室设置于混合室的近转动平台转轴端，所述乙醇室、洗脱液室分别与所述混合室通过毛细微阀相连；混合室远转动平台转轴端设置有分叉微流管道，混合室与分叉微流管道之间设置有二氧化硅膜，分叉微流管道一个分支通过毛细阀与废液室相连，废液室设置于所述混合室的远转动平台转轴端，另一个分支通过毛细阀连接T形微流管道，通过所述T形微流管道与设置于所述混合室的远转动平台转轴端的PCR左室、PCR右室相连。
2.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于，芯片体上混合室、PCR左室、PCR右室所处位置设置有加热区。
3.根据权利要求1或2所述的一种微流控芯片，其特征在于，芯片体上布局的腔室上分别设置有气孔。
4.根据权利要求1或2所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述限位结构为两个锁位阀，分别设置在微流控芯片的两侧。
5.采用权利要求1至4任一项所述的一种微流控芯片实现核酸提取并进行PCR反应的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）、依次向混合室中加入蛋白酶，待测血液样品，Buffer AL，乙醇室加入乙醇，BufferAW1加入洗液室二，Buffer AW2加入洗液室一，Buffer AE加入洗脱液室，在PCR左室装入PCR反应混合液，包括Buffer、上下游引物、4种dNTP、MgCl2、Taq酶、荧光染料SYBRgreenⅠ，水11 .25μL；
（2）、使芯片处于右态，加速度200RPM/min2，转速300RPM/min，不断加速减速1min，使混合室内的QIAGEN蛋白酶、血液、Buffer AL混合充分，使芯片静止；
（3）、打开样品加热区（19）使温度保持56℃孵育10min，关闭加热区（19）；
（4）、使芯片处于右态，加速度300RPM/min2，转速600RPM/min，位于乙醇室（7）的乙醇突破毛细阀一（8），进入混合室（11）；
（5）、使芯片处于右态，加速度200RPM/min2，转速300RPM/min，不断加速减速1min，使混合室（11）内的液体与乙醇混合充分；
（6）、使芯片处于右态，加速度300RPM/min2，转速900RPM/min，混合室（11）的液体流过二氧化硅膜（12），突破毛细阀三（14），进入废液室（15），其中DNA吸附在二氧化硅膜（12）上；
（7）、切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速300RPM/min，Buffer AW2由洗液室一（2）流至缓冲室一（4），Buffer AW1由洗液室二（5）流至缓冲室二（6），由于毛细阀一（8）作用，Buffer AE仍停留在洗脱液室（9）；
（8）、切换芯片到右态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，Buffer AW1由缓冲室二（6）流至混合室（11），经过二氧化硅膜（12），进入废液室（15），Buffer AW2由缓冲室一（4）流至洗液室二（5）；
（9）、切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速300RPM/min，Buffer AW2由洗液室二（5）流至缓冲室二（6），由于毛细阀一（8）作用，Buffer AE仍停留在洗脱液室（9）；
（10）、切换芯片到右态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，Buffer AW2由缓冲室二（6）流至混合室（11），经过二氧化硅膜（12），进入废液室（15）；
（11）、切换芯片到左态，加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，此时位于洗脱液室（9）的Buffer AE突破毛细阀二（10），流至混合室（11），由于毛细阀四（13）的作用，洗脱液将停留在混合室（11）并浸没二氧化硅膜（12），保持该状态2分钟；
（12）、芯片仍处于左态，加速度1000RPM/min2，转速900RPM/min，此时混合室（11）内的液体将突破毛细阀四（13），进入PCR左室（17）；
（13）、通过PCR左加热区（20）加热使PCR左室（17）温度65℃，PCR右加热区（21）加热使PCR右室（18）温度95℃；
（14）、使液体在PCR左室（17）停留1分钟，使芯片加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，切换至右态，液体流至PCR右室（18），停留4分钟，使芯片加速度1000RPM/min2，转速600RPM/min，再切换至左态；
（15）、重复步骤11，完成PCR扩增过程。
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