CN114768896A

CN114768896A - 集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法

Info

Publication number: CN114768896A
Application number: CN202210242670.9A
Authority: CN
Inventors: 蒋兴宇; 宗楠
Original assignee: Southern University of Science and Technology
Current assignee: Southern University of Science and Technology
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114768896B

Abstract

本发明公开了集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法。本申请的第一方面，提供一种离心式微流控芯片，该离心式微流控芯片包括加样室、结合液室、洗涤液室、洗脱液室、混合室、第一虹吸阀、第二虹吸阀、第三虹吸阀、第四虹吸阀、检测室和废液室。本申请实施例所提供的离心式微流控芯片通过多级虹吸阀调节不同的转速使结合液、洗涤液、洗脱液分别与待测样本的混合，从而可以自动完成对样本中核酸的分离，分离过程中产生的废液由分液阀流入废液室，而最终分离出的核酸则进入检测室完成进一步的检测。通过这种结构设计，最终使得该离心式微流控芯片可以完成全血分离和分子诊断的全过程。

Description

集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法

技术领域

本申请涉及微流控技术领域，尤其是涉及集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法。

背景技术

目前对全血中游离核酸的分离和检测的流程主要包括离心机分离、人工提取核酸以及PCR仪器扩增等，这种传统的技术不仅需要复杂的仪器和过多的人力，而且耗时较长，完成整个流程需要至少3个小时。以临床上针对全血中HBV的核酸诊断为例，从采集样本到得出报告的整个周期甚至达到3-7天，严重影响了临床诊断本身和后续治疗进程。

微流控技术具有小型化、集成化、高通量等特点，而离心式微流控芯片被认为是微流控领域最有前途的平台之一。与其他微流控设备不同，离心式微流控芯片无需额外的注射器泵和复杂的管道通路，利用离心力、科氏力、欧拉力等物理力作用即可对流体进行精确、直观的控制，实现分离、转运、计量、混合、分流等多种功能。目前在全血样品的临床诊断中，已有离心式微流控芯片的使用，但尚未实现对全血样本的前处理和多重分子诊断的集成，这也限制了离心式微流控芯片在临床诊断中的进一步应用。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法。

本申请的第一方面，提供一种离心式微流控芯片，该离心式微流控芯片包括：

加样室，加样室用于容纳待测样本；

结合液室，结合液室用于预置结合液；

洗涤液室，洗涤液室用于预置洗涤液；

洗脱液室，洗脱液室用于预置洗脱液；

混合室，混合室用于分离核酸；

第一虹吸阀，第一虹吸阀连接加样室和混合室，用于向混合室供给待测样本；

第二虹吸阀，第二虹吸阀连接结合液室和混合室，用于向混合室供给结合液；

第三虹吸阀，第三虹吸阀连接洗涤液室和混合室，用于向混合室供给洗涤液；

第四虹吸阀，第四虹吸阀连接洗脱液室和混合室，用于向混合室供给洗脱液；

检测室和废液室，检测室和废液室位于混合室在离心式微流控芯片的径向的外侧，检测室和废液室通过出液流道与混合室连通；出液流道在远离混合室的一侧设有分流阀，并将检测室和废液室分设于离心式微流控芯片的周向两侧，出液流道在靠近混合室的一侧设有球阀。

根据本申请实施例的离心式微流控芯片，至少具有如下有益效果：

本申请实施例所提供的离心式微流控芯片通过多级虹吸阀调节不同的转速使结合液、洗涤液、洗脱液分别与待测样本的混合，从而可以自动完成对样本中核酸的分离，分离过程中产生的废液由分液阀流入废液室，而最终分离出的核酸则进入检测室完成进一步的检测。通过这种结构设计，最终使得该离心式微流控芯片可以完成全血分离和分子诊断的全过程。在实验过程中，可以在30分钟自动完成血液分离过程，而完成包括分离和检测的整个处理流程仅需1小时左右。

在本申请的一些实施方式中，加样室在径向上具有两侧的宽头部和中间的窄颈部，第一虹吸阀连接于窄颈部。

在本申请的一些实施方式中，球阀包括球体和套筒，套筒为￢型，球体位于套筒内，球体被配置为在重力作用下封堵套筒的下端使出液流道关闭，并能够在磁力作用下远离下端使出液流道打开。

在本申请的一些实施方式中，离心式微流控芯片的表面还设有圆形或环形磁铁，圆形或环形磁铁用于向球体施加磁力。

在本申请的一些实施方式中，检测室包括若干预分配室和若干反应室，若干预分配室和若干反应室通过毛细阀一一对应连接，若干预分配室相对若干反应室位于径向的内侧，若干反应室用于预置核酸检测试剂并进行核酸检测反应。

在本申请的一些实施方式中，若干预分配室具有相同的体积。

在本申请的一些实施方式中，离心式微流控芯片还包括第二洗涤液室和第五虹吸阀，第五虹吸阀连接第二洗涤液室和混合室，用于向混合室供给第二洗涤液。

在本申请的一些实施方式中，混合室内预置有磁珠。

本申请的第二方面，提供上述离心式微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将压敏胶层贴合在亚克力板上，通过激光雕刻对压敏胶层进行切割，形成包含第一虹吸阀、第二虹吸阀、第三虹吸阀、第四虹吸阀、分流阀的第一层；

将另一压敏胶层贴合在另一亚克力板上，通过激光切割对另一压敏胶层和另一亚克力板进行切割，重复并堆叠形成包含加样室、结合液室、洗涤液室、洗脱液室、混合室、检测室和废液室的其它层；

将第一层和其它层贴合形成离心式微流控芯片。

目前的激光加工多层芯片的工艺流程，其通常是直接将亚克力板和压敏胶切穿，然后将压敏胶在贴合在对应的亚克力板上，组装过程对操作者要求高，因为压敏胶很薄，极易贴合不好和卷曲，操作复杂，此外还容易造成结构错位及对不准问题，从而容易影响多层芯片的功能实现。而本申请中对于厚度较薄的第一层采用激光雕刻只切亚克力板上的压敏胶，然后直接与另外一层组装，不需要压敏胶的单独贴合，这简化了芯片制备过程。

在本申请的一些实施方式中，第一层和其它层上设置有定位孔，通过向定位孔内导入定位柱将第一层和其它层对准，从而贴合形成离心式微流控芯片。

在本申请的一些实施方式中，出于调节虹吸阀阈值的考虑，在其它层中的至少第二层也同样形成第一虹吸阀、第二虹吸阀、第三虹吸阀、第四虹吸阀、第五虹吸阀中至少一个的结构，从而使虹吸阀中的部分横贯多个材料层，这种情况下，叠加后形成的虹吸阀管道在其高度方向(即垂直于旋转平面的上下方向的距离)上也有一定的高度差距，这样，进一步通过虹吸阀的宽度、高度、内表面的接触角等因素获得各异的转速阈值，增大彼此间的转速阈值的差距，从而在不同的转速条件下开启或关闭各个虹吸阀，避免在某一转速下出现过多的虹吸阀同时打开而影响正常的结合、洗涤、洗脱的流程。

在本申请的一些实施方式中，在距离第一层最近的第二层中也通过激光切割形成部分虹吸阀(例如第四虹吸阀和第五虹吸阀)的结构，从而与第一层的结构在对准堆叠后形成不同高度的虹吸阀。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的一种离心式微流控芯片的结构示意图。

图2是本申请的一种离心式微流控芯片的五层结构示意图。

图3是本申请的一种离心式微流控芯片的加样室110在离心过程中血清与血细胞的分离情况，a为分离前，b为分离后。

图4是本申请的一种离心式微流控芯片的球阀的机构示意图。

图5是本申请的一种离心式微流控芯片的制备方法的原理图。

图6是本申请的HBV验证实验的离心式微流控芯片在全血分离和分子诊断中的转速图。

图7是本申请的HBV验证实验的试管验证结果。

图8是本申请的HBV验证实验的离心式微流控芯片验证结果。

附图标记：加样室110、宽头部111、窄颈部112、结合液室120、洗涤液室130、第二洗涤液室140、洗脱液室150、混合室160、预分配室170、反应室180、废液室190、第一虹吸阀210、第二虹吸阀220、第三虹吸阀230、第五虹吸阀240、第四虹吸阀250、毛细阀270、出液流道300、球阀310、分流阀320。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

本申请实施例提供一种离心式微流控芯片，参考图1，为该离心式微流控芯片的局部示意图，该离心式微流控芯片包括加样室110、结合液室120、洗涤液室130、洗脱液室150、混合室160、检测室和废液室190，以及第一虹吸阀210、第二虹吸阀220、第三虹吸阀230、第四虹吸阀250。其中，加样室110用于容纳待测样本，结合液室120用于预置结合液，洗涤液室130用于预置洗涤液，洗脱液室150用于预置洗脱液，混合室160用于分离核酸。第一虹吸阀210连接加样室110和混合室160，用于向混合室160供给待测样本；第二虹吸阀220连接结合液室120和混合室160，用于向混合室160供给结合液；第三虹吸阀230连接洗涤液室130和混合室160，用于向混合室160供给洗涤液；第四虹吸阀250，第四虹吸阀250连接洗脱液室150和混合室160，用于向混合室160供给洗脱液；检测室和废液室190位于混合室160在离心式微流控芯片的径向的外侧，检测室和废液室190通过出液流道300与混合室160连通；出液流道300在远离混合室160的一侧设有分流阀320，并将检测室和废液室190分设于离心式微流控芯片的周向两侧，出液流道300在靠近混合室的一侧设有球阀310。通过球阀310调节出液流道的关闭和打开。该离心式微流控芯片通过多级虹吸阀调节不同的转速使结合液、洗涤液、洗脱液分别与待测样本的混合，从而可以自动完成对样本中核酸的分离，分离过程中产生的废液由分液阀流入废液室，而最终分离出的核酸则进入检测室完成进一步的检测。通过这种结构设计，最终使得该离心式微流控芯片可以完成全血分离和分子诊断的全过程。

在本申请的一些具体的实施方式中，加样室110在径向上具有两侧的宽头部111和中间的窄颈部112，第一虹吸阀210连接于窄颈部112。当加样室110进行全血样本中血清与血细胞的分离时，在微流控芯片的加减速过程中，血清和血细胞之间的界限会受影响而被扰动，从而使得血细胞通过虹吸阀进入到临近腔室，使得分离效果变差，而通过设置宽度不同的头部和颈部，在其中引入锁扣结构，可以有助于将血清和血细胞分开，避免因出现扰动而带来的红细胞进入虹吸阀的影响，而血细胞会沉淀到远离中心的加样室110的底部，在这种情况下，窄颈部112中全部为血清，参考图3，此时，通过打开第一虹吸阀210，使血清进入混合室160，而并不会有红细胞进入其中。这一设计在一定程度上可以将离心过程中的加减速对血清分离的影响减小，使得后续的混合液中仅含血清。

在本申请的一些具体的实施方式中，芯片中的各个反应腔室为以其转动圆心为圆心的宽扁的扇形或近扇形结构，通过这种形状设计增加芯片上的空间利用率。

参考图4，在本申请的一些具体的实施方式中，球阀包括球体和套筒，套筒为￢型，球体位于套筒内，球体被配置为在重力作用下封堵套筒的下端使出液流道关闭，并能够在磁力作用下远离下端使出液流道打开。通过设置球阀，保证在其打开的状态下，其他试剂的虹吸阀不能打开，其他的虹吸阀打开的情况下，球阀不能打开。从而保证混合室不会因为转速的限制出现边混合边排出的情况，避免未完全结合、洗涤、洗脱的试剂被排出影响后续检测过程。

在其中一些具体的实施方式中，球阀的套筒的下端设有圆孔，与出液流道相连接，球体被装设于这一圆孔上。可以理解的是，球体的直径大于圆孔直径，例如如铁球1毫米,圆孔700微米。套筒竖直方向上具有用于限定球体运动的框型结构，以此防止球体在上下移动过程中发生偏移而无法恢复原位置。套筒横向方向上的长方孔结构连接到混合室160，从而接入到混合室160的液体。

在本申请的一些具体的实施方式中，离心式微流控芯片的表面还设有圆形或环形磁铁，圆形或环形磁铁用于向球体施加磁力。考虑到不同样本来源以及结合液、洗涤液、洗脱液等的不同，转速的阈值因而也有所区别，在这种情况下，球阀所在的空间位置也是不确定的，为了避免增加定位装置影响芯片的使用广泛性和仪器开发的难度，通过引入圆形或环形磁铁来对球体施加磁力。此外，在核酸提取过程中，如果采用磁珠提取时，球阀打开而混合室的磁珠是需要吸住使液体排出而磁珠不会，因此通过设置环形或圆形磁铁控制在球阀打开的同时吸附磁珠，一举两得。

参考图1，在本申请的一些具体的实施方式中，检测室包括若干的预分配室170和若干的反应室180，预分配室170和反应室180通过毛细阀270一一对应连接，预分配室170相对反应室180位于径向的内侧，反应室180用于预置核酸检测试剂并进行核酸检测反应。最终分离过程中，混合室160中的洗脱液通过分流阀320先进入到预分配室170，多余的进入到废液室190中，然后通过预分配室170和反应室180之间的毛细阀270进入到反应室180中。通过预分配室170的设置，使得进入反应室180中的核酸洗脱液的体积固定、起到定容的作用，从而保证不同的反应室180中的反应体系恒定，避免因不同量的反应体系造成最终检测结果的误差。在其中一些实施方式中，预分配室170的体积相同，以此进入反应室180中的洗脱液的体积相同。

在本申请的一些具体的实施方式中，离心式微流控芯片还包括第二洗涤液室140和第五虹吸阀240，第五虹吸阀240连接第二洗涤液室140和混合室160，用于向混合室160供给第二洗涤液。为获得更好的洗涤效果，一般在全血分离时需要设置多个洗涤流程，因此，在离心式微流控芯片重复设置有多个洗涤液室和对应的虹吸阀，从而进行多次洗涤。其中，根据具体的检测目的和分离方法等因素的不同，洗涤液室130中的洗涤液以及第二洗涤液室140中的第二洗涤液可以是相同或不同，以完成多个洗涤目的。此外，还可以设置第三组甚至第四组洗涤液室和虹吸阀等等的组合，从而达成更多次的洗涤。

在本申请的一些具体的实施方式中，混合室160内预置有磁珠。通过磁珠对核酸进行有效提取。

可以理解的是，为了使结合液、洗涤液、洗脱液顺序与待测样本进行反应，加样室110、结合液室120、洗涤液室130、第二洗涤液室140、洗脱液室150中的待测样本和试剂需要以特定的顺序进入混合室160，因此，需要保证第一虹吸阀210、第二虹吸阀220、第三虹吸阀230、第五虹吸阀240、第四虹吸阀250之间需要满足一定的阈值，即在达到(升或降到)这一阈值时，开启或关闭对应的虹吸阀。在其中一些实施方式中，第一虹吸阀210、第二虹吸阀220的阈值最大，其次第三虹吸阀230、第五虹吸阀240、第四虹吸阀250的阈值依次降低；进一步的，第一虹吸阀210、第二虹吸阀220的阈值相同，从而使得待测样本和结合液同时进入混合室160。

其中，虹吸阀为具有折弯结构的管道，虹吸阀的开关阈值与折弯处到微流控芯片旋转中心的距离、虹吸阀对应的腔室内的液面到旋转中心的距离、虹吸阀管道的宽度(在芯片旋转平面内的宽度)和高度(在垂直于芯片旋转平面方向上的上下距离)、内表面的接触角等因素有关，通过调节这些参数可以使虹吸阀获得不同的阈值。由于虹吸阀为现有的结构，在此对于如何设置相应的开关阈值不再赘述。

可以理解的是，通过多重虹吸阀和球阀的设置，多种试剂和血清中核酸混合过程中，需要这些试剂的废液排出时，加减速的时候不会影响其他试剂，导致其他试剂的提前释放，从而可以实现混合后废液的可控排出。此外，在本申请实施例所提供的方案中，废液室是混合室中用完的废液通过科式力改变转速方向来控制液体流动方向，把无需进一步使用的溶液进入到废液室，而不会进入到反应室内，从而有利于核酸提取中结合、洗涤等操作后废液的排出，不会造成这些废液进入反应室影响后续核酸的反应的问题。

在本申请的一些具体的实施方式中，离心式微流控芯片上还设有定位孔410，不同层通过定位孔410并配合对应的定位柱完成对准和组装。

可以理解的是，结合液室120、洗涤液室130、第二洗涤液室140、洗脱液室150中预置的结合液、洗涤液、第二洗涤液、洗脱液可以根据实际反应需要进行设置对应的体积和浓度。反应室180内预置的核酸反应试剂同样可以根据实际需要进行的核酸扩增反应所需的反应体系进行调整，例如，进行重组酶聚合酶扩增(RPA)进行检测时，反应室180内预置重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶的冻干粉或液体等，或者可以根据改进后的RPA检测方法增加或移除对应的试剂原料，例如采用基于Cas核酸酶的一锅式核酸检测方法进行检测时还需加入Cas核酸酶、crRNA、探针等等。

本申请还提供上述离心式微流控芯片的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

将第一层和其它层贴合形成离心式微流控芯片。

其中，其它层可以是形成加样室、结合液室、洗涤液室、洗脱液室、混合室、检测室和废液室等所需的至少一层结构，根据实际反应所需体积、亚克力板材料参数以及制备工艺等，可以具有除第一层之外依次设置的第二层、第三层、第四层、第五层等多层结构，以此组装形成微流控芯片，例如参考图2中的五层结构，其中，部分虹吸阀除在第一层外，还在第二层中有部分结构。

在本申请的一些具体的实施方式中，第一层和其它层上设置有定位孔，通过向定位孔内导入定位柱将第一层和其它层对准，从而贴合形成离心式微流控芯片。

目前的激光加工多层芯片的工艺流程，其通常是其通常是直接将亚克力板和压敏胶切穿，然后将压敏胶在贴合在对应的亚克力板上，组装过程对操作者要求高，因为压敏胶很薄，极易贴合不好和卷曲，操作复杂，此外还容易造成结构错位及对不准问题，从而容易影响多层芯片的功能实现。而本申请中对于厚度较薄的第一层采用激光雕刻只切亚克力板上的压敏胶，然后直接与另外一层组装，不需要压敏胶的单独贴合，这简化了芯片制备过程。参考图5，本申请中对于厚度较薄的设置对应虹吸阀、分流阀、毛细阀的第一层只切压敏胶，对于后续组装十分方便，而对于用来形成加样室、结合液室、洗涤液室、洗脱液室、混合室、检测室和废液室的较厚的第二、三、四、五层，利用激光切割将贴有压敏胶的亚克力切透，各层完成后，利用定位柱和定位孔将各层对准组装成芯片，最终通过这种工艺可以有效降低操作难度，简化加工过程。

在本申请的一些具体的实施方式中，出于调节虹吸阀阈值的考虑，在其它层中的至少第二层也同样形成第一虹吸阀、第二虹吸阀、第三虹吸阀、第四虹吸阀中至少一个的结构，从而使虹吸阀中的部分横贯多个材料层，这种情况下，叠加后形成的虹吸阀管道在其高度方向(即垂直于旋转平面的上下方向的距离)上也有一定的高度差距，这样，进一步通过虹吸阀的宽度、高度、内表面的接触角等因素获得各异的转速阈值，增大彼此间的转速阈值的差距，从而在不同的转速条件下开启或关闭各个虹吸阀，避免在某一转速下出现过多的虹吸阀同时打开而影响正常的结合、洗涤、洗脱的流程。在其中一些实施方式中，在距离第一层最近的第二层中也通过激光切割形成部分虹吸阀(例如第四虹吸阀和第五虹吸阀)的结构，从而与第一层的结构在对准堆叠后形成不同高度的虹吸阀。

以下结合具体的实施例对本申请的离心式微流控芯片进行说明。

实施例1

本实施例提供一种离心式微流控芯片，参考图1，该离心式微流控芯片包括加样室110、结合液室120、洗涤液室130、第二洗涤液室140、洗脱液室150、混合室160、预分配室170、反应室180和废液室190，其间设置有对应得第一虹吸阀210、第二虹吸阀220、第三虹吸阀230、第五虹吸阀240、第四虹吸阀250、球阀310、分流阀320、毛细阀270。其中，预分配室170和反应室180设有8组。

本实施例还针对血液中HBV进行了检测和分型，采用RPA-T7-Cas13a的方法，下表为体系的序列及实际用量

表1.反应体系的序列

表2.RPA-T7-Cas13a体系

试剂	工作浓度
		RPA冻干球(基础试剂盒配套)	1个
RPA正向引物	400nM
		RPA反向引物	400nM
T7 RNA聚合酶	1U/μL
		rNTP	1mM
Cas13a	50nM
		crRNA	20nM
探针RNA	1uM
		醋酸镁	18mM
RNA酶抑制剂	2U/ul

按照上述体系分别在试管内和离心式微流控芯片内进行验证，试管内模板浓度控制为10aM，离心式微流控芯片的检测过程简要如下：将不同基因型的HBV质粒模板(如1fM)加入全血中，获得模拟样本，在检测过程中，将制备好的芯片固定在离心微流控平台上后，在加样室中加入500μL EDTA抗凝剂处理过的全血，离心芯片即可完成其余过程，全血预处理时间约为30min，然后将离心芯片上的反应室在37℃加热30min，进行HBV基因型检测和鉴别，整个过程可在1h左右完成。

参考图6，通过控制转速，首先使加样室110内的全血样本分离形成血清和沉淀的血细胞，血清随后和结合液进入混合室160中完成核酸吸附，然后调节转速排出废液；再调节转速依次使洗涤液室130和第二洗涤液室140中的洗涤液进入混合室160中进行两次洗涤并排出废液；随后调节转速将洗脱液室150中的洗脱液投入混合室160中进行洗脱，洗脱完成后进入预分配室170，多余的洗脱液进入废液室190；随后调节转速打开毛细阀270，将预分配室170的核酸投入反应室180与其中预置的核酸反应体系进行扩增检测。

其中，试管内的验证结果如图7所示，离心式微流控芯片的验证结果如图8所示。图7中a为加入B型模板分别用crRNA-B(上方)和crRNA-C(下方)进行验证的荧光扩增曲线，b为加入C型模板分别用crRNA-B(下方)和crRNA-C(上方)进行验证的荧光扩增曲线，从图中的四条曲线可以看出，只有crRNA与基因型完全匹配时才有强荧光信号，实现基因分型。图8中8个平行的检测室分为4组：

(1)用含有crRNA-HBV的1-2号检测室来检测HBV的存在；

(2)用含有crRNA-B的3-4号室检测目标DNA是否为HBV B型；

(3)用含有crRNA-C的5-6号室检测目标DNA是否为HBV C型；

(4)用含有参考RPA-T7-Cas13a检测的7-8号腔室作为离心微流控平台的质量控制，验证该平台的有效性。

参考图8，从左往右依次为：样本不携带HBV基因；样本携带HBV基因，但不携带B型或C型；样本携带HBV B型基因；样本携带HBV C型基因。终点荧光图像与预期一致，证实了本申请实施例所提供的集成预处理和分子诊断的离心式微流控芯片能够成功实现全血DNA快速、自动化基因分型。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方科技大学

<120> 集成全血分离和分子诊断的离心式微流控芯片及制备方法

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggaactac cgtgtgtctt ggccaaaatt 60

cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa cctcctgtcc tccaacttgt cctggttatc 120

gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct 180

tcttgttgg 189

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaattaata cgactcacta tagggactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggg 57

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaacaagaa gatgaggcat agcagcagga tg 32

<210> 4

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacauaa aacgccgcag acacauccag 60

cgau 64

<210> 5

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggaacacc cgtgtgtctt ggccaaaatt 60

cgcagtccca aatctccagt cactcaccaa cctgttgtcc tccaatttgt cctggttatc 120

gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct tcctctgcat cctgctgcta tgcctcatct 180

tcttgttgg 189

<210> 6

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggagcacc cgcgtgtcct ggccaaaatt 60

cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa cctcttgtcc tccaatttgt cctggctatc 120

gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct tcctctgcat cctgctgcta tgcctcatct 180

tcttgttgg 189

<210> 7

<211> 72

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuaac gaggacaaau uggaggacaa 60

caggccucgu ua 72

<210> 8

<211> 72

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuagc gaggacaaau uggaggacaa 60

gaggccucgc ua 72

<210> 9

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagaatgaca aagtggaact ggtgatccgc ctgggcgaga acaacatcgc ccaactggtc 60

tacaacgtct cctacctgat tcccggcgag ggactgtcgc ggccgcattt cgtcatcgac 120

gccaagaccg gcgaagtgct cgatcagtgg gaaggcctgg c 161

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaattaata cgactcacta tagggagaat gacaaagtgg aactggtgat ccgcctg 57

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gccaggcctt cccactgatc gagcacttcg ccg 33

<210> 12

<211> 62

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuugu agaccaguug ggcgauguug 60

uu 62

Claims

1.离心式微流控芯片，其特征在于，包括：

加样室，所述加样室用于容纳待测样本；

结合液室，所述结合液室用于预置结合液；

洗涤液室，所述洗涤液室用于预置洗涤液；

洗脱液室，所述洗脱液室用于预置洗脱液；

混合室，所述混合室用于分离核酸；

第一虹吸阀，所述第一虹吸阀连接所述加样室和所述混合室，用于向所述混合室供给待测样本；

第二虹吸阀，所述第二虹吸阀连接所述结合液室和所述混合室，用于向所述混合室供给结合液；

第三虹吸阀，所述第三虹吸阀连接所述洗涤液室和所述混合室，用于向所述混合室供给洗涤液；

第四虹吸阀，所述第四虹吸阀连接所述洗脱液室和所述混合室，用于向所述混合室供给洗脱液；

检测室和废液室，所述检测室和废液室位于所述混合室在所述离心式微流控芯片的径向的外侧，所述检测室和废液室通过出液流道与所述混合室连通；所述出液流道在远离所述混合室的一侧设有分流阀，并将所述检测室和所述废液室分设于所述离心式微流控芯片的周向两侧，所述出液流道在靠近所述混合室的一侧还设有球阀。

2.根据权利要求1所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述加样室在所述径向上具有两侧的宽头部和中间的窄颈部，所述第一虹吸阀连接于所述窄颈部。

3.根据权利要求1所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述球阀包括球体和套筒，所述套筒为￢型，所述球体位于所述套筒内，所述球体被配置为在重力作用下封堵所述套筒的下端使所述出液流道关闭，并能够在磁力作用下远离所述下端使所述出液流道打开。

4.根据权利要求3所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述离心式微流控芯片的表面还设有圆形或环形磁铁，所述圆形或环形磁铁用于向所述球体施加磁力。

5.根据权利要求1所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述检测室包括若干预分配室和若干反应室，所述若干预分配室和所述若干反应室通过毛细阀一一对应连接，所述若干预分配室相对所述若干反应室位于所述径向的内侧，所述若干反应室用于预置核酸检测试剂并进行核酸检测反应。

6.根据权利要求5所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述若干预分配室具有相同的体积。

7.根据权利要求1至6任一项所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述离心式微流控芯片还包括第二洗涤液室和第五虹吸阀，所述第五虹吸阀连接所述第二洗涤液室和所述混合室，用于向所述混合室供给第二洗涤液。

8.根据权利要求1至6任一项所述的离心式微流控芯片，其特征在于，所述混合室内预置有磁珠。

9.权利要求1至8任一项所述的离心式微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将压敏胶层贴合在亚克力板上，通过激光雕刻对所述压敏胶层进行切割，形成包含第一虹吸阀、第二虹吸阀、第三虹吸阀、第四虹吸阀、分流阀的第一层；

将另一压敏胶层贴合在另一亚克力板上，通过激光切割对所述另一压敏胶层和所述另一亚克力板进行切割，重复并堆叠形成加样室、结合液室、洗涤液室、洗脱液室、混合室、检测室和废液室的其它层；

将所述第一层和所述其它层贴合形成所述离心式微流控芯片。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第一层和所述其它层上设置有定位孔，通过向所述定位孔内导入定位柱将所述第一层和所述其它层对准，从而贴合形成所述离心式微流控芯片。