CN113522380A - 用于核酸检测的碟式微流控芯片及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种碟式微流控芯片，所述碟式微流控芯片具有三层结构，自下而上依次包括：通道层、密封层和硅胶层。还提供了其制备方法和应用。本发明的微流控芯片，配合集成化全自动微流控核酸检测装置使用，可以同时在21个反应单元中进行检测，并可通过改变芯片结构进一步增加检测通量。可以在单个反应单元中实现完成多步反应。样品用量少，反应精确可控，可以实现包括核酸提取、扩增、检测在内的全流程自动化高通量核酸检测和病原体感染筛查。

Description

用于核酸检测的碟式微流控芯片及应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及一种用于核酸检测的碟式微流控芯片及应用。
背景技术
微流控设备被广泛应用于包括分离、合成、器官模拟以及检测等研究。得益于样本消耗量少，反应快速、精准、可控等优势，微流控技术已在疾病检测领域占据了重要地位。病毒、循环肿瘤细胞、ctDNA、肿瘤相关外泌体等疾病标志物，被认为存在于血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、唾液等体液中，针对直接分离检测患者体液中的各种疾病标志物的微流控设备在临床应用中取得重大成功。在微流控设备中，碟式微流控芯片作为一种独特的微流控设备，近年来在快速检测方面得到广泛使用。
现有技术提供了一种微流控芯片可以完成核酸提取，但未能进行后续核酸扩增等步骤。现有技术还提供了利用微流控核酸检测芯片进行核酸检测，每次只能实现单样本六靶标检测，检测通量低。现有用于检测临床样本中的碟式微流控芯片，为集成核酸提取、核酸扩增、核酸检测等多种功能于一身，其设计多为复杂结构，一定程度上增加了设备成本和操作复杂度。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种碟式微流控芯片及应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“PMMA”是指：聚甲基丙烯酸甲酯。
术语“PC”是指：聚碳酸酯。
术语“PS”是指：聚苯乙烯。
术语“PDMS”是指：聚二甲基硅氧烷。
术语“高分子聚合物”是指：键重复连接而成的高分子量化合物，分子量通常可达10～106。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种碟式微流控芯片，所述碟式微流控芯片具有三层结构，自下而上依次包括：通道层、密封层和硅胶层；
所述通道层包含一个或多个反应单元，所述反应单元中包括一个或多个加样池、微通道、压力平衡通道和反应池。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述通道层包括10～30个反应单元。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述样品池顶端连接压力平衡微管道，所述加样池底端与所述微通道连接所述反应池。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述反应池的容积大于所述加样池的容积。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述密封层上包括一个或多个加样孔，所述加样孔与所述通道层反应单元中的加样池对应。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述硅胶层的厚度为0.01mm～20mm，优选为0.01mm～10mm。
根据本发明第一方面的碟式微流控芯片，其中，所述密封层的材料为高分子聚合物，优选选自以下一种或多种：PMMA、聚碳酸酯PC，聚苯乙烯PS，PDMS；和/或
所述通道层的材料选自以下一种或多种：PMMA、聚碳酸酯PC，聚苯乙烯PS。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的碟式微流控芯片的使用方法，所述方法包括：芯片转动过程中位于加样池的样品在离心力作用下经过微通道到达反应池。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的碟式微流控芯片的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
(1)切割硅胶制成所述硅胶层；
(2)通过机械加工和/或注塑工艺制备所述通道层和所述密封层；和
(3)结合所述各层结构。
优选地，步骤(3)中，所述结合方法选自以下一种或多种：热键合、双面胶贴合、胶水贴合。
本发明的第四方面提供了一种核酸检测装置，所述装置包括第一方面所述的碟式微流控芯片。
本发明提出一种集成式碟式微流控芯片，配合集成式全自动微流控检测装置使用，可以实现包括核酸提取、扩增、检测在内的全流程自动化核酸检测。本设计在实现集成多种功能的同时，很大程度的降低了芯片设计复杂程度、制作成本以及简化了操作步骤。
本发明涉及一种微流控芯片，用以实现对未处理的临床样本中包括核酸在内的多种疾病标志物的高通量检测。
得益于芯片的结构，该种碟式微流控芯片可能用于检测临床样本中多种疾病标志物。以病毒核酸为例，病毒临床样品(血液、唾液等)、裂解液、核酸提取试剂、核酸检测信标等可依次穿过硅胶层，加样孔加入样品池，并在惯性的作用下进入反应池依次实现病毒核酸提取、标记，在信号读取装置的帮助下实现信号读出。由于该碟式微流控芯片的样本消耗量小、反应快速、通量大等优点，可以实现对临床样本中病毒核酸的快速提取与检测。
本发明的碟式微流控芯片可以具有但不限于以下有益效果：
本发明提供了一种集成化微流控核酸检测芯片，配合集成化全自动微流控核酸检测装置使用，可以同时在21个反应单元中进行检测，并可通过改变芯片结构进一步增加检测通量。可以在单个反应单元中实现完成多步反应。样品用量少，反应精确可控，可以实现包括核酸提取、扩增、检测在内的全流程自动化高通量核酸检测和病原体感染筛查。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明碟式微流控芯片的整体结构。
图2示出了本发明碟式微流控芯片的分层结构。
图3示出了本发明碟式微流控芯片的反应单元结构。
图4示出了试验例1中本发明碟式微流控芯片的一次检测结果。
附图标记说明：
1、硅胶层；2、胶塞；3、固定孔；4、胶塞密封圈；5密封层；6、通道层；7、密封孔；8、加样孔一；9、加样孔二；10、反应池；11、加样池一；12、加样池二；13、微通道；14、压力平衡通道；15、加样针一；16、加样针二。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的材料如下：
材料：
硅胶、PMMA，购自上海美佳塑料制品有限公司。
核酸释放剂，购自圣湘公司。
核酸扩增试剂，购自LAMP公司。
实施例1
本实施例用于说明本发明碟式微流控芯片的结构。
图1示出了本发明碟式微流控芯片的整体结构。
如图2所示，本发明的微流控芯片具有三层结构：底层通道层6、中间层密封层5、顶层硅胶层1。其中：
底层通道层6包含微通道结构，用于承载反应溶液和控制流体流动。
中间层密封层5中的加样孔一8、加样孔二9用于溶液的加注。
顶层硅胶层1用于密封加样孔二9。由于硅胶较软且具有一定弹性，可使用包括加样针穿透硅胶层进行自动加样在内方法完成加样，而仍可实现对加样孔的密封。顶层硅胶层附带有胶塞2和胶塞密封圈4。其中，加样孔一8对应于胶塞密封圈4上的密封孔7并在加样后通过胶塞2密封。
该微流控芯片的底层通道层6包括多个反应单元，本实施例中提供的微流控芯片包括21个反应单元，可供21个样品的同步分析。如图2所示，每个反应单元中具有加样池一11、加样池二12、微通道13、压力平衡通道14以及反应池10。本实施例中，加样池为圆形结构，两端分别由微通道13和压力平衡通道14与反应池10的顶端两处不同位置连接。加样池二12顶端连接压力平衡通道14，保证了所加入的样品在离心力作用下，只能通过加样池底端微通道13进入反应池。反应池10的容积大于加样池的容积，保证了实现多步检测、多步反应的可能性。
样品通过加样孔一8首先进入通道层6加样池一11，并通过胶塞2密封加样池一11，用以防止样品泄漏以及环境对样品、样品间的污染。在芯片转动产生过程中，位于加样池的样品在惯性的作用下到达反应池10。由于整个单元在硅胶层1贴合后处于密封状态，压力平衡通道14的存在可以消除反应池10内的气体压力，保证样品顺利进入。
在一个优选方案中，在每个单元中，压力平衡通道14、微通道13的深度为500μm，加样池一11、加样池二12、反应池10的深度为1000μm。
实施例2
本实施例用于说明本发明碟式微流控芯片的制备方法。
本发明微流控芯片的制作流程如下：硅胶层由硅胶切割制成，密封层、通道层为PMMA材质，加样孔、压力平衡通道、加样池、反应池由机械加工或通过注塑工艺实现。硅胶层和密封层通过双面胶贴合完成结合，密封层和通道层通过热键合完成结合。
试验例1
本实施例用于说明本发明碟式微流控芯片的使用方法。
1.将通道层6、密封层5和硅胶层1键合，完成芯片组装。
2.分别向加样池一11中加入4微升假病毒样本溶液，本实施例中采取SARS-CoV-2假病毒样本溶液，浓度依次为100拷贝每微升、10拷贝每微升、1拷贝每微升、0.5拷贝每微升、0拷贝每微升，并利用胶塞2封闭各加样孔。
3.将芯片置入集成化自动化微流控核酸检测装置。核酸检测装置利用进样针一15向加样池二12中加入4微升核酸释放剂，将芯片以4000转每分速率转动10秒，将样本与核酸释放剂转移至反应池10并混合，室温反应10分钟，完成核酸释放。利用进样针二16向加样池二12中加入扩增试剂17微升，将芯片以4000转每分速率转动10秒，将扩增试剂转移至反应池9并与样本混合，65摄氏度下反应80分，完成核酸扩增。
4.反应结束，取出芯片，观察结果。
如图4所示，从左至右各反应池内样本浓度分别为100拷贝每微升、10拷贝每微升、1拷贝每微升、0.5拷贝每微升、0拷贝每微升。从结果中可以看到，各浓度样本均有荧光信号，表明样本被检出，0浓度样本无信号。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种碟式微流控芯片，其特征在于，所述碟式微流控芯片具有三层结构，自下而上依次包括：通道层、密封层和硅胶层；
所述通道层包含一个或多个反应单元，所述反应单元中包括一个或多个加样池、微通道、压力平衡通道和反应池。
2.根据权利要求1所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述通道层包括10～30个反应单元。
3.根据权利要求1或2所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述样品池顶端连接压力平衡微管道，所述加样池底端与所述微通道连接所述反应池。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述反应池的容积大于所述加样池的容积。
5.根据权利要求3或4所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述密封层上包括一个或多个加样孔，所述加样孔与所述通道层反应单元中的加样池对应。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述硅胶层的厚度为0.1mm～20mm，优选为0.1mm～10mm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的碟式微流控芯片，其特征在于，所述密封层的材料为高分子聚合物，优选选自以下一种或多种：PMMA、PC、PS、PDMS；和/或
所述通道层的材料选自以下一种或多种：PMMA、PC、PS。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的碟式微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述方法包括：芯片转动过程中位于加样池的样品在离心力作用下经过微通道到达反应池。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的碟式微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)切割硅胶制成所述硅胶层；
(2)通过机械加工和/或注塑工艺制备所述通道层和所述密封层；和
(3)结合所述各层结构；
优选地，步骤(3)中所述结合方法选自以下一种或多种：热键合、双面胶贴合、胶水贴合；
更优选地，所述硅胶层和所述密封层通过双面胶贴合完成结合，和/或所述密封层和所述通道层通过热键合完成结合。
10.一种核酸检测装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1至7中任一项所述的碟式微流控芯片。
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