CN105572337A - 一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡 - Google Patents

一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡 Download PDF

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高云华
孟凡达
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Abstract

本发明公开一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡，其包括底板、上盖和位于上盖和底板之间的双面胶层，其中双面胶层具有微通道，该检测卡的制备方法包括如下步骤：制备具有微通道的双面胶层；用马来酸酐基团修饰底板的材料表面；将双面胶层粘贴到马来酸酐修饰的底板表面；在微通道固定捕获抗体和标记抗体；将所述上盖粘贴到上述处理过的双面胶层上，其中所述微通道包括进样口、标记抗体储存区、第一时间控制通道、第二时间控制通道、反应检测区以及废液区。本微流体检测卡具有制作简单、检测灵敏度高、检测时间短、操作简便、能够自主驱动的优点。

Description

一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡
技术领域
本发明涉及微流体制作领域，更具体地，涉及一种自驱动微流体检测卡制作方法。
背景技术
微流体技术为蛋白的检测提供了一个有效的手段，其优点在于通过微通道中微流控操作，大大降低了样品及其试剂的消耗，并且有效提高了检测的速度；微流体技术还具有体积小、便于携带等特点，从而有利于开发成床旁实时监测技术(pointofcaretest，POCT)。
然而，微流体中微通道的制作仍是微流体发展的最大技术难点。常用的微通道制作方法，如注塑、热压、光刻等，都有着自身的缺陷，并且微通道的组装及键合也是微通道需要解决的问题，常用的键合方式如超声焊接、有机粘合等方式也存在着相应的缺陷。
如专利CN200510023895提供了一种使用SU-8胶光刻制作微通道，使用稀释的SU-8胶作为微通道的键合方法，在一定程度上解决了微通道的制作问题。但是，该方法仍会出现通道制作过程中的堵塞状况，而且其制作过程依旧相对繁琐。
将捕获抗体或者其他靶标分子高效的固定在微通道的表面是建立高质量微流体检测关键问题。常用的固定方式分为物理吸附和共价连接两种方式。物理吸附法固定蛋白会改变蛋白的空间构象因而固定效率相对较低。常用的共价固定方法又存在着操作步骤相对繁琐的问题。
如专利CN03157199、CN201110346431、CN201010045620分别提供了各自的在芯片表面固定蛋白的方法，有效解决了蛋白在芯片表面的固定，提高了蛋白在芯片表面的固定效率。但是，这些方法的操作步骤依旧相对繁琐。
微流体的驱动方式一般来说主要有两种，外力驱动和自驱动。外力驱动是通过外在的动力源进行流体的驱动，比如，借助马达、微泵、外压、出口负压等方式进行液体的驱动，这类驱动方式对微流体的加工要求较高，并且需要借助外在的仪器或装置，从而会增加检测的成本。自驱动是微流体本身不借助外在装置而液体能够进行自主流动的方式，比如，通过液体的重力、表面张力等方式进行液体的自主流动。自驱动不依赖于外在的装置来控制液体的流动相对能够降低检测成本。
如专利CN201380018250提供了一种利用液体在通道内的表面张力和控制出口压力的方式控制液体在微通道内流动的方式，有效地控制了液体在微通道中的流动。但是，该检测卡设计复杂，通道仍需要繁琐的步骤制备，仍然部分依赖于出口压力的控制。
而专利CN201210329604提供了一种完全依赖于流体重力驱动微流体流动的方法，有效地摆脱了外部装置的依赖，提供了一种检测的思路。
使用微流体检测技术进行多靶标的检测能够进一步的降低检测成本，而且多靶标的同检能够提高检测的准确度和特异性。
专利CN201210142337提供了一种多靶标同检的微流体检测技术，能够通过一部进样同时进行多种指标的检测，大大降低了检测的成本。但是，该微流体的制作难度仍相对较大，仍需要外在的驱动作为样品在微通道中的作用力，因而检测成本仍相对较高。
因此，建立一种制作简便的不依赖于外力驱动的能够进行多靶标检测的微流体检测技术具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种制作简便的高灵敏度多靶标检测的自驱动微流体检测卡。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡，其包括底板、上盖和位于上盖和底板之间的双面胶层，其中双面胶层具有微通道，该自驱动微流体检测卡的制备方法包括如下步骤：
制备具有微通道的双面胶层；用马来酸酐基团修饰底板的材料表面；将双面胶层粘贴到马来酸酐修饰的底板表面；在微通道固定捕获抗体和储存标记抗体；将所述上盖粘贴到上述处理过的双面胶层上，其中所述微通道包括进样口、标记抗体储存区、第一时间控制通道、第二时间控制通道、反应检测区以及废液区。
使用计算机画图软件，如solidworks、CAD，画出设计好的的底板、双面胶层、双面胶层微通道和上盖的形状。通过激光打印技术，又称为激光切割技术，分别在所述底板材料、双面胶层材料、上盖材料上使用激光切割出相应的形状。
所述标记抗体储存区为检测所使用标记抗体固定储存区；所述第一时间控制通道为标记抗体与样本的混合时间的窄通道，该通道由至少一个S型通道或者至少一个Z型通道构成，液体流通时经过弯曲通道时与通道边缘的撞击能够有效地提高样本与标记物的混合程度，同时该通道能够延长样本与标记物的反应时间从而使样本中的靶标(待测物)与标记抗体充分反应形成靶标-标记物的复合物；所述第二时间控制通道为延长样本在检测区的反应时间的窄通道，该通道由至少一个S型通道或者至少一个Z型通道或者一段窄的直通道构成，目的为提高靶标-标记物的复合物与捕获抗体的反应程度形成捕获抗体-靶标-标记物的复合物，由于第二时间控制通道的存在，使反应区的溶液流向废液池中的速度减慢，也就是溶液在反应区的停留时间加长，使反应区的溶液能充分与捕获抗体反应，进而提高复合物的反应程度；所述反应检测区为固定捕获抗体、背景校正试剂及其他校准试剂的区域；所述废液区为收集流过检测区的样本的区域。
优选地，反应检测区固定不同抗原的捕获抗体。
优选地，捕获抗体与标记抗体结合于目标抗原的不同表位。
优选地，标记抗体的标记物为磁珠、荧光、胶体金或胶体银，更优选地荧光微球、荧光分子或量子点。
所述上盖包括进样口和透气孔。其中上盖与双面胶层黏合后，上盖的进样口和双面胶层上的进样口重合。优选地，所述透气孔为1个以上，所述透气孔位于与双面胶层废液区相应的上盖处。
所述上盖的材料为透光性较好的高聚物材料，选自但不限于PMMA、PS、PC或PET，优选为PMMA或PS。当所述高聚物材料为亲水材料时可直接使用；当所述高聚物材料为疏水材料时需对疏水材料进行亲水性修饰，例如涂覆一层亲水性薄层或采用物理修饰方法，优选地，采用等离子体处理技术进行亲水性修饰。
所述等离子体处理技术进行亲水性修饰所用溶液为酸溶液、碱溶液或中性溶液，优选地，使用水进行亲水性修饰，优选地，在水溶液浸泡时间为1-24h，更优选地，浸泡2h。
所述马来酸酐基团修饰底板的材料为含有马来酸酐的聚合物，包括接枝聚合物和嵌段共聚物。所述含有马来酸酐的聚合物选自聚苯乙烯-马来酸酐聚合物、聚苯丙烯-马来酸酐聚合物和聚氧乙烯-马来酸酐聚合物中的一种或多种，优选聚苯乙烯-马来酸酐聚合物，接枝率优选0.5％-17％。
优选地，所述用马来酸酐基团修饰底板的材料表面的方法为：使用提拉法涂膜技术在底板表面使用聚苯乙烯-马来酸酐聚合物的溶液中进行修饰，在底板材料表面引入马来酸酐基团。所述马来酸酐基团可以用于固定捕获抗体。
所述的底板材料为单晶硅、玻璃或高聚物材料，如高聚合度的有机玻璃(Polymethylmethacrylate，PMMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(Acrylonitrile-Butadiene-Styrene，ABS)、聚氯乙烯(PolyVinylChloride，PVC)聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)等，优选地，使用高聚合度的PMMA。
所述含有马来酸酐聚合物的溶液为含有马来酸酐的聚合物溶于有机溶液中获得的溶液。优选地，所述聚苯乙烯马来酸酐聚合物溶液为聚苯乙烯-马来酸酐聚合物溶于有机溶液中获得的溶液。所述有机溶剂选自丙酮、氯仿、甲苯和二氯乙烷中的一种或多种，优选地为甲苯。
所述底板、上盖和双面胶层进一步包括定位结构。利用定位结构将双面胶层粘贴到底板表面，同时利用定位结构将上盖粘贴到双面胶上。
优选地，采用聚苯乙烯-马来酸酐聚合物溶液提拉法涂膜修饰底板的方法完成捕获抗体的固定；
优选地，所述底板的材料选用高聚合度PMMA；
优选地，底板尺寸为长度为60-130mm，宽度为20-60mm，厚度为0.5-5mm；
优选地，所述上盖的尺寸与底板相同；
优选地，所述双面胶层厚度为10-500μm。更优选地，厚度为100μm；
优选地，所述第一时间控制通道长度为5-50mm，宽度为0.3-1.0mm；
优选地，所述第二时间控制通道长度为5-50mm，宽度为0.3-1.0mm；
优选地，所述反应检测区长度为10-30mm，宽度为0.3-2.0mm；
优选地，所述废液区面积为4-20cm2；
所述双面胶层的材料即作为粘合材料又作为微通道的主体支撑材料，所选厚度为10-500μm，优选地，厚度为100μm。
所述微流体检测卡可用于检测生物样品中目标抗原，利用仪器检测标记信号强度推算抗原浓度。
通过激光打印技术快速的形成微流体所需要的微通道，通过提拉涂膜修饰技术简便解决了捕获抗体的固定，通过等离子体处理技术简便解决了微流体通道浸润性。实现了微流体检测卡自发流动，在短时间内完成多种抗原的快速检测。
本发明的有益效果如下：
本微流体检测卡具有制作简单、检测灵敏度高、检测时间短、操作简便、能够自主驱动的优点；通过本方法制成的自驱动测试卡所用样本体积小、检测灵敏度高、检测范围宽，并且用于多靶标检测具有一定优势。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出微流体检测卡主视图。
图2示出微流体检测卡剖视图。
图3示出具有定位孔的微流体检测卡剖视图。
图4示出具有定位孔的微流体检测卡主视图。
图5示出实施例3CRP检测曲线。
图6示出实施例3PCT检测曲线。
图7示出实施例4CRP检测曲线。
图8示出实施例4FABP检测曲线。
图9示出不同浓度不同接枝率的聚苯乙烯接枝马来酸酐溶液涂膜固定捕获抗体检测结果。
100.微流体检测卡；101.上盖；201.双面胶层；301.底板；102.进样口；202.进样口；103.透气孔；203.标记物固定区；204.第一时间控制通道；205.反应检测区；206.第二时间控制通道；207.废液区；102.进样口；120.定位孔；121.定位孔；122.定位孔；123.定位孔；208.背景校正试剂点样区；209.校准试剂点样区；210.CRP捕获抗体点样区；211.CRP捕获抗体点样区；212.PCT捕获抗体点样区；213.PCT捕获抗体点样区。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：量子点标记的CRP和PCT的联合微流体检测卡的制备
1.量子点交联CRP抗体和量子点交联PCT抗体的制备：
使用羧基修饰的量子点分别修饰CRP抗体和PCT抗体，基本步骤如下：
1)取一定量0.1mM的羧基修饰量子点，使用pH＝7.4的PBS稀释50倍，按体积比1:10加入10mMEDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)溶液，室温震荡活化15min。
2)在活化好的量子点溶液中按1μg/μL加入CRP抗体，4℃震荡反应过夜。
3)按1:10的体积比加入1％BSA溶液，封闭反应1h。
4)使用超高速离心机20000g离心以除去未反应的蛋白，使用PBST复溶即获得量子点交联CRP抗体。
量子点交联PCT抗体的制备与量子点交联CRP抗体相同，不同之处仅在于步骤2)中按1μg/μL加入PCT抗体。
2.捕获抗体的固定：
使用接枝率为0.6％的聚苯乙烯-马来酸酐溶于甲苯中，配制成为浓度为2％聚苯乙烯-枝马来酸酐溶液，底板PMMA使用提拉法进行涂膜，获得马来酸酐基团修饰的底板。
设计双面胶层微通道，并通过激光打印技术快速的形成微通道；
将具有微通道的双面胶层黏贴到底板上，使用点样仪分别在反应检测区的不同位置固定CRP和PCT捕获抗体，优选地，固定抗体浓度为100μg/mL。
3.背景校正试剂及其校准试剂的固定：
分别将BSA和相应的抗二抗抗体使用点样仪点在微通道的相应位置。
4.标记抗体的固定：
将使用PBST稀释的量子点交联CRP抗体和量子点交联PCT抗体的溶液按照体积比1:1混合后，使用点样仪滴加到标记抗体区，37℃烘干。
5.上盖的处理：
使用600V，空气流速1200cm3/min，80s的等离子体条件处理后的水溶液浸泡上盖2h，然后37℃烘干。
6.检测卡的组装：
按照定位装置施加一定压力，将检测卡组装。对微流体检测卡的整体组装过程中加入了定位孔进行整体组装定位，所使用的定位方式仅仅是其中的一种定位方式，不局限于实施例所提供的定位方式，其他类似于此的定位方式，如边角定位、三点定位、两点定位等也应属于专利所保护范畴。
实施例1所使用微流体检测卡如图3和图4所示。
其中微流体检测卡100包括底板301、上盖101和位于上盖和底板之间的双面胶层201，其中双面胶层201具有微通道，所述微通道包括进样口202、标记物固定区203、第一时间控制通道204、第二时间控制通道206、反应检测区205以及废液区207。所述上盖包括进样口102、多个透气孔103。其中双面胶层的进样口和上盖的进样口重合，所述透气孔103在双面胶层废液区207的相应位置。
实施例2：荧光微球标记的CRP和FABP的联合检测微流体检测卡的制备
1.荧光微球交联CRP抗体和荧光微球交联FABP抗体的制备：
使用羧基修饰的荧光微球分别修饰CRP抗体和FABP抗体。
1)取一定量的1％固含量的羧基修饰荧光微球溶液，使用pH＝8.2的硼酸溶液稀释5倍，按体积比1:10加入10mMEDC溶液，室温震荡活化15min。
2)在活化好的荧光微球点溶液中按0.1μg/μL加入CRP抗体，4℃震荡反应过夜。
3)按1:10的体积比加入1％BSA溶液，封闭反应1h。
4)使用高速离心机10000g离心除去未反应的蛋白，使用含有吐温-20的硼酸缓冲液复溶。
荧光微球交联FABP抗体的制备与荧光微球交联CRP抗体相同，不同之处仅在于步骤2)中按0.1μg/μL加入FABP抗体。
2.捕获抗体的固定：
使用接枝率为1.0％的聚苯乙烯-马来酸酐溶于甲苯中，配制成为浓度为1.5％聚苯乙烯-马来酸酐溶液，底板PMMA使用提拉法进行涂膜，获得马来酸酐基团修饰的底板。
设计双面胶层微通道，并通过激光打印技术快速的形成微通道；
使用聚苯乙烯-马来酸酐溶液修饰好的底板，黏贴双面胶层后，使用点样仪分别在反应检测区不同位置固定CRP和FABP捕获抗体，优选地，固定抗体浓度为100μg/mL。
3.背景校正试剂及其校准试剂的固定：
分别将BSA和相应的抗二抗抗体使用点样仪点在微通道的相应位置。
4.标记抗体的固定：
将使用浓度为1％的吐温-20的硼酸缓冲液稀释的荧光微球交联CRP抗体和荧光微球交联FABP抗体的溶液，按照体积比1:2比例混合后，使用点样仪滴加到标记抗体区，37℃烘干。
5.上盖的处理：
使用600V，空气流速1200cm3/min，80s，的等离子体条件处理后水溶液浸泡2h，37℃烘干。
6.检测卡的组装：
对定位装置施加一定压力，将检测卡组装。
实施例2所使用微流体检测卡如图3和图4所示。
实施例3：量子点标记的CRP和PCT的联合检测
使用实施例1制作的微流体检测卡进行CRP和PCT的联合检测。
抗原溶液的配制：使用小牛血清配制梯度混合的CRP和PCT的抗原溶液，编号为1、2、3、4、5、6和7，分别对应CRP浓度为0.1、0.5、2.0、10、50、200和1000ng/mL，对应FABP浓度为500、200、100、20、5、1.0和0.1ng/mL。
使用检测卡分别检测相应抗原溶液，检测时只需使用移液枪取70μL相应样品滴加于检测卡的进样口，样品自由进入微通道中进行反应，约9min样品流尽后，使用荧光检测仪进行荧光定量即可。平行实验4次。
测定荧光信号值后，拟合检测曲线，如图5和6。CRP和PCT的R2分别为0.9984和0.9726，说明该检测卡具有良好的检测效果。
实施例4：荧光微球标记的CRP和FABP的联合检测
使用实施例2制作的微流体检测卡进行CRP和PCT的联合检测。
抗原溶液的配制：使用小牛血清配制梯度混合的CRP和FABP的抗原溶液，编号为1、2、3、4和5，分别对应CRP浓度为10、50、200、500和2000ng/mL，对应FABP浓度为100、40、20、5和1.0ng/mL。
使用微流体检测卡分别检测相应抗原溶液，检测时只需使用移液枪取70μL相应样品滴加于检测卡的进样口，样品自由进入微通道中进行反应，约9min样品流尽后，使用荧光检测仪进行荧光定量即可。平行实验4次。
测定荧光信号值后，拟合检测曲线，如图7和8。CRP和FABP的R2分别为0.9891和0.9980，说明该检测卡具有良好的检测效果。
实施例5：采用不同浓度不同接枝率的聚苯乙烯-马来酸酐溶液涂膜固定蛋白
按照实施例2所描述的方法制作FABP微流体检测卡，本实施例与实施例2所描述方法主要区别在于以下几点：
1.使用接枝率0.6％、5％、10％的聚苯乙烯-马来酸酐溶于甲苯中分别配制0.5％、1％、2.5％的聚苯乙烯-马来酸酐溶液。使用配制的溶液在切割好的PMMA表面提拉法涂膜。
2.使用点样仪在不同表面修饰的微流体表面反应检测区相应位置只固定FABP捕获抗体。
3.标记抗体固定：在标记抗体固定区只点荧光微球交联FABP抗体的溶液。
使用微流体检测卡分别检测7ng/mL的FABP抗原溶液，平行实验4次。
实验结果如图9所示，采用不同浓度不同接枝率的聚苯乙烯-马来酸酐溶液涂膜固定捕获抗体具有不同的效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种检测多靶标的自驱动微流体检测卡，其特征在于，包括底板、上盖和位于上盖和底板之间的双面胶层，其中双面胶层具有微通道，该检测卡的制备方法包括如下步骤：
制备具有微通道的双面胶层；用马来酸酐基团修饰底板的材料表面；将双面胶层粘贴到马来酸酐修饰的底板表面；在微通道固定捕获抗体和储存标记抗体；将所述上盖粘贴到上述处理过的双面胶层上，其中所述微通道包括进样口、标记抗体储存区、第一时间控制通道、第二时间控制通道、反应检测区以及废液区。
2.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，反应检测区可固定结合不同抗原的捕获抗体；标记抗体储存区储存针对不同抗原的标记抗体，优选地，捕获抗体与标记抗体结合于目标抗原的不同表位。
3.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述上盖包括进样口和1个以上透气孔，其中上盖的进样口和双面胶上的进样口重合，优选地，所述透气孔位于与双面胶层废液区相应的位置。
4.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述上盖的材料为透光性好的高聚物材料，选自PMMA、PS、PC或PET。
5.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述用马来酸酐基团修饰底板的材料表面的方法为：使用提拉法涂膜技术在底板表面使用含有马来酸酐聚合物的溶液中进行修饰，在底板材料表面引入马来酸酐基团。
6.如权利要求5所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述含有马来酸酐聚合物的溶液为含有马来酸酐的聚合物溶于有机溶液中获得的溶液；所述含有马来酸酐的聚合物选自聚苯乙烯-马来酸酐聚合物、聚苯丙烯-马来酸酐聚合物和聚氧乙烯-马来酸酐聚合物中的一种或多种；所述有机溶剂选自丙酮、氯仿、甲苯和二氯乙烷中的一种或多种，优选地，所述有机溶液为甲苯溶液。
7.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述底板的材料选用高聚合度PMMA；底板尺寸为长度为60-130mm，宽度为20-60mm，厚度为0.5-5mm，优选地，所述上盖的尺寸与底板相同。
8.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述双面胶层的厚度为10-500μm，优选地，厚度为100μm；所述第一时间控制通道长度为5-50mm，宽度为0.3-1.0mm；所述第二时间控制通道长度为5-50mm，宽度为0.3-1.0mm；所述反应检测区长度为10-30mm，宽度为0.3-2.0mm；所述废液区面积为4-20cm2。
9.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，所述第一时间控制通道由至少一个S型通道或者至少一个Z型通道构成；优选地，所述第二时间控制通道由至少一个S型通道或者至少一个Z型通道或者一段窄的直通道构成。
10.如权利要求1所述的自驱动微流体检测卡，其特征在于，标记抗体的标记物为磁珠、荧光、胶体金或胶体银，更优选地为荧光微球、荧光分子或量子点。
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