CN116042382A - 一种多靶标基因联合检测样品舟 - Google Patents

一种多靶标基因联合检测样品舟 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种多靶标基因联合检测样品舟，包括底板和与其相配的上盖；上盖的一侧排布4个竖直放置的储液孔，上盖的另一侧设置有水平放置的依次相连通的基因扩增区、检测区和废液池；所述的基因扩增区通过微流控通道3与检测区相连；检测区与废液池相连通，所述的废液池上连接向上的排气孔。本发明首先可以实现实时在线基因扩增后检测，扩增后可以快速检测，克服了温度差别和环境的差别，可以检测多靶标基因，检测准确度高。

Description

一种多靶标基因联合检测样品舟
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种多靶标基因联合检测样品舟。
背景技术
现有常用基于生物芯片的基因检测需要在外部进行基因扩增后得到新的基因，然后进行检测，这是由于基因扩增时的高温及反复高/低温切换过程中往往会降低生物芯片的活性，从而降低反应效率；同时现有的检测技术的检测样品或溶剂以及试剂在流动过程中不可避免的会出现气泡，导致检测结果出现问题；另外针对多靶标基因的检测，如果分次单独进行，实验过程中不可避免的会存在误差。。
发明内容
针对现阶段基因检测中存在的问题，本发明提供了一种多靶标基因联合检测样品舟，将所有反应试剂集成于样品舟内部，使用时仅需要加入样本后，置于相应装置上运行相应程序，从而实现基因的检测；同时，解决了流动过程中出现气泡的问题。
本发明是通过以下措施来实现的：
本发明公开了一种多靶标基因联合检测样品舟，包括底板和与其相配的上盖；上盖的一侧排布4个竖直放置的储液孔，上盖的另一侧设置有水平放置的依次相连通的基因扩增区、检测区和废液池；
所述的4个储液孔从右到左分别为第一储液孔、第二储液孔、第三储液孔、第四储液孔，第一储液孔和第二储液孔分别通过微流控通道1与基因扩增区的进液口连接；第三储液孔和第四储液孔分别通过微流控通道2与检测区的进液口连接；
所述的基因扩增区通过微流控通道3与检测区相连；检测区与废液池相连通，所述的废液池上连接向上的排气孔。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的基因扩增区、检测区的下腔板为平面，上腔板上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述阻隔条与液体流动方向垂直；上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述阻隔条与液体流动方向垂直所述的阻隔条的高度为50-300微米、间距为0.5-5毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为50-300微米。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的阻隔条与上腔板之间形成波浪形；所述阻隔条的高度为100-200微米、间距为0.5-4毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为50-400微米。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的下腔板为水平放置，上腔板与下腔板之间的倾斜角为2-5度。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，下盖上设置有与基因扩增区相匹配的加温区，以及与检测区相匹配的传感器集成区，所述的传感器集成区表面修饰基因识别探针。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的废液池底部铺设吸水纸，所述的废液池为分体式结构。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的储液孔匹配有乳胶球，推动储液孔中的试剂或样品进样。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的上盖和底板周边切合密封。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的上盖为透明材料。
上述的多靶标基因联合检测样品舟，优选的，所述的微流控通道1、微流控通道2、微流控通道3上均设置有开关。
本申请的样品舟的使用方法：当在一个储液孔加样时，需将其余储液孔和排气孔关闭。将试剂使用移液枪或者针筒从底部加入然后缓慢推入乳胶微球；进样时，通过推动乳胶微球的步进距离控制进样量；使试剂首先进入基因扩增区，基因扩增时使用生物素修饰的引物，被扩增的基因片段均被修饰上生物素；使用亲和素修饰的荧光微球，或者针对传感器的识别物反应后识别物别固定到表面从而产生信号。扩增后的试剂进入检测区，位于检测区下面的传感器集成区表面修饰基因识别探针，识别扩增的待测基因，进行检测。实现实时在线基因扩增后检测，扩增后可以快速检测，克服了温度和环境的变化导致的结果的变化，整体提升了检测的准确度。
由于设置有多个储液孔，可以分别将不同的试剂进入不同的储液孔内，可以检测多靶标基因，进行联合检测，克服常规多次检测的误差，保证检测数据的准确性。
在进样过程中，检测区和基因扩增内，采用特定的阻隔条，以及特定的上下腔板的间隔，由于表面张力原因，液体在反应区即基因扩增区、检测区，能够缓慢的沿着设置的阻隔条一级一级的往前走，很难产生气泡；离开的时候会一级一级的离开，不会产生残留，从而避免了液体在相对开阔区域的无序流动，进而产生气泡，降低反应效率。另外本申请的吸水纸能够阻止废液回流，保证废液稳定储存。
下盖上设置有与基因扩增区相匹配的加温区2，可以使基因的扩增反应更加快速和准确。
本发明的有益效果
首先可以实现实时在线基因扩增后检测，扩增后可以快速检测，克服了温度差别和环境的差别；
其次可以检测多靶标基因，进行联合检测，克服常规多次检测的误差，保证检测数据的准确性；
最后检测准确度高，采用特定的阻隔条，避免了液体在相对开阔区域的无序流动，进而产生气泡，降低反应效率；再结合多靶标同时检测，克服多次检测的误差；基因扩增区的存在，克服了温度和环境的变化导致的结果的变化，整体提升了检测的准确度。
说明书附图
图1为本申请样品舟的俯视结构示意图；
图2为本申请样品舟的结构示意图；
图3 为腔体内阻隔条结构和试剂流动示意图；
图4是储液孔的进样示意图；
图5是信号产生示意图；
图6为阳性图片；
图7为阴性图片；
图中，1底板；2加温区；3微流控通道3；4基因扩增区；5微流控通道1；6上盖；7阻隔条；8储液孔；9微流控通道2；10废液池；11检测区；12排气孔；13传感器集成区。
具体实施方式
实施例1
如图1-5所示，为本发明的一种多靶标基因联合检测样品舟，包括底板（1）和与其相配的上盖（6），上盖（6）为透明材料。上盖的一侧有凸起（7），上面排布4个储液孔（8），上盖（6）的另一侧设置有水平放置的基因扩增区（4）、检测区（11）和废液池（10）；
所述的4个储液孔（8）从右到左分别为第一储液孔、第二储液孔、第三储液孔、第四储液孔，第一储液孔和第二储液孔分别通过微流控通道1（5）与基因扩增区（4）的进液口连接；第三储液孔和第四储液孔分别通过微流控通道2（9）与检测区（11）的进液口连接；
所述的基因扩增区（4）通过微流控通道3（3）与检测区（11）相连；检测区（11）与废液池（10）相连通，所述的废液池（10）上连接向上的排气孔（12）。所述的微流控通道1 （5）、微流控通道2（ 9）、微流控通道3（ 3）、检测区（11）、基因扩增区（4）、废液池（10）排列在上盖上无凸起的地方。下盖上设置有与基因扩增区（4）相匹配的加温区（2），以及与检测区（11）相匹配的传感器集成区（13），所述的传感器集成区（13）表面修饰基因识别探针。所述的上盖（6）和底板（1）之间存在空腔，周边切合密封；
所述的基因扩增区（4）、检测区（11）均具有上腔板和下腔板，上腔板与下腔之间形成内腔，上腔板与下腔板均水平放置。的下腔板为平面，上腔板上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述的阻隔条的横截面为长方形，所述阻隔条与液体流动方向垂直；所述阻隔条与液体流动方向垂直所述的阻隔条的高度为200微米、间距为3毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为150微米；
所述的废液池（10）为下端可拆除结构，底部铺设吸水纸。
本申请的样品舟的使用方法：加样时/加试剂时，需将其余储液孔和排气孔使用生物胶带封闭(防止试剂流入微通道)，将试剂使用移液枪或者针筒从底部加入然后缓慢推入乳胶微球；进样时，通过推动乳胶微球的步进距离控制进样量；
传感器集成区表面修饰基因识别探针，识别扩增的待测基因；基因扩增时使用生物素修饰的引物，因而被扩增的基因片段均被修饰上生物素；使用亲和素修饰的荧光微球，或者针对传感器的识别物反应后识别物别固定到表面从而产生信号。可以实现实时在线基因扩增后检测，扩增后可以快速检测，克服了温度差别和环境的差别。可以检测多靶标基因，进行联合检测，克服常规多次检测的误差，保证检测数据的准确性。检测准确度高，采用凸起结构，避免了液体在相对开阔区域的无序流动，进而产生气泡，降低反应效率；再结合多靶标同时检测，克服多次检测的误差；基因扩增区的存在，克服了温度和环境的变化导致的结果的变化，整体提升了检测的准确度。
采用上述装置进行B型乙型肝炎病毒的鉴别
储液孔（8）从右至左，分别为第一储液孔、第二储液孔、第三储液孔、第四储液孔。
第一储液孔加提取的乙肝病毒的特异性基因片段样本（样本）；第二储液孔加PCR扩增试剂（总量为100 μL， 10 μL 10×PCR缓冲液(Mg2+ Plus)， 8 μL (2.5 mM) dNTP混合物，2 μL (5U/μL) Taq DNA聚合酶，5 μL (10 μM)正向引物(5’-ggacttctctcaattttctaggg-3’)，5 μL (10 μM)生物素化反向引物(5’-Biotin-tgaggcccactcccata-3’)和70 μL无菌去离子水）；第三储液孔加链霉亲和素修饰荧光探针；第四储液孔加冲洗溶液。
该方法检测靶标为B型乙肝病毒的特异性基因片段，在扩增区实现目标基因片段的PCR扩增；
首先，将样本和扩增试剂按照一定比例同时推入扩增区，同时样本和扩增试剂在设置的特定结构下能够实现充分的混合，使用温度控制元件调整温度，进行PCR扩增；
PCR扩增使用热循环器，在以下条件下进行：95℃初始变性5 min，然后进行30个循环（94℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 30 s）, 最后 72℃ 5 min；
继续推动第二储液孔，然后将扩增后的试剂推入预先修饰好特异性寡核苷酸捕获探针（5’-tttttttttttttttt-cccaaatctccagtcactcaccaacctgttgt-3’）的检测区，检测区在入口处储存有冻干的杂交溶液冻干粉，扩增后试剂会迅速溶解杂交溶液冻干粉，后将检测区温控50℃下孵育1 h。扩增的biotin修饰的DNA会与捕获探针杂交；
推动第三储液孔，推入链霉亲和素修饰的荧光探针溶液，avidin修饰荧光探针会被连接到杂交的复合物上；
最后推动第四储液孔，往检测区推入冲洗溶液，洗脱未固定的荧光探针；
使用荧光显微镜对特定区域进行扫描，荧光强度进行定量。
测试的结果见图6和图7，图6为阳性图片，图7为阴性图片。
实施例2
本实施例所述的基因扩增区（4）、检测区（11）的下腔板为平面，所述的下腔板为水平放置，上腔板与下腔板之间的倾斜角为3度。上腔板上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述的阻隔条的横截面为弧形，阻隔条与腔板的内表面形成连续的波浪形。所述阻隔条与液体流动方向垂直；所述阻隔条与液体流动方向垂直所述的阻隔条的高度为100微米、间距为5毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为200微米；
其它部分与实施例1相同，同样用于基因检测。

Claims (10)

1.一种多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，包括底板（1）和与其相配的上盖（6）；上盖（6）的一侧排布4个竖直放置的储液孔（8），上盖（6）的另一侧设置有水平放置的依次相连通的基因扩增区（4）、检测区（11）和废液池（10）；
所述的4个储液孔（8）从右到左分别为第一储液孔、第二储液孔、第三储液孔、第四储液孔，第一储液孔和第二储液孔分别通过微流控通道1（5）与基因扩增区（4）的进液口连接；第三储液孔和第四储液孔分别通过微流控通道2（9）与检测区（11）的进液口连接；
所述的基因扩增区（4）通过微流控通道3（3）与检测区（11）相连；检测区（11）与废液池（10）相连通，所述的废液池（10）上连接向上的排气孔（12）。
2.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的基因扩增区（4）、检测区（11）的下腔板为平面，上腔板上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述阻隔条与液体流动方向垂直；上密布有若干延伸到两端的阻隔条，所述阻隔条与液体流动方向垂直所述的阻隔条的高度为50-300微米、间距为0.5-5毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为50-300微米。
3.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的阻隔条与上腔板之间形成波浪形；所述阻隔条的高度为100-200微米、间距为0.5-4毫米，所述的阻隔条与下腔板的距离为50-400微米。
4.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的下腔板为水平放置，上腔板与下腔板之间的倾斜角为2-5度。
5.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，下盖上设置有与基因扩增区（4）相匹配的加温区（2），以及与检测区（11）相匹配的传感器集成区（13），所述的传感器集成区（13）表面修饰基因识别探针。
6.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的废液池（10）底部铺设吸水纸，所述的废液池（10）为分体式结构。
7.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的储液孔（8）匹配有乳胶球，推动储液孔（8）中的试剂或样品进样。
8.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的上盖（6）和底板（1）周边切合密封。
9.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的上盖（6）为透明材料。
10.根据权利要求1所述的多靶标基因联合检测样品舟，其特征在于，所述的微流控通道1（5）、微流控通道2（9）、微流控通道3（3）上均设置有开关。
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