CN114480096A - 按压式微流控芯片、微流控装置及细菌检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种按压式微流控芯片、微流控装置及细菌检测方法。本发明的按压式微流控芯片，包括：芯片本体，芯片本体上设置有用于检测样本中的目标细菌的检测液路和至少一个用于控制检测液路内的液体的气控单元，气控单元均包括操作腔和控制腔，其中，按压相应的操作腔能够改变相应的控制腔内的压力并作用于检测液路的预设位置上，以控制检测液路内的液体的流动。本发明中，通过手指按压操作腔即可控制检测液路中的液体流动，以完成细菌的检测，而无需外加驱动装置，操作简单，能够实现将细菌的识别、捕获、裂解、提纯、扩增、信号输出等过程集成在一张芯片上，适用于细菌的现场即时检测及分析。

Description

按压式微流控芯片、微流控装置及细菌检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种按压式微流控芯片、微流控装置及细菌检测方法。
背景技术
食源性致病菌通常出现在肉类、蔬菜、水果和即食类等产品中，引起传染病，对人类健康造成严重威胁。传统的细菌培养计数法作为“金标准”，适用性强、成本低，但存在检测时间长(2-4天)的问题。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，但严重依赖温度控制设备，限制其在护理点检测过程中的应用。基于恒温扩增技术如重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)可避免温度控制问题，室温下即可反应，但存在细菌识别、裂解、提纯、扩增、信号读取等过程无法集成等问题。
微流控芯片技术被称为芯片上的实验室，可将实验中的各个环节集成在一张芯片上。微流控芯片集成度高、体积小、试剂使用量小、成本低、高通量、操作简便，可将细菌识别、裂解、提纯、扩增、信号读取集成在一张芯片上，为现场即时检测提供了新的技术选择。此外，智能手机作为微流控芯片中信号的读取设备，可对信号图像即时采集、处理及分析，有利于细菌现场检测仪器的小型化。目前微流控芯片技术可实现检测的多环节集成，但仍存在使用外部设备，如注射泵、离心装置等外加驱动设备，设备体积大，操作复杂，不利于进行现场即时检测与分析。
发明内容
本发明提供一种按压式微流控芯片、微流控装置及细菌检测方法，用于至少解决上述一个技术问题。
本发明的第一方面提供一种按压式微流控芯片，包括：芯片本体，所述芯片本体上设置有用于检测样本中的目标细菌的检测液路和至少一个用于控制所述检测液路内的液体的气控单元，
所述气控单元均包括操作腔和控制腔，
其中，按压相应的所述操作腔能够改变相应的所述控制腔内的压力并作用于所述检测液路的预设位置上，以控制所述检测液路内的液体的流动。
在一个实施方式中，所述检测液路包括：用于与所述控制腔相配合的第一液体通道，
所述第一液体通道包括：依次相连的进液微通道、驱动室和出液微通道，所述进液微通道中设置有处于常开状态的第一微阀，所述出液微通道内设置有处于常闭状态的第二微阀；
所述控制腔包括：与第一微阀相配合的第一气控腔、与所述驱动室相配合的第二气控腔和与所述第二微阀相配合的平衡腔，所述第一气控腔和所述第二气控腔分别与相应的所述操作腔相连通，所述平衡腔与外界连通；
其中，按压相应的所述操作腔能够分别使相应的所述第一气控腔和所述第二气控腔膨胀，从而所述第一气控腔驱动所述第一微阀关闭，所述第二气控腔驱动所述驱动室内的液体朝向所述第二微阀流动；
并且所述驱动室内的液体朝向所述第二微阀流动时，所述平衡腔能够被压缩以使所述第二微阀打开，以使所述驱动室内的液体从所述出液微通道中流出。
在一个实施方式中，所述检测液路包括：用于加入预处理试剂的液池、用于加入样本并捕获所述样本中的目标细菌的细菌捕获腔、用于加入扩增试剂以进行细菌扩增的扩增池、用于加入酶切反应试剂以进行酶切反应的反应池和用于回收废液的废液池，
所述液池包括：用于加入洗涤液的第一液池、用于加入细菌裂解液的第二液池，用于加入核酸纯化液的第三液池和用于加入核酸洗脱液的第四液池，
所述第一液池、所述第二液池、所述第三液池和所述第四液池分别通过相应的所述第一液体通道与所述细菌捕获腔的进液端相连所述细菌捕获腔的出液端通过第二液体通道与所述废液池相连，所述细菌捕获腔的出液端通过第三液体通道与所述扩增池的进液端相连，所述扩增池的出液端通过相应的所述第一液体通道与所述反应池相连，
所述第一液池、所述第二液池、所述第三液池、所述第四液池和所述扩增池分别对应设置一个所述气控单元。
在一个实施方式中，所述第三液体通道内设置有处于常开状态的第一附加阀、第二附加阀和第三附加阀，所述第二液体通道内设置有一个处于常开状态的第四附加阀，
用于控制所述洗涤液的气控单元还包括与所述第一附加阀相配的第一附加气控腔；用于控制所述细菌裂解液的气控单元还包括与所述第二附加阀相配的第二附加气控腔；用于控制所述核酸纯化液的气控单元还包括与所述第三附加阀相配的第三附加气控腔；用于控制所述核酸洗脱液的气控单元还包括与所述第四附加阀相配的第四附加气控腔，
其中，分别按压用于控制所述洗涤液、所述细菌裂解液、所述核酸纯化液或者所述核酸洗脱液的操作腔，能够分别使相应的所述第一附加开关腔、所述第二附加开关腔、所述第三附加开关腔或者所述第四附加开关腔膨胀，从而驱动相应的第一附加阀、第二附加阀、第三附加阀或者第四附加阀关闭。
在一个实施方式中，所述液池与所述细菌捕获腔之间的所述第一液体通道的出口端均设有第一防回流结构，以防止所述细菌捕获腔中的液体回流至相应的所述液池中。
在一个实施方式中，所述第三液体通道中设置有第二防回流结构，以防止所述扩增池中的液体回流至所述细菌捕获腔中。
在一个实施方式中，所述芯片本体包括依次层叠设置的第一芯片层、第二芯片层、第三芯片层和第四芯片层，
其中，所述第一芯片层与所述第二芯片层之间形成所述操作腔，所述第二芯片层与所述第三芯片层之间形成所述控制腔，所述第三芯片层与所述第四芯片层之间至少形成所述检测液路，所述第三芯片层为弹性薄膜，
其中，按压相应的所述操作腔能够改变相应所述控制腔内的压力并引起所述第三芯片层发生弹性形变，从而控制所述检测液路内的液体的流动。
本发明的第二方面提供一种微流控装置，包括盒体、磁吸单元、激发光源、拍照设备和上述的按压式微流控芯片，
其中，所述磁吸单元、所述激发光源和所述按压式微流控芯片均设置在所述盒体内，所述磁吸单元设置在所述按压式微流控芯片的下方，所述激发光源位于所述按压式微流控芯片的上方，所述拍照设备可拆卸地设置在所述盒体的顶部以拍摄荧光图像。
在一个实施方式中，所述盒体的顶部设置有拍照孔，所述拍照孔中设置有滤光片，所述拍照设备透过所述滤光片拍摄荧光图像。
本发明的第三方面提供一种细菌检测方法，采用上述的按压式微流控芯片或者上述的微流控装置对样本进行细菌检测，包括：
在检测液路的相应位置处分别加入预处理试剂、扩增试剂、反应试剂和样本；
通过分别按压相应的操作腔，依次控制预处理试剂与样本混合以获得目标细菌的核酸，控制获得的目标细菌的核酸与扩增试剂混合以进行扩增，以及控制扩增后的目标细菌的核酸与反应试剂混合以进行反应。
在一个实施方式中，具体包括以下步骤：
步骤1：在按压式微流控芯片的细菌捕获腔中加入复合磁性核酸提纯颗粒和磁性纳米颗粒后将所述细菌捕获腔封闭，在按压式微流控芯片的扩增池中加入目标细菌的扩增试剂，在按压式微流控芯片的反应池中加入酶切反应试剂；
步骤2：打开所述细菌捕获腔，并在所述细菌捕获腔中加入样本后将其封闭，同时，在按压式微流控芯片的第一液池中加入洗涤液，在第二液池加入细菌裂解液，在第三液池中加入核酸纯化液，以及在第四液池中加入核酸洗脱液；
步骤3：按压第一预设次数用于控制所述洗涤液的操作腔，使所述洗涤液流入所述细菌捕获腔中，以将样本中未被所述磁性纳米颗粒捕获的其它物质冲入废液池中；
步骤4：按压第二预设次数用于控制所述裂解液的操作腔，使所述裂解液流入所述细菌捕获腔中，以将捕获的目标细菌进行裂解；
步骤5：按压第三预设次数用于控制核酸提纯液的操作腔，使所述核酸提纯液流入细菌捕获腔，以使复合磁性核酸提纯颗粒吸附裂解后的目标细菌的核酸；
步骤6：按压第四预设次数用于控制所述洗涤液的操作腔，使所述洗涤液流入所述细菌捕获腔中，以将细菌捕获腔中未被复合磁性核酸提纯颗粒吸附的物质冲入废液池中；
步骤7：按压第五预设次数用于控制核酸洗脱液的操作腔，使所述核酸洗脱液流入细菌捕获腔，以将纯化后的目标细菌的核酸冲入到扩增池中；
步骤8：使纯化后的目标细菌的核酸在预设温度下进行第一预设时间的扩增反应；
步骤9：按压第六预设次数用于控制扩增试剂的操作腔，使所述扩增后的目标细菌的核酸流入反应池中，以使扩增后的目标细菌的核酸进行第二预设时间的酶切反应；
步骤10：使激发光源在所述反应池形成预设大小的入射光斑后，通过拍照设备透过滤光片并对准反应池进行拍摄，以获取荧光信号图片。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的按压式微流控传感芯片，通过手指按压即可控制检测液路中的液体流动，以完成细菌的检测，而无需外加驱动装置，操作简单，无需专业的技术人员即可进行操作，同时芯片的体积小，试剂用量小，成本低。
(2)本发明中，能够实现将细菌的识别、捕获、裂解、提纯、扩增、信号输出等过程集成在一张芯片上，且无需外加驱动装置，仅需通过手指按压，即可实现液体的反复加入、洗涤等过程，使用智能手机对芯片的信号图像进行实时采集和分析处理，可实现细菌的现场即时检测及分析。
本发明微流控芯片和微流控装置具有检测快速、灵敏度高、效果稳定等优点，适合细菌的现场检测，可推广至食品检测、临床疾病诊断等领域。
附图说明
在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的一个实施例中的按压式微流控芯片的结构示意图；
图2是本发明的一个实施例中的气控单元的控制原理图一(按压状态)；
图3是本发明的一个实施例中的气控单元的控制原理图二(松开状态)；
图4是本发明的一个实施例中的按压式微流控芯片的四个芯片层的示意图；
图5是本发明的一个实施例中的第二芯片层的结构示意图；
图6是本发明的一个实施例中的第四芯片层的结构示意图；
图7是本发明的一个实施例中的微流控装置的盒体的结构示意图；
图8是本发明的一个实施例中的微流控装置的激发光源、滤光片以及拍照设备的示意图；
图9是本发明的一个实施例中的细菌检测方法的流程图；
图10是本发明的一个实施例中的细菌检测原理图。
附图标记：
1、第一芯片层；2、第二芯片层；3、第三芯片层；4、第四芯片层；
10、气控单元；20、检测液路；
101、操作腔；102、第一气控腔；103、第二气控腔；104、平衡腔；
105、第一附加气控腔；106、第二附加气控腔；107、第三附加气控腔；
108、第四附加气控腔；109、防回流气控腔；
201、第一液体通道；202、第一液池；203、第二液池；204、第三液池；
205、第四液池；206、细菌捕获腔；207、废液池；208、扩增池；
209、反应池；210、第二液体通道；211、第三液体通道；2061、加样孔；
2011、第一微阀；2012、驱动室；2013、第二微阀；
2014、第一防回流阻隔微柱；2101、第四附加阀；
2111、第一附加阀；2112、第二附加阀；2113、第三附加阀；
2114、第二防回流阻隔微柱；
5、盒体；6、磁吸单元；7、激发光源；8、滤光片；9、拍照设备。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
如图1-6中所示，根据本发明的第一方面，本发明的按压式微流控芯片包括：芯片本体，芯片本体上设置有用于检测样本中的目标细菌的检测液路20和至少一个用于控制检测液路20内的液体的气控单元10，气控单元10均包括操作腔101和控制腔。其中，按压相应的操作腔101能够改变相应的控制腔内的压力并作用于检测液路20的预设位置上，以控制检测液路20内的液体的流动。
本发明的按压式微流控传感芯片，通过手指按压即可控制检测液路20中的液体流动，以完成细菌的检测，而无需外加驱动装置，操作简单，无需专业的技术人员即可进行操作，同时芯片的体积小，试剂用量小，成本低。
具体地，检测液路20包括与用于与控制腔相配合的第一液体通道201。第一液体通道201包括：依次相连的进液微通道、驱动室2012和出液微通道，进液微通道中设置有处于常开状态的第一微阀2011，出液微通道内设置有处于常闭状态的第二微阀2013。
控制腔包括：与第一微阀2011相配合的第一气控腔102、与驱动室2012相配合的第二气控腔103和与第二微阀2013相配合的平衡腔104，第一气控腔102和第二气控腔103分别与相应的操作腔101相连通，平衡腔104与外界连通。
其中，按压相应的操作腔101能够分别使相应的第一气控腔102和第二气控腔103膨胀，从而第一气控腔102驱动第一微阀2011关闭，第二气控腔103驱动驱动室2012内的液体朝向第二微阀2013流动。并且驱动室2012内的液体朝向第二微阀2013流动时，平衡腔104能够被压缩以使第二微阀2013打开，以使驱动室2012内的液体从出液微通道中流出。
具体地，控制腔与第一液体通道201相邻设置，例如上下相邻设置。其中，控制腔与第一液体通道201之间通过弹性膜层相互分隔。第一微阀2011构造为第一阻隔微柱，第二微阀2013构造为第二阻隔柱，在初始状态(未按压操作腔101)时，第一阻隔微柱与第一气控腔102对应的弹性膜层之间有间隔，使进液微通道与驱动室2012处于连通状态，即第一微阀2011处于常开状态，第二阻隔柱与平衡腔104对应的弹性膜层之间紧密贴合，使驱动室2012与出液微通道之间处于断开状态，即第二微阀2013处于常闭状态。按压操作腔101后，第一气控腔102膨胀，使其对应的弹性膜层与第一阻隔微柱紧密贴合，从而使进液微通道与驱动室2012之间处于断开状态，同时第二气控腔103膨胀，使其对应的弹性膜层发生形变并挤压驱动室2012的空间，从而使驱动室2012内的液体朝向第二微阀2013流动，而由于平衡腔104与外界连通，其对应的弹性膜层受到驱动室2012内流出的液体的压力时，能够朝向平衡腔104的方向形变，与第二阻隔微柱脱离，从而使驱动室2012与出液微通道连通，直至驱动室2012内的液体停止流动，平衡腔104对应的弹性膜层回复至其初始位置，第二微阀2013关闭。当松开该操作腔101后，第一气控腔102内压力减小，其对应的弹性膜层回复至其初始位置，第一微阀2011打开，同时第二气控阀对应弹性膜层也回复至其初始位置，从而将进液微通道内的液体吸入驱动室2012内，直至充满驱动室2012后储存在其中。
其中，操作腔101的截面形状可以设计为圆形，其直径可以是10mm-15mm；控制腔的截面形状可以设置为圆形或正方形，其尺寸与其对应的第一液体通道201的相应位置处的尺寸相匹配。
具体地，第一气控腔102和第二气控腔103分别通过相应的气体微通道与其对应的操作腔101相连通，气体微通道的宽深比可以是1-3，优选地，气体微通道的宽度为200μm，深度为50μm-150μm。
在一个实施例中，检测液路20包括：用于加入预处理试剂的液池、用于加入样本并捕获样本中的目标细菌的细菌捕获腔206、用于加入扩增试剂以进行细菌扩增的扩增池208、用于加入酶切反应试剂以进行酶切反应的反应池209和用于回收废液的废液池207。
其中，液池包括：用于加入洗涤液的第一液池202、用于加入细菌裂解液的第二液池203，用于加入核酸纯化液的第三液池204和用于加入核酸洗脱液的第四液池205。
第一液池202、第二液池203、第三液池204和第四液池205分别通过相应的第一液体通道201与细菌捕获腔206的进液端相连细菌捕获腔206的出液端通过第二液体通道210与废液池207相连，细菌捕获腔206的出液端通过第三液体通道211与扩增池208的进液端相连，扩增池208的出液端通过相应的第一液体通道201与反应池209相连。
同时，第一液池202、第二液池203、第三液池204、第四液池205和扩增池208分别对应设置一个气控单元10。
本实施例中，能够实现将细菌的识别、捕获、裂解、提纯、扩增、信号输出等过程集成在一张芯片上，且无需外加电源等驱动设备，仅需通过手指按压，即可实现液体的反复加入、洗涤等过程。
具体地，整个芯片的尺寸可以设计为8cm×5cm。四个液池的尺寸分别与其载入的试剂的体积相匹配，例如，液池的直径在3mm-10mm的范围内。与四个液池相连的第一液体通道201中，驱动室2012的直径小于液池的直径，例如驱动室2012的直径为2mm-8mm，进液微通道和出液微通道的宽深比均可以是1-4，优选地，进液微通道和出液微通道的宽度均可以是300μm，深度均可以是50μm-150μm。同时，进液微通道内的第一阻隔微柱以及出液微通道内的第二阻隔微柱的尺寸应与其所在的微通道的尺寸相匹配，以达到阻断液体的目的。
进一步地，细菌捕获腔206上设置有加样孔2061，以用于加入样本和复合磁性核酸提纯颗粒等物质，且加样结束后可以通过聚丙烯酰胺柱封闭加样孔2061。
进一步地，上述反应池209为Cas-12a酶反应池209，即上述的酶切反应试剂为Cas-12a酶切反应试剂。
优选地，第三液体通道211内设置有处于常开状态的第一附加阀2111、第二附加阀2112和第三附加阀2113，第二液体通道210内设置有一个处于常开状态的第四附加阀2101。相应地，用于控制洗涤液的气控单元10还包括与第一附加阀2111相配的第一附加气控腔105；用于控制细菌裂解液的气控单元10还包括与第二附加阀2112相配的第二附加气控腔106；用于控制核酸纯化液的气控单元10还包括与第三附加阀2113相配的第三附加气控腔107；用于控制核酸洗脱液的气控单元10还包括与第四附加阀2101相配的第四附加气控腔108。
其中，分别按压用于控制洗涤液、细菌裂解液、核酸纯化液或者核酸洗脱液的操作腔101，能够分别使相应的第一附加开关腔、第二附加开关腔、第三附加开关腔或者第四附加开关腔膨胀，从而驱动相应的第一附加阀2111、第二附加阀2112、第三附加阀2113或者第四附加阀2101关闭。
换言之，本实施例中预处理试剂包括洗涤液、细菌裂解液、核酸纯化液和核酸洗脱液四种液体，其中，洗涤液用于洗涤液、细菌裂解液、核酸纯化液三种液体进入细菌捕获腔206内对样本进行相应的处理后，多余的液体需要排入废液池207中，并且，而核酸洗脱液用于将细菌捕获腔206内的提纯后的细菌核酸充入至扩增池208中。因此，通过在第三液体通道211和第四液体通道内分别设置相应的附加开关阀，可以控制相应的预处理试剂的流向。
在一个实施例中，液池与细菌捕获腔206之间的第一液体通道201的出口端均设有第一防回流结构，以防止细菌捕获腔206中的液体回流至相应的液池中。第三液体通道211中设置有第二防回流结构，以防止扩增池208中的液体回流至细菌捕获腔206中。
具体地，第一防回流结构为第一防回流阻隔微柱2014。其中，四个液池与细菌捕获腔206之间的四个第一液体通道201的出口端(即出液微微通道中)中均分别设置有三个间隔的第一防护回流阻隔微柱。每个第一防回流阻隔微柱2014的一侧(例如上侧)分别对应设置一个防回流气控腔109，每个液池的气控单元10的操作腔101分别与其他三个液池的第一液体通道201中的一个第一防回流阻隔微柱2014对应的防回流气控腔109相连通。
这样，按压控制其中一个液池的操作腔101，其它三个液池对应的第一液体通道201的出口端中第一防回流阻隔微柱2014被其对应的防回流气控腔109关闭，从而能够防止细菌捕获腔206中的液体回流至其它三个液池中。例如，按压控制第一液池202的操作腔101时，第一液池202中的液体流入细菌捕获腔206中，同时与该操作腔101相连通的防回流气控腔109膨胀，从而驱动其它三个液池(第二液池203、第三液池204和第四液池205)对应的第一液体通道201的出口端中的第一防回流阻隔柱将其所在的通道关闭，从而防止细菌捕获腔206中的液体回流至第二液池203、第三液池204、第四液池205中。同理可知分别按压控制其它三个液池的操作腔101时的防回流原理。
具体地，第二防回流结构为第二防回流阻隔微柱2114。其中，第三液体通道211中设置有一个第二防回流阻隔微柱2114，第二防回流阻隔微柱2114的一侧(例如上侧)对应设置一个防回流气控腔109，该防回流气控腔109与扩增池208的气控单元10的操作腔101相连通。这样，按压控制扩增池208的操作腔101，第三液体通道211中的第二防回流阻隔微柱2114被其对应的防回流气控腔109关闭，从而能够扩增池208中的液体回流至细菌捕获腔206中。
在一个实施例中，芯片本体包括依次层叠设置的第一芯片层1、第二芯片层2、第三芯片层3和第四芯片层4。其中，第一芯片层1与第二芯片层2之间形成操作腔101，第二芯片层2与第三芯片层3之间形成控制腔，第三芯片层3与第四芯片层4之间至少形成检测液路20，第三芯片层3为弹性薄膜。其中，按压相应的操作腔101能够改变相应控制腔内的压力并引起第三芯片层3发生弹性形变，从而控制检测液路20内的液体的流动。
换言之，第二芯片层2为用于设置气控单元10的气路芯片层，第四芯片层4为用于设置检测液路20的液路芯片层，气路芯片层与液路芯片层之间设置弹性薄膜层，从而使气控单元10通过改变其内部的压力并引起弹性薄膜层的弹性形变，以实现对检测液路20中液体(流向)的控制。第一芯片层1为覆盖芯片层，位于芯片本体的最上层，其用于与第二芯片层2之间形成操作腔101，以便于操作人员按压操作腔101。
下面具体说明上述按压式微流控芯片的设计和制作。
其中，各芯层的制作材料均为聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，简称PDMS)与引发剂。第一芯片层1、第二芯片层2和第四芯片层4中，PDMS与引发剂比例为10：1至5：1；第三芯片层3中，PDMS与引发剂比例为20：1。第一芯片层1、第二芯片层2和第四芯片层4通过标准的软光刻技术进行制作。
如图6所示，第四芯片层4(液路芯片层)上设计有细菌捕获腔206、加样孔2061、四个液池、废液池207、扩增池208、反应池209，以及五个第一液体通道201、一个第二液体通道210和一个第三液体通道211，以及液体通道中的相应的阻隔微柱。其中，第四芯片层4通过分别甩胶SU8-2005和SU8-2050，分别曝光制作具有阻隔微柱的液路芯片层。
如图5所示，第二芯片层2(气路芯片层)上设计有五个气控单元10，操作腔101、平衡腔104、第一气控腔102、第二气控腔103，第一气控腔102和第二气控腔103分别通过气体微通道与操作腔101相连通。第二芯片层2上的操作腔101、平衡腔104、第一气控腔102和第二气控腔103处也相应的开孔。同时，第二芯片层2与第四芯片层4的细菌捕获腔206、加样孔2061、四个液池、废液池207、扩增池208、反应池209相对应的位置处开孔设置，以将上述结构露出。
第一芯片层1(覆盖芯片层)的厚度为2mm，无微通道。第一芯片层1在与第四芯片层4的加样孔2061、四个液池、废液池207、扩增池208、酶反应池209以及第二芯片层2上的平衡腔104相对应的位置处，直接使用尺寸相匹配的打孔器开孔以使上述结构露出，如图4所示。
第三芯片层3的厚度为30-100μm，无微通道。将PDMS和引发剂混合均匀后，置于甩胶机上1500rpm旋涂60s，150℃温度下晾干10min后撕下。同样的，第三芯片层3在与第四芯片层4相对应的加样孔2061、四个液池、废液池207、扩增池208、酶反应池209以及与第二芯片层2上的平衡腔104相对应的位置处，直接使用尺寸相匹配的打孔器开孔以使上述结构露出，如图4所示。
具体地，上述按压微流控芯片的制作方法，包括以下步骤：
分别制作第一芯片层1、第二芯片层2、第三芯片层3以及第四芯片层4。
将第三芯片层3与第四芯片层4等离子体氧化1min后，放入烘箱中，在75℃下进行键合20min，使两者之间形成检测液路20，并形成上芯片层。
同时，将第二芯片层2和第一芯片层1等离子体氧化1min后，放入烘箱中，在75℃下进行键合20min，使两者之间形成操作腔101，并形成下芯片层。
将上芯片层与下芯片层等离子体氧化1min后，放入烘箱中，在75℃进行键合20min，使两者之间形成控制腔和气控微通道，最终形成四层结构的手指按压微流控传感芯片。其中，键合时，上芯片层的第二芯片层2与下芯片层的第三芯片层3相邻。
如图7-8中所示，根据本发明的第二方面，本发明的微流控装置，包括盒体5、磁吸单元6、激发光源7、拍照设备9和上述的按压式微流控芯片。
其中，磁吸单元6、激发光源7和按压式微流控芯片均设置在盒体5内，磁吸单元6设置在按压式微流控芯片的下方，激发光源7位于按压式微流控芯片的上方，拍照设备9可拆卸地设置在盒体5的顶部以拍摄荧光图像。
具体地，盒体5的顶部设置有拍照孔，拍照孔中设置有滤光片8，拍照设备9透过滤光片8拍摄荧光图像。滤光片8的滤光波段为520±15nm。拍照孔的为1cm×0.6cm的椭圆形孔。
其中，激发光源7为LED灯或导光板等。优选地，激发光源7为由电池驱动的LED灯，功率5W，聚光角度15°，发射波长462nm，激发光源7能够在按压式微流芯片的反应池209处形成直径大于1cm的入射光斑。
进一步具体地，上述盒体5为空心无盖长方体，可采用3D打印制作，材料为PLA。优选地，盒体5的长度为155mm，宽度为75mm，高度为65mm，厚度为2mm。盒体5的内部设有用于安装激发光源7的光源座、纽扣电池座、电源开关、用于安装磁吸单元6的磁吸槽以及用于安装压式微流控芯片的芯片槽。
具体地，磁性单元为高强度磁铁，可嵌入磁吸槽中。
盒体5的顶部边缘设有高为1cm的围堰，用于固定拍照设备9。其中，拍照设备9可以是照相机、手机或者平板电脑的任一种。优选地，拍照设备9选用智能手机，具体地，智能手机的手机像素建议不低于800万像素，以保证能够拍摄清晰的图像。使用时，将手机放置在盒体5顶部的围堰中，并且使手机的摄像头位于拍照孔中以对准反应池209，具体地，摄像头与反应池209的成像焦大约为6.2cm。
根据本发明的第三方面，如图10中所示，本发明的细菌检测方法，采用上述的按压式微流控芯片或者上述的微流控装置对样本进行细菌检测，包括：在检测液路20的相应位置处分别加入预处理试剂、扩增试剂、反应试剂和样本；通过分别按压相应的操作腔101，依次控制预处理试剂与样本混合以获得目标细菌的核酸，控制获得的目标细菌的核酸与扩增试剂混合以进行扩增，以及控制扩增后的目标细菌的核酸与反应试剂混合以进行反应。
本发明细菌检测方法，采用上述的按压式微流控传感芯片，通过手指按压即可控制检测液路20中的液体流动，以完成细菌的检测，而无需外加驱动装置，操作简单，无需专业的技术人员即可进行操作，同时芯片的体积小，试剂用量小，成本低。
如图9中所示，上述细菌检测方法具体包括以下步骤：
步骤1：在按压式微流控芯片的细菌捕获腔206中加入复合磁性核酸提纯颗粒和磁性纳米颗粒后将细菌捕获腔206封闭，在按压式微流控芯片的扩增池208中加入目标细菌的扩增试剂，在按压式微流控芯片的反应池209中加入酶切反应试剂。
步骤1为试剂预载的步骤。其中，磁性纳米颗粒为抗体修饰的磁性纳米颗粒，其粒径在100μm-300μm的范围内，用于目标细菌的捕获；复合磁性核酸提纯颗粒为磁性颗粒包裹的二氧化硅颗粒，其粒径在500μm-1000μm的范围内，用于细菌裂解后的核酸提纯。具体地，复合磁性核酸提纯颗粒和磁性纳米颗粒通过加样孔2061加入到细菌捕获腔206中，加样结束后通过聚丙烯酰胺柱堵住加样孔2061以封闭细菌捕获腔206。
扩增试剂为RPA扩增试剂，酶切反应试剂为Cas12a酶切反应试剂。扩增试剂和酶切反应试剂均可采用冻干技术预埋到扩增池208和酶反应池209中。或者，扩增试剂和酶切反应试剂也可以使用玻璃纤维分别浸润到相应的试剂溶液中，取出晾干后，采用打孔器打孔后放置到对应的扩增池208和反应池209中。
步骤2：打开细菌捕获腔206，并在细菌捕获腔206中加入样本后将其封闭，同时，在按压式微流控芯片的第一液池202中加入洗涤液，在第二液池203加入细菌裂解液，在第三液池204中加入核酸纯化液，以及在第四液池205中加入核酸洗脱液。
步骤2为加样步骤，具体地打开加样孔2061处的聚丙烯酰胺柱，以将细菌样品加入至细菌捕获腔206中，随后在加样孔2061处堵上聚丙烯酰胺柱，以进行目标细菌的抗体免疫识别和捕获。
步骤3：按压第一预设次数用于控制洗涤液的操作腔101，使洗涤液流入细菌捕获腔206中，以将样本中未被磁性纳米颗粒捕获的其它物质冲入废液池207中。
步骤4：按压第二预设次数用于控制裂解液的操作腔101，使裂解液流入细菌捕获腔206中，以将捕获的目标细菌进行裂解。
步骤3和步骤4为细菌裂解的步骤。其中，步骤3中，第一预设次数为4次-30次；步骤4中，第二预设次数为3次-30次。
步骤5：按压第三预设次数用于控制核酸提纯液的操作腔101，使核酸提纯液流入细菌捕获腔206，以使复合磁性核酸提纯颗粒吸附裂解后的目标细菌的核酸。
步骤6：按压第四预设次数用于控制洗涤液的操作腔101，使洗涤液流入细菌捕获腔206中，以将细菌捕获腔206中未被复合磁性核酸提纯颗粒吸附的物质冲入废液池207中。
步骤5和步骤6为核酸纯化的步骤。其中，步骤5中，第三预设次数为4次-30次；步骤6中，第四预设次数为4次-30次。具体地，带正电的复合磁性核酸提纯颗粒吸附裂解后的目标细菌的核酸，其余杂质通过洗涤液冲入废液池207中。
步骤7：按压第五预设次数用于控制核酸洗脱液的操作腔101，使核酸洗脱液流入细菌捕获腔206，以将纯化后的目标细菌的核酸冲入到扩增池208中。
步骤7为核酸洗脱的步骤。步骤7中，第五预设次数为4次-30次。
步骤8：使纯化后的目标细菌的核酸在预设温度下进行第一预设时间的扩增反应。
步骤8为RPA扩增(重组酶聚合酶扩增)的步骤。其中，预设温度为室温，第一预设时间为15min-30min。
步骤9：按压第六预设次数用于控制扩增试剂的操作腔101，使扩增后的目标细菌的核酸流入反应池209中，以使扩增后的目标细菌的核酸进行第二预设时间的酶切反应。
步骤9为Cas12a酶切反应的步骤，RPA扩增后的产物通入到反应池209中，进行酶切反应，经过第二预设时间后，可进行信号读取。其中，第六预设次数为3次-30次，第二预设时间为15min-30min。
步骤10：使激发光源7在反应池209形成预设大小的入射光斑后，通过拍照设备9透过滤光片8并对准反应池209进行拍摄，以获取荧光信号图片。
步骤10为荧光信号读取与处理的步骤。具体地，打开微流控装置的激发光源7的开关，用智能手机对准反应池209进行拍照，以获取荧光信号图片。
之后，可利用自编程序、Image J软件或自编手机APP，对荧光图像提取RGB值，计算G值的变化，制作其与细菌浓度拟合曲线，进行细菌定量分析，并得到检出限。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本实施例中提到的“上”、“下”等描述是按照通常的意义而定义的，比如，参考重力的方向定义，重力的方向是下方，相反的方向是上方，类似地在上方的是顶部或者顶端，在下方的是底部或底端，也仅为便于叙述明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，也当视为本发明可实施的范畴，实施例中所述的“第一”、“第二”、“第三”、“第四”同样是为了方便叙述而定义的。
虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (11)

1.一种按压式微流控芯片，其特征在于，包括：芯片本体，所述芯片本体上设置有用于检测样本中的目标细菌的检测液路和至少一个用于控制所述检测液路内的液体的气控单元，
所述气控单元均包括操作腔和控制腔，
其中，按压相应的所述操作腔能够改变相应的所述控制腔内的压力并作用于所述检测液路的预设位置上，以控制所述检测液路内的液体的流动。
2.根据权利要求1所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述检测液路包括：用于与所述控制腔相配合的第一液体通道，
所述第一液体通道包括：依次相连的进液微通道、驱动室和出液微通道，所述进液微通道中设置有处于常开状态的第一微阀，所述出液微通道内设置有处于常闭状态的第二微阀；
所述控制腔包括：与第一微阀相配合的第一气控腔、与所述驱动室相配合的第二气控腔和与所述第二微阀相配合的平衡腔，所述第一气控腔和所述第二气控腔分别与相应的所述操作腔相连通，所述平衡腔与外界连通；
其中，按压相应的所述操作腔能够分别使相应的所述第一气控腔和所述第二气控腔膨胀，从而所述第一气控腔驱动所述第一微阀关闭，所述第二气控腔驱动所述驱动室内的液体朝向所述第二微阀流动；
并且所述驱动室内的液体朝向所述第二微阀流动时，所述平衡腔能够被压缩以使所述第二微阀打开，以使所述驱动室内的液体从所述出液微通道中流出。
3.根据权利要求2所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述检测液路包括：用于加入预处理试剂的液池、用于加入样本并捕获所述样本中的目标细菌的细菌捕获腔、用于加入扩增试剂以进行细菌扩增的扩增池、用于加入酶切反应试剂以进行酶切反应的反应池和用于回收废液的废液池，
所述液池包括：用于加入洗涤液的第一液池、用于加入细菌裂解液的第二液池，用于加入核酸纯化液的第三液池和用于加入核酸洗脱液的第四液池，
所述第一液池、所述第二液池、所述第三液池和所述第四液池分别通过相应的所述第一液体通道与所述细菌捕获腔的进液端相连所述细菌捕获腔的出液端通过第二液体通道与所述废液池相连，所述细菌捕获腔的出液端通过第三液体通道与所述扩增池的进液端相连，所述扩增池的出液端通过相应的所述第一液体通道与所述反应池相连，
所述第一液池、所述第二液池、所述第三液池、所述第四液池和所述扩增池分别对应设置一个所述气控单元。
4.根据权利要求3所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述第三液体通道内设置有处于常开状态的第一附加阀、第二附加阀和第三附加阀，所述第二液体通道内设置有一个处于常开状态的第四附加阀，
用于控制所述洗涤液的气控单元还包括与所述第一附加阀相配的第一附加气控腔；用于控制所述细菌裂解液的气控单元还包括与所述第二附加阀相配的第二附加气控腔；用于控制所述核酸纯化液的气控单元还包括与所述第三附加阀相配的第三附加气控腔；用于控制所述核酸洗脱液的气控单元还包括与所述第四附加阀相配的第四附加气控腔，
其中，分别按压用于控制所述洗涤液、所述细菌裂解液、所述核酸纯化液或者所述核酸洗脱液的操作腔，能够分别使相应的所述第一附加开关腔、所述第二附加开关腔、所述第三附加开关腔或者所述第四附加开关腔膨胀，从而驱动相应的第一附加阀、第二附加阀、第三附加阀或者第四附加阀关闭。
5.根据权利要求3或4所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述液池与所述细菌捕获腔之间的所述第一液体通道的出口端均设有第一防回流结构，以防止所述细菌捕获腔中的液体回流至相应的所述液池中。
6.根据权利要求3或4所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述第三液体通道中设置有第二防回流结构，以防止所述扩增池中的液体回流至所述细菌捕获腔中。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的按压式微流控芯片，其特征在于，所述芯片本体包括依次层叠设置的第一芯片层、第二芯片层、第三芯片层和第四芯片层，
其中，所述第一芯片层与所述第二芯片层之间形成所述操作腔，所述第二芯片层与所述第三芯片层之间形成所述控制腔，所述第三芯片层与所述第四芯片层之间至少形成所述检测液路，所述第三芯片层为弹性薄膜，
其中，按压相应的所述操作腔能够改变相应的所述控制腔内的压力并引起所述第三芯片层发生弹性形变，从而控制所述检测液路内的液体的流动。
8.一种微流控装置，其特征在于，包括盒体、磁吸单元、激发光源、拍照设备和权利要求1-7中任一项所述的按压式微流控芯片，
其中，所述磁吸单元、所述激发光源和所述按压式微流控芯片均设置在所述盒体内，所述磁吸单元设置在所述按压式微流控芯片的下方，所述激发光源位于所述按压式微流控芯片的上方，所述拍照设备可拆卸地设置在所述盒体的顶部以拍摄荧光图像。
9.根据权利要求8所述的微流控装置，其特征在于，所述盒体的顶部设置有拍照孔，所述拍照孔中设置有滤光片，所述拍照设备透过所述滤光片拍摄荧光图像。
10.一种细菌检测方法，采用权利要求1-7中任一项所述的按压式微流控芯片或者权利要求8或9所述的微流控装置对样本进行细菌检测，其特征在于，包括：
在检测液路的相应位置处分别加入预处理试剂、扩增试剂、反应试剂和样本；
通过分别按压相应的操作腔，依次控制预处理试剂与样本混合以获得目标细菌的核酸，控制获得的目标细菌的核酸与扩增试剂混合以进行扩增，以及控制扩增后的目标细菌的核酸与反应试剂混合以进行反应。
11.根据权利要求10所述的一种细菌检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1：在按压式微流控芯片的细菌捕获腔中加入复合磁性核酸提纯颗粒和磁性纳米颗粒后将所述细菌捕获腔封闭，在按压式微流控芯片的扩增池中加入目标细菌的扩增试剂，在按压式微流控芯片的反应池中加入酶切反应试剂；
步骤2：打开所述细菌捕获腔，并在所述细菌捕获腔中加入样本后将其封闭，同时，在按压式微流控芯片的第一液池中加入洗涤液，在第二液池加入细菌裂解液，在第三液池中加入核酸纯化液，以及在第四液池中加入核酸洗脱液；
步骤3：按压第一预设次数用于控制所述洗涤液的操作腔，使所述洗涤液流入所述细菌捕获腔中，以将样本中未被所述磁性纳米颗粒捕获的其它物质冲入废液池中；
步骤4：按压第二预设次数用于控制所述裂解液的操作腔，使所述裂解液流入所述细菌捕获腔中，以将捕获的目标细菌进行裂解；
步骤5：按压第三预设次数用于控制核酸提纯液的操作腔，使所述核酸提纯液流入细菌捕获腔，以使复合磁性核酸提纯颗粒吸附裂解后的目标细菌的核酸；
步骤6：按压第四预设次数用于控制所述洗涤液的操作腔，使所述洗涤液流入所述细菌捕获腔中，以将细菌捕获腔中未被复合磁性核酸提纯颗粒吸附的物质冲入废液池中；
步骤7：按压第五预设次数用于控制核酸洗脱液的操作腔，使所述核酸洗脱液流入细菌捕获腔，以将纯化后的目标细菌的核酸冲入到扩增池中；
步骤8：使纯化后的目标细菌的核酸在预设温度下进行第一预设时间的扩增反应；
步骤9：按压第六预设次数用于控制扩增试剂的操作腔，使所述扩增后的目标细菌的核酸流入反应池中，以使扩增后的目标细菌的核酸进行第二预设时间的酶切反应；
步骤10：使激发光源在所述反应池形成预设大小的入射光斑后，通过拍照设备透过滤光片并对准反应池进行拍摄，以获取荧光信号图片。
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