CN209327360U - 基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，包括紧密叠合的微流控基片和微流控盖片，微流控基片的上表面沿样本流动方向依次间隔设有荧光标记区和检测区，微流控盖片的下表面开设有微通道，微通道的一侧设有废液槽，另一侧沿样本流动方向依次开设有上下贯通微流控盖片的缓冲液加样孔和样本加样孔，缓冲液加样孔和样本加样孔均与微通道相连通，废液槽的顶部设有连通废液槽与外界的通孔，微流控基片和微流控盖片紧密叠合时，荧光标记区和检测区均位于微通道内。本实用新型在提供简化的全血样本加样同时，能够保证高灵敏度及快速、准确的检测目的。

Description

基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片

技术领域

本实用新型属于体外诊断与免疫检测技术领域，尤其是涉及基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片。

背景技术

微流控芯片能把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等一系列基本操作单元整合到一个微米尺寸的芯片上，通过微通道形成的网络实现对生物样品的低量、高灵敏与快速分离分析。

目前微流控的创新多集中于分离、检测体系方面；对芯片上如何引入实际样品分析的诸多问题，如样品引入、换样、前处理等有关研究还十分薄弱。在微流控样本预处理方面，绝大部分研究与实用新型仅仅是采用微流控技术和原理构建全血过滤或者血浆提取的装置，借助外力机械作用实现血浆的分离与提取。在微流控检测方面，一般需要传统的离心处理方式获得血浆作为样本，然后加到微流控芯片上实现检测。以上两种方式均将微流控的样本预处理与检测功能分裂开来，不能在一张微流控芯片上实现全血样本分离与检测的一体化，不利于微流控芯片实现自动化的检测，同时也不能满足现场快速检验(point-of-care testing，POCT)简单、快速、高效等特点的检测要求。

在传统的微流控芯片上加滤血膜的方式虽然实现血浆与检测的一体化，但滤血膜对样本的损耗也非常可观，通常需要加入较高的全血样本量(大于200μL)才能够达到灵敏度要求，同时此方法分离血浆时间较长，同样不利于POCT现场实时检测的特点，降低了临床患者的体验和应用度。

实用新型内容

有鉴于此，本实用新型旨在提出基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，以解决现有微流控芯片应用过程中存在的样本处理与检测分开以及芯片上常规的滤血装置使得样本用量大，时间长的问题，该微流控芯片提供了一种基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片装置及检测方法，在提供简化的全血样本加样同时，能够保证高灵敏度及快速、准确的检测目的。

为达到上述目的，本实用新型的技术方案是这样实现的：

一种基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，包括紧密叠合的微流控基片和微流控盖片，微流控基片的上表面沿样本流动方向依次间隔设有荧光标记区和检测区，检测区包括包被在微流控基片上的检测位点T和质控位点C，微流控盖片的下表面开设有微通道，微通道的一侧设有废液槽，另一侧沿样本流动方向依次开设有上下贯通微流控盖片的缓冲液加样孔和样本加样孔，缓冲液加样孔和样本加样孔均与微通道相连通，废液槽的顶部设有连通废液槽与外界的通孔，微流控基片和微流控盖片紧密叠合时，荧光标记区和检测区均位于微通道内。

进一步的，微流控基片的材质为聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种。

进一步的，检测区包括沿样本流动方向依次包被在微流控基片上的检测位点T和质控位点C。

进一步的，检测区包括沿样本流动方向依次包被在微流控基片上的第一检测位点T、第二检测位点T、第一质控位点C和第二质控位点C。

进一步的，第一检测位点T为NT-proBNP检测位点，第二检测位点T为BNP检测位点，第一质控位点C为NT-proBNP质控位点，第二质控位点C为BNP质控位点

进一步的，荧光标记区固定干燥有待检测项目的荧光标记抗体，检测位点T包被干燥有配对抗体，质控位点C包被干燥有偶联重组抗原的配对抗体。

进一步的，荧光标记区固定干燥有BNP及NT-proBNP荧光标记抗体的混合物，第一检测位点T包被干燥有NT-proBNP配对抗体，第二检测位点T包被干燥有BNP配对抗体，第一质控位点C包被干燥有偶联NT-proBNP重组抗原的配对抗体，第二质控位点C包被干燥有偶联BNP重组抗原的配对抗体。

进一步的，微通道包括宽度较大的宽部和宽度较小的窄部，宽部和窄部之间设有向外侧凸起的弧形连接部，样本加样孔靠近弧形连接部，缓冲液加样孔位于宽部，样本加样孔处的微通道的宽度小于缓冲液加样孔处的微通道的宽度。

采用上述技术方案，全血样本有向废液槽流动的趋势，避免全血样本从样本加样孔倒流至缓冲液加样孔。

进一步的，样本加样孔和缓冲液加样孔之间的间距为10-20mm。

进一步的，样本加样孔和缓冲液加样孔之间设有若干排第一柱形凸起，第一柱形凸起呈圆柱体状，第一柱形凸起的数目沿样本的流动方向逐渐减少，第一柱形凸起的底端与微流控盖片的下表面相齐平。

采用上述技术方案，防止全血样本从样本加样孔倒流至缓冲液加样孔。

进一步的，靠近样本加样孔的微通道的内部两侧设有第二柱形凸起，第二柱形凸起呈圆柱体状，第二柱形凸起上固定包被有红细胞单抗，第二柱形凸起的底端与微流控盖片的下表面相齐平。

采用上述技术方案，当全血样本加入到样本加样孔时，血液中的部分红细胞能够被红细胞单抗特异性捕获并固定，能够分流一部分红细胞进入微通道内，同时红细胞捕获并固定的位置于微通道两侧，不容易造成微通道堵塞。

进一步的，缓冲液加样孔与第一柱形凸起之间的微通道内壁设有若干引流片，引流片呈长方形，平行于微通道，引流片的底端与微流控盖片的下表面相齐平。

采用上述技术方案，当稀释液加入到缓冲液加样孔后，可以迅速引流稀释液前行。

上述基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：

S1：在样本加样孔的位置处，加入全血样本，全血样本在微通道的毛细作用下依次流经微通道内的荧光标记区、检测区、最终到达废液槽；

S2：在缓冲液加样孔的位置处，加入缓冲液，缓冲液在微通道的毛细作用下依次流经微通道内的荧光标记区、检测区、最终到达废液槽；

S3：通过配套仪器检测检测位点T和质控位点C的荧光信号强度并计算检测位点T/质控位点C的比值，对于二联测项目的检测，第一检测位点T/第一质控位点C、第二检测位点T/第二质控位点C，根据以荧光信号比值为纵坐标、以配制的系列质控品浓度为横坐标绘制的标准曲线，最终得到全血样本的检测指标的浓度。

进一步的，废液槽的容积为40-50μL，全血样本的加样量为10μL-20μL，缓冲液的加样量为废液槽的容积减去全血样本的加样量体积且缓冲液的加样量不少于30μL。

进一步的，全血样本从加入样本加样孔到流入废液槽所需最长时间为2min，缓冲液从加入缓冲液加样孔到流入废液槽所需最长时间为4min。

相对于现有技术，本实用新型所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片具有以下优势：

(1)本实用新型在微流控芯片上实现了全血检测，可以用于一种或多种临床生化指标检测；

(2)本实用新型的结构设计和加样方式将样本预处理与检测集中在一张微流控芯片卡上，提高了自动化检测效率，拓展了临床样本使用范围，更加便于临床应用；

(3)本实用新型通过两步加样的方式，在能够达到检测灵敏度的同时，还极大的减少了样本使用量，同时也降低了检测背景干扰，提高了检测的准确度和精密度；

(4)本实用新型通过两步加样的方式，整个检测时间只需6min，更加适用于POCT检测的需求。

附图说明

构成本实用新型的一部分的附图用来提供对本实用新型的进一步理解，本实用新型的示意性实施例及其说明用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的不当限定。在附图中：

图1为本实施例所述的微流控基片结构示意图；

图2为本实施例所述的微流控盖片结构示意图。

附图标记说明：

1、微流控基片；11、荧光标记区；12、检测区；121、第一检测位点T；122、第一质控位点C；123、第二检测位点T；124、第二质控位点C；2、微流控盖片；21、微通道；211、宽部；212、窄部；213、弧形连接部；22、废液槽；221、通孔；23、样本加样孔；24、缓冲液加样孔；25、第一柱形凸起；26、第二柱形凸起；27、引流片。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本实用新型中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本实用新型的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本实用新型的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。

下面结合实施例及附图来详细说明本实用新型。

一种基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，结合图1和图2所示，包括紧密叠合的微流控基片1和微流控盖片2。微流控基片1的材质为聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种。如图1所示，微流控基片1的上表面沿样本流动方向依次间隔设有荧光标记区11和检测区12。

如图2所示，微流控盖片2的下表面开设有微通道21。微通道21的一侧设有废液槽22，另一侧沿样本流动方向依次开设有上下贯通微流控盖片2的缓冲液加样孔24和样本加样孔23，缓冲液加样孔24和样本加样孔23均与微通道21相连通，废液槽22的顶部设有连通废液槽22与外界的通孔221。微流控基片1和微流控盖片2紧密叠合时，荧光标记区11和检测区12均位于微通道21内。

微通道21包括宽度较大的宽部211和宽度较小的窄部212，宽部211和窄部212之间设有向外侧凸起的弧形连接部213，弧形连接部213圆滑连接宽部211和窄部212。样本加样孔23靠近弧形连接部213，缓冲液加样孔24位于宽部211，样本加样孔23和缓冲液加样孔24之间的间距为10-20mm，样本加样孔23处的微通道21的宽度小于缓冲液加样孔24处的微通道21的宽度。

此外，样本加样孔23和缓冲液加样孔24之间设有若干排第一柱形凸起25，第一柱形凸起25的数目沿样本的流动方向逐渐减少，第一柱形凸起25的底端与微流控盖片2的下表面相齐平。

靠近样本加样孔23的微通道21的内部两侧设有第二柱形凸起26，第二柱形凸起26上固定包被有红细胞单抗，第二柱形凸起26的底端与微流控盖片2的下表面相齐平。

缓冲液加样孔24与第一柱形凸起25之间的微通道21内壁设有若干引流片27，引流片27呈长方形，平行于微通道21，引流片27的底端与微流控盖片2的下表面相齐平。

下面采用上述微流控芯片进行BNP及NT-proBNP的二联测：

检测区包括沿样本流动方向依次包被在微流控基片上的第一检测位点T121、第二检测位点T123、第一质控位点C122和第二质控位点C124。荧光标记区11固定干燥有BNP及NT-proBNP荧光标记抗体的混合物，第一检测位点T121包被干燥有NT-proBNP配对抗体，第二检测位点T123包被干燥有BNP配对抗体，第一质控位点C122包被干燥有偶联NT-proBNP重组抗原的配对抗体，第二质控位点C124包被干燥有偶联BNP重组抗原的配对抗体。

检测包括以下步骤：

S1：在样本加样孔23的位置处，加入全血样本，全血样本在微通道21的毛细作用下依次流经微通道21内的荧光标记区11、检测区12、最终到达废液槽22，流经荧光标记区11时溶解包被在荧光标记区11的荧光混合标记抗体，全血样本中的抗原与荧光混合标记抗体反应结合形成荧光复合物，流经检测区12时，荧光复合物分别与第一检测位点T121、第二检测位点T123、第一质控位点C122和第二质控位点C124进行特异性的免疫反应；

S2：在缓冲液加样孔24的位置处，加入缓冲液，缓冲液在微通道21的毛细作用下依次流经微通道21内的荧光标记区11、检测区12、最终到达废液槽22，以冲洗样本加样孔23内及微通道21内的残留的红细胞、杂蛋白，降低背景干扰；

S3：通过配套仪器检测分别检测第一检测位点T121、第二检测位点T123、第一质控位点C122和第二质控位点C124的荧光信号强度并分别计算第一检测位点T121的荧光信号强度/第一质控位点C122的荧光信号强度、第二检测位点T123的荧光信号强度/第二质控位点C124的荧光信号强度，根据以BNP及NT-proBNP各自的荧光信号比值为纵坐标、以配制的系列质控品浓度为横坐标绘制的标准曲线，最终得到全血样本中各检测指标的浓度。

步骤S3中，用信号比值作为纵坐标可以减小芯片的系统误差以及样本带来的基质影响。废液槽22的容积为40-50μL，全血样本的加样量为10μL-20μL，缓冲液的加样量为废液槽22的容积减去全血样本的加样量体积且缓冲液的加样量不少于30μL。

全血样本从加入样本加样孔23到流入废液槽22所需最长时间为2min，缓冲液从加入缓冲液加样孔24到流入废液槽22所需最长时间为4min。

下面通过实验探索合适的全血样本的加样量的范围，为了方便验证，以单指标NT-proBNP定量检测为例进行试验。具体如下：

1、材料准备

带有双加样孔的NT-proBNP微流控芯片，天津中新科炬生物制药公司生产；

全血样本以及EDTA临床血浆样本，血浆样本中NT-proBNP浓度均为300pg/mL(临床Cut Off值)；

荧光免疫分析仪(FREND system)，韩国NanoEntek公司生产。

2、方法

在上述微流控芯片的样本加样孔23中加入35μL EDTA临床血浆样本作为对照，用荧光免疫分析仪检测实际浓度值；

在上述微流控芯片的样本加样孔23首先加入不同体积的全血样本(5μL，10μL，15μL，20μL，25μL)，等待2min，然后在缓冲液加样孔24中加入不同体积的缓冲液(加入体积为50μL减去全血样本体积)，4min后进行结果检测。

以上步骤各进行10个重复，取平均值并计算变异系数CV。

3、结果

实验结果如表1所示，在双加样孔设计的微流控芯片上，当全血样本的加样量为5μL时，由于加样量太少，微流控芯片上的反应不能充分进行，导致检测结果偏低；当全血样本的加样量在10-20μL之间时，加样量适合，缓冲液清洗微通道21充分，检测结果与EDTA血浆检测结果具有很好的一致性；当全血样本的加样量超过20μL时，用于清洗微通道21的缓冲液的加样量少于30μL，微通道21清洗不彻底，背景信号值偏高，导致检测结果整体高于临床检测值。

表1 EDTA血浆和全血样本的检测数据

因此，本实施例中的微流控芯片通过两步加样法即可实现10-20μL的全血检测分析。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：包括紧密叠合的微流控基片(1)和微流控盖片(2)，微流控基片(1)的上表面沿样本流动方向依次间隔设有荧光标记区(11)和检测区(12)，微流控盖片(2)的下表面开设有微通道(21)，微通道(21)的一侧设有废液槽(22)，另一侧沿样本流动方向依次开设有上下贯通微流控盖片(2)的缓冲液加样孔(24)和样本加样孔(23)，缓冲液加样孔(24)和样本加样孔(23)均与微通道(21)相连通，废液槽(22)的顶部设有连通废液槽(22)与外界的通孔(221)，微流控基片(1)和微流控盖片(2)紧密叠合时，荧光标记区(11)和检测区(12)均位于微通道(21)内。

2.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：微通道(21)包括宽度较大的宽部(211)和宽度较小的窄部(212)，宽部(211)和窄部(212)之间设有向外侧凸起的弧形连接部(213)，样本加样孔(23)靠近弧形连接部(213)，缓冲液加样孔(24)位于宽部(211)，样本加样孔(23)处的微通道(21)的宽度小于缓冲液加样孔(24)处的微通道(21)的宽度。

3.根据权利要求2所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：样本加样孔(23)和缓冲液加样孔(24)之间的间距为10-20mm。

4.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：样本加样孔(23)和缓冲液加样孔(24)之间设有若干排第一柱形凸起(25)，第一柱形凸起(25)的数目沿样本的流动方向逐渐减少，第一柱形凸起(25)的底端与微流控盖片(2)的下表面相齐平。

5.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：靠近样本加样孔(23)的微通道(21)的内部两侧设有第二柱形凸起(26)，第二柱形凸起(26)上固定包被有红细胞单抗，第二柱形凸起(26)的底端与微流控盖片(2)的下表面相齐平。

6.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：缓冲液加样孔(24)与第一柱形凸起(25)之间的微通道(21)内壁设有若干引流片(27)，引流片(27)呈长方形，引流片(27)的长度方向与样本的流动方向相平行，引流片(27)的底端与微流控盖片(2)的下表面相齐平。

7.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：检测区(12)包括沿样本流动方向依次包被在微流控基片(1)上的第一检测位点T(121)、第二检测位点T(123)、第一质控位点C(122)和第二质控位点C(124)。

8.根据权利要求7所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：第一检测位点T(121)为NT-proBNP检测位点，第二检测位点T(123)为BNP检测位点，第一质控位点C(122)为NT-proBNP质控位点，第二质控位点C(124)为BNP质控位点。

9.根据权利要求8所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：荧光标记区(11)固定干燥有BNP及NT-proBNP荧光标记抗体的混合物，第一检测位点T(121)包被干燥有NT-proBNP配对抗体，第二检测位点T(123)包被干燥有BNP配对抗体，第一质控位点C(122)包被干燥有偶联NT-proBNP重组抗原的配对抗体，第二质控位点C(124)包被干燥有偶联BNP重组抗原的配对抗体。

10.根据权利要求1所述的基于两步加样实现微量全血检测的微流控芯片，其特征在于：废液槽(22)的容积为40-50μL。